Summary
عادة ما تنطوي الجراحة المجسمة لاستهداف مواقع الدماغ في الفئران على الوصول من خلال عظام الجمجمة وتسترشد بمعالم الجمجمة. هنا نحدد نهجا مجسما بديلا لاستهداف جذع الدماغ الذيلي والحبل الشوكي العنقي العلوي عبر الصهريج الكبير الذي يعتمد على التصور المباشر لمعالم جذع الدماغ.
Abstract
عادة ما تسترشد الجراحة المجسمة لاستهداف مواقع الدماغ لدى الفئران بمعالم الجمجمة. ثم يتم الحصول على الوصول عن طريق ثقوب لدغ حفر من خلال الجمجمة. يمكن أن يكون هذا النهج القياسي تحديا للأهداف في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي بسبب التحديات التشريحية المحددة لأن هذه المواقع بعيدة عن معالم الجمجمة ، مما يؤدي إلى عدم الدقة. هنا نوجز نهجا مجسما بديلا عبر cisterna magna الذي تم استخدامه لاستهداف المناطق المنفصلة ذات الأهمية في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي. يمتد الصهريج الضخم من العظم القذالي إلى الأطلس (أي العظم الفقري الثاني) ، ويمتلئ بالسائل الدماغي الشوكي ، وتغطيه الأم الجافية. يوفر هذا النهج طريقا قابلا للتكرار للوصول إلى هياكل مختارة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) يصعب الوصول إليها بسبب الحواجز التشريحية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتصور المباشر لمعالم جذع الدماغ على مقربة من المواقع المستهدفة ، مما يزيد من الدقة عند توصيل كميات حقن صغيرة إلى المناطق المقيدة ذات الأهمية في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي. أخيرا ، يوفر هذا النهج فرصة لتجنب المخيخ ، والذي يمكن أن يكون مهما للدراسات الحركية والحسية الحركية.
Introduction
عادة ما تتضمن الجراحة المجسمة القياسية لاستهداف مواقع الدماغ في الفئران1 تثبيت الجمجمة باستخدام مجموعة من قضبان الأذن وشريط الفم. ثم يتم تقدير الإحداثيات بناء على الأطالس المرجعية 2,3 ، ومعالم الجمجمة ، وهي bregma (النقطة التي تلتقي فيها خيوط العظام الأمامية والجدارية) أو lambda (النقطة التي تلتقي فيها خيوط العظام الجدارية والقذالية. الشكل 1 ألف، باء). من خلال ثقب لدغ في الجمجمة فوق الهدف المقدر ، يمكن بعد ذلك الوصول إلى المنطقة المستهدفة ، إما لتوصيل الحقن المجهرية أو الأجهزة باستخدام القنية أو الألياف البصرية. بسبب الاختلاف في تشريح هذه الغرز والأخطاء في توطين bregma أو lambda 4,5 ، يختلف موضع نقاط الصفر فيما يتعلق بالدماغ من إلى آخر. في حين أن الأخطاء الصغيرة في الاستهداف، التي تنتج عن هذا التباين، ليست مشكلة بالنسبة للأهداف الكبيرة أو القريبة، فإن تأثيرها أكبر بالنسبة للمناطق الأصغر ذات الأهمية البعيدة عن نقاط الصفر في المستويات الأمامية الخلفية أو الظهرية البطنية و / أو عند دراسة الحيوانات ذات الأحجام المتفاوتة بسبب العمر و / أو الإجهاد و / أو الجنس. هناك العديد من التحديات الإضافية الفريدة من نوعها للنخاع المستطيل والحبل العنقي العلوي. أولا ، ترتبط التغيرات الصغيرة في الإحداثيات الأمامية الخلفية بتغيرات كبيرة في الإحداثيات الظهرية البطنية بالنسبة إلى الجافية ، بسبب موقع وشكل المخيخ (الشكل 1Bi)2،6،7. ثانيا ، لا يوجد الحبل العنقي العلوي داخل الجمجمة2. ثالثا ، يجعل الوضع المائل للعظم القذالي والطبقة العلوية من عضلات الرقبة2 النهج المجسمة القياسي أكثر تحديا للهياكل الموجودة بالقرب من الانتقال بين جذع الدماغ والحبل الشوكي (الشكل 1Bi). أخيرا ، العديد من الأهداف ذات الأهمية في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي صغيرة2 ، تتطلب حقن دقيقة وقابلة للتكرار 8,9.
نهج بديل من خلال cisterna magna يتحايل على هذه المشاكل. الصهريج الضخم هو مساحة كبيرة تمتد من العظم القذالي إلى الأطلس (الشكل 1 أ، أي العظم الفقري الثاني)10. وهي مليئة بالسائل الدماغي الشوكي وتغطيها الأم الجافية10. تفتح هذه المسافة بين العظم القذالي والأطلس عند ثني الرأس. يمكن الوصول إليه عن طريق التنقل بين البطون المقترنة المتراكبة لعضلة الرأس الطويلة ، مما يعرض السطح الظهري لجذع الدماغ الذيلي. ويمكن بعد ذلك استهداف المناطق ذات الأهمية استنادا إلى معالم هذه المناطق نفسها إذا كانت تقع بالقرب من السطح الظهري؛ أو باستخدام obex ، النقطة التي تفتح فيها القناة المركزية في البطين الرابع ، كنقطة صفر للإحداثيات للوصول إلى هياكل أعمق. تم استخدام هذا النهج بنجاح في مجموعة متنوعة من الأنواع ، بما في ذلك الفئران11 ، القط12 ، الفأر 8,9 ، والرئيسيات غير البشرية13 لاستهداف المجموعة التنفسية البطنية ، أو التكوين الشبكي الإنسي النخاعي ، أو نواة الجهاز الانفرادي ، أو منطقة ما بعد الريما ، أو النواة تحت اللسان. ومع ذلك ، لا يستخدم هذا النهج على نطاق واسع لأنه يتطلب معرفة علم التشريح ، ومجموعة أدوات متخصصة ، ومهارات جراحية أكثر تقدما مقارنة بالنهج التجسيمي القياسي.
