Summary
Стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей обычно включает доступ через кости черепа и руководствуется ориентирами черепа. Здесь мы излагаем альтернативный стереотаксический подход для нацеливания на хвостовой ствол мозга и верхний шейный отдел спинного мозга с помощью cisterna magna, который опирается на прямую визуализацию ориентиров ствола мозга.
Abstract
Стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей обычно руководствуется ориентирами черепа. Затем доступ осуществляется через отверстия заусенца, просверленные через череп. Этот стандартный подход может быть сложным для целей в хвостовом стволе мозга и верхней части шейного канатика из-за специфических анатомических проблем, поскольку эти участки удалены от ориентиров черепа, что приводит к неточности. Здесь мы излагаем альтернативный стереотаксический подход с помощью cisterna magna, который использовался для нацеливания на дискретные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Cisterna magna простирается от затылочной кости до атласа (т. е. второй позвоночной кости), заполнена спинномозговой жидкостью и покрыта твердой мозговой оболочкой. Этот подход обеспечивает воспроизводимый путь доступа к выбранным структурам центральной нервной системы (ЦНС), которые в противном случае трудно достичь из-за анатомических барьеров. Кроме того, он позволяет напрямую визуализировать ориентиры ствола мозга в непосредственной близости от целевых участков, повышая точность при доставке небольших объемов инъекций в ограниченные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Наконец, такой подход дает возможность избежать мозжечка, что может быть важно для моторных и сенсомоторных исследований.
Introduction
Стандартная стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей1 обычно включает фиксацию черепа с использованием набора ушных перекладин и ротовой панели. Затем координаты оцениваются на основе справочных атласов 2,3 и ориентиров черепа, а именно: брегма (точка, где швы лобной и теменной костей сходятся) или лямбда (точка, где швы теменной и затылочной костей сходятся; Рисунок 1А,В). Через отверстие в черепе над предполагаемой целью может быть достигнута целевая область, либо для доставки микроинъекций, либо для инструментов с помощью канюль или оптических волокон. Из-за вариации анатомии этих швов и ошибок в локализации брегмы или лямбды 4,5 положение нулевых точек по отношению к мозгу варьируется от животного к животному. Хотя небольшие ошибки в нацеливании, которые являются результатом этой изменчивости, не являются проблемой для крупных или близлежащих целей, их воздействие больше для небольших областей интереса, которые удалены от нулевых точек в переднезадней или дорсовентральной плоскостях и / или при изучении животных различного размера из-за возраста, деформации и / или пола. Существует несколько дополнительных проблем, которые являются уникальными для продолговатого мозга и верхней части шейного канатика. Во-первых, небольшие изменения переднезадных координат связаны со значительными изменениями дорсовентральных координат относительно твердой мозговой оболочки, обусловленными положением и формой мозжечка (рисунок 1Bi)2,6,7. Во-вторых, верхний шейный канатик не содержится в черепе2. В-третьих, наклонное положение затылочной кости и вышележащего слоя мышц шеи2 делает стандартный стереотаксический подход еще более сложным для структур, расположенных вблизи перехода между стволом головного и спинного мозга (рисунок 1Bi). Наконец, многие мишени, представляющие интерес в каудальном стволе мозга ишейном канатике, являются небольшими 2, требующими точных и воспроизводимых инъекций 8,9.
Альтернативный подход через cisterna magna обходит эти проблемы. Cisterna magna представляет собой большое пространство, которое простирается от затылочной кости до атласа (рисунок 1A, т. е. вторая позвоночная кость)10. Он заполнен спинномозговой жидкостью и покрыт твердой мозговой оболочкой10. Это пространство между затылочной костью и атласом открывается при антерофлексе головы. К нему можно получить доступ, перемещаясь между вышележащими парными животами мышцы longus capitis, обнажая дорсальную поверхность хвостового ствола мозга. Затем можно ориентироваться на области, представляющие интерес, на основе ориентиров самих этих регионов, если они расположены вблизи дорсальной поверхности; или с помощью obex, точки, где центральный канал открывается в IV желудочек, в качестве нулевой точки для координат, чтобы достичь более глубоких структур. Этот подход был успешно использован у различных видов, включая крысу11, кошку12, мышь 8,9 и нечеловеческого примата13 для нацеливания на вентральную респираторную группу, медуллярную медиальную ретикулярную формацию, ядро одиночных путей, область постремы или подъязычное ядро. Однако этот подход широко не используется, поскольку он требует знания анатомии, специализированного инструментария и более продвинутых хирургических навыков по сравнению со стандартным стереотаксическим подходом.
