Summary
En modifisert post-fiksering prosedyre øker kontrasten av glykogen partikler i vev. Dette dokumentet gir en trinnvis protokoll som beskriver hvordan man håndterer vevet, utfører avbildningen og bruker stereologiske metoder for å oppnå objektive og kvantitative data om fibertypespesifikk subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulatur.
Abstract
Ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi kan det oppnås høyoppløselige bilder av faste prøver som inneholder individuelle muskelfibre. Dette muliggjør kvantifisering av ultrastrukturelle aspekter som volumfraksjoner, overflateareal til volumforhold, morformetri og fysiske kontaktområder for forskjellige subcellulære strukturer. På 1970-tallet ble en protokoll for forbedret farging av glykogen i celler utviklet og banet vei for en rekke studier på subcellulær lokalisering av glykogen og glykogenpartikkelstørrelse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Mens de fleste analyser tolker glykogen som om det er homogent fordelt i muskelfibrene, og bare gir en enkelt verdi (f.eks. en gjennomsnittlig konsentrasjon), har transmisjonselektronmikroskopi avslørt at glykogen lagres som diskrete glykogenpartikler plassert i forskjellige subcellulære rom. Her beskrives den trinnvise protokollen fra vevsinnsamling til kvantitativ bestemmelse av volumfraksjonen og partikkeldiameteren til glykogen i de distinkte subcellulære rommene til individuelle skjelettmuskulaturfibre. Hensyn til hvordan man samler inn og flekker vevsprøver, 2) utfører bildeanalyser og datahåndtering, 3) evaluerer presisjonen av estimater, 4) diskriminerer mellom muskelfibertyper, og 5) metodologiske fallgruver og begrensninger er inkludert.
Introduction
Glykogenpartikler består av forgrenede polymerer av glukose og ulike tilknyttede proteiner1 og utgjør et viktig drivstoff under høye metabolske krav2. Selv om det ikke er allment anerkjent, utgjør glykogenpartikler også et lokalt drivstoff, hvor noen subcellulære prosesser fortrinnsvis bruker glykogen til tross for tilgjengeligheten av andre og mer langvarige drivstoff som plasmaglukose og fettsyrer3,4.
Betydningen av å lagre glykogen som et subcellulært spesifikt lokalisert drivstoff har blitt diskutert i flere vurderinger5,6 hovedsakelig basert på noen av de tidligste dokumentasjonene av den subcellulære fordelingen av glykogen ved overføringselektronmikroskopi (TEM)7,8. De første studiene brukte forskjellige protokoller for å øke kontrasten til glykogen fra histokjemiske fargingsteknikker til negative og positive flekker9,10. En viktig metodologisk utvikling var den raffinerte postfikseringsprotokollen med kaliumferrocyanid-redusert osmium11,12,13,14, noe som forbedret kontrasten til glykogenpartikler betydelig. Denne raffinerte protokollen ble ikke brukt i noe av det banebrytende arbeidet med treningsindusert glykogenuttømming15, men ble gjeninnført av Graham og kolleger16,17.
Basert på de 2-dimensjonale bildene, er den subcellulære fordelingen av glykogen oftest beskrevet som glykogenpartikler som ligger i tre bassenger: subsarcolemmal (like under overflatemembranen), intermyofibrillar (mellom myofibrils) eller intramyofibrillar (innenfor myofibrilene). Glykogenpartikler kan imidlertid også beskrives som assosiert med for eksempel sarkoplasmatisk retikulum7 eller kjerner18. I tillegg til den subcellulære fordelingen er fordelen med TEM-estimert glykogeninnhold også at kvantifisering kan utføres på enkeltfibernivå. Dette gjør det mulig å undersøke fiber-til-fiber variasjon og korrelative analyser med fibertyper og cellulære komponenter som mitokondrier og lipiddråper.