هنا نصف نهجا جراحيا خطوة بخطوة للوصول إلى جذع الدماغ والحبل العنقي العلوي عبر الجذع العظمي ، وتصور المعالم ، وتعيين نقطة الصفر (الشكل 2) ، وتقدير وتحسين الإحداثيات المستهدفة للتوصيل المجسمي للحقن المجهري في مناطق جذع الدماغ والحبل الشوكي المنفصلة ذات الأهمية (الشكل 3). ثم نناقش المزايا والعيوب المتعلقة بهذا النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يعلن المؤلف أن البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مركز بيت إسرائيل ديكونيس الطبي.
1. إعداد الأدوات الجراحية والإطار المجسم.
ملاحظة: يتم إجراء الجراحة في ظل ظروف معقمة. يتم الحفاظ على العقم باستخدام تقنية الطرف المعقم.
- قم بتثبيت الذراع المجسمة باستخدام ماصة أو حقنة صغيرة مملوءة بحقن من اختيارك (فيروس مرتبط بالغدي (AAV) أو متتبع تقليدي) على الإطار المجسمي وقم بإعداد محول الماوس (الشكل 2A).
- تحضير الأدوات الجراحية المعقمة (جدول المواد) ووضعها على سطح معقم.
2. تحريض التخدير وإعداد الماوس
- قم بتشغيل O 2 عند 0.5 لتر / دقيقة واضبط مبخر الأيزوفلوران على 4.0 ، مع التأكد من أن تدفق O2 إلى صندوق الحث.
تنبيه: تأكد من وضع صندوق تحريض الأيزوفلوران في غطاء محرك السيارة وأن الإيسوفلوران يتم مسحه بعيدا عن موقع الجراحة. - ضع الماوس (ذكر C57BL/6J البالغ من العمر 10 أسابيع) في غرفة الحث.
- بمجرد أن يتباطأ التنفس ، افتح غرفة الحث ، وارفع الماوس قليلا. استخدم ماكينات قص الشعر لإزالة الشعر من الرأس إلى الكتفين.
3. وضع الماوس في الإطار المجسم.
- حرك الماوس إلى الإطار المجسم، وضع الأنف في مخروط أنف مرن. في هذه المرحلة ، تأكد من توجيه تدفق O2 الآن إلى مخروط الأنف.
- ضع الماوس في الإطار المجسمة باستخدام قضبان الأذن فقط.
ملاحظة: تأكد من أن قضبان الأذن متساوية وأن الرأس مستو. - Anteroflex رأس الماوس إلى زاوية 90 درجة عن طريق توجيه الأنف يدويا. لتأمين هذا الموضع ، ضع حاجزا بلاستيكيا بين أعمدة شريط الأذن لمحول الماوس ، بالتوازي مع الأعمدة. يعمل الجزء المسطح من الجمجمة كمرجع ، على غرار نهج الجمجمة المسطحة في الجراحة المجسمة التقليدية.
ملاحظة: لا تقم بثني الرأس (أي أبعد من زاوية 90 درجة بين مستوى عظم الجمجمة الأمامي ومستوى سطح الطاولة) لأن هذا يعيق تدفق الهواء عبر مجرى الهواء العلوي. إذا تم إعاقة تدفق الهواء ، فقم بإعادة وضع الماوس ، مع التأكد من دعم الجسم أسفل الجذع وتعيين بطاقة بلاستيكية عند 90 درجة بين مستوى عظم الجمجمة الأمامي ومستوى سطح الطاولة كما هو موضح في الشكل 2A ، C. - ضع وسادة التدفئة أسفل الماوس، ثم تأكد من وضع الرقبة وبقية الجسم على نفس المستوى (أي عند حوالي 180 درجة أو بالتوازي مع الطاولة). يمكن استخدام صندوق الأدوات الذي يحمل مقص الزنبرك لرفع الجسم إلى هذا الموقف.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لأن جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي يتحركان اعتمادا على الموضع ، على عكس الأجزاء الأكثر سطحية من الجهاز العصبي المركزي التي يتم تثبيتها في مكانها بواسطة الجمجمة. - حقن جرعة واحدة من 4 ملغ / كغ ميلوكسيكام بطيئة الإطلاق (SR) تحت الجلد (s.c.) بحجم 2 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم ووضع مواد التشحيم على العينين.
- نظف موقع الشق الجراحي أولا باستخدام وسادة إعداد الكحول بنسبة 70٪ ، ثم باستخدام وسادة إعداد البيتادين ، ثم مرة أخرى باستخدام وسادة إعداد الكحول واتركها تجف.
- ضع ستارة تحت الجسم.
- تطهير اليدين ووضع قفازات معقمة.
