Summary
Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için stereotaksik cerrahi genellikle kafatası kemiklerinden erişimi içerir ve kafatası yer işaretleri tarafından yönlendirilir. Burada, beyin sapı yer işaretlerinin doğrudan görselleştirilmesine dayanan sarnıç magna aracılığıyla kaudal beyin sapı ve üst servikal omuriliği hedeflemek için alternatif bir stereotaksik yaklaşımı özetlemekteyiz.
Abstract
Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için stereotaksik cerrahi genellikle kafatası yer işaretleri tarafından yönlendirilir. Erişim daha sonra kafatasından delinmiş çapak delikleri aracılığıyla elde edilir. Bu standart yaklaşım, belirli anatomik zorluklar nedeniyle kaudal beyin sapı ve üst servikal kordondaki hedefler için zorlayıcı olabilir, çünkü bu bölgeler kafatası yer işaretlerinden uzaktır ve belirsizliğe yol açar. Burada, kaudal beyin sapı ve üst servikal kordondaki ayrı ilgi bölgelerini hedeflemek için kullanılan cisterna magna aracılığıyla alternatif bir stereotaksik yaklaşımı özetlemekteyiz. Sarnıç magna, oksipital kemikten atlasa (yani ikinci vertebral kemiğe) kadar uzanır, beyin omurilik sıvısı ile doldurulur ve dura mater ile kaplanır. Bu yaklaşım, anatomik engeller nedeniyle ulaşılması zor olan seçilmiş merkezi sinir sistemi (CNS) yapılarına yeniden üretilebilir bir erişim yolu sağlar. Ayrıca, beyin sapı işaretlerinin hedef bölgelere yakın bir yerde doğrudan görselleştirilmesine izin vererek, kaudal beyin sapı ve üst servikal kordondaki sınırlı ilgi alanlarına küçük enjeksiyon hacimleri verirken doğruluğu arttırır. Son olarak, bu yaklaşım, motor ve sensorimotor çalışmalar için önemli olabilecek beyincikten kaçınmak için bir fırsat sağlar.
Introduction
Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için standart stereotaksik cerrahi1 genellikle kafatasının bir dizi kulak çubuğu ve bir ağız çubuğu kullanılarak sabitlenmesini içerir. Koordinatlar daha sonra referans atlasları 2,3 ve kafatası yer işaretlerine, yani bregma (frontal ve parietal kemiklerin dikişlerinin bir araya geldiği nokta) veya lambda (parietal ve oksipital kemiklerin dikişlerinin bir araya geldiği nokta; Şekil 1A,B). Tahmini hedefin üzerindeki kafatasına bir çapak deliğinden sonra, mikroenjeksiyonların verilmesi veya kanüller veya optik fiberlerle enstrümantasyon için hedef bölgeye ulaşılabilir. Bu dikişlerin anatomisindeki farklılıklar ve bregma veya lambda 4,5'in lokalizasyonundaki hatalar nedeniyle, sıfır noktalarının beyne göre konumu hayvandan hayvana değişir. Bu değişkenlikten kaynaklanan hedeflemedeki küçük hatalar, büyük veya yakın hedefler için bir sorun olmasa da, etkileri, anteroposterior veya dorsoventral düzlemlerdeki sıfır noktalarından uzak olan ve / veya yaş, gerginlik ve / veya cinsiyet nedeniyle değişen büyüklükteki hayvanları incelerken daha küçük ilgi alanları için daha büyüktür. Medulla oblongata ve üst servikal kordon için benzersiz olan birkaç ek zorluk vardır. İlk olarak, anteroposterior koordinatlardaki küçük değişiklikler, beyinciğin konumu ve şekli nedeniyle duraya göre dorsoventral koordinatlardaki önemli değişikliklerle ilişkilidir (Şekil 1Bi)2,6,7. İkincisi, üst servikal kordon kafatası2 içinde yer almaz. Üçüncüsü, oksipital kemiğin eğimli pozisyonu ve boyun kaslarının üst tabakası2, beyin sapı ve omurilik arasındaki geçişin yakınında bulunan yapılar için standart stereotaksik yaklaşımı daha da zorlaştırmaktadır (Şekil 1Bi). Son olarak, kaudal beyin sapı ve servikal kordona ilgi duyan birçok hedef küçük2'dir ve hassas ve tekrarlanabilir enjeksiyonlar gerektirir 8,9.
Sarnıç magna aracılığıyla alternatif bir yaklaşım bu sorunları aşar. Sarnıç magna, oksipital kemikten atlasa kadar uzanan geniş bir alandır (Şekil 1A, yani ikinci omur kemiği)10. Beyin omurilik sıvısı ile doldurulur ve dura mater10 ile kaplanır. Oksipital kemik ve atlas arasındaki bu boşluk, kafayı anteroflekleştirdiğinde açılır. Longus capitis kasının üstteki eşleştirilmiş karınları arasında gezinerek ve kaudal beyin sapının dorsal yüzeyini açığa çıkararak erişilebilir. İlgilenilen bölgeler daha sonra sırt yüzeyinin yakınında bulunuyorlarsa, bu bölgelerin işaretlerine dayanarak hedeflenebilir; veya obeksi kullanarak, merkezi kanalın IV ventriküle açıldığı nokta, koordinatların daha derin yapılara ulaşması için sıfır noktası olarak. Bu yaklaşım, ventral solunum grubunu, medüller medial retiküler oluşumu, soliter sistemin çekirdeğini, alan postremasını veya hipoglossal çekirdeği hedeflemek için sıçan11, kedi 12, fare 8,9 ve insan dışı primat 13 dahil olmak üzere çeşitli türlerde başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, anatomi bilgisi, özel bir araç seti ve standart stereotaksik yaklaşıma kıyasla daha gelişmiş cerrahi beceriler gerektirdiği için yaygın olarak kullanılmamaktadır.
