Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

Summary

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi comporta comunemente l'accesso attraverso le ossa del cranio ed è guidata da punti di riferimento del cranio. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo per colpire il tronco cerebrale caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna che si basa sulla visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale.

Abstract

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi è comunemente guidata da punti di riferimento del cranio. L'accesso è quindi ottenuto tramite fori di bava praticati attraverso il cranio. Questo approccio standard può essere difficile per gli obiettivi nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore a causa di specifiche sfide anatomiche in quanto questi siti sono lontani dai punti di riferimento del cranio, portando all'imprecisione. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo tramite la cisterna magna che è stato utilizzato per indirizzare regioni discrete di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. La cisterna magna si estende dall'osso occipitale all'atlante (cioè il secondo osso vertebrale), è piena di liquido cerebrospinale ed è ricoperta da dura madre. Questo approccio fornisce una via di accesso riproducibile a strutture selezionate del sistema nervoso centrale (SNC) che sono altrimenti difficili da raggiungere a causa delle barriere anatomiche. Inoltre, consente la visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale in prossimità dei siti target, aumentando la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale superiore. Infine, questo approccio offre l'opportunità di evitare il cervelletto, che può essere importante per gli studi motori e sensomotori.

Introduction

La chirurgia stereotassica standard per colpire i siti cerebrali nei topi¹ comporta comunemente la fissazione del cranio utilizzando una serie di barre auricolari e una barra della bocca. Le coordinate vengono quindi stimate in base agli atlanti^{di riferimento 2,3} e ai punti di riferimento del cranio, vale a dire, bregma (il punto in cui le suture delle ossa frontali e parietali si uniscono) o lambda (il punto in cui le suture delle ossa parietale e occipitale si uniscono; Figura 1A,B). Attraverso un foro di bava nel cranio sopra il bersaglio stimato, la regione target può quindi essere raggiunta, sia per la consegna di microiniezioni che per la strumentazione con cannule o fibre ottiche. A causa della variazione nell'anatomia di queste suture e degli errori nella localizzazione di bregma o lambda ^4,5, la posizione dei punti zero in relazione al cervello varia da animale ad animale. Mentre piccoli errori nel targeting, che derivano da questa variabilità, non sono un problema per bersagli grandi o vicini, il loro impatto è maggiore per aree di interesse più piccole che sono lontane dai punti zero nei piani anteroposterior o dorsoventral e / o quando si studiano animali di dimensioni variabili a causa dell'età, della tensione e / o del sesso. Ci sono diverse sfide aggiuntive che sono uniche per il midollo allungato e il cordone cervicale superiore. In primo luogo, piccoli cambiamenti nelle coordinate anteroposteriore sono associati a cambiamenti significativi nelle coordinate dorsoventrali rispetto alla dura, a causa della posizione e della forma del cervelletto (Figura 1Bi)^2,6,7. In secondo luogo, il cordone cervicale superiore non è contenuto all'interno del cranio². In terzo luogo, la posizione obliqua dell'osso occipitale e lo strato sovrastante dei muscoli del collo² rendono l'approccio stereotassico standard ancora più impegnativo per le strutture situate vicino alla transizione tra il tronco cerebrale e il midollo spinale (Figura 1Bi). Infine, molti bersagli di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale sono piccoli², che richiedono iniezioni precise e riproducibili ^8,9.

Un approccio alternativo attraverso la cisterna magna aggira questi problemi. La cisterna magna è un grande spazio che si estende dall'osso occipitale all'atlante (Figura 1A, cioè il secondo osso vertebrale)¹⁰. È riempito con liquido cerebrospinale e coperto da dura madre¹⁰. Questo spazio tra l'osso occipitale e l'atlante si apre quando si anterofisce la testa. È possibile accedervi navigando tra le pance accoppiate sovrastanti del muscolo longus capitis, esponendo la superficie dorsale del tronco cerebrale caudale. Le regioni di interesse possono quindi essere prese di mira in base ai punti di riferimento di queste regioni stesse se si trovano vicino alla superficie dorsale; o usando l'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, come punto zero per le coordinate per raggiungere strutture più profonde. Questo approccio è stato utilizzato con successo in una varietà di specie, tra cui il ratto¹¹, il gatto¹², il topo ^8,9 e il primate non umano¹³ per colpire il gruppo respiratorio ventrale, la formazione reticolare mediale midollare, il nucleo del tratto solitario, l'area postrema o il nucleo ipoglosso. Tuttavia, questo approccio non è ampiamente utilizzato in quanto richiede conoscenze di anatomia, un toolkit specializzato e competenze chirurgiche più avanzate rispetto all'approccio stereotassico standard.