- ضع ستارة في موقع الجراحة.
4. جراحة للوصول إلى الصهريج ماجنا
- تأكد من تخدير الماوس بشكل مناسب عن طريق قرص أصابع القدم أو التحقق من رد فعل القرنية.
- تقليل الايسوفلوران إلى مستويات الصيانة (2.0).
- قم بعمل شق 1-1.2 سم باستخدام الشفرة الجراحية رقم 10 من حافة العظم القذالي باتجاه الكتفين في حركة واحدة سلسة.
- قم بعمل شق في خط الوسط لعضلة شبه منحرفة. هذا يكشف عضلات الرأس الطويلة المقترنة.
ملاحظة: في الفئران ، تكون عضلة شبه منحرف عضلة رقيقة جدا وشفافة تقريبا. تأكد من البقاء في خط الوسط وعدم قطع العضلات الكامنة لأن هذا سوف يسبب نزيفا غير ضروري. - ضع كلا خطافي التراجع بين عضلات التهاب الرأس الطويل المقترنة ، أحدهما موجه إلى اليسار والآخر إلى اليمين. يوفر وزن مرقئ الدم توترا لخطافات التراجع التي يمكن تعديلها عن طريق إعادة ضبط موضع مرقئات.
- ضع المجهر الجراحي في مكانه لتصور المجال الجراحي بشكل أفضل.
- استخدم ملقط استئصال الصفيحة الفقرية الحاد لفصل البطنين اليسرى واليمنى لعضلة الرأس الطويلة المقترنة ، بدءا من occiput ، حيث يكون خط الوسط مرئيا بسهولة. قم بتوجيه الملقط الحاد عبر عظم الأوكسيبوت في خط الوسط وصولا إلى حيث يلتقي بالأم الجافية الصهريجية ، ثم استمر عبر الأم الجافية إلى الأطلس.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لقطع عضلات الرأس الطويلة المقترنة حيث لا شيء يجمعها معا في خط الوسط. القيام بذلك سوف يسبب نزيفا لا لزوم له. - إعادة وضع المنسحبين وضبط التوتر عن طريق إعادة وضع مرقئ الدم ، وفتح وجهة نظر سيسترنا ماجنا.
- استخدم ملقط استئصال الصفيحة الفقرية الحاد لفصل العضلات بشكل أكبر في خط الوسط للحصول على نافذة رؤية جيدة لجذع الدماغ والمخيخ.
- كرر الخطوات 4.7-4.9 حسب الحاجة حتى يظهر المخيخ وجذع الدماغ أسفل الجافية.
- باستخدام ملقط استئصال الصفيحة الفقرية الحاد ، قم بمسح جافا الخيوط الصغيرة للنسيج الضام عن طريق تحريك الملقط من خط الوسط في اتجاه جانبي ، حتى يكون هناك رؤية واضحة لجذع الدماغ وخلق مساحة جانبية أكبر ، حسب الحاجة للهدف.
5. فتح الغشاء الخزان
- استخدم ملقط Dumont ذو الزاوية (# 4/45) للاستيلاء على الجعة ، التي تمتد من العظم القذالي إلى الأطلس. أمسك الجافية بالقرب من العظم القذالي واستخدم مقص الزنبرك لعمل فتحة صغيرة (~ 0.5 إلى 1.5 مم) في الجافية.
ملاحظة: في هذا الموقع على السطح ، تكون المسافة بين جذع الدماغ والجافية العلوية أوسع ، مما يوفر مساحة واسعة للتلاعب الآمن بالجافية. - استخدم مقص الزنبرك لرفع الجافية وفتح الجافية أكثر. يعتمد حجم النافذة على الهدف.
ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى نافذة أكبر عند إجراء حقن طولية متعددة أو حقن ثنائية. ستكون النافذة الصغيرة كافية عند إجراء حقن أحادية الجانب أو خط الوسط. - بمجرد فتح الجافية ، قم بتصريف السائل الدماغي الشوكي الزائد بطرف جديلة معقم.
6. تحديد المعالم ونقطة الصفر
- شاهد السطح الظهري لجذع الدماغ مع معالم مفصلة من خلال الجافية المفتوحة. ال obex ، النقطة التي تفتح فيها القناة المركزية في البطين الرابع ، هي نقطة الصفر الأمامية والخلفية والمتوسطة.
7. إحداثيات الهدف
ملاحظة: بالنسبة لأهداف مختلفة، قمنا بتضمين قائمة بالإحداثيات القياسية مع الإحداثيات الخلفية الأمامية (AP) والمتوسطية (ML) بالنسبة لإحداثيات bregma ذات النقطة الصفرية وإحداثيات cisterna magna مع إحداثيات AP و ML بالنسبة إلى obex نقطة الصفر لتسهيل الانتقال بين المنهجيات (الجدول 1). الإحداثيات الظهرية البطنية (DV) هي نسبة إلى سطح الدماغ أو المخيخ (النهج القياسي) أو سطح جذع الدماغ أو الحبل العنقي العلوي (نهج الجذع العظمي) عند نقطة دخول AP و ML. يجب أن يتم التخطيط قبل الجراحة.
- استخدم المجموعات الثلاث من الإحداثيات لتحديد الهدف: AP و ML و DV. بسبب وضع الرأس ، يختلف الاتجاه النسبي لهياكل جذع الدماغ حسب الموقع.
