Summary
Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können eine potenzielle Quelle für MSCs sein, die sich in insulinproduzierende Zellen (IPCs) differenzieren. In diesem Protokoll stellen wir detaillierte Schritte zur Isolierung und Charakterisierung von epididymalen Ad-MSCs von Ratten bereit, gefolgt von einem einfachen, kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus denselben Ratten-Ad-MSCs.
Abstract
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) - insbesondere solche, die aus Fettgewebe isoliert wurden (Ad-MSCs) - haben als erneuerbare, reichlich vorhandene Quelle von Stammzellen, die keine ethischen Bedenken aufwirft, besondere Aufmerksamkeit erregt. Die derzeitigen Methoden zur Isolierung von Ad-MSCs sind jedoch nicht standardisiert und verwenden komplizierte Protokolle, die eine spezielle Ausrüstung erfordern. Wir isolierten Ad-MSCs aus dem Nebenhodenfett von Sprague-Dawley-Ratten mit einer einfachen, reproduzierbaren Methode. Die isolierten Ad-MSCs erscheinen normalerweise innerhalb von 3 Tagen nach der Isolierung, da adhärente Zellen eine fibroblastische Morphologie aufweisen. Diese Zellen erreichen innerhalb von 1 Woche nach der Isolierung eine Konfluenz von 80%. Danach, in der Passage 3-5 (P3-5), wurde eine vollständige Charakterisierung für die isolierten Ad-MSCs durch Immunphänotypisierung für charakteristische MSC-Cluster-of-Differentiation-Oberflächenmarker (CD) wie CD90, CD73 und CD105 sowie durch Induktion der Differenzierung dieser Zellen entlang der osteogenen, adipogenen und chondrogenen Linien durchgeführt. Dies wiederum impliziert die Multipotenz der isolierten Zellen. Darüber hinaus induzierten wir die Differenzierung der isolierten Ad-MSCs in Richtung der insulinproduzierenden Zellen (IPCs) über ein einfaches, relativ kurzes Protokoll, indem wir das modifizierte Eagle-Medium (HG-DMEM), β-Mercaptethanol, Nicotinamid und Exendin-4 von Dulbecco mit hoher Glucose einbehielten. Die IPC-Differenzierung wurde genetisch bewertet, indem zunächst die Expressionsniveaus spezifischer β-Zell-Marker wie MafA, NKX6.1, Pdx-1 und Ins1 sowie die Dithizon-Färbung für die erzeugten IPCs gemessen wurden. Zweitens wurde die Bewertung auch funktionell durch einen Glukose-stimulierten Insulinsekretions-Assay (GSIS) durchgeführt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ad-MSCs leicht isoliert werden können, indem sie alle MSC-Charakterisierungskriterien aufweisen, und sie können in der Tat eine reichliche, erneuerbare Quelle von IPCs im Labor für die Diabetesforschung bieten.
Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSCs), auch mesenchymale Stromazellen genannt, gehören zu den am häufigsten verwendeten Zelltypen für die regenerative Medizin 1,2. Sie werden als adulte Stammzellen klassifiziert und zeichnen sich durch Multilineage-Differenzierungspotenzial und Selbsterneuerungskapazitätaus 3. MSCs können isoliert und aus verschiedenen Quellen gewonnen werden, einschließlich Fettgewebe, Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurgewebe und Blut, Haarfollikeln und Zähnen 4,5.
Die Isolierung von Stammzellen aus Fettgewebe wird aufgrund ihres einfachen Zugangs, ihrer schnellen Expansion in vitro und ihrer hohen Ausbeute als attraktiv und vielversprechend angesehen6. Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können aus verschiedenen Arten wie Menschen, Rindern, Mäusen, Ratten und in jüngster Zeit auch aus Ziegenisoliert werden 7. Es wurde nachgewiesen, dass Ad-MSCs jetzt potenzielle Kandidaten für Tissue Engineering und Gen-/Zelltherapie sind, die sogar verwendet werden können, um eine autologe Alternative für die langfristige Reparatur von Weichteilverletzungen oder -defekten zu entwickeln 7,8.
Die International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) hat drei Mindestkriterien definiert, die von MSCs für eine vollständige Charakterisierung nachgewiesen werden müssen9. Erstens müssen sie plastikhaltig sein. Zweitens sollten MSCs mesenchymale Stammzelloberflächenmarker wie CD73, CD90 und CD105 exprimieren und die hämatopoetischen Marker CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79α oder CD19 und HLA-DR nicht exprimieren. Schließlich sollten MSCs die Fähigkeit aufweisen, sich in die drei mesenchymalen Linien zu differenzieren: Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten. Interessanterweise können MSCs auch in andere Linien wie neuronale Zellen, Kardiomyozyten, Hepatozyten und Epithelzellendifferenzieren 10,11.
