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Neuroscience

स्टीरियोटैक्सिक सर्जिकल दृष्टिकोण माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा रीढ़ की हड्डी चूहों में टंकी मैग्ना के माध्यम से

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63344
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

Summary

चूहों में मस्तिष्क साइटों को लक्षित करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी में आमतौर पर खोपड़ी की हड्डियों के माध्यम से पहुंच शामिल होती है और खोपड़ी के स्थलों द्वारा निर्देशित होती है। यहां हम एक वैकल्पिक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयार करते हैं ताकि कुडल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को टंकी मैग्ना के माध्यम से लक्षित किया जा सके जो ब्रेनस्टेम स्थलों के प्रत्यक्ष दृश्य पर निर्भर करता है।

Abstract

चूहों में मस्तिष्क साइटों को लक्षित करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी आमतौर पर खोपड़ी स्थलों द्वारा निर्देशित होती है। पहुँच तो खोपड़ी के माध्यम से ड्रिल burr छेद के माध्यम से प्राप्त किया जाता है. यह मानक दृष्टिकोण विशिष्ट शारीरिक चुनौतियों के कारण पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड में लक्ष्यों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि ये साइटें खोपड़ी के स्थलों से दूरस्थ हैं, जिससे अशुद्धता होती है। यहां हम सिस्टेरा मैग्ना के माध्यम से एक वैकल्पिक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयार करते हैं जिसका उपयोग पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड में रुचि के असतत क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए किया गया है। टंकी मैग्ना ओसीसीपटल हड्डी से एटलस (यानी, दूसरी कशेरुक हड्डी) तक फैली हुई है, मस्तिष्कमेरु द्रव से भरी होती है, और ड्यूरा मेटर द्वारा कवर की जाती है। यह दृष्टिकोण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) संरचनाओं का चयन करने के लिए उपयोग का एक पुनरुत्पादक मार्ग प्रदान करता है जो अन्यथा शारीरिक बाधाओं के कारण पहुंचने के लिए कठिन हैं। इसके अलावा, यह लक्ष्य साइटों के करीब निकटता में ब्रेनस्टेम लैंडमार्क के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देता है, पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड में रुचि के प्रतिबंधित क्षेत्रों में छोटे इंजेक्शन वॉल्यूम प्रदान करते समय सटीकता में वृद्धि करता है। अंत में, यह दृष्टिकोण सेरिबैलम से बचने का अवसर प्रदान करता है, जो मोटर और सेंसरीमोटर अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।

Introduction

चूहों में मस्तिष्क साइटों को लक्षित करने के लिए मानक स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी1 में आमतौर पर कान की सलाखों और मुंह बार के एक सेट का उपयोग करके खोपड़ी का निर्धारण शामिल होता है। निर्देशांक तब संदर्भ एटलस 2,3, और खोपड़ी के स्थलों के आधार पर अनुमानित किए जाते हैं, अर्थात्, ब्रेग्मा (वह बिंदु जहां ललाट और पार्श्विका हड्डियों के टांके एक साथ आते हैं) या लैम्ब्डा (वह बिंदु जहां पार्श्विका और पश्चकपाल हड्डियों के टांके एक साथ आते हैं; चित्रा 1A, B)। अनुमानित लक्ष्य के ऊपर खोपड़ी में एक छेद के माध्यम से, लक्ष्य क्षेत्र तक पहुंचा जा सकता है, या तो माइक्रोइंजेक्शन के वितरण के लिए या कैनुला या ऑप्टिक फाइबर के साथ इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए। इन टांके की शारीरिक रचना में भिन्नता और ब्रेग्मा या लैम्ब्डा 4,5 के स्थानीयकरण में त्रुटियों के कारण, मस्तिष्क के संबंध में शून्य बिंदुओं की स्थिति जानवर से जानवरों में भिन्न होती है। जबकि लक्ष्यीकरण में छोटी त्रुटियां, जो इस परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप होती हैं, बड़े या आस-पास के लक्ष्यों के लिए कोई समस्या नहीं हैं, उनका प्रभाव ब्याज के छोटे क्षेत्रों के लिए अधिक होता है जो एंटेरोपोस्टीरियर या डोर्सोवेंट्रल विमानों में शून्य बिंदुओं से दूरस्थ होते हैं और / या उम्र, तनाव और / या लिंग के कारण अलग-अलग आकार के जानवरों का अध्ययन करते समय। कई अतिरिक्त चुनौतियां हैं जो मज्जा oblongata और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड के लिए अद्वितीय हैं। सबसे पहले, एंटेरोपोस्टीरियर निर्देशांक में छोटे परिवर्तन सेरिबैलम (चित्रा 1Bi) 2,6,7 की स्थिति और आकार के कारण, ड्यूरा के सापेक्ष डोर्सोवेंट्रल निर्देशांक में महत्वपूर्ण परिवर्तनों से जुड़े होते हैं। दूसरा, ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड खोपड़ी2 के भीतर निहित नहीं है। तीसरा, पश्चकपाल की हड्डी की तिरछी स्थिति और गर्दन की मांसपेशियों की अतिरंजित परत2 मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण को ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के बीच संक्रमण के पास स्थित संरचनाओं के लिए और भी अधिक चुनौतीपूर्ण बनाती है (चित्रा 1बीआई)। अंत में, पुच्छल ब्रेनस्टेम और सर्वाइकल कॉर्ड में रुचि के कई लक्ष्य छोटे2 हैं, जिनके लिए सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य इंजेक्शन 8,9 की आवश्यकता होती है।

टंकी मैग्ना के माध्यम से एक वैकल्पिक दृष्टिकोण इन समस्याओं को दरकिनार करता है। टंकी मैग्ना एक बड़ी जगह है जो पश्चकपाल की हड्डी से एटलस तक फैली हुई है (चित्रा 1 ए, यानी, दूसरी कशेरुका हड्डी)10। यह मस्तिष्कमेरु द्रव से भरा होता है और ड्यूरा मेटर10 द्वारा कवर किया जाता है। ओसीसीपटल हड्डी और एटलस के बीच यह स्थान सिर को एंटेरोफ्लेक्स करते समय खुलता है। यह longus capitis मांसपेशी के overlying युग्मित पेट के बीच में नेविगेट करके पहुँचा जा सकता है, पुच्छल brainstem की पृष्ठीय सतह को उजागर. ब्याज के क्षेत्रों को तब इन क्षेत्रों के स्थलों के आधार पर लक्षित किया जा सकता है यदि वे पृष्ठीय सतह के पास स्थित हैं; या obex का उपयोग करके, वह बिंदु जहां केंद्रीय नहर IV वेंट्रिकल में खुलती है, निर्देशांक के लिए एक शून्य बिंदु के रूप में गहरी संरचनाओं तक पहुंचने के लिए। इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक विभिन्न प्रजातियों में उपयोग किया गया है, जिसमें चूहे11, बिल्ली12, माउस 8,9, और गैर-मानव प्राइमेट13 शामिल हैं, जो वेंट्रल श्वसन समूह को लक्षित करने के लिए, मज्जा औसत दर्जे का रेटिकुलर गठन, एकान्त पथ के नाभिक, क्षेत्र पोस्ट्रेमा, या हाइपोग्लोसल नाभिक शामिल हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है क्योंकि इसके लिए शरीर रचना विज्ञान, एक विशेष टूलकिट और मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण की तुलना में अधिक उन्नत सर्जिकल कौशल के ज्ञान की आवश्यकता होती है।