- للمسافة المستهدفة >0.4 مم من الذيلي إلى obex (الشكل 1B ، الأخضر) قم بما يلي.
- AP: استخدم أي أطلس مرجعي مجسمة قياسي (على سبيل المثال ، Paxinos و Franklin Atlas2) أو سلسلة الأنسجة المقطوعة في المستوى العرضي لتقدير مسافة AP بين obex والهدف.
- ML: استخدم أي أطلس مرجعي مجسمة قياسي أو سلسلة أنسجة مقطوعة في المستوى العرضي لتقدير مسافة ML بين obex والهدف.
- DV: تقدير الإحداثيات المتعلقة بسطح الدماغ أو المخيخ عند نقطة الهدف AP و ML. استخدم أي أطلس مرجعي مجسمة قياسي أو سلسلة أنسجة مقطوعة في المستوى العرضي لتقدير المسافة بين سطح جذع الدماغ عند إحداثيات AP و ML المطلوبة والهدف.
- بالنسبة للمسافة المستهدفة <0.4 مم من الذيلية إلى obex (الشكل 1B ، برتقالي) ، قم بما يلي.
- AP: اضبط الإحداثيات لحساب الانثناء الأمامي لجذع الدماغ. بالنسبة للإحداثيات البطنية والسطحية ، ستكون نقطة دخول جذع الدماغ AP أكثر ذيلية بالنسبة لإحداثيات AP المستهدفة في المستوى القياسي.
- ML: اشتق إحداثيات الهدف من أطلس مرجعي مجسمة قياسي أو سلسلة أنسجة مقطوعة في المستوى المستعرض. ستكون الإحداثيات بالنسبة إلى خط الوسط المرئي على مستوى AP المستهدف.
- DV: تقدير الإحداثيات المتعلقة بسطح جذع الدماغ عند نقطة الهدف AP و ML. اضبط DV لحساب الانثناء الأمامي لجذع الدماغ. بالنسبة للإحداثيات البطنية والسطحية ، ستكون إحداثيات DV أكبر من المسافة من السطح الظهري لجذع الدماغ في المستوى القياسي.
- للمسافة المستهدفة >0.4 مم من الذيلي إلى obex (الشكل 1B ، الأخضر) قم بما يلي.
8. حقن الهدف
- خفض الماصة أو المحقنة إلى الهدف باستخدام الذراع المجسمة وحقن الحل كما هو الحال بالنسبة للنهج المجسمة القياسية. اتركيه في مكانه لمدة 1-5 دقائق بعد الحقن ، لتجنب مسار الإبرة عند استخدام أحجام تتراوح بين 3-50 نانولتر. ثم ارفع الماصة أو المحقنة باستخدام الذراع المجسمة.
- كرر الخطوة 8.1. لأهداف متعددة.
9. إغلاق المجال الجراحي
- إزالة السنانير بعناية من المجال الجراحي. سوف تعود عضلات التهاب الرأس الطويل المقترنة إلى وضع محايد ، وتغطي بالكامل السيستيرنا ماجنا. لا تغلق عضلة شبه منحرف والأم الجافية في خط الوسط لأنها هشة للغاية بحيث لا يمكن الاحتفاظ بالغرز.
- أغلق الجلد بثلاث خيوط من النايلون أو البولي بروبيلين (5-0 أو 6-0).
10. رعاية ما بعد الجراحة
- قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران وإزالة الماوس من الإطار المجسم. ضع الماوس في قفص نظيف على وسادة تدفئة وراقب حتى يستيقظ ويتحرك.
- مراقبة الحالة الصحية والوزن والغرز في أيام ما بعد الجراحة 1-3. قم بإزالة الغرز في اليوم 10 إذا لم تتم إزالتها بالفعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتيح نهج cisterna magna استهداف جذع الدماغ الذيلي وهياكل الحبل العنقي العلوي التي يصعب الوصول إليها عبر النهج المجسمة القياسية أو المعرضة للاستهداف غير المتسق. تتطلب الجراحة للوصول إلى الصهريج ماجنا شقوقا في الجلد ، وطبقة رقيقة من عضلة شبه منحرف ، وفتح الأم الجافية ، وبالتالي فهي جيدة التحمل من قبل الفئران. وهي فعالة بشكل خاص وأقل توغلا عند استهداف مواقع متعددة (مشتتة طوليا أو ثنائيا) ، لأنها لا تتطلب حفر ثقوب لدغ متعددة كما هو الحال في النهج المجسمة القياسية. في الفئران ، استهدفنا بشكل روتيني هياكل مثل النواة تحت اللسان9 ، والمجموعة التنفسية البطنية8 ، والتكوين الشبكي المجاور8 في جذع الدماغ الذيلي باستخدام نهج cisterna magna ، كما نوضح بشكل أكبر للنواة تحت اللسان والنخاع البطني (GiV) في الشكل 3. على سبيل المثال ، النواة تحت اللسان هي عمود نحيف ولكنه ممدود بشكل روستروكوسيلي من الخلايا العصبية المتحركة في النخاع الظهري المستطيل ويمكن استهداف قطبه السطحي من خلال نهج قياسي. ومع ذلك ، نظرا لأن إحداثيات DV (~ 4.5 مم) تمليها في الغالب المخيخ العلوي مع دخول 1.2-1.4 مم فقط إلى جذع الدماغ ، فإن اختلافا صغيرا نسبيا في تحديد موضع رأس الفأر يمكن أن يؤدي بسهولة إلى حقن في غير محله. نظرا لقرب هذا الهدف من obex نقطة الصفر ، يمكن استهدافه بشكل أكثر موثوقية عبر نهج cisterna magna. علاوة على ذلك ، يمكن استهداف النهاية الذيلية للنواة تحت اللسان التي تمتد حتى الانتقال بين جذع الدماغ والحبل الشوكي بنفس نهج cisterna magna ، في حين يجب تعديل النهج القياسي للوصول إلى مثل هذا الموقع الذيلي عن طريق الصيد بنهج AP وتعديل الإحداثيات لتجنب العظام القذالية وعضلات الرقبة الفوقية.