Burada, sarnıç magna yoluyla beyin sapına ve üst servikal kordona ulaşmak, yer işaretlerini görselleştirmek, sıfır noktasını ayarlamak (Şekil 2) ve mikroenjeksiyonların stereotaksik olarak verilmesi için hedef koordinatları tahmin etmek ve optimize etmek için adım adım cerrahi bir yaklaşımı açıklıyoruz (Şekil 3). Daha sonra bu yaklaşımla ilgili avantaj ve dezavantajları tartışacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yazar, protokolün Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerini izlediğini beyan eder.
1. Cerrahi aletlerin ve stereotaksik çerçevenin hazırlanması
NOT: Ameliyat aseptik koşullar altında yapılır. Sterilite steril uç tekniği kullanılarak korunur.
- Stereotaksik kolu, stereotaksik çerçeveye enjekte edilebilir bir seçenek (adeno ilişkili virüs (AAV) veya geleneksel izleyici) ile doldurulmuş bir mikropipet veya şırınga ile takın ve fare adaptörünü hazırlayın (Şekil 2A).
- Otoklavlanmış cerrahi aletler hazırlayın (Malzeme tablosu) ve steril bir yüzeye yerleştirin.
2. Anestezi indüksiyonu ve fare hazırlığı
- O2'yi 0,5 L/dak'da açın ve izofluran buharlaştırıcıyı 4,0'a ayarlayarakO2 akışının indüksiyon kutusuna olduğundan emin olun.
DİKKAT: İzofluran indüksiyon kutusunun bir davlumbaza yerleştirildiğinden ve izofluran'ın cerrahi bölgeden uzaklaştırıldığından emin olun. - Fareyi (10 haftalık erkek C57BL/6J) indüksiyon odasına yerleştirin.
- Solunum yavaşladığında, indüksiyon odasını açın ve fareyi hafifçe kaldırın. Saçları baştan omuzlara çıkarmak için makas kullanın.
3. Farenin stereotaksik çerçevede konumlandırılması
- Fareyi stereotaksik çerçeveye hareket ettirin ve burnu esnek bir burun konisine yerleştirin. Bu aşamada,O2 akışının artık burun konisine yönlendirildiğinden emin olun.
- Fareyi yalnızca kulak çubuklarını kullanarak stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
NOT: Kulak çubuklarının düz ve başın düz olduğundan emin olun. - Anteroflex, burnu manuel olarak yönlendirerek farenin başını 90° açıyla bükün. Bu konumu korumak için, fare adaptörünün kulak çubuğu sütunları arasına, sütunlara paralel olarak plastik bir bariyer yerleştirin. Kafatasının düz kısmı, geleneksel stereotaksik cerrahideki düz kafatası yaklaşımına benzer şekilde referans görevi görür.
NOT: Kafayı aşırı esnetmeyin (yani frontal kafatası kemiğinin düzlemi ile masanın yüzeyinin düzlemi arasındaki 90°'lik bir açının ötesinde), çünkü bu, üst solunum yolundan hava akışını engeller. Hava akımı engellenirse, fareyi yeniden konumlandırın, gövdenin gövdenin altında desteklendiğinden ve plastik bir kartın ön kafatası kemiğinin düzlemi ile Şekil 2A, C'de belirtildiği gibi tablonun yüzeyinin düzlemi arasında 90 ° 'ye ayarlandığından emin olun. - Isıtma yastığını farenin altına yerleştirin ve ardından boynun ve vücudun geri kalanının aynı seviyede (yani yaklaşık 180 ° veya masaya paralel olarak) konumlandırıldığından emin olun. Yaylı makası tutan alet kutusu, gövdeyi bu konuma kaldırmak için kullanılabilir.
NOT: Bu adım, kaudal beyin sapı ve üst servikal kordon, kafatası tarafından yerinde tutulan CNS'nin daha fazla rostral kısmının aksine, pozisyona bağlı olarak hareket ettiğinden önemlidir. - 4 mg / kg'lık tek bir doz Meloksikam yavaş salınımlı (SR) deri altından (SC) 2 μL / g vücut ağırlığı hacminde enjekte edin ve gözlere kayganlaştırıcı yerleştirin.
- Cerrahi kesi bölgesini önce %70 alkol hazırlama pediyle, sonra betadin hazırlama pediyle ve sonra tekrar alkol hazırlama pediyle temizleyin ve kurumaya bırakın.
- Vücudun altına bir örtü yerleştirin.
- Ellerinizi dezenfekte edin ve steril eldivenler giyin.