यहां हम सिस्टेरा मैग्ना के माध्यम से ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड तक पहुंचने के लिए एक चरण-दर-चरण सर्जिकल दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, स्थलों की कल्पना करते हैं, शून्य बिंदु (चित्रा 2) सेट करते हैं, और असतत ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों में माइक्रोइंजेक्शन के स्टीरियोटैक्सिक वितरण के लिए लक्ष्य निर्देशांक का अनुमान लगाते हैं और अनुकूलित करते हैं (चित्रा 3)। फिर हम इस दृष्टिकोण से संबंधित फायदे और नुकसान पर चर्चा करते हैं।

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Protocol

लेखक ने घोषणा की है कि प्रोटोकॉल बेथ इज़राइल डेकोनेस मेडिकल सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. सर्जिकल उपकरणों और stereotaxic फ्रेम की तैयारी

नोट: सर्जरी एसेप्टिक स्थितियों के तहत किया जाता है। बाँझ टिप तकनीक का उपयोग करके बाँझपन बनाए रखा जाता है।

  1. स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम पर एक माइक्रोपिपेट या सिरिंज (एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) या पारंपरिक अनुरेखक) के इंजेक्शन से भरा हुआ स्टीरियोटैक्सिक हाथ स्थापित करें और माउस एडाप्टर (चित्रा 2 ए) तैयार करें।
  2. Autoclaved सर्जिकल उपकरणों (सामग्री की तालिका) तैयार करें और उन्हें एक बाँझ सतह पर रखें।

2. संज्ञाहरण प्रेरण और माउस तैयारी

  1. 0.5 एल / मिनट पर ओ2 को चालू करें और आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को 4.0 पर सेट करें, यह सुनिश्चित करें कि ओ2 प्रवाह प्रेरण बॉक्स में है।
    सावधानी: सुनिश्चित करें कि आइसोफ्लुरेन प्रेरण बॉक्स को एक हुड में रखा गया है और यह कि आइसोफ्लुरेन को सर्जिकल साइट से दूर रखा गया है।
  2. माउस (10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL / 6J) प्रेरण कक्ष में रखें।
  3. एक बार सांस लेने के धीमा हो जाने के बाद, प्रेरण कक्ष खोलें, और माउस को थोड़ा उठाएं। सिर से कंधों तक बालों को हटाने के लिए क्लिपर्स का उपयोग करें।

3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस की स्थिति

  1. माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में ले जाएं और नाक को एक लचीले नाक शंकु में रखें। इस स्तर पर, सुनिश्चित करें कि ओ2 प्रवाह अब नाक शंकु के लिए निर्देशित है।
  2. माउस को केवल कान सलाखों का उपयोग करके स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कान सलाखों भी कर रहे हैं और सिर स्तर है।
  3. मैन्युअल रूप से नाक का मार्गदर्शन करके माउस के सिर को 90 ° कोण पर एंटेरोफ्लेक्स करें। इस स्थिति को सुरक्षित करने के लिए, माउस एडाप्टर के कान बार स्तंभों के बीच एक प्लास्टिक बाधा रखें, जो स्तंभों के समानांतर है। खोपड़ी का सपाट हिस्सा संदर्भ के रूप में कार्य करता है, पारंपरिक स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी में फ्लैट खोपड़ी दृष्टिकोण के समान।
    नोट: सिर को फ्लेक्स न करें (यानी ललाट खोपड़ी की हड्डी के विमान और मेज की सतह के विमान के बीच 90 डिग्री के कोण से परे) क्योंकि यह ऊपरी वायुमार्ग के माध्यम से एयरफ्लो को बाधित करता है। यदि एयरफ्लो को बाधित किया जाता है, तो माउस को फिर से स्थापित करें, यह सुनिश्चित करें कि शरीर ट्रंक के नीचे समर्थित है और ललाट खोपड़ी की हड्डी के विमान और तालिका की सतह के विमान के बीच एक प्लास्टिक कार्ड 90 डिग्री पर सेट किया गया है जैसा कि चित्रा 2 ए, सी में उल्लिखित है।
  4. माउस के नीचे हीटिंग पैड रखें, और फिर सुनिश्चित करें कि गर्दन और शरीर के बाकी हिस्सों को एक ही स्तर पर तैनात किया गया है (यानी, लगभग 180 डिग्री या तालिका के समानांतर)। स्प्रिंग कैंची रखने वाले टूलबॉक्स का उपयोग शरीर को इस स्थिति में उठाने के लिए किया जा सकता है।
    नोट: यह चरण महत्वपूर्ण है क्योंकि पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड स्थिति के आधार पर चलते हैं, सीएनएस के अधिक रोस्ट्रल भागों के विपरीत जो खोपड़ी द्वारा जगह में आयोजित किए जाते हैं।
  5. 4 मिलीग्राम / किग्रा मेलोक्सिकैम धीमी गति से रिलीज (एसआर) की एक खुराक को चमड़े के नीचे (एससी) 2 μL / g शरीर के वजन की मात्रा पर इंजेक्ट करें और आंखों पर स्नेहक रखें।
  6. सर्जिकल चीरा साइट को पहले 70% अल्कोहल प्रेप पैड के साथ साफ करें, फिर एक बीटाडीन प्रेप पैड के साथ, और फिर फिर से अल्कोहल प्रेप पैड के साथ और सूखने दें।
  7. शरीर के नीचे एक ड्रेप रखें।
  8. हाथों को कीटाणुरहित करें और बाँझ दस्ताने पहनें।
  9. सर्जिकल साइट पर एक ड्रेप रखें।