من أجل تحديد دقة نهج cisterna magna مقابل النهج القياسي ، قمنا بقياس المسافة بين المواقع المستهدفة المقصودة والفعلية في المستويات الأمامية الخلفية والمتوسطة والظهرية البطنية للنخاع البطني (النخاع البطني; جيا / V; N = 10) والظهرية (NuXII; N = 16) منطقة. تم إجراء القياسات في أقسام عرضية من جذع الدماغ الذيلي (الشكل 3). تظهر النتائج (الشكل 4) أخطاء أصغر بكثير في المستويات الأمامية الخلفية والمتوسطة الجانبية وخاصة الظهرية البطنية لنهج cisterna magna مقارنة بالنهج القياسي. وتسلط هذه النتائج الضوء على الدقة المحسنة لنهج سيسترنا ماجنا لهذه الأهداف. لقد أدرجنا إحداثيات مجسمة قياسية (بالنسبة إلى bregma ، مشتقة من Paxinos و Franklin 2 ، ولكنها محسنة لدراساتنا) وإحداثيات cisterna magna (بالنسبة إلى obex) في الجدول 1. تم تحسين جميع هذه الإحداثيات والتحقق منها كما هو موضح للنواة تحت اللسان والنخاع البطني في الشكل 3.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للمعالم الرئيسية والمناطق المستهدفة ومستوى نهج السيستيرنا ماجنا المجسم . (أ) المعالم التشريحية الرئيسية وتحديد المواقع في المستوى السهمي. (ب) المجالات التي يمكن الوصول إليها من خلال النهج التجسيمي المعياري مقابل النهج التجسيمي الستيرنجي الضخم وعلاقته بنقاطها المرجعية. ط) يستخدم النهج القياسي المعالم العظمية bregma و lambda ، والتي تبعد عن المناطق المستهدفة باللون الأرجواني والأرجواني. يصعب الوصول إلى المنطقة الأرجوانية (النخاع الذيلي المستطيل والحبل العنقي العلوي) بسبب عضلات العظام القذالية والرقبة المائلة. المنطقة باللون الأرجواني (النخاع المستطيل السطحي) عرضة للحركة وبعيدة عن المعالم التقليدية. ب) نهج سيستيرنا ماجنا مناسب للوصول إلى النخاع الذيلي المستطيل والحبل العنقي العلوي وله مزايا عند دراسة هياكل جذع الدماغ التي يتم تنظيمها في أعمدة طولية تمتد من النخاع الذيلي المستطيل بشكل علوي ، حتى مستوى البونس الذيلي. (ج) تخطيط طائرات مختلف الأطالس المرجعية المجسمة فيما يتعلق بنهج سيسترنا ماجنا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية خطوة بخطوة على نهج سيستيرنا ماجنا المجسم . (أ) محول الماوس مع قضبان الأذن الموضوعة بالتساوي على أعلى مستوى ، وشريط الفم في وضع منخفض ، وبطاقة بلاستيكية لتأمين الرأس الأمامي بزاوية 90 درجة. (ب) قم بتثبيت الماوس في الإطار المجسم، باستخدام قضبان الأذن وقم بتثبيت الرأس عند 90 درجة واحتفظ به في موضعه عبر بطاقة بلاستيكية صلبة، مع الإطار المجسم. (ج) تأكد من أن الجسم مرتفع بحيث يكون في نفس مستوى الأذن. جس المعالم الرئيسية. (د) إجراء شق في الجلد من الأوكسيبوت إلى الجزء العلوي من الكتفين. (ه) إجراء شق في راب العضلة شبه المنحرفة. تأكد من البقاء في خط الوسط وعدم قطع العضلات الأساسية. (و) تحديد خط الوسط بين بطني عضلة الرأس الطويلة ، بدءا من القرد ، وتوجيه ملقط استئصال الصفيحة الفقرية في اتجاه ذيلي. (ز) ضع كل خطاف من خطافات الجرح بين بطون عضلة الرأس الطويلة وأعد وضعها حتى تظهر الجذع الكبير. (ح) تحديد المعالم العظمية (العظم القذالي ، الأطلس) ، الأم الجافية التي تمتد بين هذه الهياكل العظمية ، والمخيخ الأساسي وجذع الدماغ. نظف الأم الجافية حسب الحاجة لكشف المستوى المستهدف. (I) استخدام مقص الربيع والملقط الناعم يفتح الجافية. (ي) تحديد obex ، الذي يشكل نقطة الصفر AP و ML. انقل الماصة إلى إحداثيات AP و ML التي تختارها. اخفض الماصة حتى تصل إلى السطح الظهري لجذع الدماغ. هذه هي نقطة الصفر DV. خفض ماصة إلى الإحداثي المطلوب. (K) قم بإزالة الماصة وخطافات الجرح ودع عضلات الرأس الطويلة تستأنف وضعها الأصلي. (L) أغلق الجرح وأزل الماوس من الإطار المجسم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم إحداثيات الهدف. صور مجهرية ضوئية منخفضة التكبير لجذع الدماغ الذيلي. (أ) حقن الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا الرجعي المقتفي ب (CTb؛ أزرق) في النواة تحت اللسان لفأر مراسل ChAT-cre L10 GFP (أخضر) (أنثى، عمرها 6 أشهر). لاحظ أن حقن CTb يقتصر على النواة تحت اللسان. (ب) نقل خلايا الغلوتاماتيرجيك لفأر مراسل vGluT2-ires-cre L10 GFP (أخضر) (ذكر، يبلغ من العمر شهرين) مع مقتفي