Tatsächlich besitzen MSCs einzigartige Eigenschaften, die es ermöglichen, sie als potenzielle Therapeutika in der regenerativen Therapie für verschiedene Krankheiten einzusetzen. MSCs können lösliche Faktoren absondern, um eine immunmodulatorische Umgebung zu induzieren, die therapeutische Vorteile bietet12. Darüber hinaus können MSCs zu Verletzungsstellen und Tumormikroumgebungen migrieren, um eine zielgerichtete Therapie durchzuführen. Die Mechanismen sind jedoch nicht vollständig aufgeklärt13. Darüber hinaus haben MSCs die Fähigkeit, Exosomen abzusondern, extrazelluläre Vesikel im Nanobereich, die eine Ladung nicht-kodierender RNAs, Proteine und löslicher Faktoren tragen, die sich in letzter Zeit als neuartiger Mechanismus des therapeutischen Potenzials der MSCs bei verschiedenen Krankheiten herausgestellthaben 14.
Noch wichtiger ist, dass MSCs deutliche Aufmerksamkeit für ihr Potenzial zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen (IPCs) erzeugt haben, entweder durch genetische Veränderung 15,16 oder durch die Verwendung verschiedener extrinsisch induzierender Faktoren innerhalb der Kulturmedien in vitro17. Die IPC-Induktionsperiode variiert stark, da sie vom verwendeten Induktionsprotokoll und den verwendeten extrinsischen Faktoren abhängt. Der Prozess der Differenzierung kann von Tagen bis zu Monaten dauern und erfordert eine Kombination von exogen induzierenden Faktoren, die in verschiedenen Stadien hinzugefügt und / oder zurückgezogen werden müssen. Viele dieser Faktoren, die für die endokrine Pankreasdifferenzierung verwendet wurden, sind biologisch aktive Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Proliferation oder Differenzierung / Neogenese von insulinsezernierenden β-Zellen fördern und / oder den Insulingehalt von IPCs 18,19,20,21 erhöhen. Es ist hier bemerkenswert, dass MSCs auch therapeutische Wirkungen bei Diabetes und seinen Komplikationen über mehrere Mechanismen, einschließlich ihres Sekrets, sowie eine breite Palette von immunmodulatorischen Wirkungen haben22,23,24.
In diesem Protokoll stellen wir ein detailliertes Stufenprotokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs aus Eileiterfett von Ratten vor, gefolgt von einem einfachen, relativ kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus Ad-MSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt, und alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Fakultät für Pharmazie der British University in Egypt (BUE), Kairo, Ägypten, genehmigt. Das Ad-MSC-Isolationsprotokoll wurde von Lopez und Spencer übernommen, mit Modifikationen15.
1. Isolierung von Ad-MSCs aus epididymalen Fettpölstigen von Ratten
- Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250-300 g, die nicht älter als 1 Monat sind (zwei pro Isolation). Betäuben Sie die Tiere und euthanasieren Sie sie dann durch Zervixdislokation. Besprühen Sie das eingeschläferte Tier mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Haut und den Muskel am unteren Teil des Bauches aus und ziehen Sie dann die beiden Hoden heraus, um die Nebenhodenfettpolster freizulegen.
- Schneiden Sie vorsichtig die Nebenhoden-Fettpolster ab und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu schneiden.
- Isolieren Sie das Fettgewebe, das den Nebenhoden umgibt, und geben Sie es dann in eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
- Schneiden Sie diese Fettpolster in der Biosicherheitskabine mit Pinzette und Skalpell in kleine Stücke. Übertragen Sie diese geschnittenen Fettgewebestücke in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das 10 ml steriles PBS enthält.
- Waschen Sie das gehackte Fettgewebe 5 Mal mit 10 ml PBS jedes Mal, um das kontaminierende Blut zu entfernen. Die folgenden Waschvorgänge müssen sorgfältig durchgeführt werden.
- Fügen Sie 10 ml PBS zum Gewebe hinzu und mischen Sie gründlich für 45 s. Lassen Sie dann das Gewebe durch die Schwerkraft absetzen, indem Sie das Rohr 5 Minuten lang stehen lassen, um es in zwei Schichten zu trennen.