Здесь мы описываем пошаговый хирургический подход к достижению ствола мозга и верхней части шейного мозга через cisterna magna, визуализации ориентиров, установке нулевой точки (рисунок 2), а также оценке и оптимизации целевых координат для стереотаксической доставки микроинъекций в дискретные области ствола мозга и спинного мозга, представляющие интерес (рисунок 3). Затем мы обсудим преимущества и недостатки, связанные с этим подходом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Автор заявляет, что протокол следует руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре Бет Исраэль Диаконисс.
1. Подготовка хирургических инструментов и стереотаксического каркаса
ПРИМЕЧАНИЕ: Операция проводится в асептических условиях. Стерильность поддерживается с помощью метода стерильного наконечника.
- Установите стереотаксическую руку с микропипеткой или шприцем, заполненным инъекционным препаратом по выбору (аденоассоциированный вирус (AAV) или обычный индикатор) на стереотаксическую рамку и подготовьте адаптер мыши (рисунок 2A).
- Подготовьте автоклавные хирургические инструменты (Таблицу материалов) и поместите их на стерильную поверхность.
2. Индукция анестезии и подготовка мышей
- Включите O2 со скоростью 0,5 л/мин и установите испаритель изофлурана на 4,0, убедившись, что поток O2 поступает в индукционную коробку.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что индукционная коробка изофлунана помещена в капюшон и что изофлуран удаляется от места операции. - Поместите мышь (10-недельный самец C57BL/6J) в индукционную камеру.
- Как только дыхание замедлится, откройте индукционную камеру и слегка приподнимите мышь. Используйте машинки для стрижки для удаления волос с головы на плечи.
3. Позиционирование мыши в стереотаксическом кадре
- Переместите мышь к стереотаксической рамке и поместите нос в гибкий носовой конус. На этом этапе убедитесь, что поток O2 теперь направлен к носовому конусу.
- Поместите мышь в стереотаксическую рамку, используя только наушники.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ушные вкладыши ровные, а голова ровная. - Антерофлекс головку мыши под углом 90° путем ручного наведения носа. Чтобы закрепить это положение, поместите пластиковый барьер между стойками ушной перекладины адаптера мыши, параллельно стойкам. Плоская часть черепа служит ориентиром, подобно подходу плоского черепа в обычной стереотаксической хирургии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует чрезмерно сгибать головку (т.е. за пределы угла 90° между плоскостью лобной кости черепа и плоскостью поверхности стола), так как это препятствует потоку воздуха через верхние дыхательные пути. Если воздушный поток затруднен, переместите мышь, убедившись, что тело поддерживается под туловищем, а пластиковая карта установлена на 90° между плоскостью лобной кости черепа и плоскостью поверхности стола, как показано на рисунке 2A, C. - Поместите грелку под мышь, а затем убедитесь, что шея и остальная часть тела расположены на одном уровне (то есть примерно на 180° или параллельно столу). Набор инструментов, который удерживает пружинные ножницы, можно использовать для подъема тела в это положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен, так как хвостовой ствол мозга и верхний шейный канатик движутся в зависимости от положения, в отличие от более ростральных частей ЦНС, которые удерживаются на месте черепом. - Вводят однократную дозу 4 мг/кг мелоксикама с медленным высвобождением (SR) подкожно (s.c.) при объеме 2 мкл/г массы тела и наносят смазку на глаза.
- Очистите место хирургического разреза сначала с помощью 70% спиртовой прокладки для приготовления, затем с помощью прокладки для подготовки бетадина, а затем снова с помощью прокладки для подготовки спирта и дайте высохнуть.
- Поместите драпировку под корпус.
- Продезинфицируйте руки и наденьте стерильные перчатки.
- Поместите драпировку в месте операции.
4. Операция по доступу к cisterna magna
- Убедитесь, что мышь соответствующим образом обезболена, зажав пальцы ног или проверив рефлекс роговицы.
- Снизить уровень изофлурана до уровня технического обслуживания (2,0).