أمامي شرطي (أرجواني) في الجزء البطني من النخاع الإنسي الذيلي المستطيل (القطب الذيلي لمنطقة GiV). (ج) التتبع الرجعي المشروط في فأر vGLuT2-ires-cre (ذكر، عمره شهران) يظهر نقل TVA (أرجواني) للخلايا العصبية الغلوتاماتية وعدوى داء الكلب المعدلة (الأخضر) في النخاع الإنسي الذيلي المستطيل (القطب الذيلي لمنطقة GiV). تم حقن فيروس داء الكلب في الحبل الشوكي العنقي العلوي. المعالم الداخلية بمثابة توجيه. الاختصارات-cAmb: النواة المدمجة للمجمع الغامض. أسوشيتد برس: منطقة بوستريما; DMV: النواة الحركية الظهرية للمبهم. GiV: نواة الخلايا العملاقة ، الجزء البطني ؛ IO: الزيتون الأدنى. ه: النواة الشبكية المتوسطة. LRN: نواة شبكية جانبية. NuXII- نواة تحت اللسان. سول: نواة المسالك الانفرادية. Sp5: النواة الثلاثية التوائم الشوكية. VRG: مجموعة الجهاز التنفسي البطني. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنة الدقة بين النهج القياسي ونهج سيسترنا ماجنا. متوسط المسافة بين مركز الهدف المقصود ومركز الموقع الفعلي في المستوى الأمامي الخلفي (A) والمستوى المتوسط الجانبي (B) والمستوى الظهري البطني (C). تم الحصول على البيانات من N = 13 فئران بالغة باستخدام نهج قياسي و N = 13 فئران بالغة باستخدام نهج cisterna magna. تم تعيين نصف قطر الهدف عند 30 ميكرومتر. تظهر النتائج دقة أعلى في المستوى الأمامي الخلفي (t(24) = 2.08 ، p = 0.049 ؛ اختبار t ثنائي الذيل ؛ alpha 0.05) ، المستوى المتوسط (t(24) = 2.55 ، p = 0.018 ؛ اختبار t ثنائي الذيل ؛ alpha 0.05) والمستوى الظهري البطني (t(24) = 4.33 ، p = 0.0002 ؛ اختبار t ثنائي الذيل ؛ ألفا 0.05). تمثل الرسوم البيانية الشريطية المتوسط مع الانحراف المعياري وتمثل النقاط الفردية القيم في كل ماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: نظرة عامة على الإحداثيات المجسمة القياسية و cisterna magna لاستهداف هياكل جذع الدماغ الذيلية. ويرجى ملاحظة أنه بالنسبة لكل من النهج القياسي ونهج سيستيرنا ماجنا، تم تعديل الإحداثيات من أطلس باكسينوس وفرانكلين2 إلى أن تم استهداف المناطق ذات الأهمية بشكل مناسب كما تم التحقق منها من خلال علم الأنسجة (الشكل 3). لاحظ أيضا أن المناطق في التكوين الشبكي تفتقر إلى حدود محددة جيدا ويتم تصنيفها هنا كما في Paxinos و Franklin2. اختصارات-AP: أمامي خلفي. ML: متوسط الجانب. DV: الظهرية البطنية. ChAT: الكولين أسيتيل ترانسفيراز; F: أنثى; م: ذكر. M & F: الذكور والإناث; NA: غير قابل للتطبيق؛ Pet1: ورم البلازما أعرب عن عامل النسخ 1 ؛ Sert: السيروتونين الناقل, vGaT: الناقل GABA الحويصلي; vGluT2: ناقل الغلوتامات الحويصلي 2 ؛ WT: نوع البرية. جميع الإحداثيات بالملليمتر (مم). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعتمد الجراحة المجسمة القياسية عادة على معالم الجمجمة لحساب إحداثيات المواقع المستهدفة في الجهاز العصبي المركزي1. ثم يتم الوصول إلى المواقع المستهدفة عبر ثقوب لدغ التي يتم حفرها من خلال الجمجمة1. هذه الطريقة ليست مثالية لجذع الدماغ الذيلي حيث تقع المواقع المستهدفة بعيدا عن معالم الجمجمة في المستويين الأمامي الخلفي والظهري البطني2 وبما أن تشريح الجمجمة والعضلات العلوية تجعل الوصول صعبا6 (الشكل 1Bi). تصف دراستنا نهجا مجسما بديلا للوصول إلى المواقع المستهدفة في جذع الدماغ الذيلي والحبل الشوكي العلوي يسمى نهج cisterna magna. السمات الرئيسية التي تجعل هذه الطريقة مختلفة عن النهج التجسيمي القياسي هي تحديد المواقع ، مع الانثناء الأمامي للرأس لفتح الصهريج الضخم ، واستخدام معالم جذع الدماغ الرئيسية على السطح الظهري لجذع الدماغ كنقاط مرجعية مثل obex. تشير نتائجنا إلى أن هذا النهج مناسب لتوصيل كميات صغيرة (5-50 نانولتر) من المقتفيات أو الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAVs) إلى هياكل جذع الدماغ المنفصلة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نقطة مرجعية تمثل معلما من معالم الجهاز العصبي المركزي، بدلا من بنية عظمية، وتكون على مقربة من الهدف المقصود يزيد من قابلية التكرار والدقة للأهداف الصغيرة وأحجام الحقن الصغيرة، حسب صلتها برسم خرائط الدوائر والدراسات الكيميائية الجينية (الشكل 3)14،15.