- Saugen Sie das PBS mit einer 10-ml-Spritze aus dem Infranatant ab und ersetzen Sie es durch frische 10 ml PBS für eine weitere Wäsche.
- Wiederholen Sie diesen Waschschritt 4-5 Mal, bis das PBS blutfrei ist. Dies deutet darauf hin, dass der meiste, wenn nicht sogar das gesamte Blut entfernt wird.
- Nach dem Waschen das Fettgewebe in 10 ml Kollagenaselösung (0,1% Kollagenase Typ 1 in PBS) resuspendieren. Verschließen Sie das Rohr fest mit Parafilm und inkubieren Sie es dann in einem schüttelnden Wasserbad (37 ° C, 80 U / min, für 45 min), bis das Gewebe fast homogen ist.
HINWEIS: Vermeiden Sie die vollständige Verdauung des Gewebes (wenn die Lösung vollständig homogen wird und alle Gewebereste / -stücke vollständig verschwinden), da dies die anschließende Kultivierung der Zellen beeinträchtigt. Normalerweise dauert die Verdauung 30-45 min. - Sobald die Kollagenase-Verdauung abgeschlossen ist, wirbeln Sie das Röhrchen für 15 s und zentrifugieren Sie dann für 5 Minuten bei 300 x g. Wirbeln Sie das Rohr erneut für 10 s, gefolgt von einer weiteren 5-minütigen Zentrifugation. Es werden dann drei Schichten beobachtet. Entsorgen Sie vorsichtig die Ölschicht, gefolgt von der wässrigen Schicht, ohne das Pellet der stromalen Gefäßfraktion (SVF) zu stören.
HINWEIS: Entfernen Sie den Überstand, der Adipozyten enthält, und die Kollagenaselösung. Entfernen Sie zuerst die Adipozyten und die begleitende Ölschicht mit einer 10 ml Pipette, um eine vollständige Entfernung der Öltröpfchen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann die darunter liegende wässrige Schicht. - Resuspendiert das SVF-Pellet am Boden des Röhrchens in 10 ml steriler BSA-Lösung (1% Albumin, Rinderserum Fraction V-Lösung in PBS) und zentrifugiert dann das Röhrchen für 5 min bei 300 x g.
- Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das SVF-Pellet in 8,5 ml kompletten Medien für Ad-MSCs (bestehend aus Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] Medien, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin).
- Kultivieren Sie die Zellen in einem 25 cm 2 Kolben bei 37 °C unter 5% CO2 . Überprüfen Sie am folgenden Tag die angehängten Zellen, entfernen Sie die suspendierten Zellen und ersetzen Sie die Medien. Danach wechseln Sie alle zwei Tage die Medien.
- Passieren Sie die Zellen alle 5-7 Tage, wenn sie zu 80% -90% konfluent sind, mit Trypsin-EDTA. Verwenden Sie Zellen zwischen den Passagen 3-5 für die nachfolgenden Experimente, die in diesem Protokoll beschrieben werden. Eine schematische Darstellung aller Isolationsschritte ist in Abbildung 1 dargestellt.
HINWEIS: Normalerweise kann die Trypisn-EDTA-Potenz zwischen verschiedenen Lieferanten variieren, also versuchen Sie, die Zeit der Trypsinisierung zu minimieren, um toxische Wirkungen auf die Zellen zu vermeiden.
2. Charakterisierung von Ad-MSCs durch Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie-Analysen
- Teilen Sie in Passage 3 die Zellen mit Trypsin-EDTA auf. Mit PBS 2 mal waschen und dann die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
- Inkubieren Sie 100.000 Zellen bei 4 °C im Dunkeln für 20 Minuten mit entweder Maus-Anti-Ratten-CD90 oder CD105 (mesenchymale Marker) oder CD34 (hämatopoetischer Marker) monoklonaler Antikörper, markiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC).
- Waschen Sie die Zellen und suspendieren Sie sie in 500 μL FACS-Puffer. Analysieren Sie durch Durchflusszytometrie25.
3. Bewertung des Differenzierungspotenzials isolierter Ad-MSCs in verschiedene mesenchymale Linien
- Adipogene Differenzierung
- Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben), dann kultivieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 3,7 x 10 4 Zellen / Well in einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2. Als nächstes wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bis die Zellen fast 100% Konfluenz erreichen, was normalerweise 3 Tage dauert.
- Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, ersetzen Sie die Proliferationsmedien durch die adipogenen Differenzierungsmedien (bestehend aus LG-DMEM-Medien, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin mit 1x adipogener Ergänzung, geliefert mit dem Mesenchymal Stem Cells Functional Identification Kit), um die Adipogenese zu induzieren. Wechseln Sie dann alle 3 Tage das Medium (0,5 ml/gut). Achten Sie darauf, den Medienaustausch vorsichtig durchzuführen, um die Lipidvakuolen nicht zu stören.
- Nach 21 Tagen beurteilen Sie die adipogene Differenzierung durch mikroskopische Untersuchung des Aussehens der Lipidvakuolen und durch Ölrotfärbung.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von Oil Red vor, indem Sie 30 mg Oil Red-Fleck in 10 ml Isopropanol auflösen und dann mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren. Bereiten Sie anschließend eine Arbeitslösung vor, indem Sie 3 Teile Stammlösung mit 2 Teilen doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) mischen, gut mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, dann anschließend mit Filterpapier filtern.
- Um die adipogene Differenzierung zu dokumentieren, waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit neutralgepuffertem Formalin 10% (0,75 ml / Well) für 15 min. Danach waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS mit 1 ml / Well und inkubieren Sie die Zellen jedes Mal für 5 Minuten. Es ist wichtig, das PBS vollständig zu aspirieren, bevor Sie die Oil Red-Arbeitslösung hinzufügen.
- Nach der letzten Wäsche die Oil Red Arbeitslösung zu den Zellen geben und sie für 60 min bei 37 °C inkubieren. Entfernen Sie anschließend die Fleckenlösung und waschen Sie die Zellen vorsichtig 2 Mal mit PBS. Beobachten Sie die gefärbten Lipidtröpfchen unter dem Mikroskop.
- Osteogene Differenzierung
- Samen Sie 7,4 x 10 3 Zellen/Well (0,5 mL medium/Well) in einer 24-Well-Platte aus und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben) für3 Tage, um eine Konfluenz von fast 70% zu erreichen.
- Induzieren Sie die Zellen mit dem osteogenen Supplement (im Lieferumfang des Kits enthalten) in LG-DMEM-Medien, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin.
- Setzen Sie die osteogene Induktion für 21 Tage fort und wechseln Sie alle 3 Tage das Differenzierungsmedium.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Alizarin Red S-Fleck vor, indem Sie 200 mg Alizarin Red S-Fleck in 9 ml ddH2O auflösen und dann den pH-Wert mit Ammoniumhydroxid und HCl auf 4,1-4,3 einstellen. Als nächstes erhöhen Sie die Lautstärke auf 10 ml von ddH2O. Entfernen Sie anschließend alle Ausscheidungen durch Filtration mit Filterpapier.
- Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit 10% gepuffertem Formalin (0,75 ml / Well) für 15 min. Danach waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS (1 ml / Well). Inkubieren Sie die Zellen jedes Mal für 5 min.
- Inkubieren Sie die fixierten Zellen mit der vorbereiteten 2%igen Alizarin-Red S-Lösung für 30 min in einem 37 °C Inkubator.
- Danach entfernen Sie die Fleckenlösung, waschen Sie die Zellen 2 Mal mit ddH2O und einmal mit PBS und beobachten Sie dann die gefärbte kalziumreiche extrazelluläre Matrix, um die osteogene Differenzierung unter dem Mikroskop zu beurteilen.
- Chondrogene Differenzierung
- Samen Sie 7,4 x 10 3 Zellen/Well (0,5 mL medium/Well) in einer 24-Well-Platte aus und inkubieren Sie diese bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben) für3 Tage, um eine Konfluenz von fast 70% zu erreichen.
- Wenn die gewünschte Konfluenz erreicht ist, induzieren Sie die chongene Differenzierung der Zellen mit serumfreiem DMEM / F12, das Insulin-Transferrin-Selen (ITS), chondrogenes Supplement (im Lieferumfang des Kits enthalten), 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 0,25 μg / ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin21.
- Inkubieren Sie die Zellen mit den chondrogenen Medien für 21 Tage, während Sie die chondrogenen Differenzierungsmedien alle 3 Tage wechseln.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus Alcian Blue 8GX-Färbung wie folgt vor: Zunächst wird eine 3%ige Eisessigsäurelösung in ddH2O hergestellt, indem 3 ml Eisessigsäure zu 97 ml ddH2O zugegeben werden. Bereiten Sie dann eine Arbeitslösung aus Alcian Blue 8GX-Fleck vor, indem Sie 0,1 g in 100 ml 3% ige Gletschersäurelösung mischen und alle Ausscheidungen durch Filtration mit Filterpapier entfernen.
- Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit 10% gepuffertem Formalin (0,75 ml / Well) für 15 min. Danach waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS (1 ml / Well). Inkubieren Sie die Zellen jedes Mal für 5 min.
- Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen in der vorbereiteten 0,1% Alcian Blue 8GX-Färbung in 3% Eisessigsäure für 60 min bei 37 °C zu inkubieren. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2 Mal mit ddH2O und einmal mit PBS und beobachten Sie dann die gefärbten sulfatierten Proteoglykane unter dem Mikroskop.
4. Differenzierung von Ad-MSCs in IPCs
- Teilen Sie in Passage 3 die Ad-MSCs mit Trypsin-EDTA auf. Entfernen Sie zuerst die Medien und waschen Sie dann die Zellen, während sie noch im Kulturkolben mit 5 ml PBS befestigt sind. Als nächstes 5 ml Trypsin-EDTA in den 75 cm2 Kolben geben und bei 37 °C für 3-10 min inkubieren.
HINWEIS: Versuchen Sie, die Zellen in frühen Passagen zu induzieren, normalerweise zwischen P3-P5, da späte Passagen die Eigenschaften und Differenzierungsfähigkeiten der Zellen beeinträchtigen17,24. - Anschließend untersuchen Sie die Zellen auf Ablösung und darauf, dass es sich um eine Einzelzellsuspension handelt. Fügen Sie dem Kolben 5 ml vollständiges DMEM/F12-Medium hinzu, um die Trypsin-Wirkung zu verhindern. Sammeln Sie die Zellsuspension und übertragen Sie sie in eine 15-ml-Röhre und fügen Sie dann weitere 5 ml vollständiges DMEM/F12-Medium in die Röhre ein.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 2 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, zentrifieren Sie erneut bei 300 x g für 2 min und suspendieren Sie dann das Zellpellet in 3-5 ml kompletten DMEM / F12-Medien.
- Zählen Sie die Zellen mit trypanblauem Ausschlussfarbstoff und einem Hämozytometer.
- Dann säen Sie die Zellen in 6-Well-Platten (1 x 10 6 Zellen/Platte) und einer 12-Well-Platte (für GSIS-Assay; 1 x 106 Zellen/Platte) und inkubieren Sie in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben) für 3 Tage, um fast 90% Konfluenz zu erreichen.
- Entfernen Sie am Tag der Induktion die Medien, waschen Sie die Zellen mit PBS und induzieren Sie die Zellen dann für 2 Tage mit Vorinduktionsmedien (DMEM/F12 ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin, 10 mM Nicotinamid [NA] und 1mM β-Mercaptoethanol [β-ME]).
- Induzieren Sie die Zellen für weitere 1 Tag mit hohem Glukose-DMEM (HG-DMEM, 4,5 g / L Glukose), ergänzt mit 2,5% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 0,25 μg / ml Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin, 10 mM NA und 1 mM β-Mercaptoethanol. Sammeln Sie Zellpellets am Ende dieser Phase (in diesem Protokoll als D3-Zellen bezeichnet).
- Inkubieren Sie die Zellen für weitere 7 Tage in den abschließenden Differenzierungsinduktionsmedien bestehend aus HG-DMEM, ergänzt mit 2,5% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin, 10 mM NA, 1mM β-Mercaptoethanol und 10 nM Exendin-4.
- Sammeln Sie am Ende des angegebenen Zeitraums Zellpellets (in diesem Protokoll als Final bezeichnet) und bewerten Sie die erfolgreiche Differenzierung der Zellen durch DTZ-Färbung und GSIS-Assay, wie in diesem Protokoll beschrieben.
- Bewerten Sie die generierten IPCs, indem Sie die Schritte 5 und 6 unten ausführen.
5. Dithizon-Färbung
- Dithizon (DTZ) Färbstofflösung wie folgt vorbereiten: 25 mg DTZ in 2,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) vollständig auflösen, in Aliquots teilen und bis zur Verwendung bei −20 °C im Dunkeln lagern.
- Für die Färbung ist eine Arbeitslösung 1:100 (Volumen/Volumen) vorzubereiten, indem die Stammlösung in vollständigem Kulturmedium verdünnt wird (HG-DMEM ergänzt mit 5% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin). Filtern Sie dann die Arbeitslösung durch einen 0,2 μm Spritzenfilter.
