Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Summary

Die stereotaktische Chirurgie zur Ausrichtung auf Gehirnstellen bei Mäusen beinhaltet häufig den Zugang durch die Schädelknochen und wird von Schädel-Landmarken geleitet. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz, um den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark über die Cisterna magna anzusprechen, der auf der direkten Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken beruht.

Abstract

Stereotaktische Chirurgie, um Gehirnstellen bei Mäusen anzuvisieren, wird häufig von Schädel-Landmarken geleitet. Der Zugang erfolgt dann über Gratlöcher, die durch den Schädel gebohrt werden. Dieser Standardansatz kann für Ziele im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang aufgrund spezifischer anatomischer Herausforderungen eine Herausforderung darstellen, da diese Stellen von Schädellandmarken entfernt sind, was zu Ungenauigkeiten führt. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz über die Cisterna magna, der verwendet wurde, um diskrete Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur anzusprechen. Die Cisterna magna erstreckt sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas (d.h. dem zweiten Wirbelknochen), ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und wird von Dura mater bedeckt. Dieser Ansatz bietet einen reproduzierbaren Zugang zu ausgewählten Strukturen des zentralen Nervensystems (ZNS), die aufgrund anatomischer Barrieren sonst schwer zu erreichen sind. Darüber hinaus ermöglicht es die direkte Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken in unmittelbarer Nähe zu den Zielstellen, wodurch die Genauigkeit bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur erhöht wird. Schließlich bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, das Kleinhirn zu vermeiden, was für motorische und sensomotorische Studien wichtig sein kann.

Introduction

Die stereotaktische Standardchirurgie zur gezielten Gehirnstelle bei^{Mäusen 1} beinhaltet häufig die Fixierung des Schädels mit einem Satz Ohrstangen und einem Mundbalken. Die Koordinaten werden dann auf der Grundlage der Referenzatlanten^2,3 und der Schädellandmarken geschätzt, nämlich Bregma (der Punkt, an dem die Nähte der Frontal- und Parietalknochen zusammenkommen) oder Lambda (der Punkt^, an dem die Nähte der Parietal- und Hinterhauptsknochen zusammenkommen; Abbildung 1A,B). Durch ein Gratloch in den Schädel oberhalb des geschätzten Ziels kann dann die Zielregion erreicht werden, entweder für die Lieferung von Mikroinjektionen oder Instrumenten mit Kanülen oder optischen Fasern. Aufgrund von Variationen in der Anatomie dieser Nähte und Fehlern in der Lokalisation von Bregma oder Lambda ^4,5 variiert die Position der Nullpunkte in Bezug auf das Gehirn von Tier zu Tier. Während kleine Fehler beim Targeting, die sich aus dieser Variabilität ergeben, für große oder nahe gelegene Ziele kein Problem darstellen, sind ihre Auswirkungen für kleinere Interessengebiete, die von den Nullpunkten in den anteroposterioren oder dorsoventralen Ebenen entfernt sind, und / oder bei der Untersuchung von Tieren unterschiedlicher Größe aufgrund von Alter, Belastung und / oder Geschlecht größer. Es gibt mehrere zusätzliche Herausforderungen, die für die Medulla oblongata und die obere Halsschnur einzigartig sind. Erstens sind kleine Änderungen der anteroposterioren Koordinaten aufgrund der Position und Form des Kleinhirns mit signifikanten Änderungen der dorsoventralen Koordinaten relativ zur Dura verbunden (Abbildung 1Bi)^2,6,7. Zweitens ist die obere Halsschnur nicht im Schädel^{enthalten 2}. Drittens macht die schräge Position des Hinterhauptbeins und der darüber liegenden Schicht der Nackenmuskulatur² den stereotaktischen Standardansatz für Strukturen, die sich in der Nähe des Übergangs zwischen Hirnstamm und Rückenmark befinden, noch schwieriger (Abbildung 1Bi). Schließlich sind viele Ziele, die im kaudalen Hirnstamm und in der Halsschnur von Interesse sind, klein², was präzise und reproduzierbare Injektionen erfordert ^8,9.

Ein alternativer Ansatz durch die Cisterna magna umgeht diese Probleme. Die Cisterna magna ist ein großer Raum, der sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt (Abbildung 1A, d.h. der zweite Wirbelknochen)¹⁰. Es ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und mit Dura mater¹⁰ bedeckt. Dieser Raum zwischen dem Hinterhauptbein und dem Atlas öffnet sich, wenn der Kopf anteroflexiert wird. Es kann erreicht werden, indem man zwischen den darüber liegenden paarigen Bäuchen des Musculus longus capitis navigiert und die dorsale Oberfläche des kaudalen Hirnstamms freilegt. Interessante Regionen können dann basierend auf den Landmarken dieser Regionen selbst ins Visier genommen werden, wenn sie sich in der Nähe der dorsalen Oberfläche befinden. oder durch die Verwendung des Obex, des Punktes, an dem sich der zentrale Kanal in den IV-Ventrikel öffnet, als Nullpunkt für Koordinaten, um tiefere Strukturen zu erreichen. Dieser Ansatz wurde erfolgreich bei einer Vielzahl von Arten eingesetzt, darunter die Ratte¹¹, Katze¹², Maus^8,9 und der nichtmenschliche Primat¹³, um auf die ventrale Atmungsgruppe, die medulläre mediale retikuläre Formation, den Kern des Einzeltraktes^, die Arealpostrema oder den hypoglossalen Kern abzuzielen. Dieser Ansatz wird jedoch nicht häufig verwendet, da er Kenntnisse der Anatomie, ein spezialisiertes Toolkit und fortgeschrittenere chirurgische Fähigkeiten im Vergleich zum stereotaktischen Standardansatz erfordert.