Qui descriviamo un approccio chirurgico passo-passo per raggiungere il tronco cerebrale e il cordone cervicale superiore attraverso la cisterna magna, visualizzare i punti di riferimento, impostare il punto zero (Figura 2) e stimare e ottimizzare le coordinate target per la consegna stereotassica di microiniezioni nelle regioni discrete del tronco cerebrale e del midollo spinale di interesse (Figura 3). Discutiamo quindi i vantaggi e gli svantaggi legati a questo approccio.

Protocol

L'autore dichiara che il protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Preparazione di strumenti chirurgici e telaio stereotassico

NOTA: L'intervento viene eseguito in condizioni asettiche. La sterilità viene mantenuta utilizzando la tecnica della punta sterile.

1. Installare il braccio stereotassico con una micropipetta o una siringa riempita con un iniettabile di scelta (virus adeno-associato (AAV) o tracciante convenzionale) sul telaio stereotassico e preparare l'adattatore per mouse (Figura 2A).
2. Preparare strumenti chirurgici autoclavati (Tabella dei materiali) e posizionarli su una superficie sterile.

2. Induzione dell'anestesia e preparazione del topo

1. Accendere O₂ a 0,5 L/min e impostare il vaporizzatore isoflurano a 4.0, assicurandosi che il flusso di O₂ sia alla scatola di induzione.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che la scatola di induzione dell'isoflurano sia collocata in un cappuccio e che l'isoflurano sia rimosso dal sito chirurgico.
2. Posizionare il mouse (maschio di 10 settimane C57BL/6J) nella camera di induzione.
3. Una volta che la respirazione è rallentata, aprire la camera di induzione e sollevare leggermente il mouse. Usa i tagliacapelli per rimuovere i peli dalla testa alle spalle.

3. Posizionamento del mouse nel frame stereotassico

1. Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile. In questa fase, assicurarsi che il flusso di O₂ sia ora diretto al cono del naso.
2. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari.
   NOTA: Assicurarsi che le barre auricolari siano uniformi e che la testa sia in piano.
3. Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90° guidando manualmente il naso. Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti del padiglione auricolare dell'adattatore del mouse, parallelamente ai pilastri. La parte piatta del cranio funge da riferimento, simile all'approccio del cranio piatto nella chirurgia stereotassica convenzionale.
   NOTA: Non flettere eccessivamente la testa (cioè oltre un angolo di 90° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo) in quanto ciò impedisce il flusso d'aria attraverso le vie aeree superiori. Se il flusso d'aria è ostacolato, riposizionare il mouse, assicurandosi che il corpo sia supportato sotto il tronco e che una carta di plastica sia posizionata a 90 ° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo come indicato nella Figura 2A, C.
4. Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse, quindi assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati allo stesso livello (cioè a circa 180 ° o parallelamente al tavolo). La cassetta degli attrezzi che contiene le forbici a molla può essere utilizzata per sollevare il corpo in questa posizione.
   NOTA: Questo passaggio è importante in quanto il tronco cerebrale caudale e il cordone cervicale superiore si muovono a seconda della posizione, in contrasto con più parti rostrali del SNC che sono tenute in posizione dal cranio.
5. Iniettare una singola dose di 4 mg/kg di Meloxicam a lento rilascio (SR) per via sottocutanea (s.c.) ad un volume di 2 μL/g di peso corporeo e posizionare il lubrificante sugli occhi.
6. Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione betadine, e poi di nuovo con un tampone di preparazione dell'alcol e lasciare asciugare.
7. Posiziona un drappo sotto il corpo.
8. Disinfettare le mani e indossare guanti sterili.
9. Posizionare un drappo nel sito chirurgico.