Her er protokollen for TEM-estimert fibertypespesifikk volumetrisk innhold av de tre vanlige subcellulære bassengene av glykogen (subsarcolemmal, intermyofibrillar og intramyofibrillar) i skjelettmuskulaturfibre beskrevet. Metoden har blitt brukt på skjelettmuskler fra mennesker19, rotter20 og mus21; så vel som fugler og fisk22; kardiomyocytter fra rotter23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dagens protokoll med humane biopsied skjelettmuskulaturprøver ble godkjent av Regionale komiteer for helseforskningsetikk for Sør-Danmark (S-20170198). Muskelbiopsier ble oppnådd gjennom et snitt i huden fra den enorme lateralismuskelen ved hjelp av en Bergström nål med sug etter at lokalbedøvelse ble gitt subkutant (1-3 ml Lidokain 2% per snitt). Hvis isolerte hele rottemuskler ble brukt, ble dyrene ofret av cervical dislokasjon før muskelbiopsiene ble oppnådd, i samsvar med retningslinjene fra dyreetikkkomiteen ved Odense Universitetssykehus, Danmark.
1. Primær fiksering, etterfiksering, innebygging, seksjonering og kontrast
- Forbered 1,6 ml primær fixativ oppløsning (2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkaktokylatbuffer (pH 7,3)) i et 2 ml mikrosentrifugeringsrør. Oppbevar den ved 5 °C i maksimalt 14 dager.
- Fra muskelbiopsien eller hele muskelen isolerer du en liten prøve, som har en maksimal diameter på 1 mm i alle retninger og er litt lengre i langsgående fiberretning enn tverrsnitt (for orienteringsformål).
- Plasser prøven i røret som inneholder den kalde primære fikseringsløsningen. Oppbevar den ved 5 °C i 24 timer.
- Vask prøven fire ganger (15 min mellom hver vask) i 0,1 M natriumkakroktylatbuffer (pH 7,3). Bruk overføringspipetter til å fjerne den brukte bufferen fra røret slik at prøven blir urørt, og legg deretter til den ferske bufferen.
MERK: Etter den endelige vasken kan prøven lagres i 0,1 M natriumkakroktylatbuffer ved 5 °C i flere måneder11. Protokollen kan settes på pause her. - Postfix med 1% osmium tetroxide (OsO4) og 1,5% kalium ferrocyanid (K4Fe(CN)6) i 0,1 M natriumkakrodocylatbuffer (pH 7,3) i 120 min ved 4 °C.
MERK: Bruk av 1,5% kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) er avgjørende for en optimal kontrast av glykogenpartikler11,12,13. - Skyll to ganger i dobbeltdestillert vann ved romtemperatur (RT).
- Dehydrer ved å nedsenke i en gradert serie alkohol (etanol) ved RT ved hjelp av følgende konsentrasjoner: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) og 100% (10 min).
MERK: I hvert trinn er prøven nedsenket i etanol, som deretter bare fjernes delvis for å unngå tørking av prøven. Til slutt kastes venstre etanol. - Infiltrer med graderte blandinger av propylenoksid og epossidisk harpiks ved RT ved hjelp av følgende volumforhold (propylenoksid/epossidisk harpiks): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (over natten). Neste dag legger du inn prøver i 100% frisk epossidisk harpiks i mugg og polymeriserer ved 60 °C i 48 timer.
MERK: Denne vurderte metoden er i henhold til de tidligere protokollene11,12. Protokollen kan settes på pause her. - Klipp ultratynne (60-70 nm) deler av langsgående orienterte fibre og samle dem på etthulls kobbergitter som følger.
- Monter blokken av en prøve på ultramikrotomholderen.
- Trim blokken på overflaten med et barberblad for å nå vevets nivå.
- Monter en diamantkniv (ultrakuttet 45) foran prøven og juster prøveoverflaten parallelt med kniven.
- Produser en halvtynn (1 μm) seksjon med diamantkniven for å sjekke retningen på prøven. Flekk den halvtynne delen med toluidinblå for observasjon med lysmikroskopi.
- Trim blokken videre for å redusere interesseområdet for å få riktige ultratynne seksjoner.
- Klipp ultratynne (60-70 nm) seksjoner med en annen diamantkniv (ultrakuttet 45).
- Samle 1-2 seksjoner på ett-hulls kobbergitter ved hjelp av en Perfect Loop.
MERK: Etthulls kobbergitter har et enkelt hull i midten med Formvar støttemembran.