- Cerrahi bölgeye bir örtü yerleştirin.
4. Sarnıç magnasına erişmek için ameliyat
- Ayak parmaklarını sıkıştırarak veya kornea refleksini kontrol ederek farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
- İzofluranı bakım seviyelerine indirin (2.0).
- Oksipital kemiğin kenarından omuzlara doğru 10 numaralı cerrahi bıçakla tek bir yumuşak hareketle 1-1.2 cm'lik bir kesi yapın.
- Trapezius kasının orta hat raphesinde bir kesi yapın. Bu, eşleştirilmiş longus kapitis kaslarını açığa çıkarır.
NOT: Farelerde, trapezius kası çok ince, neredeyse şeffaf bir kastır. Orta hatta kaldığınızdan emin olun ve gereksiz kanamaya neden olacağından altta yatan kasları kesmeyin. - Her iki retraktör kancasını da eşleştirilmiş longus kapitis kasları arasına yerleştirin, biri sola, diğeri sağa yönlendirilmiştir. Hemostatların ağırlığı, hemostatların pozisyonunun yeniden ayarlanmasıyla değiştirilebilen retraktör kancalarına gerginlik sağlar.
- Cerrahi alanı daha iyi görselleştirmek için cerrahi mikroskopu yerine yerleştirin.
- Eşleştirilmiş longus kapitis kasının sol ve sağ karnını, orta hattın kolayca görülebildiği oksiputtan başlayarak ayırmak için künt laminektomi forsepslerini kullanın. Künt forsepsleri orta çizgideki oksiput kemiği boyunca sarnıç dura mater ile buluştuğu yere kadar yönlendirin ve ardından dura mater boyunca atlasa doğru devam edin.
NOT: Eşleştirilmiş longus kapitis kaslarını kesmeye gerek yoktur, çünkü hiçbir şey onları orta hatta bir arada tutmaz; bunu yapmak gereksiz kanamaya neden olur. - Retraktörleri yeniden konumlandırın ve hemostatları yeniden konumlandırarak gerginliği ayarlayın, sarnıç magna görünümünü açın.
- Beyin sapı ve beyinciğin iyi bir görüntüleme penceresini elde etmek için orta hatta kasları daha da ayırmak için künt laminektomi forsepslerini kullanın.
- Beyincik ve beyin sapı duranın altında görünene kadar 4.7-4.9 arasındaki adımları gerektiği gibi tekrarlayın.
- Künt laminektomi forseps kullanarak, forsepsleri orta hattan lateral yönde hareket ettirerek, beyin sapının net bir görünümü olana kadar ve hedef için gerektiği gibi daha fazla yanal alan oluşturmak için küçük bağ dokusu iplikçiklerinin durasını temizleyin.
5. Sarnıç zarının açılması
- Oksipital kemikten atlasa kadar uzanan durayı yakalamak için açılı Dumont forsepslerini (#4/45) kullanın. Dura'yı oksipital kemiğin yakınında tutun ve durada küçük bir açıklık (~ 0,5 ila 1,5 mm) yapmak için yay makasını kullanın.
NOT: Bu rostral konumda, beyin sapı ile üstteki dura arasındaki boşluk en geniştir ve duranın güvenli bir şekilde manipüle edilmesi için yeterli alan sağlar. - Durayı kaldırmak ve durayı daha da açmak için yaylı makası kullanın. Pencerenin boyutu hedefe bağlıdır.
NOT: Birden fazla uzunlamasına enjeksiyon veya bilateral enjeksiyon yaparken daha büyük bir pencereye ihtiyaç duyulacaktır; tek taraflı veya orta hat enjeksiyonları yapılırken küçük bir pencere yeterli olacaktır. - Dura açıldıktan sonra, fazla beyin omurilik sıvısını steril bir ipucu ucu ile boşaltın.
6. Yer işaretlerinin ve sıfır noktasının tanımlanması
- Beyin sapının sırt yüzeyini, açık dura boyunca ayrıntılı işaretlerle görüntüleyin. Merkezi kanalın IV ventriküle açıldığı nokta olan obeks, standart ön-arka ve mediolateral sıfır noktasıdır.
7. Hedef koordinatları
NOT: Çeşitli hedefler için, metodolojiler arasındaki geçişi kolaylaştırmak için sıfır noktası bregma'ya göre anterior posterior (AP) ve mediolateral (ML) koordinatları ve sıfır noktası obex'e göre AP ve ML koordinatları ile cisterna magna koordinatları içeren standart koordinatların bir listesini ekledik (Tablo 1). Dorsoventral (DV) koordinatlar, AP ve ML giriş noktasındaki beyin veya beyincik yüzeyine (standart yaklaşım) veya beyin sapı veya üst servikal kordonun yüzeyine (sarnıç magna yaklaşımı) göredir. Ameliyat öncesi planlama yapılmalıdır.
- Hedefi belirlemek için üç koordinat kümesini kullanın: AP, ML ve DV. Baş pozisyonu nedeniyle, beyin sapı yapılarının göreceli oryantasyonu konuma göre değişir.
- Hedef mesafe >0,4 mm için kaudalden obekse (Şekil 1B, yeşil) aşağıdakileri gerçekleştirin.