4. Chirurgia per accedere alla cisterna magna

1. Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale.
2. Ridurre l'isoflurano a livelli di manutenzione (2.0).
3. Fai un'incisione di 1-1,2 cm con la lama chirurgica #10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.
4. Fai un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio. Questo espone i muscoli longus capitis accoppiati.
   NOTA: Nei topi, il muscolo trapezio è un muscolo molto sottile, quasi trasparente. Assicurati di rimanere nella linea mediana e non tagliare i muscoli sottostanti in quanto ciò causerà sanguinamento inutile.
5. Posiziona entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Il peso degli emostati fornisce tensione ai ganci di riavvolgimento che possono essere modificati regolando nuovamente la posizione degli emostati.
6. Posizionare il microscopio chirurgico in posizione per visualizzare meglio il campo chirurgico.
7. Utilizzare la pinza smussata per laminectomia per separare il ventre sinistro e destro del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite, dove la linea mediana è facilmente visibile. Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale, quindi continua attraverso la dura madre fino all'atlante.
   NOTA: Non è necessario tagliare i muscoli longus capitis accoppiati poiché nulla li tiene insieme nella linea mediana; in questo modo causerà sanguinamento inutile.
8. Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati, aprendo la vista della cisterna magna.
9. Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona finestra di visualizzazione del tronco cerebrale e del cervelletto.
10. Ripetere i passaggi 4.7-4.9 secondo necessità fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale vengono visualizzati sotto la dura.
11. Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli fili di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale, fino a quando non vi è una visione chiara del tronco cerebrale e creare più spazio laterale, se necessario per il bersaglio.

5. Apertura della membrana cisternale

1. Usa la pinza Dumont angolata (#4/45) per afferrare la dura, che si estende dall'osso occipitale all'atlante. Afferrare la dura vicino all'osso occipitale e utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura (~ 0,5 a 1,5 mm) nella dura.
   NOTA: In questa posizione rostrale, lo spazio tra il tronco cerebrale e la dura sovrastante è più ampio, fornendo ampio spazio per la manipolazione sicura della dura.
2. Utilizzare le forbici a molla per sollevare la dura e aprire ulteriormente la dura. La dimensione della finestra dipende dalla destinazione.
   NOTA: Sarà necessaria una finestra più grande quando si effettuano iniezioni longitudinali multiple o iniezioni bilaterali; una piccola finestra sarà sufficiente quando si effettuano iniezioni unilaterali o intermedie singole.
3. Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta sterile.

6. Identificazione dei punti di riferimento e del punto zero

1. Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, è il punto zero anteriore-posteriore e mediolaterale standard.

7. Coordinate target

NOTA: Per vari target, abbiamo incluso un elenco di coordinate standard con coordinate anteriori posteriori (AP) e mediolaterali (ML) relative alle coordinate bregma e cisterna magna a punto zero con coordinate AP e ML relative all'obex a punto zero per facilitare la transizione tra le metodologie (Tabella 1). Le coordinate dorsoventrali (DV) sono relative alla superficie del cervello o del cervelletto (approccio standard) o alla superficie del tronco cerebrale o del cordone cervicale superiore (approccio cisterna magna) nel punto di ingresso AP e ML. La pianificazione dovrebbe essere fatta prima dell'intervento chirurgico.

1. Utilizzare i tre set di coordinate per determinare la destinazione: AP, ML e DV. A causa della posizione della testa, l'orientamento relativo delle strutture del tronco cerebrale varia in base alla posizione.
   1. Per la distanza target >0,4 mm dall'ombelico all'obex (Figura 1B, verde) eseguire le seguenti operazioni.
      1. AP: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard (ad esempio, Paxinos e Franklin atlas²) o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza AP tra obex e il bersaglio.
      2. ML: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza ML tra obex e il bersaglio.
      3. DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del cervello o del cervelletto nel punto target AP e ML. Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza tra la superficie del tronco cerebrale alle coordinate AP e ML desiderate e il bersaglio.
   2. Per la distanza target <0,4 mm dall'caudale all'obex (Figura 1B, arancione) eseguire quanto segue.
      1. AP: Regola le coordinate per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, il punto di ingresso del tronco cerebrale AP sarà più caudale rispetto alla coordinata AP target nel piano standard.
      2. ML: Derivare le coordinate target da un atlante di riferimento stereotassico standard o da una serie di tessuti tagliati nel piano trasversale. Le coordinate saranno relative alla linea mediana visualizzata a livello di AP di destinazione.
      3. DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del tronco cerebrale nel punto target AP e ML. Regola DV per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, le coordinate DV saranno maggiori della distanza dalla superficie dorsale del tronco cerebrale nel piano standard.