- Kontrastseksjoner med uranylacetat og blysitrat ved å nedsenke de ovennevnte gitterene i uranylacetatoppløsning (0,5% i dobbeltdestillert vann) i 20 min, og deretter i blysitratoppløsning (1% i dobbeltdestillert vann) i 15 min. Vask gitteret i dobbeltdestillert vann mellom og etter de to flekkene.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
2. Bildebehandling
- Slå på transmisjonselektronmikroskopet (operert med en akselererende spenning på 80 kV), datamaskin og bildeopptaksprogramvare. Ta opp digitale bilder med et digitalt sakte skanningskamera på 2 k x 2 k CCD og tilhørende bildebehandlingsprogramvare.
- Sett inn rutenettet med flere seksjoner i mikroskopfasen.
- Screen rutenettet i utgangspunktet ved lav forstørrelse (f.eks. x100) for å bestemme kvaliteten på seksjonene (dvs. hull i støttemembranen, rusk, etc.) og velg seksjoner av beste kvalitet. Ved lav forstørrelse, bestem retningen av muskelfibrene.
- Deretter øker du forstørrelsen med strålen sentrert på en perifer fiber i delen. Fokuser bildet ved forstørrelse over 30 k for å sikre tilstrekkelige fine detaljer i bildet, styrt av en rask fouriertransformasjon i sanntid, hvis tilgjengelig. Til slutt tar du opp bilder med 1 s eksponeringstid ved ønsket forstørrelse.
- Skaff deg totalt 24 bilder av en tilfeldig valgt fiber, det vil si 12 bilder av myofibrillarrommet og 12 bilder av det subsarcolemmale rommet, med en forstørrelse mellom 10 k og 40 k. Sørg for at bildene fordeles over lengden og bredden på fiberen i en randomisert, men systematisk rekkefølge for å oppnå objektive resultater (figur 1A).
MERK: Den optimale forstørrelsen avhenger av tilgjengelig kameraoppløsning og størrelsen på mikrografene. Målet er å oppnå en endelig oppløsning, hvor glykogenpartikkeldiametre kan måles innen 1 nm trinn, og å inkludere et totalt område av myofibrillarområdet på minst 70 μm2 og en total lengde på fiberen på minst 25 μm fordelt på 12 bilder av myofibrillarrommet og 12 bilder av det subsarcolemmale rommet per fiber, henholdsvis. De 24 bildene per fiber vil mest sannsynlig gi en presisjon (feilkoeffisient) av det volumetriske innholdet i de forskjellige bassengene av glykogen mellom 0,1 og 0,2 i individuelle fibre fra menneskelige, rotte- og mus skjelettmuskler20,21,24 (figur 2E). - Gjenta trinn 2.4 og 2.5 til totalt 6-10 fibre er avbildet. Klipp om nødvendig flere seksjoner (separert med minst 150 μm for å unngå overlapping av allerede avbildet fibre) og gjenta trinn 1.9-2.5.
3. Bildeanalyser
- Importer bilder til ImageJ ved å klikke på Fil > Åpne.
- Angi global skala slik at den samsvarer med den opprinnelige størrelsen på bildet ved å klikke på Analyser > Angi skala.
- Zoom inn 100% ved å klikke på Bilde > Zoom > Inn.
- Mål tykkelsen på én Z-plate per bilde av myofibrillarområdet (12 per fiber) ved hjelp av rett linje-verktøyet fra Verktøy-menyen (figur 1D). Beregn den gjennomsnittlige Z-platetykkelsen til hver av de 6-10 fibrene.
- Definer 2-3 fibre med den tykkeste gjennomsnittlige Z-platen som type 1 fibre og 2-3 fibre med den tynneste gjennomsnittlige Z-platen som type 2 fibre. Se bort fra de mellomliggende 2-4 fibrene for videre analyser (figur 1E).
MERK: Følgende trinn gjentas for hver av de 4-6 fibrene fra prøven. Glykogenvolumfraksjonene er estimert etter punkttelling som beskrevet andre steder25,26. Størrelsen på gitteret er valgt for å oppnå en tilfredsstillende høy presisjon av estimatene. Dette oppnås ofte ved å oppnå 250 treff, som deretter dikterer det totale antall poeng som trengs, og i sin tur området per punkt. - Bruk segmentert linje-verktøyet til å måle lengden på den ytterste myofibril som er synlig like under det subsarkolemmale området (figur 2A).