- Сделайте разрез 1-1,2 см хирургическим лезвием No10 от края затылочной кости по направлению к плечам одним плавным движением.
- Сделайте разрез в средней линии трапециевидной мышцы. Это обнажает парные мышцы longus capitis.
ПРИМЕЧАНИЕ: У мышей трапециевидная мышца представляет собой очень тонкую, почти прозрачную мышцу. Убедитесь, что вы остаетесь в средней линии и не врезаетесь в нижележащие мышцы, так как это вызовет ненужное кровотечение. - Поместите оба втягивающих крючка между парными мышцами longus capitis, один из которых ориентирован влево, а другой вправо. Вес гемостатов обеспечивает натяжение втягивающих крючков, которые могут быть изменены путем повторной регулировки положения гемостатов.
- Расположите хирургический микроскоп на месте, чтобы лучше визуализировать хирургическое поле.
- Используйте тупые щипцы ламинэктомии, чтобы отделить левый и правый живот парной мышцы longus capitis, начиная с затылка, где хорошо видна средняя линия. Направьте тупые щипцы через кость затылка по средней линии вниз к тому месту, где она встречается с цистерной твердой мозговой оболочки, а затем продолжайте через твердую мозговую оболочку к атласу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости разрезать парные мышцы longus capitis, так как ничто не удерживает их вместе в средней линии; это вызовет ненужное кровотечение. - Переставьте втягивающие устройства и отрегулируйте напряжение, переместив гемостаты, открыв вид cisterna magna.
- Используйте тупые щипцы ламинэктомии, чтобы отделить мышцы дальше по средней линии, чтобы получить хорошее окно обзора ствола мозга и мозжечка.
- Повторяйте шаги 4.7-4.9 по мере необходимости, пока мозжечок и ствол мозга не попадут ниже твердой мозговой оболочки.
- Используя тупые щипцы ламинэктомии, очищают твердую мозговую оболочку от мелких нитей соединительной ткани, перемещая щипцы от средней линии в боковом направлении, пока не появится четкое представление ствола мозга и создают больше бокового пространства, как это необходимо для цели.
5. Открытие цистернальной мембраны
- Используйте угловые щипцы Дюмона (#4/45), чтобы захватить твердую мозговую оболочку, которая простирается от затылочной кости до атласа. Возьмите твердое тело вблизи затылочной кости и используйте пружинные ножницы, чтобы сделать небольшое отверстие (~ 0,5-1,5 мм) в твердой мозговой оболочке.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом ростральном расположении пространство между стволом мозга и вышележащей твердой мозговой оболочкой является самым широким, что обеспечивает достаточно места для безопасных манипуляций с твердой мозговой оболочкой. - Используйте пружинные ножницы, чтобы поднять твердую мозговую оболочку и открыть твердую мозговую оболочку дальше. Размер окна зависит от целевого объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: При многократных продольных инъекциях или двусторонних инъекциях потребуется большее окно; небольшого окошка будет достаточно при совершении одиночных односторонних или среднелинейных инъекций. - Как только твердая мозговая оболочка будет открыта, слейте избыток спинномозговой жидкости стерильным кончиком сигнала.
6. Идентификация ориентиров и нулевой точки
- Посмотрите на дорсальную поверхность ствола мозга с подробными ориентирами через открытую твердую мозговую оболочку. Обекс, точка, где центральный канал открывается в IV желудочек, является стандартной передне-задней и медиолатеральной нулевой точкой.
7. Координаты цели
ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных целей мы включили список стандартных координат с передними задними (AP) и медиолатеральными (ML) координатами относительно координат брегмы нулевой точки и cisterna magna с координатами AP и ML относительно нулевой точки obex для облегчения перехода между методологиями (таблица 1). Координаты дорсовентрального (DV) относятся к поверхности мозга или мозжечка (стандартный подход) или поверхности ствола мозга или верхней части шейного канатика (cisterna magna approach) в точке входа AP и ML. Планирование должно быть сделано до операции.
- Используйте три набора координат для определения цели: AP, ML и DV. Из-за положения головы относительная ориентация структур ствола мозга варьируется в зависимости от местоположения.
- Для целевого расстояния >0,4 мм от каудального до обекса (рисунок 1B, зеленый) выполните следующие действия.