8. Iniezione del bersaglio

1. Abbassare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico e iniettare la soluzione come per gli approcci stereotassici standard. Lasciare in posa per 1-5 minuti dopo l'iniezione, per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra 3-50 nL. Quindi, sollevare la pipetta o la siringa utilizzando il braccio stereotassico.
2. Ripetere il passaggio 8.1. per obiettivi multipli.

9. Chiusura del campo chirurgico

1. Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico. I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra, coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture.
2. Chiudere la pelle con tre punti di sutura in nylon o polipropilene (5-0 o 6-0).

10. Assistenza post-operatoria

1. Spegnere l'isoflurano e rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Metti il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante e osserva fino a quando non sei sveglio e in movimento.
2. Monitorare lo stato di salute, il peso e le suture nei giorni post-operatori 1-3. Rimuovere le suture il giorno 10 se non sono già state rimosse.

Representative Results

L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. L'intervento chirurgico per raggiungere la cisterna magna richiede incisioni della pelle, un sottile strato di muscolo trapezio e l'apertura della dura madre ed è quindi ben tollerato dai topi. È particolarmente efficiente e meno invasivo quando si prendono di mira più siti (dispersi longitudinalmente o bilaterali), in quanto non richiede la perforazione di più fori di bava come negli approcci stereotasssici standard. Nei topi, abbiamo regolarmente mirato strutture come il nucleo ipoglosso⁹, il gruppo respiratorio ventrale⁸ e la formazione reticolare adiacente 8 nel tronco^cerebrale caudale usando l'approccio cisterna magna, come illustriamo ulteriormente per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale (GiV) nella Figura 3. Ad esempio, il nucleo ipoglosso è una colonna sottile ma rostrocaudamente allungata di motoneuroni nel midollo allungato dorsale e il suo polo rostrale può essere mirato tramite un approccio standard. Tuttavia, poiché le coordinate DV (~ 4,5 mm) sono per lo più dettate dal cervelletto sovrastante con solo 1,2-1,4 mm che entrano nel tronco cerebrale, una differenza relativamente piccola nel posizionamento della testa del topo potrebbe quindi facilmente provocare un'iniezione fuori posto. A causa della vicinanza di questo obiettivo all'obex di punto zero, può essere mirato in modo più affidabile tramite l'approccio cisterna magna. Inoltre, l'estremità caudale del nucleo ipoglosso che si estende fino alla transizione tra tronco cerebrale e midollo spinale può essere presa di mira dallo stesso approccio cisterna magna, mentre l'approccio standard dovrebbe essere modificato per raggiungere tale sito caudale angolando l'approccio AP e regolando le coordinate per evitare l'osso occipitale e la muscolatura del collo sovrastante.

Al fine di determinare l'accuratezza dell'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard, abbiamo misurato la distanza tra i siti bersaglio previsti ed effettivi nei piani anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale per il ventrale (midollo ventromediale; Gia/V; N = 10) e dorsale (NuXII; N = 16) regioni. Le misurazioni sono state effettuate in sezioni trasversali del tronco cerebrale caudale (Figura 3). I risultati (Figura 4) mostrano errori significativamente più piccoli nei piani anteroposteriori, mediolaterali e soprattutto dorsoventrali per l'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard. Questi risultati evidenziano la maggiore precisione dell'approccio cisterna magna per questi obiettivi. Abbiamo incluso coordinate stereotassiche standard (relative al bregma, derivate da Paxinos e Franklin ², ma ottimizzate per i nostri studi) e coordinate cisterna magna (relative all'obex) nella Tabella 1. Queste coordinate sono state tutte ottimizzate e verificate come mostrato per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale nella Figura 3.