كما هو الحال مع أي بروتوكول ، فإن نهج cisterna magna لديه خطوات حاسمة من أجل تحقيق قابلية التكرار. كما هو الحال مع أي نهج مجسمة يعتمد على الإحداثيات في ثلاث مستويات مختلفة (أمامية خلفية ، متوسطة ، وظهرية بطنية) ، فإن تحديد المواقع أمر بالغ الأهمية. بالنسبة لنهج cisterna magna ، لا ينطوي هذا فقط على موضع الرأس ، والذي يجب أن يكون منثنيا عند 90 درجة ولكن أيضا موضع الجسم ، والذي يجب أن يكون مرتفعا بحيث يكون جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي في نفس المستوى. خطوة حاسمة أخرى هي تجنب التلاعب غير الضروري الذي يسبب النزيف ، لأن هذا من شأنه أن يعيق تصور المعالم الرئيسية. هناك نوعان من التلاعب الذي يحمل مخاطر عالية من النزيف. أولا ، يتم تغطية الأم الدورية التي تغطي الصهريج الضخم بعضلة كبيرة نسبيا (التهاب الرأس الطويل). نظرا لأن هذه عضلة مقترنة ، مع بطن واحد على جانبي خط الوسط ، فلن تحتاج بطني هذه العضلة إلا إلى فصلهما بلطف في خط الوسط. شق هذه العضلات ليس ضروريا وسوف يسبب النزيف. ثانيا ، عند الفتح الناجح للأم الجافية ، سيصبح عدد متغير من الأوردة ذات المسار المتغير مرئيا أعلى السطح الظهري لجذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي. يجب تجنب هذه الأوردة عن طريق تطبيق تعديلات طفيفة في الإحداثيات (حتى 0.1 مم) أو ، إذا سمح النموذج التجريبي ، عن طريق اختيار هدف مختلف.
تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لنهج cisterna magna في أنه يوفر الوصول إلى جذع الدماغ وهياكل عنق الرحم العلوية التي يصعب الوصول إليها عند استخدام المستوى المجسمة القياسي لأنها تقع بالقرب من النهاية الذيلية أو الذيلية فقط للعظم القذالي. علاوة على ذلك ، بالنسبة للأهداف في النخاع المستطيل ، يتجنب النهج آثار آفة المخيخ وبالتالي المخيخ أو وضع العلامات الزائفة عبر قناة إبرة ، والتي يمكن أن تؤثر على نتائج الدراسة عند استخدام المنهجية القياسية ليست مصدر قلق. ميزة أخرى لنهج cisterna magna هي أن السطح الظهري لجذع الدماغ يصبح مرئيا. وهذا يوفر الفرصة لاستخدام معلم على السطح الظهري كنقطة مرجعية للإحداثيات. علاوة على ذلك ، فإن النهج مرن ويمكن تحسينه اعتمادا على الهدف. على سبيل المثال ، استخدمنا معلم خط الوسط ، obex ، كنقطة مرجعية. ومع ذلك ، عند استهداف الهياكل الظهرية ، قد تملي بنية الاهتمام نفسها المشهد الطبيعي للسطح الظهري. على سبيل المثال ، تبرز نواة cuneate الخارجية ظهريا ، وبالتالي يمكن تصورها وحقنها مباشرة. بالنسبة للأهداف الجانبية ، مثل المجموعة التنفسية البطنية أو المجمع الغامض ، يمكن زيادة نافذة cisterna magna في اتجاه جانبي. وبالمثل ، لاستهداف هياكل عنق الرحم العليا ، يمكن تمديد النافذة نحو الأطلس. بينما استخدمنا محول الماوس الموضوعة في إطار نمطي حيواني كبير ، يمكن بسهولة تكييف النهج مع الإطارات أو الإعدادات الأخرى ، طالما يتم اتباع الخطوات الرئيسية. على سبيل المثال ، بدلا من البطاقة البلاستيكية ، يمكن وضع شريط الفم على جسر الأنف للحفاظ على الرأس في وضع ثابت مضاد للانعكاس. تجدر الإشارة إلى أن إحداثيات المواقع المستهدفة لجذع الدماغ مع obex كنقطة صفر ، كما هو موضح في الجدول 1 ، تعمل كمرجع ، ويمكن الإشارة إلى التعديلات بناء على سلالة الماوس والعمر والجنس ومعايرة الذراع المجسمة وتقنية تحديد المواقع ، على غرار التعديلات التي يحتاج المرء إلى إجراؤها عند اشتقاق إحداثيات الهدف لنهج قياسي من أطلس مرجعي. وهذا يتطلب نظرة ثاقبة على مستوى النهج، وخاصة بالنسبة للأهداف الأكثر رصيفا كما هو موضح في الشكل 1. يمكن إجراء اختبار الإحداثيات باستخدام مقتفيات مختلفة ، على سبيل المثال ، حبات الفلورسنت أو الوحدة الفرعية B لتوكسين الكوليرا الموسومة بالفلورسنت لإحداثيات مختلفة في نفس الماوس. ثم تقدم التحليلات النسيجية لأقسام جذع الدماغ / الأنسجة الشوكية (غير المشمولة في هذا البروتوكول) ملاحظات حول التوطين بالنسبة للمعالم الداخلية الموضوعية8،9،11،16 أو للمقارنة مع أطلس مرجعي. يمكن بعد ذلك تعديل الإحداثيات واختبارها مرة أخرى ووضعها في صيغتها النهائية.