- AP: Obex ve hedef arasındaki AP mesafesini tahmin etmek için herhangi bir standart stereotaksik referans atlası (örneğin, Paxinos ve Franklin atlas2) veya enine düzlemde kesilmiş doku serilerini kullanın.
- ML: Obex ve hedef arasındaki ML mesafesini tahmin etmek için enine düzlemde kesilmiş herhangi bir standart stereotaksik referans atlası veya doku serisini kullanın.
- DV: AP ve ML hedef noktasındaki beyin veya beyincik yüzeyine göre koordinatları tahmin edin. İstenilen AP ve ML koordinatlarındaki beyin sapı yüzeyi ile hedef arasındaki mesafeyi tahmin etmek için enine düzlemde kesilmiş herhangi bir standart stereotaksik referans atlası veya doku serisini kullanın.
- Hedef mesafe için <0,4 mm kaudalden obekse (Şekil 1B, turuncu) aşağıdakileri gerçekleştirin.
- AP: Beyin sapının anterofleksiyonunu hesaba katmak için koordinatları ayarlayın. Ventral ve rostral koordinatlar için, AP beyin sapı giriş noktası, standart düzlemdeki hedef AP koordinatına göre daha kaudal olacaktır.
- ML: Hedef koordinatları standart bir stereotaksik referans atlasından veya enine düzlemde kesilmiş doku serilerinden türetin. Koordinatlar, hedef AP düzeyinde görselleştirilmiş orta hatta göre olacaktır.
- DV: AP ve ML hedef noktasındaki beyin sapının yüzeyine göre koordinatları tahmin edin. DV'yi beyin sapının anterofleksiyonunu hesaba katacak şekilde ayarlayın. Ventral ve rostral koordinatlar için, DV koordinatları standart düzlemde beyin sapının dorsal yüzeyinden olan mesafeden daha büyük olacaktır.
- Hedef mesafe >0,4 mm için kaudalden obekse (Şekil 1B, yeşil) aşağıdakileri gerçekleştirin.
8. Hedefin enjeksiyonu
- Stereotaksik kolu kullanarak pipeti veya şırıngayı hedefe indirin ve standart stereotaksik yaklaşımlarda olduğu gibi çözelti enjekte edin. 3-50 nL arasındaki hacimleri kullanırken iğne izinden kaçınmak için enjeksiyondan sonra 1-5 dakika yerinde bırakın. Ardından, stereotaksik kolu kullanarak pipeti veya şırıngayı kaldırın.
- 8.1. adımı yineleyin. birden fazla hedef için.
9. Cerrahi alanın kapatılması
- Kancaları cerrahi alandan dikkatlice çıkarın. Eşleştirilmiş longus kapitis kasları, sarnıç magnasını tamamen kaplayan nötr bir pozisyona geri dönecektir. Trapezius kasını ve orta hatta dura mater'i kapatmayın, çünkü dikişleri tutmak için çok kırılgandırlar.
- Cildi üç naylon veya polipropilen sütürle kapatın (5-0 veya 6-0).
10. Ameliyat sonrası bakım
- İzofluranı kapatın ve fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. Fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin ve uyanana ve hareket edene kadar gözlemleyin.
- Ameliyat sonrası 1-3. günlerde sağlık durumunu, ağırlığı ve dikişleri izleyin. Dikişleri daha önce alınmamışsa 10. günde çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sarnıç magna yaklaşımı, standart stereotaksik yaklaşımlarla ulaşılması zor olan veya tutarsız hedeflemeye eğilimli olan kaudal beyin sapı ve üst servikal kord yapılarını hedeflemeyi mümkün kılar. Sarnıç magnasına ulaşma ameliyatı, cildin insizyonlarını, ince bir trapezius kası tabakasını ve dura materin açılmasını gerektirir ve bu nedenle fareler tarafından iyi tolere edilir. Standart stereotaksik yaklaşımlarda olduğu gibi birden fazla çapak deliğinin delinmesini gerektirmediğinden, birden fazla (uzunlamasına dağılmış veya iki taraflı) bölgeyi hedeflerken özellikle verimli ve daha az invazivdir. Farelerde, Şekil 3'te hipoglossal çekirdek ve ventromedial medulla (GiV) için daha fazla gösterdiğimiz gibi, sarnıç magna yaklaşımını kullanarak kaudal beyin sapındaki hipoglossal çekirdek9, ventral solunum grubu 8 ve bitişik retiküler formasyon8 gibi yapıları rutin olarak hedefledik. Örneğin, hipoglossal çekirdek, dorsal medulla oblongata'daki ince fakat rostrokaudal olarak uzatılmış bir motonöron sütunudur ve rostral kutbu standart bir yaklaşımla hedeflenebilir. Bununla birlikte, DV koordinatları (~ 4.5 mm) çoğunlukla beyin sapına giren sadece 1.2-1.4 mm ile üstteki beyincik tarafından dikte edildiğinden, farenin başının konumlandırılmasındaki nispeten küçük bir fark, bu nedenle kolayca yanlış yerleştirilmiş bir enjeksiyona neden olabilir. Bu hedefin sıfır noktası obex'e yakınlığı nedeniyle, sarnıç magna yaklaşımı ile daha güvenilir bir şekilde hedeflenebilir. Ayrıca, beyin sapı ve omurilik arasındaki geçişe kadar uzanan hipoglossal çekirdeğin kaudal ucu aynı sarnıç magna yaklaşımı ile hedeflenebilirken, standart yaklaşımın AP yaklaşımını açılandırarak ve oksipital kemik ve üstteki boyun kas sistemini önlemek için koordinatları ayarlayarak böyle bir kaudal bölgeye ulaşmak için değiştirilmesi gerekecektir.