- Als nächstes waschen Sie die Zellen für die spezifizierten DTZ-Färbekulturzellen in einer 6-Well-Platte und waschen Sie die Zellen nach dem Absaugen der Kulturmedien einmal mit PBS und fügen Sie dann 2 ml DTZ-Arbeitslösung in jede Vertiefung hinzu. Im CO 2 Inkubator mindestens2 h bei 37 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig 2 mal mit PBS. Nach der letzten Wäsche 2 ml PBS in jedes Bohrloch geben. Beobachten Sie dann die karminrot gefärbten IPCs unter einem inversen Mikroskop. Verwenden Sie uninduzierte Ad-MSCs, die ursprünglich in einem vollständigen Wachstumsmedium (10% FBS - DMEM/F12) kultiviert wurden, als Steuerelement.
6. Genexpression von β-Zell-Markern durch RT-qPCR
- RNA-Extraktion
- Nach der Differenzierung sammeln Sie die Zellpellets und lagern sie bis zur Verwendung bei −80 °C. Susen Sie jedes Zellpellet (abgeleitet aus den sechs Vertiefungen einer 6-Well-Platte gepoolt) in 1 ml Guanidiumthiocyanat-RNA-Extraktionsreagenz in einem 1,5 ml nukleasefreien Röhrchen, zusammen mit mehrmaligem Auf- und Absteigen. Inkubieren Sie die lysierten Proben bei Raumtemperatur für 5 Minuten, um eine vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu ermöglichen.
- Fügen Sie 200 μL Chloroform pro 1 ml RNA-Extraktionsreagenz hinzu und verschließen Sie die Röhrchen, die 15 s lang von Hand kräftig geschüttelt werden sollen. Als nächstes 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Proben zentrifugieren bei 13.800 x g für 15 min bei 4 °C. Dies führt zu einer Mischungstrennung in eine Phase mit niedrigerer Chloroform, eine Interphase und eine farblose oberwässrige Phase, wobei die RNA in der wässrigen Phase verbleibt.
- Legen Sie die obere wässrige Phase in eine neue Röhre, während Sie vorsichtig vermeiden, die Interphase zu berühren.
- 600 μL 100% Isopropanol in die wässrige Phase (1:1 Volumen) geben, dann die Proben 25 Mal gründlich durch Inversion mischen und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Die Proben zentrifugieren bei 18.800 x g für 30 min bei 4 °C. Die ausgefällte RNA bildet ein kleines gelartiges Pellet auf der Röhrchenseite.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Pellets mit 1 ml 80% eiskaltem Ethanol. Nach Zugabe des Ethanols führen Sie langsam mehrere Pipettierungen des RNA-Pellets für 10 s durch.
- Die Proben werden 5 min bei 9.600 x g bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und lassen Sie die RNA-Pellets 5-10 min an der Luft trocknen.
- Nach dem Trocknen lösen Sie die RNA-Pellets in 25-100 μL RNase-freiem Wasser (entsprechend der ursprünglichen Pelletgröße) auf, indem Sie sie mehrmals auf und ab pipettieren, bis sie vollständig in 1,5 ml nukleasefreien Röhrchen vollständig gelöst werden. Vermeiden Sie eine übermäßige Trocknung des RNA-Pellets.
HINWEIS: Normalerweise wird das Pellet transparent, wenn es trocknet. Sobald es jedoch klar ist, suspendieren Sie es sofort, um eine übermäßige Trockenheit des Pellets zu vermeiden. - Quantifizieren Sie RNA, indem Sie die optischen Dichten (OD) bei 260 nm und 280 nm bestimmen, wobei nukleasefreies Wasser als Leer verwendet wird.
- Stellen Sie sicher, dass die Stichproben OD260/OD280 = 1,8-2,0 aufweisen.
- cDNA-Synthese
- Synthetisieren Sie cDNA aus der isolierten Gesamt-RNA mit einem cDNA-Synthesekit.
- Führen Sie die cDNA-Synthesereaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. In einem 200-μL-PCR-Röhrchen wird ein Volumen RNA-Lösung, das 0,5 μg Gesamt-RNA enthält, zu dem in Tabelle 1 gezeigten Reaktions-Master-Mix gegeben.
- Nach Zugabe der RNA zum Master-Mix geben Sie die Mischung durch ein Zyklusprogramm von 50 °C für 30 min für einen Zyklus ein, gefolgt von einem Inaktivierungszyklus von 95 °C für 2 min mit einem Thermocycler.