4. सर्जरी टंकी मैग्ना का उपयोग करने के लिए

  1. सुनिश्चित करें कि माउस पैर की उंगलियों को चुटकी लेने या कॉर्नियल रिफ्लेक्स की जांच करके उचित रूप से एनेस्थेटिक है।
  2. रखरखाव के स्तर (2.0) के लिए isoflurane को कम करें।
  3. एक चिकनी आंदोलन में कंधों की ओर पश्चकपाल हड्डी के किनारे से सर्जिकल ब्लेड # 10 के साथ एक 1-1.2 सेमी चीरा बनाएं।
  4. trapezius मांसपेशी के मध्य रेखा raphe में एक चीरा बनाओ. यह युग्मित लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशियों को उजागर करता है।
    नोट: चूहों में, trapezius मांसपेशी एक बहुत पतली, लगभग पारदर्शी मांसपेशी है। मिडलाइन में रहना सुनिश्चित करें और अंतर्निहित मांसपेशियों में कटौती न करें क्योंकि इससे अनावश्यक रक्तस्राव होगा।
  5. युग्मित लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशियों के बीच में दोनों रिट्रेक्टर हुक रखें, एक बाईं ओर उन्मुख और दूसरा दाईं ओर उन्मुख। हेमोस्टैट्स का वजन रिट्रेक्टर हुक को तनाव प्रदान करता है जिसे हेमोस्टैट्स की स्थिति को फिर से समायोजित करके संशोधित किया जा सकता है।
  6. सर्जिकल क्षेत्र को बेहतर ढंग से देखने के लिए सर्जिकल माइक्रोस्कोप को जगह में रखें।
  7. युग्मित लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशी के बाएं और दाएं पेट को अलग करने के लिए कुंद लैमिनेक्टोमी संदंश का उपयोग करें, जो कि ऑक्सिपुट से शुरू होता है, जहां मिडलाइन आसानी से दिखाई देती है। मिडलाइन में occiput की हड्डी के पार कुंद संदंश गाइड करने के लिए नीचे जहां यह कुंड dura mater से मिलता है, और फिर एटलस के लिए ड्यूरा मेटर भर में जारी है.
    नोट: युग्मित लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशियों के माध्यम से कटौती करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि कुछ भी उन्हें मिडलाइन में एक साथ नहीं रखता है; ऐसा करने से अनावश्यक रक्तस्राव होगा।
  8. retractors reposition और hemostats repositioning द्वारा तनाव को समायोजित, टंकी magna के दृश्य खोलने.
  9. ब्रेनस्टेम और सेरिबैलम की एक अच्छी देखने की खिड़की प्राप्त करने के लिए मिडलाइन में मांसपेशियों को आगे अलग करने के लिए कुंद लैमिनेक्टोमी संदंश का उपयोग करें।
  10. आवश्यकतानुसार चरण 4.7-4.9 को दोहराएं जब तक कि सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम ड्यूरा के नीचे दृश्य में नहीं आते।
  11. कुंद लैमिनेक्टोमी संदंश का उपयोग करते हुए, एक पार्श्व दिशा में मिडलाइन से संदंश को स्थानांतरित करके संयोजी ऊतक के छोटे किस्में के ड्यूरा को स्पष्ट करें, जब तक कि ब्रेनस्टेम का स्पष्ट दृश्य न हो और लक्ष्य के लिए आवश्यक रूप से अधिक पार्श्व स्थान बनाने के लिए।

5. कुंडीय झिल्ली का उद्घाटन

  1. ड्यूरा को पकड़ने के लिए कोण वाले ड्यूमोंट संदंश (# 4/45) का उपयोग करें, जो ओसीसीपटल हड्डी से एटलस तक फैला हुआ है। पश्चकपाल हड्डी के पास ड्यूरा को पकड़ो और ड्यूरा में एक छोटा सा उद्घाटन (~ 0.5 से 1.5 मिमी) बनाने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें।
    नोट: इस rostral स्थान पर, brainstem और overlying dura के बीच की जगह व्यापक है, dura के सुरक्षित हेरफेर के लिए पर्याप्त जगह प्रदान करते हैं।
  2. ड्यूरा को उठाने और ड्यूरा को आगे खोलने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें। विंडो का आकार लक्ष्य पर निर्भर करता है।
    नोट: एकाधिक अनुदैर्ध्य इंजेक्शन या द्विपक्षीय इंजेक्शन बनाते समय एक बड़ी खिड़की की आवश्यकता होगी; एकल एकतरफा या मिडलाइन इंजेक्शन बनाते समय एक छोटी सी खिड़की पर्याप्त होगी।
  3. एक बार जब ड्यूरा खोला जाता है, तो एक बाँझ क्यू टिप के साथ अतिरिक्त मस्तिष्कमेरु द्रव को नाली करें।

6. स्थलों और शून्य बिंदु की पहचान

  1. खुले ड्यूरा के माध्यम से विस्तृत स्थलों के साथ ब्रेनस्टेम की पृष्ठीय सतह देखें। Obex, वह बिंदु जहां केंद्रीय नहर IV वेंट्रिकल में खुलती है, मानक पूर्वकाल-पश्चवर्ती और औसत दर्जे का शून्य बिंदु है।

7. लक्ष्य निर्देशांक

नोट: विभिन्न लक्ष्यों के लिए, हमने पूर्वकाल पश्चवर्ती (एपी) और मेडिओलेटरल (एमएल) निर्देशांक के साथ मानक निर्देशांक की एक सूची शामिल की है, जो शून्य-बिंदु ब्रेग्मा के सापेक्ष है और एपी और एमएल निर्देशांक के साथ टंकी मैग्ना निर्देशांक शून्य बिंदु ओबेक्स के सापेक्ष है ताकि पद्धतियों के बीच संक्रमण को सुविधाजनक बनाया जा सके (तालिका 1)। डोर्सोवेंट्रल (डीवी) निर्देशांक मस्तिष्क या सेरिबैलम (मानक दृष्टिकोण) की सतह या मस्तिष्क की सतह या ब्रेनस्टेम या ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड (सिस्टरना मैग्ना दृष्टिकोण) की सतह के सापेक्ष होते हैं, जो एपी और एमएल प्रवेश के बिंदु पर होते हैं। सर्जरी से पहले योजना बनाई जानी चाहिए।