- AP: Используйте любой стандартный стереотаксический справочный атлас (например, Paxinos и Franklin atlas2) или серии тканей, вырезанные в поперечной плоскости, чтобы оценить расстояние AP между obex и целью.
- ML: Используйте любой стандартный стереотаксический эталонный атлас или серию тканей, вырезанную в поперечной плоскости, чтобы оценить расстояние ML между obex и мишенью.
- Д.В.: Оцените координаты относительно поверхности мозга или мозжечка в целевой точке AP и ML. Используйте любой стандартный стереотаксический эталонный атлас или серии тканей, вырезанные в поперечной плоскости, чтобы оценить расстояние между поверхностью ствола мозга по желаемым координатам AP и ML и целью.
- Для целевого расстояния <0,4 мм от каудального до обекса (рисунок 1B, оранжевый) выполните следующие действия.
- АП: Скорректируйте координаты, чтобы учесть антерофлексию ствола мозга. Для вентральных и ростральных координат точка входа ствола мозга AP будет более каудальной относительно координаты AP цели в стандартной плоскости.
- МЛ: Получение координат цели из стандартного стереотаксического эталонного атласа или тканевого ряда, вырезанного в поперечной плоскости. Координаты будут относительно визуализированной средней линии на целевом уровне точки доступа.
- Д.В.: Оцените координаты относительно поверхности ствола мозга в целевой точке AP и ML. Отрегулируйте DV с учетом антерофлексии ствола мозга. Для вентральных и ростральных координат координат DV будут больше, чем расстояние от дорсальной поверхности ствола мозга в стандартной плоскости.
- Для целевого расстояния >0,4 мм от каудального до обекса (рисунок 1B, зеленый) выполните следующие действия.
8. Инъекция мишени
- Опустите пипетку или шприц к мишени с помощью стереотаксического рычага и введите раствор как для стандартных стереотаксических подходов. Оставить на месте на 1-5 мин после инъекции, чтобы избежать следа иглы при использовании объемов между 3-50 нл. Затем поднимите пипетку или шприц с помощью стереотаксической руки.
- Повторите шаг 8.1. для нескольких целей.
9. Закрытие хирургического поля
- Осторожно снимите крючки с хирургического поля. Парные мышцы longus capitis будут возвращаться в нейтральное положение, полностью покрывая cisterna magna. Не закрывайте трапециевидную мышцу и твердую мозговую оболочку в средней линии, так как они слишком хрупкие, чтобы удерживать швы.
- Закройте кожу тремя нейлоновыми или полипропиленовыми швами (5-0 или 6-0).
10. Послеоперационный уход
- Выключите изофлуран и извлеките мышь из стереотаксической рамки. Поместите мышь в чистую клетку на грелку и наблюдайте, пока не проснетесь и не пошевелитесь.
- Следите за состоянием здоровья, весом и швами в послеоперационные дни 1-3. Снимите швы на 10-й день, если они еще не сняты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подход cisterna magna позволяет нацеливаться на каудальный ствол мозга и верхние структуры шейного канатика, которые в противном случае трудно достичь с помощью стандартных стереотаксических подходов или склонны к непоследовательному нацеливанию. Операция по достижению cisterna magna требует разрезов кожи, тонкого слоя трапециевидной мышцы и открытия твердой мозговой оболочки и поэтому хорошо переносится мышами. Он особенно эффективен и менее инвазивн при нацеливании на множественные (продольно диспергированные или двусторонние) участки, поскольку не требует сверления нескольких отверстий для заусенцев, как в стандартных стереотаксических подходах. У мышей мы обычно нацеливаемся на такие структуры, как подъязычное ядро9, вентральная дыхательная группа8 и прилегающая ретикулярная формация8 в каудальном стволе мозга, используя подход cisterna magna, как мы далее иллюстрируем для подъязычного ядра и вентромедиального продолговатого мозга (GiV) на рисунке 3. Например, подъязычное ядро представляет собой тонкий, но ростроковально вытянутый столб мотонейронов в дорсальном продолговатом мозге, и его ростральный полюс может быть нацелен с помощью стандартного подхода. Однако, поскольку координаты DV (~ 4,5 мм) в основном диктуются вышележащим мозжечком, при этом только 1,2-1,4 мм входит в ствол мозга, относительно небольшая разница в позиционировании головы мыши может поэтому легко привести к неуместной инъекции. Из-за близости этой цели к нулевой точке obex, она может быть более надежно нацелена с помощью подхода cisterna magna. Кроме того, каудальный конец подъязычного ядра, который простирается до перехода между стволом мозга и спинным мозгом, может быть нацелен на тот же подход cisterna magna, тогда как стандартный подход должен быть изменен, чтобы достичь такого каудального участка путем захвата подхода AP и корректировки координат, чтобы избежать затылочной кости и вышележащей мускулатуры шеи.