Sarnıç magna yaklaşımının standart yaklaşıma göre doğruluğunu belirlemek için, ventral (ventromedial medulla; GiA/V; N = 10) ve sırt (NuXII; N = 16) bölgeleri. Ölçümler kaudal beyin sapının enine kesitlerinde yapıldı (Şekil 3). Sonuçlar (Şekil 4), sarnıç magna yaklaşımı için anteroposterior, mediolateral ve özellikle dorsoventral düzlemlerde standart yaklaşıma kıyasla anlamlı derecede daha küçük hatalar göstermektedir. Bu sonuçlar, bu hedefler için cisterna magna yaklaşımının gelişmiş doğruluğunu vurgulamaktadır. Standart stereotaksik koordinatları (Paxinos ve Franklin 2'den türetilmiş, ancak çalışmalarımız için optimize edilmiş bregma'ya göre) ve sarnıç magna koordinatlarını (obekse göre) Tablo 1'e dahil ettik. Bu koordinatların tümü, Şekil 3'te hipoglossal çekirdek ve ventromedial medulla için gösterildiği gibi optimize edilmiş ve doğrulanmıştır.
Şekil 1: Anahtar yer işaretlerinin, hedef alanların ve stereotaksik sarnıç magna yaklaşımının düzleminin şematik gösterimi . (A) Anahtar anatomik işaretler ve sagital düzlemde konumlandırma. (B) Sarnıç magna stereotaksik yaklaşıma karşı standart stereotaksik yaklaşımla ulaşılabilecek alanlar ve referans noktalarıyla ilişkisi. i) Standart yaklaşım, eflatun ve mor renkte hedef bölgelerden uzak olan kemikli bregma ve lambda işaretlerini kullanır. Macentada (kaudal medulla oblongata ve üst servikal kordon) alan eğimli oksipital kemik ve boyun kasları nedeniyle ulaşılması zordur. Mor renkli alan (rostral medulla oblongata) harekete eğilimlidir ve geleneksel simge yapılardan uzaktır. ii) Sarnıç magna yaklaşımı, kaudal medulla oblongata ve üst servikal kordona erişim için uygundur ve kaudal medulla oblongata'dan rostral olarak kaudal pons seviyesine kadar uzanan uzunlamasına sütunlar halinde organize edilmiş beyin sapı yapılarını incelerken avantajlara sahiptir. (C) Sarnıç magna yaklaşımı ile ilgili olarak çeşitli stereotaksik referans atlaslarının düzlemlerinin şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Stereotaksik sarnıç magna yaklaşımına adım adım şematik genel bakış . (A) Kulak çubukları en üst seviyede eşit şekilde konumlandırılmış fare adaptörü, alçaltılmış konumda ağız çubuğu ve anterofleksiyonlu kafayı 90° açıyla sabitlemek için plastik bir kart. (B) Kulak çubuklarını kullanarak fareyi stereotakksi çerçeveye sabitleyin ve kafayı 90°'de anteroflex yapın ve stereotaksik çerçeveyi referans alarak sert bir plastik kartla pozisyonda tutun. (C) Vücudun oksiputla aynı düzlemde olacak şekilde yükseltildiğinden emin olun. Palpate önemli simge yapılar. (D) Oksiputtan omuzların rostral kısmına kadar bir cilt kesisi yapın. (E) Trapezius kasının raphesinde bir kesi yapın. Orta çizgide kaldığınızdan ve altta yatan kasları kesmediğinizden emin olun. (F) Longus kapitis kasının iki göbeği arasındaki orta çizgiyi oksiputtan başlayarak tanımlayın ve laminektomi forsepslerini kaudal yönde yönlendirin. (G) Yara kancalarının her birini longus kapitis kasının karınları arasına yerleştirin ve sarnıç magna görünene kadar yeniden konumlandırın. (H) Kemikli yer işaretlerini (oksipital kemik, atlas), bu kemikli yapılar arasında uzanan dura materini ve altta yatan beyincik ve beyin sapını tanımlayın. Hedef seviyeyi ortaya çıkarmak için dura mater'i gerektiği gibi temizleyin. (I) Yaylı makas ve ince forseps kullanmak durayı açar. (J) AP ve ML sıfır noktasını oluşturan obeksi tanımlayın. Pipetleri tercih ettiğiniz AP ve ML koordinatlarına taşıyın. Pipet, beyin sapının dorsal yüzeyine ulaşana kadar indirin. Bu DV sıfır noktasıdır. Pipetleri istediğiniz koordinata indirin. (K) Pipetleri ve yara kancalarını çıkarın ve longus kapitis kaslarının orijinal pozisyonlarına geri dönmesine izin verin. (L) Yarayı kapatın ve fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hedef koordinatların değerlendirilmesi. Kaudal beyin sapının düşük büyütmeli fotomikrografları. (A) ChAT-cre L10 GFP (yeşil) muhabir farenin (dişi, 6 aylık) hipoglossal çekirdeğine retrograd izleyici kolera toksini alt ünitesi b'nin (CTb; mavi) enjeksiyonu. CTb enjeksiyonunun hipoglossal çekirdekle sınırlı olduğunu unutmayın. (B) Bir vGluT2-ires-cre L10 GFP muhabirinin (yeşil) faresinin (erkek, 2 