Figura 1: Rappresentazione schematica dei punti di riferimento chiave, delle aree target e del piano dell'approccio stereotassico della cisterna magna. (A) Punti di riferimento anatomici chiave e posizionamento nel piano sagittale. (B) Aree che possono essere raggiunte attraverso l'approccio stereotassico standard rispetto all'approccio stereotassico cisterna magna e relazione con i loro punti di riferimento. i) L'approccio standard fa uso di punti di riferimento ossei bregma e lambda, che sono distanti dalle regioni bersaglio in magenta e viola. L'area in magenta (midollo caudale allungato e midollo cervicale superiore) è difficile da raggiungere a causa dell'osso occipitale obliquo e dei muscoli del collo. L'area in viola (midollo rostrale oblongata) è soggetta a movimenti e distante dai punti di riferimento tradizionali. ii) L'approccio della cisterna magna è appropriato per accedere al midollo caudale allungato e al cordone cervicale superiore e presenta vantaggi nello studio delle strutture del tronco cerebrale che sono organizzate in colonne longitudinali che si estendono dal midollo caudale allungato rostralmente, fino al livello del ponte caudale. (C) Schema dei piani di vari atlanti di riferimento stereotassici in relazione all'approccio cisterna magna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica schematica passo-passo dell'approccio cisterna magna stereotassico. (A) Adattatore per mouse con barre auricolari posizionate uniformemente al livello più alto, barra della bocca in posizione ribassata e una scheda di plastica per fissare la testa anteroflessa con un angolo di 90 °. (B) Fissare il mouse nel telaio stereotassico utilizzando le barre auricolari e anteroflex la testa a 90° e mantenere in posizione tramite una carta di plastica rigida, con il telaio stereotassico come riferimento. (C) Assicurarsi che il corpo sia elevato in modo che si trovi sullo stesso piano dell'occipite. Palpa i punti di riferimento chiave. (D) Fare un'incisione cutanea dall'occipite alla parte rostrale delle spalle. (E) Fare un'incisione nel rafe del muscolo trapezio. Assicurati di rimanere nella linea mediana e non tagliare i muscoli sottostanti. (F) Identificare la linea mediana tra le due pance del muscolo longus capitis, a partire dall'occipite, e guidare la pinza di laminectomia in direzione caudale. (G) Posizionare ciascuno dei ganci della ferita tra le pance del muscolo longus capitis e riposizionare fino a quando la cisterna magna non viene in vista. (H) Identificare i punti di riferimento ossei (osso occipitale, atlante), la dura madre che si estende tra queste strutture ossee e il cervelletto sottostante e il tronco cerebrale. Pulire la dura madre secondo necessità per esporre il livello target. (I) Usando forbici a molla e pinze sottili aprire la dura. (J) Identificare l'obex, che forma il punto zero AP e ML. Spostare la pipetta sulle coordinate AP e ML scelte. Abbassare la pipetta fino a raggiungere la superficie dorsale del tronco cerebrale. Questo è il punto zero DV. Abbassare la pipetta alla coordinata desiderata. (K) Rimuovere la pipetta e i ganci della ferita e lasciare che i muscoli longus capitis riprendano la loro posizione originale. (L) Chiudere la ferita e rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione delle coordinate target. Fotomicrografie a basso ingrandimento del tronco cerebrale caudale. (A) Iniezione di subunità b (CTb; blu) della tossina tracciante retrograda nel nucleo ipoglosso di un topo reporter ChAT-cre L10 GFP (verde) (femmina, 6 mesi). Si noti che l'iniezione di CTb è limitata al nucleo ipoglosso. (B) Trasfezione di cellule glutamatergiche di un topo reporter (verde) vGluT2-ires-cre L10 (verde) (maschio, 2 mesi) con un tracciante anterogrado condizionale (magenta) nella parte ventrale del midollo caudale mediale oblongata (polo caudale della regione GiV). (C) Tracciamento retrogrado condizionale in un topo vGLuT2-ires-cre (maschio, 2 mesi) che mostra la trasfezione TVA (magenta) dei neuroni glutamatergici e l'infezione da rabbia modificata (verde) nel midollo caudale mediale allungato (polo caudale della regione GiV). Il virus della rabbia è stato iniettato nel midollo spinale cervicale superiore. I punti di riferimento interni fungono da guida. Abbreviazioni-cAmb: Nucleo compatto del complesso Ambiguus; Ap: Area Postrema; DMV: Nucleo Motorio Dorsale del Vago; GiV: Nucleo gigantocellulare, parte ventrale; IO: Oliva inferiore; IRt: Nucleo reticolare intermedio; LRN: Nucleo reticolare laterale; NuXII- Nucleo ipoglosso; sol: Nucleo del Tratto Solitario; Sp5: Nucleo trigemino spinale; VRG: gruppo respiratorio ventrale. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto dell'accuratezza tra gli approcci standard e cisterna magna. Distanza media tra il centro del bersaglio previsto e il centro del sito effettivo nel piano anteroposteriore (A), nel piano mediolaterale (B) e nel piano dorsoventrale (C). I dati sono stati ottenuti da N = 13 topi adulti utilizzando un approccio standard e N = 13 topi adulti utilizzando un approccio cisterna magna. Il raggio del bersaglio è stato fissato a 30 μm. I risultati mostrano una maggiore precisione nel piano anteroposteriore (t(24) = 2,08, p = 0,049; t-test a due code; alfa 0,05), piano mediolaterale (t(24) = 2,55, p = 0,018; t-test a due code; alfa 0,05) e piano dorsoventrale (t(24) = 4,33, p = 0,0002; t-test a due code; alfa 0,05). I grafici a barre rappresentano la media con deviazione standard e i singoli punti rappresentano i valori in ciascun mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Panoramica delle coordinate stereotasssica standard e cisterna magna per colpire le strutture del tronco cerebrale caudale. Si prega di notare che sia per gli approcci standard che per quelli cisterna magna, le coordinate dell'atlante Paxinos e Franklin² sono state adattate fino a quando le regioni di interesse non sono state adeguatamente mirate come verificato dall'istologia (Figura 3). Inoltre, si noti che le aree nella formazione reticolare mancano di confini ben definiti e sono qui etichettate come in Paxinos e Franklin². Abbreviazioni-AP: anteroposterior. ML: mediolaterale. DV: dorsoventrale. ChAT: Colina acetiltransferasi; F: Femmina; M: Maschio; M&F: Maschio e Femmina; NA: non applicabile; Pet1: plasmacitoma espresso fattore di trascrizione 1; Sert: Trasportatore di serotonina, vGaT: Trasportatore GABA vescicolare; vGluT2: Trasportatore di glutammato vescicolare 2; WT: Tipo selvaggio. Tutte le coordinate sono in millimetro (mm). Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