  1. लक्ष्य निर्धारित करने के लिए निर्देशांक के तीन सेट का उपयोग करें: AP, ML, और DV. सिर की स्थिति के कारण, ब्रेनस्टेम संरचनाओं का सापेक्ष अभिविन्यास स्थान के आधार पर भिन्न होता है।
    1. लक्ष्य दूरी के लिए >उडल से ओबेक्स तक 0.4 मिमी (चित्रा 1 बी, हरा) निम्नलिखित प्रदर्शन करें।
      1. एपी: किसी भी मानक स्टीरियोटैक्सिक संदर्भ एटलस (जैसे, पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन एटलस2) या ऊतक श्रृंखला का उपयोग करें जो ओबेक्स और लक्ष्य के बीच एपी दूरी का अनुमान लगाने के लिए अनुप्रस्थ विमान में कटौती की जाती है।
      2. एमएल: ओबेक्स और लक्ष्य के बीच एमएल दूरी का अनुमान लगाने के लिए अनुप्रस्थ विमान में कटौती किए गए किसी भी मानक स्टीरियोटैक्सिक संदर्भ एटलस या ऊतक श्रृंखला का उपयोग करें।
      3. डीवी: एपी और एमएल लक्ष्य बिंदु पर मस्तिष्क या सेरिबैलम की सतह के सापेक्ष निर्देशांक का अनुमान लगाएं। वांछित एपी और एमएल निर्देशांक और लक्ष्य पर ब्रेनस्टेम सतह के बीच की दूरी का अनुमान लगाने के लिए अनुप्रस्थ विमान में कटौती किए गए किसी भी मानक स्टीरियोटैक्सिक संदर्भ एटलस या ऊतक श्रृंखला का उपयोग करें।
    2. लक्ष्य दूरी के लिए <उडल से ओबेक्स तक 0.4 मिमी (चित्रा 1 बी, नारंगी) निम्नलिखित प्रदर्शन करते हैं।
      1. एपी: brainstem के anteroflexion के लिए खाते के लिए निर्देशांक समायोजित करें। Ventral और rostral निर्देशांक के लिए, AP brainstem प्रवेश बिंदु मानक विमान में लक्ष्य AP समन्वय के सापेक्ष अधिक पुच्छल होगा।
      2. एमएल: अनुप्रस्थ विमान में कटौती एक मानक स्टीरियोटैक्सिक संदर्भ एटलस या ऊतक श्रृंखला से लक्ष्य निर्देशांक व्युत्पन्न। निर्देशांक लक्ष्य AP स्तर पर visualized मिडलाइन के सापेक्ष होगा।
      3. डीवी: अनुमान एपी और एमएल लक्ष्य बिंदु पर ब्रेनस्टेम की सतह के सापेक्ष निर्देशांक। ब्रेनस्टेम के एंटेरोफ्लेक्सियन के लिए खाते में डीवी समायोजित करें। वेंट्रल और रोस्ट्रल निर्देशांक के लिए, डीवी निर्देशांक मानक विमान में ब्रेनस्टेम की पृष्ठीय सतह से दूरी से अधिक होगा।

8. लक्ष्य के इंजेक्शन

  1. स्टीरियोटैक्सिक बांह का उपयोग करके लक्ष्य के लिए पिपेट या सिरिंज को कम करें और मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण के लिए समाधान इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद 1-5 मिनट के लिए जगह में छोड़ दें, 3-50 एनएल के बीच वॉल्यूम का उपयोग करते समय सुई ट्रैक से बचने के लिए। फिर, स्टीरियोटैक्सिक बांह का उपयोग करके पिपेट या सिरिंज को उठाएं।
  2. चरण 8.1 को दोहराएँ। कई लक्ष्यों के लिए।

9. सर्जिकल क्षेत्र के बंद

  1. सर्जिकल क्षेत्र से ध्यान से हुक निकालें। युग्मित लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशियां एक तटस्थ स्थिति में वापस आ जाएंगी, पूरी तरह से टंकी मैग्ना को कवर करेंगी। मध्यरेखा में ट्रेपेज़ियस मांसपेशी और ड्यूरा मेटर को बंद न करें क्योंकि वे टांके पकड़ने के लिए बहुत नाजुक हैं।
  2. तीन नायलॉन या polypropylene टांके (5-0 या 6-0) के साथ त्वचा को बंद करें।

10. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल

  1. Isoflurane बंद करें और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माउस को हटा दें। माउस को हीटिंग पैड पर एक साफ पिंजरे में रखें और जागने और आगे बढ़ने तक निरीक्षण करें।
  2. पोस्ट-ऑपरेटिव दिनों 1-3 पर स्वास्थ्य की स्थिति, वजन और टांके की निगरानी करें। दिन 10 पर टांके निकालें यदि पहले से ही नहीं हटाया गया है।

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Representative Results

टंकी मैग्ना दृष्टिकोण पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड संरचनाओं को लक्षित करना संभव बनाता है जो अन्यथा मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण के माध्यम से पहुंचने के लिए कठिन हैं या असंगत लक्ष्यीकरण के लिए प्रवण हैं। सिस्टेरा मैग्ना तक पहुंचने के लिए सर्जरी के लिए त्वचा के चीरों, ट्रेपेज़ियस मांसपेशियों की एक पतली परत, और ड्यूरा मेटर के उद्घाटन की आवश्यकता होती है और इसलिए चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है। यह विशेष रूप से कुशल और कम आक्रामक है जब कई (अनुदैर्ध्य रूप से बिखरे हुए या द्विपक्षीय) साइटों को लक्षित करते हैं, क्योंकि इसे मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण के रूप में कई छेदों के ड्रिलिंग की आवश्यकता नहीं होती है। चूहों में, हमने नियमित रूप से हाइपोग्लोसल नाभिक9, वेंट्रल श्वसन समूह8, और आसन्न रेटिकुलर गठन8 जैसी संरचनाओं को लक्षित किया है, जो कि टंकी मैग्ना दृष्टिकोण का उपयोग करके पुच्छल ब्रेनस्टेम में है, जैसा कि हम आगे हाइपोग्लोसल नाभिक और वेंट्रोमेडियल मेडुला (जीआईवी) के लिए चित्रा 3 में स्पष्ट करते हैं। उदाहरण के लिए, hypoglossal नाभिक पृष्ठीय मज्जा oblongata में motoneurons का एक पतला लेकिन rostrocaudally लम्बी स्तंभ है और इसके rostral ध्रुव एक मानक दृष्टिकोण के माध्यम से लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, जैसा कि डीवी निर्देशांक (~ 4.5 मिमी) ज्यादातर ओवरलाइंग सेरिबैलम द्वारा निर्धारित होते हैं, जिसमें केवल 1.2-1.4 मिमी ब्रेनस्टेम में प्रवेश करते हैं, माउस के सिर की स्थिति में अपेक्षाकृत छोटा अंतर इसलिए आसानी से एक गलत इंजेक्शन में परिणाम हो सकता है। शून्य-बिंदु ओबेक्स के लिए इस लक्ष्य की निकटता के कारण, इसे टंकी मैग्ना दृष्टिकोण के माध्यम से अधिक मज़बूती से लक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइपोग्लोसल नाभिक का पुच्छल अंत जो ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी के बीच संक्रमण तक फैलता है, को एक ही सिस्टेरा मैग्ना दृष्टिकोण द्वारा लक्षित किया जा सकता है, जबकि मानक दृष्टिकोण को एपी दृष्टिकोण को एंगल करके इस तरह के एक पुच्छल साइट तक पहुंचने के लिए संशोधित करना होगा और ओसीसीपटल हड्डी से बचने के लिए निर्देशांक को समायोजित करना होगा और गर्दन की मांसपेशियों को खत्म करना होगा।