aylık) glutamaterjik hücrelerinin, kaudal medial medulla oblongata'nın (GiV bölgesinin kaudal kutbu) ventral kısmında koşullu bir anterograd izleyici (macenta) ile transfeksiyonu. (C) Bir vGLuT2-ires-cre farede (erkek, 2 aylık) glutamaterjik nöronların TVA (macenta) transfeksiyonunu ve modifiye kuduz enfeksiyonunu (yeşil) kaudal medial medulla oblongata'da (GiV bölgesinin kaudal kutbu) gösteren koşullu retrograd izleme. Kuduz virüsü üst servikal omuriliğe enjekte edildi. İç simge yapılar bir rehber görevi görür. Kısaltmalar-cAmb: Ambiguus kompleksinin kompakt çekirdeği; Ap: Alan Postrema; DMV: Vagusun Dorsal Motor Çekirdeği; GiV: Gigantosellüler Çekirdek, ventral kısım; IO: İnferior Zeytin; IRt: Orta Retiküler Çekirdek; LRN: Lateral Retiküler Çekirdek; NuXII- Hipoglossal Çekirdek; sol: Yalnız Yolun Çekirdeği; Sp5: Spinal Trigeminal Çekirdek; VRG: ventral solunum grubu. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Standart ve sarnıç magna yaklaşımları arasındaki doğruluğun karşılaştırılması. Amaçlanan hedefin merkezi ile anteroposterior düzlemdeki (A), mediolateral düzlemdeki (B) ve dorsoventral düzlemdeki (C) gerçek bölgenin merkezi arasındaki ortalama mesafe. Veriler, standart bir yaklaşım kullanılarak N = 13 yetişkin fareden ve sarnıç magna yaklaşımı kullanılarak N = 13 yetişkin fareden elde edildi. Hedefin yarıçapı 30 μm olarak belirlendi. Sonuçlar anteroposterior düzlemde (t(24) = 2.08, p = 0.049; iki kuyruklu t-testi; alfa 0.05), mediolateral düzlemde (t(24) = 2.55, p = 0.018; iki kuyruklu t-testi; alfa 0.05) ve dorsoventral düzlemde (t(24) = 4.33, p = 0.0002; iki kuyruklu t-testi; alfa 0.05) daha yüksek doğruluk göstermektedir. Çubuk grafikler standart sapmalı ortalamayı temsil eder ve tek tek noktalar her faredeki değerleri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Kaudal beyin sapı yapılarını hedeflemek için standart ve sarnıç magna stereotaksik koordinatlarına genel bakış. Hem standart hem de sarnıç magna yaklaşımları için, Paxinos ve Franklin atlas2'deki koordinatların, ilgilenilen bölgeler histoloji tarafından doğrulandığı şekilde uygun şekilde hedeflenene kadar ayarlandığını lütfen unutmayın (Şekil 3). Ayrıca, retiküler formasyondaki alanların iyi tanımlanmış sınırlardan yoksun olduğunu ve burada Paxinos ve Franklin2'de olduğu gibi etiketlendiğini unutmayın. Kısaltmalar-AP: anteroposterior. ML: mediolateral. DV: dorsoventral. ChAT: Kolin Asetiltransferaz; F: Kadın; M: Erkek; M & F: Erkek ve Kadın; NA: uygulanamaz; Pet1: plazmasitoma eksprese transkripsiyon faktörü 1; Sert: Serotonin taşıyıcı, vGaT: Vesiküler GABA taşıyıcı; vGluT2: Veziküler Glutamat taşıyıcı 2; WT: Vahşi tip. Tüm koordinatlar milimetre (mm) cinsindendir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standart stereotaksik cerrahi, CNS1'deki hedef bölgelerin koordinatlarını hesaplamak için genellikle kafatası işaretlerine dayanır. Hedef bölgelere daha sonra kafatası1'den delinen çapak delikleri aracılığıyla erişilir. Bu yöntem, kaudal beyin sapı için ideal değildir, çünkü hedef bölgeler anteroposterior ve dorsoventral düzlemlerdeki kafatası işaretlerinden uzakta bulunur2 ve kafatası ve üstteki kasların anatomisi6'ya erişimi zorlaştırır (Şekil 1Bi). Çalışmamızda, kaudal beyin sapı ve üst omurilikteki hedef bölgelere erişmek için sarnıç magna yaklaşımı adı verilen alternatif bir stereotaksik yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntemi standart bir stereotaktik yaklaşımdan farklı kılan temel özellikler, sarnıç magnasını açmak için başın anterofleksiyonu ile konumlandırma ve beyin sapının dorsal yüzeyindeki anahtar beyin sapı işaretlerinin obeks gibi referans noktaları olarak kullanılmasıdır. Sonuçlarımız, bu yaklaşımın küçük hacimli (5-50 nL) izleyicilerin veya adeno ilişkili virüslerin (AAV'ler) ayrı beyin sapı yapılarına verilmesi için uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kemikli bir yapı yerine bir CNS dönüm noktasını temsil eden ve amaçlanan hedefe yakın olan bir referans noktasının kullanılması, devre haritalaması ve kemogenetik çalışmalarla ilgili olarak, küçük hedefler ve küçük enjeksiyon hacimleri için tekrarlanabilirliği ve doğruluğu arttırır (Şekil 3)14,15.