La chirurgia stereotassica standard si basa comunemente sui punti di riferimento del cranio per calcolare le coordinate dei siti target nel SNC¹. I siti bersaglio sono quindi accessibili tramite fori di bava che vengono perforati attraverso il cranio¹. Questo metodo non è ideale per il tronco cerebrale caudale in quanto i siti bersaglio si trovano distanti dai punti di riferimento del cranio nei piani anteroposteriore e dorsoventrale² e poiché l'anatomia del cranio e dei muscoli sovrastanti rendono difficile l'accesso⁶ (Figura 1Bi). Il nostro studio descrive un approccio stereotassico alternativo per l'accesso ai siti bersaglio nel tronco cerebrale caudale e nel midollo spinale superiore chiamato approccio cisterna magna. Le caratteristiche chiave che rendono questo metodo diverso da un approccio stereotassico standard sono il posizionamento, con anteroflessione della testa per aprire la cisterna magna, e l'uso di punti di riferimento chiave del tronco cerebrale sulla superficie dorsale del tronco cerebrale come punti di riferimento come l'obex. I nostri risultati indicano che questo approccio è adatto per la consegna di piccoli volumi (5-50 nL) di traccianti o virus adeno-associati (AAV) in strutture discrete del tronco cerebrale. Inoltre, l'uso di un punto di riferimento che rappresenta un punto di riferimento del SNC, piuttosto che una struttura ossea, e che si trova in prossimità del target previsto aumenta la riproducibilità e l'accuratezza per piccoli bersagli e piccoli volumi di iniezione, come rilevante per la mappatura dei circuiti e gli studi chemiogenetici (Figura 3) ^14,15.