Hier beschreiben wir einen schrittweisen chirurgischen Ansatz, um den Hirnstamm und das obere Halsband über die Zisterne magna zu erreichen, Orientierungspunkte zu visualisieren, den Nullpunkt zu setzen (Abbildung 2) und die Zielkoordinaten für die stereotaktische Abgabe von Mikroinjektionen in die diskreten Hirnstamm- und Rückenmarksregionen von Interesse zu schätzen und zu optimieren (Abbildung 3). Anschließend besprechen wir die Vor- und Nachteile dieses Ansatzes.

Protocol

Der Autor erklärt, dass das Protokoll den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee am Beth Israel Deaconess Medical Center folgt.

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und stereotaktischem Rahmen

HINWEIS: Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Sterilität wird mit der sterilen Spitzentechnik aufrechterhalten.

1. Installieren Sie den stereotaktischen Arm mit einer Mikropipette oder Spritze, die mit einem Injektionsmittel Ihrer Wahl (Adeno-assoziiertes Virus (AAV) oder herkömmlicher Tracer) auf dem stereotaktischen Rahmen gefüllt ist, und bereiten Sie den Mausadapter vor (Abbildung 2A).
2. Bereiten Sie autoklavierte chirurgische Instrumente (Materialtabelle) vor und legen Sie sie auf eine sterile Oberfläche.

2. Anästhesieinduktion und Mausvorbereitung

1. Schalten Sie O2 bei 0,5 l/min ein und stellen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 4,0 ein, wobei Sie sicherstellen, dass der_{O2-Durchfluss} zur Induktionsbox erfolgt.
   ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass die Isofluran-Induktionsbox in einer Haube platziert ist und dass das Isofluran von der Operationsstelle weggefegt wird.
2. Legen Sie die Maus (10 Wochen altes Männchen C57BL/6J) in die Induktionskammer.
3. Sobald sich die Atmung verlangsamt hat, öffnen Sie die Induktionskammer und heben Sie die Maus leicht an. Verwenden Sie Haarschneidemaschinen, um Haare von Kopf bis Schultern zu entfernen.

3. Positionierung der Maus im stereotaktischen Rahmen

1. Bewegen Sie die Maus zum stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Nase in einen flexiblen Nasenkonus. Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass der_O2-Fluss jetzt auf den Nasenkegel gerichtet ist.
2. Platzieren Sie die Maus nur mit Ohrstangen im stereotaktischen Rahmen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ohrstangen gleichmäßig sind und der Kopf eben ist.
3. Anteroflex den Kopf der Maus in einen 90°-Winkel, indem Sie die Nase manuell führen. Um diese Position zu sichern, platzieren Sie eine Kunststoffbarriere zwischen den Ohrstangensäulen des Mausadapters parallel zu den Säulen. Der flache Teil des Schädels dient als Referenz, ähnlich dem flachen Schädelansatz in der konventionellen stereotaktischen Chirurgie.
   HINWEIS: Beugen Sie den Kopf nicht zu stark (d.h. über einen Winkel von 90° zwischen der Ebene des vorderen Schädelknochens und der Ebene der Tischoberfläche), da dies den Luftstrom durch die oberen Atemwege behindert. Wenn der Luftstrom behindert wird, positionieren Sie die Maus neu, wobei Sie sicherstellen, dass der Körper unter dem Rumpf gestützt wird und eine Plastikkarte auf 90° zwischen der Ebene des vorderen Schädelknochens und der Ebene der Tischoberfläche eingestellt ist, wie in Abbildung 2A,C dargestellt.
4. Legen Sie das Heizkissen unter die Maus und stellen Sie dann sicher, dass der Hals und der Rest des Körpers auf der gleichen Höhe (d. h. bei ca. 180 ° oder parallel zum Tisch) positioniert sind. Die Werkzeugkiste, die die Federschere hält, kann verwendet werden, um den Körper in diese Position zu heben.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da sich der kaudale Hirnstamm und die obere Halsschnur je nach Position bewegen, im Gegensatz zu mehr rostralen Teilen des ZNS, die vom Schädel an Ort und Stelle gehalten werden.
5. Injizieren Sie eine Einzeldosis von 4 mg/kg Meloxicam Slow-Release (SR) subkutan (s.c.) bei einem Volumen von 2 μL/g Körpergewicht und geben Sie Gleitmittel auf die Augen.
6. Reinigen Sie die chirurgische Inzisionsstelle zuerst mit einem 70% igen Alkohol-Prep-Pad, dann mit einem Betadin-Prep-Pad und dann wieder mit einem Alkohol-Prep-Pad und lassen Sie es trocknen.
7. Legen Sie ein Tuch unter den Körper.
8. Desinfizieren Sie die Hände und ziehen Sie sterile Handschuhe an.
9. Legen Sie einen Vorhang an die Operationsstelle.