मानक दृष्टिकोण बनाम सिस्टेरा मैग्ना दृष्टिकोण की सटीकता को निर्धारित करने के लिए, हमने वेंट्रल (वेंट्रोमेडियल मेडुला) के लिए एंटेरोपोस्टेरियर, मेडिओलेटरल और डोर्सोवेंट्रल विमानों में इच्छित और वास्तविक लक्ष्य साइटों के बीच की दूरी को मापा; GiA/V; N = 10) और पृष्ठीय (NuXII; एन = 16) क्षेत्र। माप को पुच्छल ब्रेनस्टेम (चित्रा 3) के अनुप्रस्थ वर्गों में किया गया था। परिणाम (चित्रा 4) मानक दृष्टिकोण की तुलना में टंकी मैग्ना दृष्टिकोण के लिए एंटेरोपोस्टेरियर, मेडिओलेटरल और विशेष रूप से डोर्सोवेंट्रल विमानों में काफी छोटी त्रुटियां दिखाते हैं। ये परिणाम इन लक्ष्यों के लिए टंकी मैग्ना दृष्टिकोण की बढ़ी हुई सटीकता को उजागर करते हैं। हमने मानक स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक (ब्रेग्मा के सापेक्ष, पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन 2 से व्युत्पन्न, लेकिन हमारे अध्ययन के लिए अनुकूलित) और तालिका 1 में सिस्टरना मैग्ना निर्देशांक (ओबेक्स के सापेक्ष) को शामिल किया है। इन निर्देशांकों को सभी को अनुकूलित और सत्यापित किया गया है जैसा कि हाइपोग्लोसल नाभिक और चित्र 3 में वेंट्रोमेडियल मेडुला के लिए दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रमुख स्थलों, लक्ष्य क्षेत्रों, और स्टीरियोटैक्सिक सिस्टेरा मैग्ना दृष्टिकोण के विमान का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) प्रमुख शारीरिक स्थलों और सैगिटल विमान में स्थिति। (बी) ऐसे क्षेत्र जिन तक मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण बनाम सिस्टेरा मैग्ना स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण और उनके संदर्भ बिंदुओं के संबंध के माध्यम से पहुंचा जा सकता है। i) मानक दृष्टिकोण बोनी स्थलों ब्रेग्मा और लैम्ब्डा का उपयोग करता है, जो मैजेंटा और बैंगनी में लक्ष्य क्षेत्रों से दूर हैं। मैजेंटा (कैडल मेडुला ओबलोंगाटा और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड) में क्षेत्र तिरछी ओसीसीपटल हड्डी और गर्दन की मांसपेशियों के कारण पहुंचने के लिए चुनौतीपूर्ण है। बैंगनी (rostral medulla oblongata) में क्षेत्र आंदोलन के लिए प्रवण है और पारंपरिक स्थलों से दूर है। ii) टंकी मैग्ना दृष्टिकोण पुच्छल मज्जा oblongata और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड तक पहुँचने के लिए उपयुक्त है और brainstem संरचनाओं है कि अनुदैर्ध्य स्तंभों है कि पुच्छल मज्जा oblongata rostrally से विस्तार में आयोजित कर रहे हैं का अध्ययन करते समय लाभ है, पुच्छल पोन्स के स्तर तक. (c) टंकी मैग्ना दृष्टिकोण के संबंध में विभिन्न स्टीरियोटैक्सिक संदर्भ एटलस के विमानों की योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्टीरियोटैक्सिक सिस्टेरा मैग्ना दृष्टिकोण का चरण-दर-चरण योजनाबद्ध अवलोकन। (ए) माउस एडाप्टर कान सलाखों के साथ समान रूप से उच्चतम स्तर पर स्थित है, मुंह बार कम स्थिति में है, और 90° कोण पर एंटेरोफ्लेक्स्ड सिर को सुरक्षित करने के लिए एक प्लास्टिक कार्ड है। (बी) कान सलाखों का उपयोग करके माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में सुरक्षित करें और 90 डिग्री पर सिर को एंटेरोफ्लेक्स करें और एक संदर्भ के रूप में स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के साथ एक कठोर प्लास्टिक कार्ड के माध्यम से स्थिति में रखें। (C) सुनिश्चित करें कि शरीर ऊंचा है ताकि यह occiput के रूप में एक ही विमान में हो। Palpate कुंजी स्थलों. (D) occiput से कंधों के rostral भाग के लिए एक त्वचा चीरा बनाओ। (ई) trapezius मांसपेशी के raphe में एक चीरा बनाओ. मिडलाइन में रहना सुनिश्चित करें और अंतर्निहित मांसपेशियों में कटौती न करें। (एफ) लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशी के दो पेटों के बीच की मध्यरेखा की पहचान करें, जो ऑक्सिपुट से शुरू होता है, और एक पुच्छल दिशा में लैमिनेक्टोमी संदंश का मार्गदर्शन करता है। (जी) प्रत्येक घाव हुक को लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशी के पेट के बीच में रखें और जब तक कि टंकी मैग्ना दृश्य में नहीं आता है तब तक फिर से स्थिति। (एच) बोनी लैंडमार्क (ओसीसीपटल हड्डी, एटलस) की पहचान करें, ड्यूरा मेटर जो इन बोनी संरचनाओं और अंतर्निहित सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम के बीच फैला हुआ है। लक्ष्य स्तर को उजागर करने के लिए आवश्यकतानुसार ड्यूरा मेटर को साफ करें। (I) वसंत कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करके ड्यूरा खोलें। (जे) ओबेक्स की पहचान करें, जो एपी और एमएल शून्य बिंदु बनाता है। पिपेट को पसंद के एपी और एमएल निर्देशांक पर ले जाएँ। पिपेट को कम करें जब तक कि यह ब्रेनस्टेम की पृष्ठीय सतह तक न पहुंच जाए। यह DV शून्य बिंदु है। वांछित निर्देशांक के लिए पिपेट को कम करें। (के) पिपेट और घाव के हुक को हटा दें और लॉन्गस कैपिटिस मांसपेशियों को अपनी मूल स्थिति को फिर से शुरू करने दें। (एल) घाव को बंद करें और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माउस को हटा दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लक्ष्य निर्देशांक का मूल्यांकन। पुच्छल brainstem के कम आवर्धन photomicrographs. (ए) एक CHAT-cre L10 GFP (हरे) रिपोर्टर माउस (महिला, 6 महीने की उम्र) के hypoglossal नाभिक में प्रतिगामी अनुरेखक हैजा विष सबयूनिट बी (सीटीबी; नीला) का इंजेक्शन। ध्यान दें कि सीटीबी इंजेक्शन हाइपोग्लोसल नाभिक तक सीमित है। (बी) एक vGluT2-ires-cre L10 GFP रिपोर्टर (हरे) माउस (पुरुष, 2 महीने पुराने) के ग्लूटामेटर्जिक कोशिकाओं का अभिकर्मक एक सशर्त एंटेरोग्रेड अनुरेखक (मैजेंटा) के साथ एक सशर्त एंटेरोग्रेड अनुरेखक (मैजेंटा) के साथ पुच्छल औसत दर्जे का मेडुला ओबलोंगाटा (जीआईवी क्षेत्र का पुच्छल ध्रुव)। (सी) एक vGLuT2-ires-cre माउस (पुरुष, 2 महीने पुराना) में सशर्त प्रतिगामी अनुरेखण टीवीए (मैजेंटा) ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स के अभिकर्मक और संशोधित रेबीज संक्रमण (हरे) को पुच्छल औसत दर्जे का मेडुला ओबलोंगाटा (जीआईवी क्षेत्र के पुच्छल ध्रुव) में दिखा रहा है। रेबीज वायरस को ऊपरी ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में इंजेक्ट किया गया था। आंतरिक स्थल एक मार्गदर्शन के रूप में काम करते हैं। संक्षिप्त रूप-cAmb: Ambiguus परिसर के कॉम्पैक्ट नाभिक; एपी: क्षेत्र Postrema; DMV: Vagus के पृष्ठीय मोटर नाभिक; GiV: Gigantocellular नाभिक, वेंट्रल भाग; IO: अवर जैतून; IRt: मध्यवर्ती रेटिकुलर नाभिक; LRN: पार्श्व रेटिकुलर नाभिक; NuXII- Hypoglossal नाभिक; सोल: एकान्त पथ का नाभिक; Sp5: स्पाइनल ट्राइजेमिनल न्यूक्लियस; VRG: वेंट्रल श्वसन समूह। स्केल बार: 200 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मानक और टंकी मैग्ना दृष्टिकोण के बीच सटीकता की तुलना। इच्छित लक्ष्य के केंद्र और एंटीरोपोस्टेरियर प्लेन (ए), मेडिओलेटरल प्लेन (बी), और डोर्सोवेंट्रल प्लेन (सी) में वास्तविक साइट के केंद्र के बीच की औसत दूरी। डेटा एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग करके एन = 13 वयस्क चूहों से प्राप्त किया गया था और एन = 13 वयस्क चूहों को एक टंकी मैग्ना दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। लक्ष्य की त्रिज्या 30 μm पर निर्धारित की गई थी। परिणाम एंटेरोपोस्टेरियर प्लेन (t(24) = 2.08, p = 0.049; दो-पूंछ वाले t-परीक्षण; अल्फा 0.05), mediolateral plane (t(24) = 2.55, p = 0.018; two-tailed t-test; alpha 0.05) और dorsoventral plane (t(24) = 4.33, p = 0.0002; दो-पूंछ वाले t-05 में उच्च सटीकता दिखाते हैं। बार ग्राफ मानक विचलन के साथ माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं और अलग-अलग डॉट्स प्रत्येक माउस में मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: पुच्छल brainstem संरचनाओं को लक्षित करने के लिए मानक और टंकी मैग्ना स्टीरियोटेक्सिक निर्देशांक का अवलोकन। कृपया ध्यान दें कि मानक और टंकी मैग्ना दृष्टिकोण दोनों के लिए, पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन एटलस 2 से निर्देशांकको तब तक समायोजित किया गया है जब तक कि ब्याज के क्षेत्रों को उचित रूप से लक्षित नहीं किया गया था जैसा कि हिस्टोलॉजी (चित्रा 3) द्वारा सत्यापित किया गया था। इसके अलावा, ध्यान दें कि रेटिकुलर गठन में क्षेत्रों में अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं की कमी है और यहां पक्सिनोस और फ्रैंकलिन2 के रूप में लेबल किया गया है। संक्षेप-एपी: एंटेरोपोस्टीरियर। एमएल: mediolateral. DV: dorsoventral. ChAT: Choline Acetyltransferase; एफ: महिला; एम: पुरुष; एम एंड एफ: पुरुष और महिला; एनए: लागू नहीं है; Pet1: plasmacytoma प्रतिलेखन कारक 1 व्यक्त; Sert: सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर, vGaT: Vesicular GABA ट्रांसपोर्टर; vGluT2: Vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2; डब्ल्यूटी: जंगली प्रकार. सभी निर्देशांक मिलीमीटर (मिमी) में हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मानक स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी आमतौर पर सीएनएस1 में लक्ष्य साइटों के निर्देशांक की गणना करने के लिए खोपड़ी के स्थलों पर निर्भर करती है। लक्ष्य साइटों को तब छेद के माध्यम से एक्सेस किया जाता है जो खोपड़ी1 के माध्यम से ड्रिल किए जाते हैं। यह विधि पुच्छल ब्रेनस्टेम के लिए आदर्श नहीं है क्योंकि लक्ष्य साइटें एंटेरोपोस्टेरियर और डोर्सोवेंट्रल विमानों2 में खोपड़ी के स्थलों से दूर स्थित हैं और खोपड़ी की शारीरिक रचना और अतिरंजित मांसपेशियों के रूप में पहुंच को चुनौतीपूर्णबनाते हैं 6 (चित्रा 1Bi)। हमारा अध्ययन पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी रीढ़ की हड्डी में लक्ष्य साइटों तक पहुंचने के लिए एक वैकल्पिक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसे सिस्टरना मैग्ना दृष्टिकोण कहा जाता है। मुख्य विशेषताएं जो इस विधि को एक मानक स्टीरियोटैक्टिक दृष्टिकोण से अलग बनाती हैं, वे स्थिति में हैं, जिसमें सिर के एंटेरोफ्लेक्सियन के साथ सिस्टेरा मैग्ना को खोलने के लिए, और ब्रेनस्टेम की पृष्ठीय सतह पर प्रमुख ब्रेनस्टेम लैंडमार्क का उपयोग संदर्भ बिंदुओं के रूप में संदर्भ बिंदुओं के रूप में किया जाता है जैसे कि ओबेक्स। हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि यह दृष्टिकोण असतत ब्रेनस्टेम संरचनाओं में ट्रेसर्स या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) की छोटी मात्रा (5-50 एनएल) के वितरण के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, एक संदर्भ बिंदु का उपयोग जो एक बोनी संरचना के बजाय एक सीएनएस लैंडमार्क का प्रतिनिधित्व करता है, और जो इच्छित लक्ष्य के करीब निकटता में है, छोटे लक्ष्यों और छोटे इंजेक्शन वॉल्यूम के लिए पुनरुत्पादन और सटीकता को बढ़ाता है, जैसा कि सर्किट मैपिंग और केमोजेनेटिक अध्ययन (चित्रा 3) 14,15 के लिए प्रासंगिक है।