- Verdünnen Sie die cDNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 2 ng/μL. Bei −20 °C für nachfolgende RT-qPCR lagern.
- RT-qPCR mit SYBR Green Master Mix
- Führen Sie die RT-qPCR-Reaktion für jedes Zielgen unter Verwendung der cDNA-Vorlage gemäß der in Tabelle 2 gezeigten Reaktionsmischung durch. Führen Sie alle Maßnahmen in dreifacher Ausführung durch.
- Die verwendeten Primersätze sind in Tabelle 3 dargestellt. Führen Sie alle RT-qPCR-Verfahren auf Eis durch.
- Führen Sie die RT-qPCR-Reaktion mit einer real-time PCR-Maschine auf Standardprogrammeinstellungen durch. Die thermischen Zyklusbedingungen umfassten eine anfängliche Denaturierung von 95 °C für 10 min, gefolgt von 45 Denaturierungszyklen (95 °C, 15 s) und kombiniertem Glühen/Verlängern (60 °C, 1 min).
- Bestimmen Sie dieCT-Werte und erfassen Sie die Ausdrucksstufen gemäß 2-ΔΔCt, mit β-Actin als interne Kontrolle.
| cDNA-Synthese-Master-Mix | Volumen (μl) |
| 5x cDNA-Synthesepuffer | 4 |
| dNTP | 2 |
| RNA-Primer | 1 |
| Verso Enzym-Mix | 1 |
| RT Enhancer | 1 |
| Nuklease Freies Wasser | Variable |
| Gesamt-RNA | Variable |
| Gesamtes Reaktionsvolumen | 20 |
Tabelle 1: cDNA-Synthese-Master-Mix-Volumina.
| RT-qPCR-Reaktionsmix | Volumen (μl) | Endkonzentration in 10 μL |
| cDNA | 2 | 2 ng/gut |
| RT-qPCR Forward Primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| RT-qPCR Reverse Primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| Nuklease freies Wasser | 1 | ------- |
| 2x SYBR Green Mastermix | 5 | 1x |
| Gesamtreaktionsvolumen | 10 |
Tabelle 2: RT-qPCR-Reaktionsgemisch
| Gen | Vorwärts-Primer | Reverse Primer |
| FOXA2 | GAGCCGTGAAGATGGAAGG | ATGTTGCCGGAACCACTG |
| PDX-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT |
| NKX6,1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| MafA | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Ins-1 | CACCTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-Aktin | TGGAGAAGATTTGGCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
Tabelle 3: Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen
7. Glukosestimulierte Insulinsekretion
- Herstellung des Ringer-Bicarbonat-Puffers (KRB) von Kreb
- Bereiten Sie Krebs Ringer-Bicarbonat-Pufferlösung (KRB) mit 2 mM Glukose- (niedrige Glukose) und 20 mM Glukosekonzentration (hohe Glukose) für den GSIS-Assay (Glucose-stimulierte Insulinsekretion) vor. Die für die KRB-Pufferaufbereitung verwendeten Komponenten sind in Tabelle 4 aufgeführt.
- Stellen Sie den pH-Wert des Puffers mit 1 N HCl auf etwa 7,25-7,35 ein (d. h. 0,1-0,2 Einheiten unter dem gewünschten pH-Wert 7,4, da er während der Filtration ansteigen kann).
- Rinderserumalbumin (BSA) frisch in einer Konzentration von 0,1 % (Gewicht/Volumen) zugeben.
- Fügen Sie danach Glukose hinzu (18 mg für 50 ml KRB, um den 2 mM KRB-Puffer mit niedriger Glukose vorzubereiten, und 180 mg für 50 ml KRB, um den 20 mM hohen Glukose-KRB-Puffer vorzubereiten).
- Sterilisieren Sie die vorbereiteten LG- und HG KRB-Puffer durch Filtration durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter, um für den GSIS-Assay bereit zu sein.
- GSIS-Assay
- Samen Sie zunächst 1 x 105 Zellen / Well in einer 12-Well-Zellkulturplatte und induzieren Sie diese Zellen unter Verwendung des exakt gleichen Differenzierungsinduktionsprotokolls.
- Waschen Sie am Ende des Induktionsprotokolls die erzeugten IPCs (in Platte) vorsichtig 2 Mal mit PBS und einmal mit LG-KRB.
- Anschließend inkubieren Sie die IPCs mit 300 μL LG-KRB/Well für 1 h und verwerfen Sie dann diesen Puffer.