4. Operation zum Zugang zur Zisterne Magna

1. Stellen Sie sicher, dass die Maus angemessen betäubt ist, indem Sie die Zehen kneifen oder den Hornhautreflex überprüfen.
2. Reduzierung des Isoflurans auf ein Erhaltungsniveau (2,0).
3. Machen Sie einen 1-1,2 cm großen Schnitt mit chirurgischer Klinge # 10 vom Rand des Hinterhauptbeins in Richtung der Schultern in einer sanften Bewegung.
4. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie Raphe des Trapezmuskels. Dies entblößt die gepaarten Longus capitis-Muskeln.
   HINWEIS: Bei Mäusen ist der Musculus trapezius ein sehr dünner, fast transparenter Muskel. Achten Sie darauf, in der Mittellinie zu bleiben und schneiden Sie nicht in die darunter liegenden Muskeln, da dies zu unnötigen Blutungen führt.
5. Platzieren Sie beide Retraktorhaken zwischen den gepaarten Longus capitis-Muskeln, von denen einer nach links und der andere nach rechts ausgerichtet ist. Das Gewicht der Hämostate sorgt für Spannung an den Retraktorhaken, die durch erneutes Einstellen der Position der Hämostate modifiziert werden kann.
6. Positionieren Sie das Operationsmikroskop an Ort und Stelle, um das Operationsfeld besser sichtbar zu machen.
7. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die linke und rechte Säuche des gepaarten Musculus longus capitis zu trennen, beginnend mit dem Hinterkopf, wo die Mittellinie gut sichtbar ist. Führen Sie die stumpfe Pinzette über den Knochen des Hinterkopfes in der Mittellinie bis zu der Stelle, an der sie auf die zisternale Dura mater trifft, und fahren Sie dann weiter über die Dura mater zum Atlas.
   HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die paarigen Longus capitis-Muskeln zu durchschneiden, da nichts sie in der Mittellinie zusammenhält. Dies führt zu unnötigen Blutungen.
8. Positionieren Sie die Retraktoren neu und passen Sie die Spannung an, indem Sie die Hämostate neu positionieren, wodurch sich der Blick auf die Zisterne Magna öffnet.
9. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die Muskeln weiter in der Mittellinie zu trennen, um ein gutes Sichtfenster des Hirnstamms und des Kleinhirns zu erhalten.
10. Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.9 nach Bedarf, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm unter der Dura sichtbar sind.
11. Reinigen Sie mit stumpfen Laminektomiezangen die Dura der kleinen Bindegewebsstränge, indem Sie die Pinzette von der Mittellinie in eine laterale Richtung bewegen, bis eine klare Sicht auf den Hirnstamm besteht, und um mehr seitlichen Raum zu schaffen, wie es für das Ziel benötigt wird.

5. Öffnen der Zisternalmembran

1. Verwenden Sie die abgewinkelte Dumont-Pinzette (#4/45), um die Dura zu greifen, die sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt. Greifen Sie die Dura in der Nähe des Hinterhauptbeins und verwenden Sie die Federschere, um eine kleine Öffnung (~ 0,5 bis 1, 5 mm) in der Dura zu machen.
   HINWEIS: An diesem rostralen Standort ist der Raum zwischen dem Hirnstamm und der darüber liegenden Dura am breitesten und bietet ausreichend Platz für eine sichere Manipulation der Dura.
2. Verwenden Sie die Federschere, um die Dura anzuheben und die Dura weiter zu öffnen. Die Größe des Fensters hängt vom Ziel ab.
   HINWEIS: Ein größeres Fenster wird benötigt, wenn mehrere Längsinjektionen oder bilaterale Injektionen durchgeführt werden. Ein kleines Fenster reicht aus, wenn einzelne einseitige oder mittlere Injektionen durchgeführt werden.
3. Sobald die Dura geöffnet ist, drainieren Sie überschüssige Zerebrospinalflüssigkeit mit einer sterilen Cue-Spitze.

6. Identifizierung von Landmarken und Nullpunkt

1. Betrachten Sie die dorsale Oberfläche des Hirnstamms mit detaillierten Orientierungspunkten durch die offene Dura. Der Obex, der Punkt, an dem sich der zentrale Kanal in den IV-Ventrikel öffnet, ist der standardmäßige anterior-posteriore und mediolaterale Nullpunkt.

7. Zielkoordinaten

HINWEIS: Für verschiedene Ziele haben wir eine Liste von Standardkoordinaten mit vorderen posterioren (AP) und mediolateralen (ML) Koordinaten relativ zu Nullpunkt-Bregma und Cisterna magna-Koordinaten mit AP- und ML-Koordinaten relativ zu Nullpunkt-Obex aufgenommen, um den Übergang zwischen den Methoden zu erleichtern (Tabelle 1). Dorsoventrale (DV) Koordinaten sind relativ zur Oberfläche des Gehirns oder Kleinhirns (Standardansatz) oder zur Oberfläche des Hirnstamms oder der oberen Halsschnur (Cisterna magna-Ansatz) am Punkt des AP- und ML-Eintritts. Die Planung sollte vor der Operation erfolgen.