نهج cisterna magna له أيضا قيود. تقتصر مناطق الجهاز العصبي المركزي التي يمكن الوصول إليها عبر هذا النهج على البونس الذيلي والنخاع المستطيل والحبل العنقي العلوي. في حين يمكن الوصول إلى البونس الذيلي بسهولة من خلال النهج القياسي ، فإن نهج cisterna magna له مزايا عند دراسة التقسيمات الفرعية للهياكل ذات التوجه الطولي التي تمتد من النخاع المستطيل إلى البونس الذيلي ، كما هو الحال بالنسبة للتقسيمات الفرعية داخل التكوين الشبكي. يحدث قيد نسبي آخر عند استخدام هذا النهج للمرة الثانية في نفس الماوس ، على سبيل المثال ، في تتبع داء الكلب المعدل14. قد يؤدي وجود النسيج الندبي إلى زيادة مدة الجراحة أو إخفاء المعالم الصغيرة. ومع ذلك ، في أيدينا ، لا تزال هذه الطريقة متفوقة على النهج التجسيمي القياسي في هذه الحالة ، حيث يمكن توثيق موقع الحقن الأول فيما يتعلق بموضع الأوردة من المعالم الفريدة الأخرى ، مما يجعل من السهل العثور على نقطة الدخول الدقيقة مرة أخرى. في حين أن هذا النهج متفوق في دراسات التتبع في النخاع الذيلي والحبل الشوكي العلوي ، إلا أنه لا يمكن استخدامه لزرع الأجهزة بشكل مزمن. لذلك ، بالنسبة لدراسات علم البصريات الوراثي وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي التي تتطلب زرع الألياف البصرية17 ، يمكن استخدام نهج cisterna magna أولا لتوصيل AAV إلى الموقع المستهدف ، تليها جراحة ثانية باستخدام نهج قياسي لفئران الأدوات التي تحتوي على ألياف أو قنية. يمكن هذا النهج المرء من الحفاظ على خصوصية الموقع المستهدف ، في حين أن وضع الألياف / الأجهزة أكثر تسامحا (أي يمكن أن يكون أقل دقة) ، نظرا للحجم الكبير نسبيا للأجهزة. وأخيرا، يتطلب نهج سيستيرنا ماجنا مهارات جراحية أكثر تقدما من النهج التجسيمي القياسي. بدلا من التعرف على المعالم العظمية البسيطة ، فإنه يتطلب نظرة ثاقبة على جذع الدماغ والمعالم العضلية الهيكلية الأكثر تعقيدا. أيضا ، كما هو الحال مع أي جراحة حساسة ، يعتمد نجاح وكفاءة الإجراء على مجموعة أدوات مناسبة في حالة ممتازة. يعالج هذا البروتوكول القضايا الأخيرة ويمكن استخدامه كدليل مفصل من قبل المجربين.
في الختام ، يعد نهج cisterna magna مكملا للنهج التجسيمي القياسي ويوفر مزايا متعددة عند استهداف جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي ، والتي لا يمكن الوصول إليها بسهولة عبر نهج مجسمة قياسي. يستخدم النقاط المرجعية التي هي CNS بدلا من المعالم العظمية التي هي على مقربة من الأهداف المقصودة ، مما يزيد من قابلية الاستنساخ والدقة. وهذا يجعل هذا النهج ذا قيمة خاصة عندما تحتاج كميات الحقن الصغيرة إلى تسليمها إلى مواقع منفصلة في سياق رسم الخرائط التفصيلية أو الدراسات الكيميائية الوراثية. هذا النهج مناسب أيضا لنهج العلاج الكيميائي الوراثي الوظيفي أو البصري أو القياس الضوئي للألياف أو الآفة ، حيث يتم تسليم فيروس AAV أو السم إلى هدف مع وظيفة حركية أو تكامل حسي حركي كقراءة: فهو يتجنب دورة عبر المخيخ لأهداف في النخاع المستطيل وبالتالي يحد من تدخله في نتائج الدراسة. من وجهة نظر رعاية الحيوان ، لا يتطلب الإجراء حفر ثقوب متعددة للوصول إلى المواقع ثنائيا أو طوليا ، مما يقلل من مدة الجراحة وغزو الإجراء. في حين أوجزنا النهج بالتفصيل للفئران ، تنطبق نفس المبادئ على الأنواع الأخرى11،12،13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل R01 NS079623 و P01 HL149630 و P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004).
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