Чтобы определить точность подхода cisterna magna по сравнению со стандартным подходом, мы измерили расстояние между предполагаемыми и фактическими целевыми участками в переднезадней, медиолатеральной и дорсовентральной плоскостях для вентрального (вентромедиального продолговатого мозга; ГиА/В; N = 10) и дорсальный (NuXII; N = 16) регионов. Измерения проводились в поперечных срезах каудального ствола мозга (рисунок 3). Результаты (рисунок 4) показывают значительно меньшие погрешности в переднезадней, медиолатеральной и особенно дорсовентральной плоскостях для подхода cisterna magna по сравнению со стандартным подходом. Эти результаты подчеркивают повышенную точность подхода cisterna magna для этих целей. Мы включили стандартные стереотаксические координаты (относительно брегмы, полученные из Paxinos и Franklin 2, но оптимизированные для наших исследований) и cisterna magna координаты (относительно obex) в таблицу 1. Все эти координаты были оптимизированы и проверены, как показано для подъязычного ядра и вентромедиального продолговатого мозга на рисунке 3.
Рисунок 1: Схематическое изображение ключевых ориентиров, целевых областей и плоскости стереотаксического подхода cisterna magna. (A) Ключевые анатомические ориентиры и позиционирование в сагиттальной плоскости. (B) Области, которые могут быть достигнуты с помощью стандартного стереотаксического подхода, по сравнению со стереотаксическим подходом cisterna magna и связь с их ориентирами. i) Стандартный подход использует костные ориентиры брегма и лямбда, которые удалены от целевых регионов в пурпурном и фиолетовом цветах. Область пурпурного цвета (каудальный продолговатый мозг и верхний шейный канатик) труднодоступна из-за наклона затылочной кости и мышц шеи. Местность в фиолетовом цвете (ростральный продолговатый мозг) склонна к движению и удалена от традиционных ориентиров. ii) Подход cisterna magna подходит для доступа к каудальному продолговатому мозгу и верхнему шейному канату и имеет преимущества при изучении структур ствола мозга, которые организованы в продольные колонны, которые простираются от каудального продолговатого продолговатого мозга до уровня каудальных понсов. (C) Схема плоскостей различных стереотаксических справочных атласов применительно к подходу cisterna magna. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пошаговый схематический обзор стереотаксического подхода cisterna magna. (A) Адаптер мыши с ушными вкладышами, равномерно расположенными на самом высоком уровне, ротовой панелью в опущенном положении и пластиковой картой для закрепления головки переднего слоем под углом 90°. (B) Закрепите мышь в стереотаксической рамке с помощью ушных вкладышей и антерофлекса головки под углом 90° и удерживайте в нужном положении с помощью жесткой пластиковой карты со стереотаксической системой в качестве эталона. (C) Убедитесь, что тело приподнято, чтобы оно находилось в той же плоскости, что и затылок. Пальпать ключевые ориентиры. (D) Сделать разрез кожи от затылка до ростральной части плеч. (E) Сделать разрез в рапе трапециевидной мышцы. Убедитесь, что вы остаетесь в средней линии и не врезаетесь в нижележащие мышцы. (F) Определите среднюю линию между двумя животами длинной мышцы капита, начиная с затылка, и направьте щипцы ламинэктомии в каудальном направлении. (G) Поместите каждый из раневых крючков между брюшками мышцы longus capitis и переставьте до тех пор, пока цистерна великая не появится в поле зрения. (H) Определить костные ориентиры (затылочная кость, атлас), твердую мозговую оболочку, которая простирается между этими костными структурами, и лежащий в основе мозжечок и ствол мозга. Очистите твердые мозговые оболочки по мере необходимости, чтобы обнажить целевой уровень. (I) С помощью пружинных ножниц и тонких щипцов открываются твердые тела. (J) Определите обекс, который образует нулевую точку AP и ML. Переместите пипетку к координатам AP и ML по выбору. Опустите пипетку до тех пор, пока она не достигнет дорсальной поверхности ствола мозга. Это нулевая точка DV. Опустите пипетку до нужной координаты. (K) Снимите пипетку и раневые крючки и дайте мышцам longus capitis восстановить свое первоначальное положение. (L) Закройте рану и извлеките мышь из стереотаксической рамки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка целевых координат. Низкое увеличение микрофотографий хвостового ствола мозга. (A) Инъекция ретроградного индикатора субъединицы холерного токсина b (CTb; синий) в подъязычное ядро chAT-cre L10 GFP (зеленая) репортерской мыши (самка, 6 месяцев). Обратите внимание, что инъекция CTb