1. Verwenden Sie die drei Koordinatensätze, um das Ziel zu bestimmen: AP, ML und DV. Aufgrund der Kopfposition variiert die relative Ausrichtung der Hirnstammstrukturen je nach Standort.
   1. Für den Zielabstand >0,4 mm vom kaudalen zum Obex (Abbildung 1B, grün) gehen Sie wie folgt vor.
      1. AP: Verwenden Sie einen beliebigen stereotaktischen Standardreferenzatlas (z. B. Paxinos und Franklin Atlas²) oder Gewebereihen, die in der Querebene geschnitten wurden, um den AP-Abstand zwischen Obex und dem Ziel zu schätzen.
      2. ML: Verwenden Sie einen beliebigen stereotaktischen Referenzatlas oder eine Gewebereihe, die in der Querebene geschnitten ist, um den ML-Abstand zwischen Obex und dem Ziel zu schätzen.
      3. DV: Schätzen Sie Koordinaten relativ zur Oberfläche des Gehirns oder Kleinhirns am AP- und ML-Zielpunkt. Verwenden Sie einen beliebigen stereotaktischen Standardreferenzatlas oder eine Gewebereihe, die in der Querebene geschnitten ist, um den Abstand zwischen der Hirnstammoberfläche an den gewünschten AP- und ML-Koordinaten und dem Ziel zu schätzen.
   2. Für den Zielabstand <0,4 mm vom kaudalen zum Obex (Abbildung 1B, orange) gehen Sie wie folgt vor.
      1. AP: Passen Sie die Koordinaten an, um die Anteroflexion des Hirnstamms zu berücksichtigen. Für ventrale und rostrale Koordinaten ist der AP-Hirnstamm-Eintrittspunkt relativ zur Ziel-AP-Koordinate in der Standardebene kaudaler.
      2. ML: Leiten Sie Zielkoordinaten aus einem standardmäßigen stereotaktischen Referenzatlas oder einer Gewebereihe ab, die in der Querebene geschnitten wurde. Die Koordinaten sind relativ zur visualisierten Mittellinie auf der Ziel-AP-Ebene.
      3. DV: Schätzen Sie Koordinaten relativ zur Oberfläche des Hirnstamms am AP- und ML-Zielpunkt. Passen Sie DV an, um die Anteroflexion des Hirnstamms zu berücksichtigen. Für ventrale und rostrale Koordinaten sind die DV-Koordinaten größer als der Abstand von der dorsalen Oberfläche des Hirnstamms in der Standardebene.

8. Injektion des Ziels

1. Senken Sie die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm auf das Ziel ab und injizieren Sie die Lösung wie bei stereotaktischen Standardansätzen. Nach der Injektion 1-5 Minuten an Ort und Stelle lassen, um eine Nadelspur bei der Verwendung von Volumina zwischen 3-50 nL zu vermeiden. Heben Sie dann die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm an.
2. Wiederholen Sie Schritt 8.1. für mehrere Ziele.

9. Schließung des Operationsfeldes

1. Entfernen Sie die Haken vorsichtig aus dem Operationsfeld. Die gepaarten Musculus longus capitis fallen in eine neutrale Position zurück und bedecken die Cisterna magna vollständig. Schließen Sie den Trapezmuskel und die Dura mater in der Mittellinie nicht, da sie zu zerbrechlich sind, um Nähte zu halten.
2. Schließen Sie die Haut mit drei Nylon- oder Polypropylennähten (5-0 oder 6-0).

10. Nachsorge

1. Schalten Sie Isofluran aus und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Frame. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen und beobachten Sie, bis sie wach ist und sich bewegt.
2. Überwachen Sie den Gesundheitszustand, das Gewicht und die Nähte an den postoperativen Tagen 1-3. Entfernen Sie die Nähte am 10. Tag, wenn sie nicht bereits entfernt wurden.

Representative Results

Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, kaudale Hirnstamm- und obere Halsschnurstrukturen anzusprechen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Die Operation, um die Cisterna magna zu erreichen, erfordert Schnitte der Haut, eine dünne Schicht des Trapezmuskels und die Öffnung der Dura mater und wird daher von Mäusen gut vertragen. Es ist besonders effizient und weniger invasiv, wenn es auf mehrere (längs verteilte oder bilaterale) Standorte abzielt, da es nicht wie bei stereotaktischen Standardansätzen mehrere Gratlöcher bohren muss. Bei Mäusen haben wir routinemäßig Strukturen wie den Nucleus^{hypoglossus 9}, die ventrale respiratorische Gruppe 8 und die angrenzende retikuläre Formation⁸ im kaudalen Hirnstamm mit dem Cisterna magna-Ansatz ins Visier genommen, wie wir in Abbildung 3 für den Hypoglossuskern und die ventromediale Medulla (GiV) weiter veranschaulichen. Zum Beispiel ist der Nucleus hypoglossus eine schlanke, aber rostrocaudal längliche Säule von Motoneuronen in der dorsalen Medulla oblongata und sein rostraler Pol kann über einen Standardansatz anvisiert werden. Da die DV-Koordinaten (~4,5 mm) jedoch meist vom darüber liegenden Kleinhirn diktiert werden und nur 1,2-1,4 mm in den Hirnstamm eindringen, könnte ein relativ geringer Unterschied in der Positionierung des Mauskopfes daher leicht zu einer fehlplatzierten Injektion führen. Aufgrund der Nähe dieses Ziels zum Nullpunkt-Obex kann es über den Cisterna-Magna-Ansatz zuverlässiger anvisiert werden. Darüber hinaus kann das kaudale Ende des Hypoglossuskerns, das sich bis zum Übergang zwischen Hirnstamm und Rückenmark erstreckt, durch den gleichen Cisterna magna-Ansatz anvisiert werden, während der Standardansatz modifiziert werden müsste, um eine solche kaudale Stelle zu erreichen, indem der AP-Ansatz angewinkelt und die Koordinaten angepasst werden, um den Hinterhauptbein und die darüber liegende Halsmuskulatur zu vermeiden.