Herhangi bir protokolde olduğu gibi, cisterna magna yaklaşımı, tekrarlanabilirliği sağlamak için kritik olan adımlara sahiptir. Üç farklı düzlemdeki koordinatlara (anteroposterior, mediolateral ve dorsoventral) bağlı olan herhangi bir stereotaksik yaklaşımda olduğu gibi, konumlandırma da kritiktir. Sarnıç magna yaklaşımı için, bu sadece 90 ° 'de anteroflexed olması gereken başın pozisyonunu değil, aynı zamanda kaudal beyin sapı ve üst servikal kordonun aynı düzlemde olması için yükseltilmesi gereken vücudun pozisyonunu da içerir. Bir diğer kritik adım, kanamaya neden olan gereksiz manipülasyonlardan kaçınmaktır, çünkü bu, önemli yer işaretlerinin görselleştirilmesini engelleyecektir. Yüksek kanama riski taşıyan iki manipülasyon vardır. İlk olarak, sarnıç magnasını kaplayan dura mater, nispeten büyük bir kas (longus capitis) ile kaplıdır. Bu, orta hattın her iki tarafında bir göbek bulunan eşleştirilmiş bir kas olduğundan, bu kasın iki göbeğinin sadece orta hatta hafifçe ayrılması gerekecektir. Bu kasların kesilmesi gerekli değildir ve kanamaya neden olur. İkincisi, dura materin başarılı bir şekilde açılmasında, kaudal beyin sapının ve üst servikal kordonun dorsal yüzeyinin üstünde değişken sayıda damar görünecektir. Bu damarlar, koordinatlarda küçük ayarlamalar uygulayarak (0,1 mm'ye kadar) veya deneysel paradigma izin veriyorsa, farklı bir hedef seçerek kaçınılmalıdır.
Sarnıç magna yaklaşımının en büyük avantajı, standart stereotaksik düzlemi kullanırken ulaşılması zor olan beyin sapı ve üst servikal yapılara, oksipital kemiğin kaudal ucuna yakın veya sadece kaudal olarak yerleştirildikleri için erişim sağlamasıdır. Ayrıca, medulla oblongata'daki hedefler için yaklaşım beyinciğin ve dolayısıyla serebellar lezyon etkilerinden veya standart metodoloji kullanıldığında çalışma sonuçlarını etkileyebilecek bir iğne yolu aracılığıyla sahte etiketlemeden kaçınır. Sarnıç magna yaklaşımının bir diğer avantajı da beyin sapının dorsal yüzeyinin görünür hale gelmesidir. Bu, dorsal yüzeydeki bir dönüm noktasını koordinatlar için referans noktası olarak kullanma fırsatı sağlar. Ayrıca, yaklaşım esnektir ve hedefe bağlı olarak optimize edilebilir. Örneğin, referans noktası olarak bir orta hat simgesi olan obex'i kullandık. Bununla birlikte, sırt yapılarını hedeflerken, ilgilenilen yapının kendisi sırt yüzeyinin manzarasını belirleyebilir. Örneğin, dış çivi çekirdeği dorsal olarak çıkıntı yapar ve böylece görselleştirilebilir ve doğrudan enjekte edilebilir. Ventral solunum grubu veya belirsiz kompleks gibi lateral hedefler için, sarnıç magna penceresi yanal yönde arttırılabilir. Aynı şekilde, üst servikal yapıların hedeflenmesi için pencere atlasa doğru uzatılabilir. Büyük bir hayvan stereotaktik çerçevesine yerleştirilmiş bir fare adaptörü kullanırken, temel adımlar izlendiği sürece yaklaşım diğer çerçevelere veya kurulumlara kolayca uyarlanabilir. Örneğin, plastik bir kart yerine, ağız çubuğu, kafayı sabit bir anterofleksiyon pozisyonunda tutmak için burun köprüsüne yerleştirilebilir. Tablo 1'de belirtildiği gibi, obex sıfır noktası olan beyin sapı hedef bölgelerinin koordinatlarının bir referans görevi gördüğünü ve ayarlamaların, bir referans atlasından standart bir yaklaşım için hedef koordinatları türetilirken yapılması gereken ayarlamalara benzer şekilde, fare gerginliğine, yaşına, cinsiyetine, stereotaksik kolun kalibrasyonuna ve konumlandırma tekniğine dayanarak belirtilebileceğini belirtmek gerekir. Bu, özellikle Şekil 1'de gösterildiği gibi daha fazla rostral hedef için yaklaşımın düzlemi hakkında fikir sahibi olmayı gerektirir. Koordinatların test edilmesi, aynı faredeki farklı koordinatlar için floresan boncuklar veya floresan etiketli Kolera Toksini alt birimi b gibi farklı izleyiciler kullanılarak yapılabilir. Beyin sapı/omurilik dokusu kesitlerinin histolojik analizleri (bu protokolde ele alınmamıştır) daha sonra objektif iç işaretler 8,9,11,16'ya göre lokalizasyon hakkında veya bir referans atlası ile karşılaştırılması için geri bildirim sağlar. Koordinatlar daha sonra ayarlanabilir, tekrar test edilebilir ve sonlandırılabilir.