ограничена подъязычным ядром. (B) Трансфекция глутаматергических клеток vGluT2-ires-cre L10 GFP репортерной (зеленой) мыши (самец, 2 месяца) условным антероградным индикатором (пурпурный) в вентральной части каудальной медиальной продолговатой продолговатой (каудальный полюс области GiV). (C) Условная ретроградная трассировка у мыши vGLuT2-ires-cre (самец, 2 месяца), показывающая трансфекцию TVA (пурпурных) глутаматергических нейронов и модифицированную инфекцию бешенства (зеленый) в каудальном медиальном продолговатом мозге (каудальный полюс области GiV). Вирус бешенства вводили в верхнюю часть шейного отдела спинного мозга. Внутренние ориентиры служат ориентиром. Аббревиатуры-cAmb: Компактное ядро комплекса Ambiguus; Ap: Площадь Пострема; DMV: Дорсальное моторное ядро блуждающего нерва; GiV: гигантоклеточное ядро, вентральная часть; IO: Нижняя олива; IRt: промежуточное ретикулярное ядро; LRN: Латеральное ретикулярное ядро; NuXII- Подъязычное ядро; сол: Ядро солитарного тракта; Sp5: Спинальное тройничное ядро; ВРГ: вентральная респираторная группа. Шкала: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение точности между стандартным и cisterna magna подходами. Среднее расстояние между центром намеченной цели и центром фактического участка в переднезадней плоскости (A), медиолатеральной плоскости (B) и дорсовентральной плоскости (C). Данные были получены от N = 13 взрослых мышей с использованием стандартного подхода и N = 13 взрослых мышей с использованием подхода cisterna magna. Радиус цели был установлен на уровне 30 мкм. Результаты показывают более высокую точность в переднезадней плоскости (t(24) = 2,08, p = 0,049; двуххвостый t-тест; альфа 0,05), медиолатеральной плоскости (t(24) = 2,55, p = 0,018; двуххвостый t-тест; альфа 0,05) и дорсовентральной плоскости (t(24) = 4,33, p = 0,0002; двуххвостый t-тест; альфа 0,05). Гистограммы представляют среднее значение со стандартным отклонением, а отдельные точки представляют значения в каждой мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Обзор стандартных и cisterna magna стереотаксических координат для нацеливания на каудальные структуры ствола мозга. Обратите внимание, что как для стандартного, так и для cisterna magna подходы координаты из атласа Paxinos и Franklin2 были скорректированы до тех пор, пока области, представляющие интерес, не были надлежащим образом нацелены, как проверено гистологией (рисунок 3). Кроме того, обратите внимание, что области в ретикулярной формации не имеют четко определенных границ и здесь обозначены как в Paxinos и Franklin2. Аббревиатуры-АП: переднезадняя. МЛ: медиолатеральный. Д.В.: дорсовентральный. CHAT: Холин ацетилтрансфераза; F: Женский; M: Мужской; M&F: Мужской и Женский; NA: не применимо; Pet1: плазмоцитома, выраженная фактором транскрипции 1; Sert: Транспортер серотонина, vGaT: Везикулярный транспортер ГАМК; vGluT2: Везикулярный транспортер глутамата 2; WT: Дикий тип. Все координаты указаны в миллиметрах (мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стандартная стереотаксическая хирургия обычно полагается на ориентиры черепа для расчета координат целевых участков в ЦНС1. Затем доступ к целевым участкам осуществляется через отверстия для заусенцев, которые просверливаются через череп1. Этот метод не идеален для каудального ствола мозга, так как целевые участки расположены далеко от ориентиров черепа в переднезадней и дорсовентральной плоскостях2, а также поскольку анатомия черепа и вышележащие мышцы делают доступ сложным6 (рисунок 1Bi). Наше исследование описывает альтернативный стереотаксический подход для доступа к целевым участкам в каудальном стволе головного мозга и верхней части спинного мозга, называемый подходом cisterna magna. Ключевыми особенностями, которые отличают этот метод от стандартного стереотаксического подхода, являются позиционирование с антерофлексией головы, чтобы открыть cisterna magna, и использование ключевых ориентиров ствола мозга на дорсальной поверхности ствола мозга в качестве ориентиров, таких как obex. Наши результаты показывают, что этот подход подходит для доставки небольших объемов (5-50 нЛ) индикаторов или аденоассоциированных вирусов (AAV) в дискретные структуры ствола мозга. Кроме того, использование контрольной точки, которая представляет собой ориентир ЦНС, а не костную структуру, и которая находится в непосредственной близости от намеченной цели, повышает воспроизводимость и точность для небольших мишеней и небольших объемов инъекций, что имеет отношение к схемному картированию и химиогенетическим исследованиям (рисунок 3)14,15.