Um die Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes im Vergleich zum Standardansatz zu bestimmen, maßen wir den Abstand zwischen beabsichtigten und tatsächlichen Zielstellen in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene für ventrale (ventromediale Medulla; GiA/V; N = 10) und dorsal (NuXII; N = 16) Regionen. Die Messungen wurden in Querschnitten des kaudalen Hirnstamms durchgeführt (Abbildung 3). Die Ergebnisse (Abbildung 4) zeigen signifikant kleinere Fehler in den anteroposterioren, mediolateralen und insbesondere dorsoventralen Ebenen für den Cisterna magna-Ansatz im Vergleich zum Standardansatz. Diese Ergebnisse unterstreichen die verbesserte Genauigkeit des Cisterna-Magna-Ansatzes für diese Ziele. Wir haben stereotaktische Standardkoordinaten (relativ zu Bregma (abgeleitet von Paxinos und Franklin ², aber für unsere Studien optimiert) und Zisternenmagna-Koordinaten (relativ zum Obex) in Tabelle 1 aufgenommen. Diese Koordinaten wurden alle optimiert und verifiziert, wie in Abbildung 3 für den Hypoglossuskern und die ventromediale Medulla gezeigt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der wichtigsten Landmarken, Zielgebiete und der Ebene des stereotaktischen Cisterna magna-Ansatzes . (A) Wichtige anatomische Landmarken und Positionierung in der Sagittalebene. (B) Bereiche, die durch den stereotaktischen Standardansatz im Vergleich zum stereotaktischen Ansatz der Cisterna magna erreicht werden können, und Beziehung zu ihren Bezugspunkten. i) Der Standardansatz verwendet die knöchernen Landmarken Bregma und Lambda, die von den Zielregionen in Magenta und Lila entfernt sind. Der Bereich in Magenta (kaudale Medulla oblongata und obere Halsschnur) ist aufgrund der schrägen Hinterhauptbein- und Nackenmuskulatur schwer zu erreichen. Das Gebiet in Lila (rostral medulla oblongata) ist anfällig für Bewegung und weit entfernt von traditionellen Sehenswürdigkeiten. ii) Der Cisterna-Magna-Ansatz eignet sich für den Zugang zur kaudalen Medulla oblongata und zur oberen Halsschnur und hat Vorteile bei der Untersuchung von Hirnstammstrukturen, die in Längssäulen organisiert sind, die sich von der kaudalen Medulla oblongata rostral bis zur Höhe der kaudalen pons erstrecken. (C) Schematische Darstellung der Ebenen verschiedener stereotaktischer Referenzatlanten in bezug auf den Cisterna magna-Ansatz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Schematische Schritt-für-Schritt-Übersicht über den Ansatz der stereotaktischen Zisterne Magna . (A) Mausadapter mit gleichmäßig auf der höchsten Ebene positionierten Ohrstangen, die Mundstange in abgesenkter Position und einer Plastikkarte zur Befestigung des anteroflexierten Kopfes in einem 90 ° -Winkel. (B) Befestigen Sie die Maus mit den Ohrstangen im stereotaktischen Rahmen und lassen Sie den Kopf bei 90° anteroflex und halten Sie sie über eine starre Plastikkarte mit dem stereotaktischen Rahmen als Referenz in Position. (C) Stellen Sie sicher, dass der Körper so erhöht ist, dass er sich in der gleichen Ebene wie der Hinterkopf befindet. Palpate wichtige Wahrzeichen. (D) Machen Sie einen Hautschnitt vom Hinterkopf zum rostralen Teil der Schultern. (E) Machen Sie einen Schnitt in der Raphe des Trapezmuskels. Achten Sie darauf, in der Mittellinie zu bleiben und schneiden Sie nicht in die darunter liegenden Muskeln. (F) Identifizieren Sie die Mittellinie zwischen den beiden Bäuchen des Musculus longus capitis, beginnend am Hinterkopf, und führen Sie die Laminektomiezange in eine kaudale Richtung. (G) Legen Sie jeden der Wundhaken zwischen die Bäuche des Musculus longus capitis und positionieren Sie ihn neu, bis die Cisterna magna in Sicht kommt. (H) Identifizieren Sie knöcherne Landmarken (Hinterhauptbein, Atlas), die Dura mater, die sich zwischen diesen knöchernen Strukturen erstreckt, und das darunter liegende Kleinhirn und Hirnstamm. Reinigen Sie die Dura Mater nach Bedarf, um die Zielebene freizulegen. (I) Öffnen Sie mit einer Federschere und einer feinen Pinzette die Dura. (J) Identifizieren Sie den Over, der den AP- und ML-Nullpunkt bildet. Verschieben Sie die Pipette auf die AP- und ML-Koordinaten ihrer Wahl. Senken Sie die Pipette ab, bis sie die dorsale Oberfläche des Hirnstamms erreicht. Dies ist der DV-Nullpunkt. Senken Sie die Pipette auf die gewünschte Koordinate ab. (K) Entfernen Sie die Pipette und die Wundhaken und lassen Sie die Muskulatur longus capitis wieder in ihre ursprüngliche Position zurückkehren. (L) Schließen Sie die Wunde und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Auswertung der Zielkoordinaten. Mikroaufnahmen des kaudalen Hirnstamms mit geringer Vergrößerung. (A) Injektion der retrograden Tracer-Choleratoxin-Untereinheit b (CTb; blau) in den hypoglossalen Kern einer ChAT-cre L10 GFP (grün) Reportermaus (weiblich, 6 Monate alt). Beachten Sie, dass die CTb-Injektion auf den Kern hypoglossus beschränkt ist. (B) Transfektion von glutamatergen Zellen einer vGluT2-ires-cre L10 GFP-Reportermaus (grün) (männlich, 2 Monate alt) mit einem bedingten anterograden Tracer (Magenta) im ventralen Teil der caudalen medialen Medulla oblongata (Schwanzpol der GiV-Region). (C) Bedingte retrograde Rückverfolgung bei einer vGLuT2-ires-cre-Maus (männlich, 2 Monate alt), die eine TVA (Magenta)-Transfektion von glutamatergen Neuronen und eine modifizierte Tollwutinfektion (grün) in der kaudalen medialen Medulla oblongata (Schwanzpol der GiV-Region) zeigt. Das Tollwutvirus wurde in das obere zervikale Rückenmark injiziert. Interne Sehenswürdigkeiten dienen als Orientierung. Abkürzungen-cAmb: Kompakter Kern des Ambiguus-Komplexes; Ap: Gebiet Postrema; DMV: Dorsaler Motorkern des Vagus; GiV: Gigantozellulärer Kern, ventraler Teil; IO: Minderwertige Olive; IRt: Intermediärer retikulärer Kern; LRN: Nucleus reticularis lateralis; NuXII- Nucleus hypoglossus; sol: Kern des Einzelgängers; Sp5: Trigeminuskern spinalis; VRG: ventrale respiratorische Gruppe. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Vergleich der Genauigkeit zwischen dem Standard- und dem Cisterna magna-Ansatz. Mittlerer Abstand zwischen dem Zentrum des beabsichtigten Ziels und dem Zentrum des tatsächlichen Ortes in der anteroposterioren Ebene (A), der mediolateralen Ebene (B) und der dorsoventralen Ebene (C). Die Daten wurden von N = 13 erwachsenen Mäusen mit einem Standardansatz und N = 13 erwachsenen Mäusen mit einem Cisterna magna-Ansatz erhalten. Der Radius des Ziels wurde auf 30 μm festgelegt. Die Ergebnisse zeigen eine höhere Genauigkeit in der anteroposterioren Ebene (t(24) = 2,08, p = 0,049; zweischwänziger t-Test; alpha 0,05), der mediolateralen Ebene (t(24) = 2,55, p = 0,018; zweischwänziger t-Test; alpha 0,05) und der dorsoventralen Ebene (t(24) = 4,33, p = 0,0002; zweischwänziger t-Test; alpha 0,05). Balkendiagramme stellen den Mittelwert mit Standardabweichung dar, und einzelne Punkte stellen Werte in jeder Maus dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Übersicht über die stereotaktischen Koordinaten von Standard und Cisterna magna zur Zielstruktur des kaudalen Hirnstamms. Bitte beachten Sie, dass sowohl für den Standard- als auch für den Cisterna-Magna-Ansatz die Koordinaten aus dem Paxinos- und Franklin-Atlas² angepasst wurden, bis die Regionen von Interesse angemessen ausgerichtet wurden, wie von der Histologie verifiziert (Abbildung 3). Beachten Sie auch, dass Bereiche in der retikulären Formation keine klar definierten Grenzen haben und hier wie in Paxinos und Franklin² beschriftet sind. Abkürzungen-AP: anteroposterior. ML: mediolateral. DV: dorsoventral. ChAT: Cholin-Acetyltransferase; F: Weiblich; M: Männlich; M&F: Männlich und weiblich; NA: nicht zutreffend; Pet1: Plasmazytom exprimierter Transkriptionsfaktor 1; Sert: Serotonin-Transporter, vGaT: Vesikulärer GABA-Transporter; vGluT2: Vesikulärer Glutamattransporter 2; WT: Wildtyp. Alle Koordinaten sind in Millimeter (mm) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Die stereotaktische Standardchirurgie stützt sich häufig auf Schädel-Landmarken, um die Koordinaten der Zielstellen im ZNS¹ zu berechnen. Die Zielstandorte werden dann über Gratlöcher erreicht, die durch den Schädel^{gebohrt werden 1}. Diese Methode ist nicht ideal für den kaudalen Hirnstamm, da sich die Zielstellen in der anteroposterioren und dorsoventralen Ebene² entfernt von den Schädellandmarken befinden und da die Anatomie des Schädels und der darüber liegenden Muskeln den Zugang erschwert 6 (Abbildung 1Bi^). Unsere Studie beschreibt einen alternativen stereotaktischen Ansatz für den Zugriff auf Zielstellen im kaudalen Hirnstamm und im oberen Rückenmark, der als Cisterna magna-Ansatz bezeichnet wird. Hauptmerkmale, die diese Methode von einem standardmäßigen stereotaktischen Ansatz unterscheiden, sind die Positionierung mit einer Anteroflexion des Kopfes, um die Zisterna magna zu öffnen, und die Verwendung von Schlüssel-Hirnstamm-Landmarken an der dorsalen Oberfläche des Hirnstamms als Referenzpunkte wie dem Obex. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Ansatz für die Abgabe kleiner Volumina (5-50 nL) von Tracern oder Adeno-assoziierten Viren (AAVs) in diskrete Hirnstammstrukturen geeignet ist. Darüber hinaus erhöht die Verwendung eines Referenzpunkts, der einen CNS-Meilenstein und keine knöcherne Struktur darstellt und sich in unmittelbarer Nähe des beabsichtigten Ziels befindet, die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit für kleine Ziele und kleine Injektionsvolumina, wie für die Schaltkreiskartierung und chemogenetische Studien relevant (Abbildung 3) ^14,15.