MERK: Denne lengden brukes til å uttrykke subsarcolemmal glykogen per overflateareal (dvs. lengden på den ytterste myofibril multiplisert med tykkelsen på avsnittet (60 nm); se trinn 4.5). Derfor er bare den subsarcolemmale regionen, som er representert av denne lengden, inkludert i analysen. - Sett inn et rutenett ved å klikke på Analyser > Verktøy > Grid og sett Area Per Point til 32,400 nm2. Tell antall treff innenfor den tilgjengelige lengden i de 12 subsarcolemmale bildene, der et kryss treffer det subsarcolemmale glykogenet (figur 2A). Et treff er definert som en glykogenpartikkel som er til stede i øvre høyre hjørne av et kryss.
- Sett inn et rutenett ved å klikke på Analyser > Verktøy > Grid og sett Area Per Point til 160,000 NM2. Tell antall treff i de 12 myofibrillarbildene, der et kryss treffer intramyofibrillarrommet (figur 2B).
- Sett inn et rutenett ved å klikke på Analyser > Verktøy > Grid og sett Area Per Point til 3600 nm2. Tell antall treff i de 12 myofibrillarbildene, der et kryss treffer intramyofibrillarglykogenet (figur 2C).
- Sett inn et rutenett ved å klikke på Analyser > Verktøy > Grid og sett Area Per Point til 32,400 nm2. Tell antall treff i de 12 myofibrillarbildene, der et kryss treffer det intermyofibrillare glykogenet (figur 2D).
- Bruk Straight Line-verktøyet til å måle diameteren på fem tilfeldig valgte glykogenpartikler i hvert basseng for hvert av de 12 bildene for å oppnå i gjennomsnitt 60 partikler per basseng per fiber.
MERK: Gjennomsnittet på 60 partikler dekker i stor grad variasjonen i fiberen (figur 2F).
4. Beregninger
- Beregn den tilsynelatende områdefraksjonen (AA) av det intramyofibrillare rommet per myofibrillarrom som summen av alle treff delt på summen av alle punkter fra de 12 bildene (fra trinn 3.8).
- Beregn den tilsynelatende områdefraksjonen av intramyofibrillar glykogen per myofibrillarområde, intermyofibrillar glykogen per myofibrillarområde og subsarcolemmal glykogen per bildeområde som summen av alle treff delt på summen av alle punkter fra de 12 bildene (fra trinn 3,7, 3,9 og 3,10).
- Beregn volumfraksjonen (VV) av henholdsvis intramyofibrillar, intermyofibrillar og subsarcolemmal glykogen, som den tilsynelatende arealfraksjonen (AA) minus produktet av overflatetetthet (SV) med seksjonstykkelse (t), hvor overflatetetthet er den numeriske tettheten av partikler multiplisert med gjennomsnittlig partikkeloverflate:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
hvor
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0,06 μm
H = gjennomsnittlig diameter på partiklene (μm)
MERK: Volumfraksjonen er mindre enn den tilsynelatende arealfraksjonen på grunn av bidraget av hetter fra partikler med midten utenfor skive25. - For å uttrykke intramyofibrillar glykogen per intramyofibrillar plass, del området brøkdel av intramyofibrillar glykogen (trinn 4.2) ved området brøkdel av intramyofibrillar plass (trinn 4.1). Det intermyofibrillare glykogen uttrykkes per myofibrillarrom som beregnet i forrige trinn (trinn 4.3).
- For å uttrykke subsarcolemmal glykogen per overflateareal av fiberen (VS) (ytterste myofibril), konverter volumfraksjonen av glykogen til en absolutt mengde ved å multiplisere med volumet av bildet (produkt av areal- og seksjonstykkelse) og del med produktet av gjennomsnittlig tilgjengelig lengde (fra trinn 3.6) med seksjonstykkelse (t).