Как и в случае с любым протоколом, подход cisterna magna имеет шаги, которые имеют решающее значение для достижения воспроизводимости. Как и при любом стереотаксическом подходе, который зависит от координат в трех разных плоскостях (переднезадней, медиолатеральной и дорсовентральной), позиционирование имеет решающее значение. Для подхода cisterna magna это включает в себя не только положение головы, которая должна быть антерофлексирована под углом 90°, но и положение тела, которое должно быть поднято так, чтобы хвостовой ствол мозга и верхний шейный канатик находились в одной плоскости. Еще одним важным шагом является избежание ненужных манипуляций, которые вызывают кровотечение, так как это будет препятствовать визуализации ключевых ориентиров. Существует две манипуляции, которые несут высокий риск кровотечения. Во-первых, твердая мозговая оболочка, покрывающая cisterna magna, покрыта относительно большой мышцей (longus capitis). Поскольку это парная мышца, с одним животом по обе стороны от средней линии, два живота этой мышцы нужно будет только аккуратно разделить в средней линии. Разрез этих мышц не нужен и вызовет кровотечение. Во-вторых, при успешном вскрытии твердой мозговой оболочки на верхней части спинного ствола мозга и верхней части шейного канатика станет видно переменное количество вен с переменным течением. Этих жил следует избегать, применяя незначительные корректировки координат (до 0,1 мм) или, если позволяет экспериментальная парадигма, выбирая другую цель.
Основным преимуществом подхода cisterna magna является то, что он обеспечивает доступ к стволу мозга и верхним шейным структурам, которые трудно достичь при использовании стандартной стереотаксической плоскости, поскольку они расположены вблизи каудального конца или просто каудально к затылочной кости. Кроме того, для мишеней в продолговатом мозге подход позволяет избежать поражения мозжечка, и поэтому эффекты поражения мозжечка или ложная маркировка через игольчатый тракт, которые могут повлиять на результаты исследования при использовании стандартной методологии, не являются проблемой. Еще одним преимуществом подхода cisterna magna является то, что дорсальная поверхность ствола мозга становится видимой. Это дает возможность использовать ориентир на дорсальной поверхности в качестве ориентира для координат. Кроме того, подход является гибким и может быть оптимизирован в зависимости от цели. Например, мы использовали ориентир средней линии, obex, в качестве точки отсчета. Однако при нацеливании на дорсальные структуры сама интересующая структура может диктовать ландшафт дорсальной поверхности. Например, наружное кунеатное ядро выступает дорсально и, таким образом, может быть визуализировано и введено напрямую. Для боковых мишеней, таких как вентральная дыхательная группа или неоднозначный комплекс, окно cisterna magna может быть увеличено в боковом направлении. Аналогичным образом, для нацеливания на верхние цервикальные структуры окно может быть расширено в сторону атласа. В то время как мы использовали адаптер мыши, размещенный в стереотаксическом кадре большого животного, подход может быть легко адаптирован к другим кадрам или настройкам, если соблюдаются ключевые шаги. Например, вместо пластиковой карты ротовая планка может быть размещена против переносицы, чтобы держать голову в устойчивом антерофлексированном положении. Стоит отметить, что координаты целевых участков ствола мозга с обексом в качестве нулевой точки, как указано в таблице 1, служат ориентиром, и корректировки могут быть указаны на основе напряжения мыши, возраста, пола, калибровки стереотаксической руки и техники позиционирования, аналогично корректировкам, которые необходимо внести при получении координат цели для стандартного подхода из справочного атласа. Это требует понимания плоскости подхода, особенно для более ростральных целей, как показано на рисунке 1. Тестирование координат может быть выполнено с использованием различных индикаторов, например, флуоресцентных шариков или флуоресцентно-помеченной субъединицы холерного токсина b для разных координат в одной и той же мыши. Гистологический анализ участков ствола мозга/спинномозговой ткани (не охваченных настоящим протоколом) затем дает обратную связь о локализации относительно объективных внутренних ориентиров 8,9,11,16 или для сравнения со справочным атласом. Затем координаты могут быть скорректированы, снова протестированы и доработаны.