Wie bei jedem Protokoll hat der Cisterna magna-Ansatz Schritte, die entscheidend sind, um Reproduzierbarkeit zu erreichen. Wie bei jedem stereotaktischen Ansatz, der von Koordinaten in drei verschiedenen Ebenen (anteroposterior, mediolateral und dorsoventral) abhängt, ist die Positionierung kritisch. Für den Cisterna magna-Ansatz umfasst dies nicht nur die Position des Kopfes, der um 90° anteroflexiert werden sollte, sondern auch die des Körpers, der so erhöht sein sollte, dass sich der kaudale Hirnstamm und die obere Halsschnur in derselben Ebene befinden. Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, unnötige Manipulationen zu vermeiden, die Blutungen verursachen, da dies die Visualisierung wichtiger Sehenswürdigkeiten behindern würde. Es gibt zwei Manipulationen, die ein hohes Blutungsrisiko bergen. Erstens ist die Dura mater, die die Cisterna magna bedeckt, von einem relativ großen Muskel (Longus capitis) bedeckt. Da es sich um einen gepaarten Muskel mit einem Bauch auf beiden Seiten der Mittellinie handelt, müssen die beiden Bäuche dieses Muskels nur in der Mittellinie sanft getrennt werden. Ein Schneiden dieser Muskeln ist nicht notwendig und verursacht Blutungen. Zweitens wird bei der erfolgreichen Öffnung der Dura Mater eine variable Anzahl von Venen mit einem variablen Verlauf auf der dorsalen Oberfläche des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur sichtbar. Diese Adern sollten vermieden werden, indem geringfügige Koordinatenanpassungen (bis zu 0,1 mm) vorgenommen werden oder, wenn das experimentelle Paradigma dies zulässt, ein anderes Ziel ausgewählt wird.