- Beregn det totale volumetriske glykogeninnholdet ved hjelp av verdiene fra trinn 4.1, 4.4 og 4.5, som følger:
Myofibrillar glykogen = Intermyofibrillar glykogen + (intramyofibrillar glykogen · område brøkdel av intramyofibrillar plass)
Ved å anta en gjennomsnittlig fiberradius på 40 μm27, er volum-til-overflate-forholdet 20: 1, så totalt glykogen er:
Totalt glykogen (VV) = Myofibrillar glykogen + (subsarcolemmal glykogen (VS) / 20)
MERK: Forholdet mellom volum og overflate på 20:1 kan variere fra fiber til fiber avhengig av den faktiske fiberstørrelsen og størrelsen på den subsarcolemmale regionen. Dette tas ikke i betraktning med den nåværende protokollen. - Fra dette beregnes det relative bidraget fra hver pulje som brøkdeler av totalt glykogen:
Intermyofibrillar glykogen / Total glykogen = Intermyofibrillar glykogen / Total glykogen
Intramyofibrillar glykogen / Total glykogen = (Intramyofibrillar glykogen · områdefraksjon av intramyofibrillar plass) / Total glykogen
Subsarcolemmal glykogen / Total glykogen = Subsarcolemmal glykogen / 20 / Totalt glykogen - For hvert glykogenbasseng beregner du feilkoeffisienten (CE), som uttrykker usikkerheten i glykogenestimatet på fibernivå, basert på antall bilder (n), totalt antall kryss i hvert bilde (x), og antall kryss som treffer glykogen i det aktuelle utvalget i hvert bilde (y) som følger28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen fremstår glykogenpartikler som svarte og distinkte (figur 1 og figur 2). De normale verdiene av glykogen er avbildet i figur 3. Disse dataene er basert på totalt 362 fibre fra 41 friske unge menn som samlet inn i forskjellige tidligere studier19,24,29,30,31. Her kan man se at intermyofibrillare glykogenverdier fordeles nær normalen, mens både intramyofibrillar og subsarcolemmal glykogen viser en skjev fordeling, hvor fibre noen ganger har en overdreven mengde glykogen. Det er viktig å merke seg at i normal størrelse muskelfiber (diameter på 60-80 μm), er intermyofibrillar glykogen det største bassenget som utgjør rundt 80% av totalt glykogeninnhold. Intramyofibrillar og subsarcolemmal glykogen utgjør hver rundt 10% av det totale innholdet.
Figur 1: Avbildning og fiberskriving. (A) Hver fiber er avbildet i en randomisert systematisk rekkefølge. (B) Eksempel på et bilde fra det subsarkolemmale rommet. (C) Eksempel på et bilde fra myofibrillarrommet. (D) I hvert myofibrillarbilde måles bredden på en Z-plate (røde linjer). Målingene av totalt 12 Z-plater (én per bilde) gir en feilkoeffisient på ca. 0,03. (E) Den typiske fordelingen av gjennomsnittlig fiber Z-plate bredde i 6-10 fibre av hver av de 10 biopsier. Fra hver biopsi er 2-3 fibre definert som type 1 og 2 basert på innen biopsifordelingen. Bildene stammer fra en biopsi av m. vastus lateralis av en powerlifter inkludert i en tidligere studie29. m: mitokondrier og Z: Z-plate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Glykogenanalyser. (A) Subsarcolemmal glykogenvolum per overflateareal estimeres ved punkttelling ved hjelp av en rutenettstørrelse på 180 nm x 180 nm innenfor en region definert av lengden på den ytterste myofibril og den subsarcolemmale regionen vinkelrett på denne lengden (blå stiplede linjer). (B) Myofibrillarvolumfraksjonen estimeres ved punkttelling ved hjelp av en rutenettstørrelse på 400 nm x 400 nm. (C) Volumfraksjonen av intramyofibrillarglykogen estimeres ved punkttelling ved hjelp av en rutenettstørrelse på 60 nm x 60 nm. (D) Volumfraksjonen av intermyofibrillarglykogen er estimert ved punkttelling ved hjelp av en rutenettstørrelse på 180 nm x 180 nm. I A-D indikerer de røde sirklene treff (et kryss som treffer en glykogenpartikkel). (E) Den estimerte feilkoeffisienten for et stereologisk forholdsestimat24 for 2 til 12 analyserte bilder. Feilkoeffisienten er estimert basert på antall tellinger og varierer derfor mellom prøver basert på glykogenkonsentrasjonen. Det er ofte relativt lavt når glykogeninnholdet er høyt og omvendt. (F) Koeffisienten for variasjon av glykogenpartikkeldiameter etter måling av 2-99 partikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Normale verdier av de tre subcellulære bassengene av glykogen i skjelettmuskulatur. Fiolinplottene er basert på 362 fibre fra 41 friske unge menn (18-39 år). Fibrene stammer fra tidligere studier, hvor biopsier fra m. vastus lateralis i hvile- eller kontrolltilstand ble oppnådd19,24,29,30,31. Verdier vises som en bokstegning med et merke for medianen og en boks som angir interkvartilområdet. Linjene representerer øvre og nedre tilstøtende verdier. Boksene er lagt over av kjernetetthetsplott. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det kritiske trinnet i metoden er bruk av redusert osmium ved kaliumferrocyanid under etterfiksering. Selektiviteten til dette modifiserte fikseringsmiddelet for glykogendeteksjon kan ikke forklares fullt ut av kjemi, men inkluderer også eksperimentelle funn som ikke viser noen deteksjon av slike partikler i vev som er kjent for å være fri for glykogen eller i det ekstracellulære rommet11.