Come con qualsiasi protocollo, l'approccio cisterna magna ha passaggi che sono fondamentali per ottenere la riproducibilità. Come per qualsiasi approccio stereotassico che dipende dalle coordinate in tre piani diversi (anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale), il posizionamento è fondamentale. Per l'approccio cisterna magna, questo coinvolge non solo la posizione della testa, che dovrebbe essere anteroflessa a 90° ma anche quella del corpo, che dovrebbe essere elevata in modo che il tronco cerebrale caudale e il cordone cervicale superiore siano sullo stesso piano. Un altro passo fondamentale è quello di evitare manipolazioni non necessarie che causano sanguinamento, in quanto ciò ostacolerebbe la visualizzazione dei punti di riferimento chiave. Ci sono due manipolazioni che comportano un alto rischio di sanguinamento. In primo luogo, la dura madre che copre la cisterna magna è coperta da un muscolo relativamente grande (longus capitis). Poiché si tratta di un muscolo accoppiato, con una pancia su entrambi i lati della linea mediana, le due pance di questo muscolo dovranno solo essere delicatamente separate nella linea mediana. L'incisione di questi muscoli non è necessaria e causerà sanguinamento. In secondo luogo, all'apertura riuscita della dura madre, un numero variabile di vene con un decorso variabile diventerà visibile sulla parte superiore della superficie dorsale del tronco cerebrale caudale e del cordone cervicale superiore. Queste vene dovrebbero essere evitate applicando piccoli aggiustamenti nelle coordinate (fino a 0,1 mm) o, se il paradigma sperimentale lo consente, selezionando un target diverso.

Uno dei principali vantaggi dell'approccio cisterna magna è che fornisce l'accesso al tronco cerebrale e alle strutture cervicali superiori che sono difficili da raggiungere quando si utilizza il piano stereotassico standard in quanto si trovano vicino all'estremità caudale o semplicemente caudale all'osso occipitale. Inoltre, per i bersagli nel midollo allungato l'approccio evita il cervelletto e quindi gli effetti della lesione cerebellare o l'etichettatura spuria attraverso un tratto di ago, che possono influenzare i risultati dello studio quando si utilizza la metodologia standard non sono un problema. Un altro vantaggio dell'approccio cisterna magna è che la superficie dorsale del tronco cerebrale diventa visibile. Ciò offre l'opportunità di utilizzare un punto di riferimento sulla superficie dorsale come punto di riferimento per le coordinate. Inoltre, l'approccio è flessibile e può essere ottimizzato a seconda del target. Ad esempio, abbiamo usato un punto di riferimento della linea mediana, l'obex, come punto di riferimento. Tuttavia, quando si prendono di mira le strutture dorsali, la struttura di interesse stessa può dettare il paesaggio della superficie dorsale. Ad esempio, il nucleo cuneato esterno sporge dorsalmente e può quindi essere visualizzato e iniettato direttamente. Per i bersagli laterali, come il gruppo respiratorio ventrale o il complesso ambiguo, la finestra della cisterna magna può essere aumentata in direzione laterale. Allo stesso modo, per il targeting delle strutture cervicali superiori, la finestra può essere estesa verso l'atlante. Mentre abbiamo usato un adattatore per mouse posizionato in un grande telaio stereotassico animale, l'approccio può essere facilmente adattato ad altri fotogrammi o configurazioni, purché vengano seguiti i passaggi chiave. Ad esempio, invece di una carta di plastica, la barra della bocca può essere posizionata contro il ponte del naso per mantenere la testa in una posizione anteroflessa stabile. Vale la pena notare che le coordinate dei siti bersaglio del tronco cerebrale con l'obex come punto zero, come fornito nella Tabella 1, servono come riferimento e le regolazioni possono essere indicate in base allo sforzo del topo, all'età, al sesso, alla calibrazione del braccio stereotassico e alla tecnica di posizionamento, simile alle regolazioni che è necessario effettuare quando si derivano le coordinate target per un approccio standard da un atlante di riferimento. Ciò richiede una comprensione del piano dell'approccio, specialmente per più bersagli rostrali come illustrato nella Figura 1. Il test delle coordinate può essere effettuato utilizzando diversi traccianti, ad esempio perline fluorescenti o subunità b della tossina del colera con tag fluorescenti per coordinate diverse nello stesso topo. Le analisi istologiche delle sezioni del tronco cerebrale / tessuto spinale (non trattate in questo protocollo) forniscono quindi un feedback sulla localizzazione relativa ai punti di riferimento interni oggettivi 8,9,11,16 o per il confronto con un atlante di riferimento. Le coordinate possono quindi essere regolate, testate di nuovo e finalizzate.