Ein großer Vorteil des Cisterna magna-Ansatzes besteht darin, dass er Zugang zu den Hirnstamm- und oberen zervikalen Strukturen bietet, die bei Verwendung der stereotaktischen Standardebene schwer zu erreichen sind, da sie sich in der Nähe des kaudalen Endes oder nur des kaudalen Hinterhauptbeins befinden. Darüber hinaus vermeidet der Ansatz für Ziele in der Medulla oblongata das Kleinhirn und daher sind Kleinhirn-Läsionseffekte oder eine falsche Markierung über einen Nadeltrakt, die die Studienergebnisse beeinflussen können, wenn die Standardmethodik verwendet wird, kein Problem. Ein weiterer Vorteil des Cisterna-Magna-Ansatzes ist, dass die dorsale Oberfläche des Hirnstamms sichtbar wird. Dies bietet die Möglichkeit, ein Wahrzeichen auf der dorsalen Oberfläche als Bezugspunkt für Koordinaten zu verwenden. Darüber hinaus ist der Ansatz flexibel und kann je nach Ziel optimiert werden. Zum Beispiel haben wir ein Mittellinien-Wahrzeichen, den Obex, als Bezugspunkt verwendet. Wenn Sie jedoch auf dorsale Strukturen abzielen, kann die Struktur von Interesse selbst die Landschaft der dorsalen Oberfläche bestimmen. Zum Beispiel ragt der äußere Cuneatkern dorsal hervor und kann so direkt visualisiert und injiziert werden. Für laterale Ziele, wie die ventrale Atmungsgruppe oder den mehrdeutigen Komplex, kann das Cisterna magna-Fenster in lateraler Richtung erhöht werden. Ebenso kann das Fenster für das Targeting von oberen zervikalen Strukturen zum Atlas hin erweitert werden. Während wir einen Mausadapter in einem großen Stereotaktikrahmen für Tiere verwendet haben, kann der Ansatz leicht an andere Frames oder Setups angepasst werden, solange die wichtigsten Schritte befolgt werden. Zum Beispiel kann anstelle einer Plastikkarte die Mundleiste gegen den Nasenrücken gelegt werden, um den Kopf in einer stabilen anteroflexierten Position zu halten. Es ist erwähnenswert, dass Koordinaten von Hirnstammzielstellen mit dem Obex als Nullpunkt, wie in Tabelle 1 angegeben, als Referenz dienen, und Anpassungen können basierend auf dem Mauszug, Alter, Geschlecht, Kalibrierung des stereotaktischen Arms und Positionierungstechnik angezeigt werden, ähnlich wie Anpassungen, die man vornehmen muss, wenn man Zielkoordinaten für einen Standardansatz aus einem Referenzatlas ableitet. Dies erfordert einen Einblick in die Ebene des Ansatzes, insbesondere für eher rostrale Ziele, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das Testen von Koordinaten kann durch die Verwendung verschiedener Tracer erfolgen, z. B. fluoreszierende Perlen oder fluoreszierend markierte Choleratoxin-Untereinheit b für verschiedene Koordinaten in derselben Maus. Histologische Analysen von Hirnstamm-/Wirbelsäulengewebeschnitten (die in diesem Protokoll nicht behandelt werden) liefern dann Rückmeldung über die Lokalisation in Bezug auf objektive interne Landmarken 8,9,11,16 oder zum Vergleich mit einem Referenzatlas^. Koordinaten können dann angepasst, erneut getestet und finalisiert werden.