किसी भी प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, टंकी magna दृष्टिकोण में ऐसे चरण हैं जो पुनरुत्पादन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। किसी भी स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण के साथ जो तीन अलग-अलग विमानों (एंटेरोपोस्टीरियर, मेडिओलेटरल और डोर्सोवेंट्रल) में निर्देशांक पर निर्भर है, स्थिति महत्वपूर्ण है। टंकी मैग्ना दृष्टिकोण के लिए, इसमें न केवल सिर की स्थिति शामिल है, जिसे 90 डिग्री पर एंटेरोफ्लेक्स किया जाना चाहिए, बल्कि शरीर का भी, जिसे ऊंचा किया जाना चाहिए ताकि पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड एक ही विमान में हों। एक और महत्वपूर्ण कदम अनावश्यक जोड़तोड़ से बचने के लिए है जो रक्तस्राव का कारण बनता है, क्योंकि यह प्रमुख स्थलों के विज़ुअलाइज़ेशन को बाधित करेगा। दो जोड़तोड़ हैं जो रक्तस्राव का एक उच्च जोखिम ले जाते हैं। सबसे पहले, कुंड मैग्ना को कवर करने वाले ड्यूरा मेटर को अपेक्षाकृत बड़ी मांसपेशी (लॉन्गस कैपिटिस) द्वारा कवर किया जाता है। जैसा कि यह एक युग्मित मांसपेशी है, मिडलाइन के दोनों ओर एक पेट के साथ, इस मांसपेशी के दो पेट को केवल मध्यरेखा में धीरे से अलग करने की आवश्यकता होगी। इन मांसपेशियों का चीरा आवश्यक नहीं है और रक्तस्राव का कारण होगा। दूसरे, ड्यूरा मेटर के सफल उद्घाटन पर, एक चर पाठ्यक्रम के साथ नसों की एक चर संख्या पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड की पृष्ठीय सतह के शीर्ष पर दिखाई देगी। इन नसों को निर्देशांक (0.1 मिमी तक) में मामूली समायोजन लागू करके या, यदि प्रयोगात्मक प्रतिमान अनुमति देता है, तो एक अलग लक्ष्य का चयन करके बचा जाना चाहिए।