Anche l'approccio della cisterna magna ha dei limiti. Le regioni del SNC che possono essere raggiunte tramite questo approccio sono limitate al ponte caudale, al midollo allungato e al cordone cervicale superiore. Mentre il ponte caudale è facilmente accessibile tramite l'approccio standard, l'approccio cisterna magna presenta vantaggi quando si studiano suddivisioni di strutture orientate longitudinalmente che si estendono dal midollo allungato al ponte caudale, come nel caso delle suddivisioni all'interno della formazione reticolare. Un'altra limitazione relativa si verifica quando si utilizza questo approccio per la seconda volta nello stesso mouse, ad esempio nel tracciamento della rabbia modificato¹⁴. La presenza di tessuto cicatriziale può aumentare la durata dell'intervento chirurgico o oscuri punti di riferimento minori. Tuttavia, nelle nostre mani, questo metodo è stato ancora superiore all'approccio stereotassico standard in questo caso, poiché il sito della prima iniezione può essere documentato in relazione alla posizione delle vene di altri punti di riferimento unici, rendendo facile trovare l'esatto punto di ingresso indietro. Mentre questo approccio è superiore per gli studi di tracciamento nel midollo caudale e nel midollo spinale superiore, non può essere utilizzato per impiantare cronicamente hardware. Pertanto, per gli studi di optogenetica e imaging del calcio in vivo che richiedono l'impianto di fibre ottiche¹⁷ , l'approccio cisterna magna può essere utilizzato prima per fornire un AAV al sito target, seguito da un secondo intervento chirurgico utilizzando un approccio standard per strumentare topi con fibre o cannule. Questo approccio consente di mantenere discreto il sito di destinazione, mentre il posizionamento di fibre / hardware è più indulgente (cioè può essere meno accurato), a causa delle dimensioni relativamente grandi dell'hardware. Infine, l'approccio cisterna magna richiede competenze chirurgiche più avanzate rispetto a un approccio stereotassico standard. Piuttosto che il riconoscimento di semplici punti di riferimento ossei, richiede una comprensione di punti di riferimento più complessi del tronco cerebrale e muscolo-scheletrico. Inoltre, come con qualsiasi intervento chirurgico delicato, il successo e l'efficienza della procedura dipendono da un toolkit adeguato che è in ottime condizioni. Questo protocollo affronta questi ultimi problemi e può essere utilizzato come guida dettagliata dagli sperimentatori.

In conclusione, l'approccio cisterna magna è complementare all'approccio stereotassico standard e offre molteplici vantaggi quando si prende di mira il tronco cerebrale caudale e il cordone cervicale superiore, che non sono facilmente accessibili tramite un approccio stereotassico standard. Utilizza punti di riferimento che sono CNS piuttosto che punti di riferimento ossei che si trovano in prossimità degli obiettivi previsti, aumentando la riproducibilità e l'accuratezza. Ciò rende l'approccio particolarmente prezioso quando piccoli volumi di iniezione devono essere consegnati a siti discreti nel contesto di una mappatura dettagliata o di studi chemiogenetici. Questo approccio è rilevante anche per gli approcci chemiogenetici funzionali, optogenetici, fotometrici delle fibre o delle lesioni, in cui un virus o una tossina AAV viene consegnato a un bersaglio con funzione motoria o integrazione sensomotoria come lettura: evita un decorso attraverso il cervelletto per bersagli nel midollo allungato e quindi limita la sua interferenza nei risultati dello studio. Dal punto di vista del benessere degli animali, la procedura non richiede la perforazione di più fori di sbavatura per accedere ai siti bilateralmente o longitudinalmente, riducendo la durata dell'intervento chirurgico e l'invasività della procedura. Mentre abbiamo delineato l'approccio in dettaglio per i topi, gli stessi principi si applicano ad altre specie ^11,12,13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window