Der Cisterna-Magna-Ansatz hat auch Grenzen. ZNS-Regionen, die über diesen Ansatz erreicht werden können, sind auf die Schwanzpons, Medulla oblongata und die obere Halsschnur beschränkt. Während die kaudalen pons über den Standardansatz leicht zugänglich sind, hat der Cisterna magna-Ansatz Vorteile bei der Untersuchung von Unterteilungen längsorientierter Strukturen, die sich von der Medulla oblongata in die kaudalen pons erstrecken, wie dies bei Unterteilungen innerhalb der retikulären Formation der Fall ist. Eine weitere relative Einschränkung tritt auf, wenn dieser Ansatz zum zweiten Mal in derselben Maus verwendet wird, z. B. bei modifizierter Tollwutverfolgung¹⁴. Das Vorhandensein von Narbengewebe kann die Dauer der Operation verlängern oder kleinere Sehenswürdigkeiten verschleiern. In unseren Händen war diese Methode jedoch in diesem Fall dem stereotaktischen Standardansatz immer noch überlegen, da der Ort der ersten Injektion in Bezug auf die Position der Venen anderer einzigartiger Landmarken dokumentiert werden kann, was es leicht macht, den genauen Eintrittspunkt zurück zu finden. Während dieser Ansatz für die Rückverfolgung von Studien in der Schwanzmedulla und im oberen Rückenmark überlegen ist, kann er nicht zur chronischen Implantation von Hardware verwendet werden. Daher kann für In-vivo-Optogenetik- und Calcium-Imaging-Studien, die die Implantation von optischen Fasern^{erfordern 17}, der Cisterna-Magna-Ansatz zuerst verwendet wird, um ein AAV an die Zielstelle zu liefern, gefolgt von einer zweiten Operation mit einem Standardansatz für Instrumentenmäuse mit Fasern oder Kanülen. Dieser Ansatz ermöglicht es, den Zielstandort diskret zu halten, während die Platzierung von Glasfaser / Hardware aufgrund der relativ großen Größe der Hardware fehlerverzeihender ist (dh weniger genau sein kann). Schließlich erfordert der Cisterna-Magna-Ansatz fortgeschrittenere chirurgische Fähigkeiten als ein standardmäßiger stereotaktischer Ansatz. Anstatt einfache knöcherne Orientierungspunkte zu erkennen, erfordert es Einblicke in komplexere Hirnstamm- und Muskel-Skelett-Orientierungspunkte. Wie bei jeder heiklen Operation hängen der Erfolg und die Effizienz des Verfahrens von einem geeigneten Toolkit ab, das sich in ausgezeichnetem Zustand befindet. Dieses Protokoll befasst sich mit den letztgenannten Problemen und kann von Experimentatoren als detaillierte Anleitung verwendet werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Cisterna-Magna-Ansatz den stereotaktischen Standardansatz ergänzt und mehrere Vorteile bietet, wenn er auf den kaudalen Hirnstamm und die obere Halsschnur abzielt, die über einen stereotaktischen Standardansatz nicht leicht zugänglich sind. Es verwendet Referenzpunkte, die CNS sind, und nicht knöcherne Landmarken, die sich in unmittelbarer Nähe zu den beabsichtigten Zielen befinden, was die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit erhöht. Dies macht den Ansatz besonders wertvoll, wenn kleine Injektionsvolumina im Rahmen detaillierter Kartierungen oder chemogenetischer Studien an diskrete Stellen abgegeben werden müssen. Dieser Ansatz ist auch für funktionelle chemogenetische, optogenetische, Faserphotometrie- oder Läsionsansätze relevant, bei denen ein AAV-Virus oder -Toxin als Auslesung an ein Ziel mit motorischer Funktion oder sensomotorischer Integration abgegeben wird: Es vermeidet einen Verlauf durch das Kleinhirn für Ziele in der Medulla oblongata und begrenzt daher seine Interferenz in Studienergebnissen. Aus Sicht des Tierschutzes erfordert das Verfahren nicht das Bohren mehrerer Gratlöcher, um bilateral oder längs auf die Standorte zuzugreifen, wodurch die Dauer der Operation und die Invasivität des Verfahrens reduziert werden. Während wir den Ansatz für Mäuse detailliert beschrieben haben, gelten die gleichen Prinzipien für andere Arten^11,12,13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window