टंकी मैग्ना दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा संरचनाओं तक पहुंच प्रदान करता है जो मानक स्टीरियोटैक्सिक विमान का उपयोग करते समय पहुंचने के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं क्योंकि वे ओसीसीपटल हड्डी के लिए पुच्छल अंत या सिर्फ पुच्छल के पास स्थित होते हैं। इसके अलावा, मज्जा oblongata में लक्ष्य के लिए दृष्टिकोण सेरिबैलम से बचा जाता है और इसलिए अनुमस्तिष्क घाव प्रभाव या एक सुई पथ के माध्यम से नकली लेबलिंग, जो मानक पद्धति का उपयोग करते समय अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं एक चिंता का विषय नहीं हैं। सिस्टेना मैग्ना दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि ब्रेनस्टेम की पृष्ठीय सतह दिखाई देती है। यह निर्देशांक के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में पृष्ठीय सतह पर एक मील का पत्थर का उपयोग करने का अवसर प्रदान करता है। इसके अलावा, दृष्टिकोण लचीला है और लक्ष्य के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने संदर्भ बिंदु के रूप में एक मिडलाइन लैंडमार्क, ओबेक्स का उपयोग किया। हालांकि, पृष्ठीय संरचनाओं को लक्षित करते समय, ब्याज की संरचना स्वयं पृष्ठीय सतह के परिदृश्य को निर्देशित कर सकती है। उदाहरण के लिए, बाहरी क्यूनेट नाभिक पृष्ठीय रूप से उभरा हुआ है, और इस प्रकार इसे सीधे कल्पना और इंजेक्ट किया जा सकता है। पार्श्व लक्ष्यों के लिए, जैसे कि वेंट्रल श्वसन समूह या अस्पष्ट परिसर, टंकी मैग्ना विंडो को पार्श्व दिशा में बढ़ाया जा सकता है। इसी तरह, ऊपरी ग्रीवा संरचनाओं को लक्षित करने के लिए, खिड़की को एटलस की ओर बढ़ाया जा सकता है। जबकि हमने एक बड़े पशु स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में रखे गए माउस एडाप्टर का उपयोग किया, दृष्टिकोण को आसानी से अन्य फ्रेम या सेटअप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जब तक कि प्रमुख चरणों का पालन किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, एक प्लास्टिक कार्ड के बजाय, मुंह की पट्टी को नाक के पुल के खिलाफ रखा जा सकता है ताकि सिर को स्थिर एंटेरोफ्लेक्स्ड स्थिति में रखा जा सके। यह ध्यान देने योग्य है कि शून्य बिंदु के रूप में ओबेक्स के साथ ब्रेनस्टेम लक्ष्य साइटों के निर्देशांक, जैसा कि तालिका 1 में प्रदान किया गया है, एक संदर्भ के रूप में कार्य करते हैं, और समायोजन माउस तनाव, उम्र, लिंग, स्टीरियोटैक्सिक हाथ के अंशांकन, और पोजिशनिंग तकनीक के आधार पर इंगित किया जा सकता है, समायोजन के समान जो किसी को संदर्भ एटलस से मानक दृष्टिकोण के लिए लक्ष्य निर्देशांक प्राप्त करते समय करने की आवश्यकता होती है। इसके लिए दृष्टिकोण के विमान में अंतर्दृष्टि की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से अधिक रोस्ट्रल लक्ष्यों के लिए जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। निर्देशांक का परीक्षण विभिन्न अनुरेखकों का उपयोग करके किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट मोतियों या फ्लोरोसेंट-टैग किए गए हैजा टॉक्सिन सबयूनिट बी एक ही माउस में विभिन्न निर्देशांकों के लिए। ब्रेनस्टेम / स्पाइनल ऊतक वर्गों के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (इस प्रोटोकॉल में कवर नहीं किए गए हैं) फिर उद्देश्य आंतरिक स्थलों 8,9,11,16 के सापेक्ष स्थानीयकरण के बारे में प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं या संदर्भ एटलस के साथ तुलना के लिए। निर्देशांक को तब समायोजित किया जा सकता है, फिर से परीक्षण किया जा सकता है, और अंतिम रूप दिया जा सकता है।