Kritiske parametere er presisjonen til estimatene og fiber-til-fiber-variasjonen. Ved å følge den nåværende protokollen for avbildning oppnås en feilkoeffisient mellom 0,1 og 0,2 av estimatene for de forskjellige bassengene av glykogen per fiber. Dette feilnivået er godt under variasjonen mellom individuelle fibre (figur 3). Det oppfordres til å rapportere slike presisjonsestimater ved beregning av volumetrisk innhold av glykogen. Den presenterte fibermetoden er validert mot myosin ATPase isoform29. Z-platetykkelsen og mitokondrievolumfraksjonen kan også brukes i kombinasjon for å indikere fibertype, men ikke mitokondrievolumfraksjon alene32.
De viktigste begrensningene ved metoden er manglende evne til å oppdage de svært små glykogenpartiklene, og at profiler av glykogenpartikler kan overlappe i det projiserte bildet28. Den første begrensningen ugyldiggjør et sant mål på den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen. Dette blir en alvorlig skjevhet når glykogenpartiklene blir degradert under høye metabolske krav, mens skjevheten kan være ubetydelig når glykogenpartiklene vokser fra medium til en større størrelse under glykogensyntese eller superkompensasjon. Selv om dette kan ha store konsekvenser for anslaget av gjennomsnittlig glykogenpartikkelstørrelse ved lave glykogennivåer, er estimatene for volumetriske glykogenkonsentrasjoner robuste, siden små, uobserverte glykogenpartikler bidrar svært lite til det totale glykogeninnholdet. Den andre begrensningen stammer fra tilstanden, hvor glykogenpartiklene er mye mindre enn tykkelsen på seksjonene. Denne skjevheten er for det meste til stede ved svært høye glykogenkonsentrasjoner og kan undersøkes ved å sammenligne glykogenvolumfraksjonene av seksjoner med forskjellige tykkelser. Hvis en tykkere seksjon ikke er parallelt med en høy glykogenvolumfraksjon, må det skyldes en underestimering på grunn av mer overlappende partikler i den tykkeste delen. I tidligere studier korrelerer glykogenvolumfraksjonen med glykogenkonsentrasjonen i området fra 50 til 600 mmol kg dw-1 som indikerer ingen uttalt overlapping av partikler. Men hvis glykogenkonsentrasjonen øker over dette nivået, er det ingen økning i intermyofibrillar glykogen som indikerer overlapping33. Dette kan løses ved å ekstrapolere forholdet mellom glykogenvolumfraksjonen og konsentrasjonen ved de nedre glykogenkonsentrasjonene.
Basert på NM-oppløsningen fra TEM, er denne protokollen for tiden den eneste metoden for å estimere subcellulær fordeling av glykogen. I tillegg tillater metodikken også en storstilt kvantitativ tilnærming (som beskrevet her), hvor kvantitative verdier kan oppnås på enkeltfibernivå. Dette er av enorm betydning i skjelettmuskler med høy heterogenitet i fiberrekruttering under ulike typer trening2, hvor glykogenavhengige utmattelsesmekanismer bare forekommer i noen fibre. Metoden har også potensial for andre spennende vev som kardiomyocytter, hvor glykogen er kjent for å være avgjørende for normal hjertefunksjon og kritisk under iskemi23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Den svenske olympiske komité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