Подход cisterna magna также имеет ограничения. Области ЦНС, которые могут быть достигнуты с помощью этого подхода, ограничены каудальным понсом, продолговатым мозгом и верхним шейным канатиком. В то время как к каудальным понам можно легко получить доступ с помощью стандартного подхода, подход cisterna magna имеет преимущества при изучении подразделений продольно ориентированных структур, которые простираются от продолговатого мозга до каудального понса, как в случае с подразделениями в ретикулярной формации. Другое относительное ограничение возникает при использовании этого подхода во второй раз у той же мыши, например, при модифицированном отслеживании бешенства14. Наличие рубцовой ткани может увеличить продолжительность операции или скрыть незначительные ориентиры. Однако в наших руках этот метод все же превосходит стандартный стереотаксический подход в данном случае, так как место первой инъекции может быть задокументировано по отношению к положению вен других уникальных ориентиров, что позволяет легко найти точную точку входа обратно. Хотя этот подход превосходит для отслеживания исследований в каудальном мозге и верхней части спинного мозга, он не может быть использован для хронической имплантации оборудования. Поэтому для исследований оптогенетики in-vivo и визуализации кальция, которые требуют имплантации оптических волокон17 , подход cisterna magna может быть использован сначала для доставки AAV к целевому участку, а затем вторая операция с использованием стандартного подхода к инструментальным мышам с волокнами или канюлями. Этот подход позволяет сохранить целевой сайт дискретным, в то время как размещение оптоволоконного / аппаратного обеспечения более снисходительно (то есть может быть менее точным) из-за относительно большого размера оборудования. Наконец, подход cisterna magna требует более продвинутых хирургических навыков, чем стандартный стереотаксический подход. Вместо того, чтобы распознавать простые костные ориентиры, это требует понимания более сложных стволов мозга и опорно-двигательного аппарата. Также, как и при любой деликатной операции, успех и эффективность процедуры зависят от правильного инструментария, который находится в отличном состоянии. Этот протокол решает последние проблемы и может быть использован в качестве подробного руководства экспериментаторами.
В заключение, подход cisterna magna дополняет стандартный стереотаксический подход и обеспечивает многочисленные преимущества при нацеливании на хвостовой ствол мозга и верхний шейный канатик, к которым нелегко получить доступ с помощью стандартного стереотаксического подхода. Он использует контрольные точки, которые являются ЦНС, а не костные ориентиры, которые находятся в непосредственной близости от намеченных целей, повышая воспроизводимость и точность. Это делает подход особенно ценным, когда небольшие объемы инъекций должны быть доставлены на дискретные участки в контексте подробного картирования или хемогенетических исследований. Этот подход также актуален для функциональной хемогенетической, оптогенетической, волоконной фотометрии или очагов поражения, когда вирус или токсин AAV доставляется к мишени с моторной функцией или сенсомоторной интеграцией в качестве считывания: он избегает прохождения через мозжечок для мишеней в продолговатом мозге и, следовательно, ограничивает его вмешательство в результаты исследования. С точки зрения благополучия животных, процедура не требует сверления нескольких отверстий для заусенцев для двустороннего или продольного доступа к местам, что сокращает продолжительность операции и инвазивность процедуры. Хотя мы подробно изложили подход для мышей, те же принципы применимы и к другим видам 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01 NS079623, P01 HL149630 и P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004).
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