टंकी मैग्ना दृष्टिकोण की भी सीमाएं हैं। सीएनएस क्षेत्र जो इस दृष्टिकोण के माध्यम से पहुंचा जा सकता है, वे पुच्छल पोन्स, मेडुला ओबलोंगाटा और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड तक सीमित हैं। जबकि पुच्छल पोन्स को मानक दृष्टिकोण के माध्यम से आसानी से एक्सेस किया जा सकता है, टंकी मैग्ना दृष्टिकोण के फायदे हैं जब अनुदैर्ध्य रूप से उन्मुख संरचनाओं के उपखंडों का अध्ययन किया जाता है जो मज्जा ओब्लोंगाटा से पुच्छल पोन्स में विस्तारित होते हैं, जैसा कि रेटिकुलर गठन के भीतर उपखंडों के मामले में होता है। एक ही माउस में दूसरी बार इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय एक अन्य सापेक्ष सीमा उत्पन्न होती है, उदाहरण के लिए, संशोधित रेबीज ट्रेसिंग14 में। निशान ऊतक की उपस्थिति सर्जरी या अस्पष्ट मामूली स्थलों की अवधि को बढ़ा सकती है। हालांकि, हमारे हाथों में, यह विधि अभी भी इस मामले में मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण से बेहतर रही है, क्योंकि पहले इंजेक्शन की साइट को अन्य अद्वितीय स्थलों की नसों की स्थिति के संबंध में प्रलेखित किया जा सकता है, जिससे सटीक प्रवेश बिंदु को वापस ढूंढना आसान हो जाता है। जबकि यह दृष्टिकोण पुच्छल मज्जा और ऊपरी रीढ़ की हड्डी में अध्ययन का पता लगाने के लिए बेहतर है, इसका उपयोग हार्डवेयर को क्रोनिक रूप से प्रत्यारोपित करने के लिए नहीं किया जा सकता है। इसलिए, इन-विवो ऑप्टोजेनेटिक्स और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययनों के लिए जिन्हें ऑप्टिक फाइबर के आरोपण की आवश्यकता होती है17 सिस्टेरा मैग्ना दृष्टिकोण का उपयोग पहले लक्ष्य स्थल पर एएवी देने के लिए किया जा सकता है, इसके बाद फाइबर या कैनुला के साथ उपकरण चूहों के लिए एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग करके दूसरी सर्जरी की जा सकती है। यह दृष्टिकोण किसी को लक्ष्य साइट को असतत रखने में सक्षम बनाता है, जबकि हार्डवेयर के अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण फाइबर / हार्डवेयर प्लेसमेंट अधिक क्षमाशील है (यानी, कम सटीक हो सकता है)। अंत में, टंकी मैग्ना दृष्टिकोण को एक मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण की तुलना में अधिक उन्नत सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है। सरल बोनी स्थलों की मान्यता के बजाय, इसे अधिक जटिल ब्रेनस्टेम और मस्कुलोस्केलेटल लैंडमार्क में अंतर्दृष्टि की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, किसी भी नाजुक सर्जरी के साथ, प्रक्रिया की सफलता और दक्षता एक उचित टूलकिट पर निर्भर करती है जो उत्कृष्ट स्थिति में है। यह प्रोटोकॉल बाद के मुद्दों को संबोधित करता है और प्रयोगकर्ताओं द्वारा एक विस्तृत गाइड के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

अंत में, टंकी मैग्ना दृष्टिकोण मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण के पूरक है और पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा कॉर्ड को लक्षित करते समय कई फायदे प्रदान करता है, जो एक मानक स्टीरियोटैक्सिक दृष्टिकोण के माध्यम से आसानी से एक्सेस नहीं किए जाते हैं। यह संदर्भ बिंदुओं का उपयोग करता है जो बोनी लैंडमार्क के बजाय सीएनएस हैं जो इच्छित लक्ष्यों के करीब निकटता में हैं, प्रजनन क्षमता और सटीकता में वृद्धि करते हैं। यह दृष्टिकोण को विशेष रूप से मूल्यवान बनाता है जब छोटे इंजेक्शन की मात्रा को विस्तृत मानचित्रण या केमोजेनेटिक अध्ययन के संदर्भ में असतत साइटों पर वितरित करने की आवश्यकता होती है। यह दृष्टिकोण कार्यात्मक chemogenetic, optogenetic, फाइबर फोटोमेट्री, या घाव के दृष्टिकोण के लिए भी प्रासंगिक है, जहां एक एएवी वायरस या विष को रीडआउट के रूप में मोटर फ़ंक्शन या सेंसरीमोटर एकीकरण के साथ एक लक्ष्य पर वितरित किया जाता है: यह मेडुला ओबलोंगाटा में लक्ष्य के लिए सेरिबैलम के माध्यम से एक कोर्स से बचता है और इसलिए अध्ययन परिणामों में इसके हस्तक्षेप को सीमित करता है। पशु कल्याण के दृष्टिकोण से, प्रक्रिया को द्विपक्षीय या अनुदैर्ध्य रूप से साइटों तक पहुंचने के लिए कई छेद ड्रिलिंग की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे सर्जरी की अवधि और प्रक्रिया की आक्रामकता कम हो जाती है। जबकि हमने चूहों के लिए दृष्टिकोण को विस्तार से रेखांकित किया, वही सिद्धांत अन्य प्रजातियों11,12,13 पर लागू होते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को R01 NS079623, P01 HL149630, और P01 HL095491 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol pad Med-Vet International SKU: MDS090735Z skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45 FST 11251-35 only to grab dura
Betadine pad Med-Vet International SKU:PVP-PAD skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate Thermo Fisher Scientific 488: C34775, 594: C22842 Fluorescent tracer
Clippers Wahl Model MC3, 28915-10 for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp Kopf 1770 to hold glass pipette
Flowmeter Gilmont instruments model # 65 MM to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene Thermo Fisher Scientific F13080 Fluorescent tracer
Heating pad Stoelting 53800M thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit Midmark Inc 93805107 92800131 chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe Exelint International 26028 to administer saline and analgesic
Isoflurane Med-Vet International SKU:RXISO-250 inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer Midmark Inc 91305430 apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2 FST 11223-20 only to clean dura
Medical air, compressed Linde UN 1002 used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR Zoo Pharm LLC Lot # MSR2-211201 analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube Globe Scientific Inc 51628 for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor Stoelting 0051625  adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats FST 91308-12 for suturing
Oxygen regulator Life Support Products S/N 909328, lot 092109 regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed Linde USP UN 1072 provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card not applicable not applicable any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar) World Precision Instruments (WPI) SYS-PV820 For precision solution injection
Saline, sterile Mountainside Medical Equipment H04888-10 to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3 FST 10003-12 to hold scalpel
Scissors, Wagner FST 14070-12 to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box FST 15002-08 scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator Kopf 1760-61 attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate Kopf 1730-B, 1711 frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators Puritan 25-806 10WC absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes Henry Schein 9004686 for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment Puralube P1490 ocular lubricant
Stimulator & Tubing Grass Medical Instruments S44 to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10 Med-Vet International SKU: 10SS for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe FST 11153-10 to hold skin
Surgical gloves Med-Vet International MSG2280Z for asceptic surgery
Surgical microscope Leica Model M320/ F12 for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene Oasis MV-8661 to close the skin
Tegaderm 3M 3M ID 70200749250 provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post Kopf 1725 attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats FST 18200-09, 13003-10 to separate muscles and provide surgical window

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 179
स्टीरियोटैक्सिक सर्जिकल दृष्टिकोण माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए पुच्छल ब्रेनस्टेम और ऊपरी ग्रीवा रीढ़ की हड्डी चूहों में टंकी मैग्ना के <em>माध्यम से</em>
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Joshi, K., Kirby, A., Niu, J.,… More

Joshi, K., Kirby, A., Niu, J., VanderHorst, V. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (179), e63344, doi:10.3791/63344 (2022).

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