Sarnıç magna yaklaşımının da sınırlamaları vardır. Bu yaklaşımla ulaşılabilen SSS bölgeleri kaudal pons, medulla oblongata ve üst servikal kord ile sınırlıdır. Kaudal ponlara standart yaklaşımla kolayca erişilebilse de, sarnıç magna yaklaşımı, retiküler formasyon içindeki alt bölümlerde olduğu gibi, medulla oblongata'dan kaudal pons'a uzanan uzunlamasına yönlendirilmiş yapıların alt bölümlerini incelerken avantajlara sahiptir. Başka bir göreceli sınırlama, bu yaklaşımı aynı farede ikinci kez kullanırken, örneğin modifiye kuduz izleme14'te ortaya çıkar. Skar dokusunun varlığı ameliyat süresini uzatabilir veya küçük yer işaretlerini gizleyebilir. Bununla birlikte, elimizdeki bu yöntem, bu durumda standart stereotaksik yaklaşımdan hala üstün olmuştur, çünkü ilk enjeksiyonun yeri, diğer benzersiz yer işaretlerinin damarlarının konumu ile ilgili olarak belgelenebilir ve bu da kesin giriş noktasını geri bulmayı kolaylaştırır. Bu yaklaşım, kaudal medulla ve üst omurilikteki çalışmaların izlenmesinde üstün olmakla birlikte, kronik olarak donanım implantasyonu için kullanılamaz. Bu nedenle, optik liflerin implantasyonunu gerektiren in-vivo optogenetik ve kalsiyum görüntüleme çalışmaları için17 sarnıç magna yaklaşımı ilk önce hedef bölgeye bir AAV vermek için kullanılabilir, ardından lifli veya kanüllü aletli farelere standart bir yaklaşım kullanılarak ikinci bir cerrahi uygulanabilir. Bu yaklaşım, hedef sitenin ayrı tutulmasını sağlarken, fiber / donanım yerleşimi, donanımın nispeten büyük boyutu nedeniyle daha affedicidir (yani, daha az doğru olabilir). Son olarak, sarnıç magna yaklaşımı, standart stereotaksik yaklaşımdan daha gelişmiş cerrahi beceriler gerektirir. Basit kemikli yer işaretlerinin tanınmasından ziyade, daha karmaşık beyin sapı ve kas-iskelet sistemi yer işaretlerine dair içgörü gerektirir. Ayrıca, herhangi bir hassas ameliyatta olduğu gibi, prosedürün başarısı ve verimliliği, mükemmel durumda olan uygun bir araç setine bağlıdır. Bu protokol ikinci sorunları ele alır ve deneyciler tarafından ayrıntılı bir rehber olarak kullanılabilir.
Sonuç olarak, cisterna magna yaklaşımı standart stereotaksik yaklaşımı tamamlayıcı niteliktedir ve standart stereotaksik yaklaşımla kolayca erişilemeyen kaudal beyin sapı ve üst servikal kordonu hedeflerken birçok avantaj sağlamaktadır. Amaçlanan hedeflere yakın olan kemikli yer işaretleri yerine CNS olan referans noktalarını kullanır, tekrarlanabilirliği ve doğruluğu arttırır. Bu, ayrıntılı haritalama veya kemogenetik çalışmalar bağlamında küçük enjeksiyon hacimlerinin ayrı bölgelere verilmesi gerektiğinde yaklaşımı özellikle değerli kılar. Bu yaklaşım aynı zamanda fonksiyonel kemogenetik, optogenetik, lif fotometrisi veya lezyon yaklaşımları için de geçerlidir; burada bir AAV virüsü veya toksini, motor fonksiyon veya sensorimotor entegrasyon ile bir okuma olarak bir hedefe verilir: medulla oblongata'daki hedefler için beyincik boyunca bir rotadan kaçınır ve bu nedenle çalışma sonuçlarına müdahalesini sınırlar. Hayvan refahı açısından bakıldığında, prosedür, bölgelere iki taraflı veya uzunlamasına erişmek için birden fazla çapak deliği açılmasını gerektirmez, bu da ameliyat süresini ve prosedürün invazivliğini azaltır. Yaklaşımı fareler için ayrıntılı olarak özetlemiş olsak da, aynı ilkeler diğer türler için de geçerlidir11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma R01 NS079623, P01 HL149630 ve P01 HL095491 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004).
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