- Als nächstes inkubieren Sie die IPCs mit 300 μL entweder 2 mM (LG) oder 20 mM (HG) KRB-Puffer für weitere 1 h. Sammeln Sie am Ende der Inkubationszeit den Überstand und lagern Sie ihn bei −80 °C für den anschließenden sezernierten Insulinassay mit einem handelsüblichen ELISA-Kit und unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Versuchen Sie, beim Absaugen oder Hinzufügen des PBS- und KRB-Puffers beim Ausführen des GSIS-Assays so vorsichtig wie möglich zu sein.
| Bestandteil | Konzentration |
| Magnesiumchlorid (wasserfrei) | 0,0468 g/L |
| Kaliumchlorid | 0,34 g/l |
| Natriumchlorid | 7,00 g/l |
| Natriumphosphat zweibasisch (wasserfrei) | 0,1 g/l |
| Natriumphosphat einbasisch (wasserfrei) | 0,18 g/l |
| Natriumbicarbonat | 1,26 g/l |
| Calciumchlorid | 0,2997 g/L |
Tabelle 4: Die für die KRB-Puffervorbereitung verwendeten Komponenten.
8. Statistische Auswertung
- Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus. Alle Vergleiche wurden mit Hilfe der unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) und Tukeys Post-hoc-Test mit statistischer Software durchgeführt. Ergebnisse mit p-Werten ** p ≤ 0,01 und *p ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs
Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigten die isolierten Zellen aus Fettgewebe eine heterogene Population von abgerundeten und fibroblastenähnlichen Zellen ab dem nächsten Tag der Isolierung (Abbildung 2A). 4 Tage nach der Isolierung begannen die Fibroblastenzellen in Anzahl und Größe zuzunehmen und als homogene Population durch Passage 1 zu wachsen (Abbildung 2B, C). Diese Zellen wuchsen weiterhin als kunststoffhafte, fibroblastische Zellen, wie gezeigt, bis zur Passage 3 und erfüllten das erste Kriterium der MSC-Eigenschaften (Abbildung 2D). Diese Ad-MSCs zeigten sehr gute Kultureigenschaften, und dieses Protokoll erwies sich als relevantes, einfaches und relativ schnelles Protokoll, um Ad-MSCs von Nebenhoden-Fettpolstern zu isolieren.
Der nächste Schritt bestand darin, die isolierten Ad-MSCs zu charakterisieren. Laut ISCT sollten MSCs die drei Kriterien der plastischen Adhärenz, der Expression mesenchymaler CDs mit einem Mangel an hämatopoetischen Markern und der Fähigkeit, sich in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten zu differenzieren, befolgen. Wie in Abbildung 3A gezeigt, zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse, dass die meisten dieser Zellen CD90 und CD105 exprimierten (76,4% bzw. 73,6%). Inzwischen waren sie fast negativ für CD34 (0,1%).
Darüber hinaus zeigten sie bei der Induktion der Differenzierung dieser Zellen die Fähigkeit, sich in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten zu differenzieren. Wie in Abbildung 3B (oberes Feld) gezeigt, zeigten die Adipozyten eine ölrote Färbung von Lipidvakuolen im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen. Die Osteozyten zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen eine charakteristische Alizarin-Rot-Färbung (Abbildung 3B, mittleres Panel). Schließlich zeigten Chondrozyten-induzierte Zellen eine blaue Färbung der extrazellulären Matrix im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen (Abbildung 3B, unteres Bild).
Diese Daten zeigen deutlich, dass isolierte Zellen aus Fettgewebe nicht nur gute Kultureigenschaften aufweisen, sondern auch alle für MSCs vorgeschlagenen Kriterien aufweisen.
Differenzierung von Ad-MSCs in insulinproduzierende Zellen (IPCs)
Wie in Abbildung 4A gezeigt, haben wir ein relativ einfaches, kurzes Protokoll verwendet, um Ad-MSCs in IPCs zu unterscheiden. Nach der Induktion der Differenzierung wurden die induzierten IPCs auf verschiedene Arten bewertet. Die induzierten Zellen zeigten deutliche morphologische Veränderungen. Wie in Abbildung 4B (oberes Panel) gezeigt, zeigten die induzierten Zellen eine abgerundete, clusterartige Morphologie im Vergleich zur normalen fibroblastischen Morphologie von Ad-MSCs. Interessanterweise zeigten diese Cluster bei der Färbung mit Dithizon eine karmesinrote Färbung, die eine Eigenschaft von Zinkgranula der β-Zell-Färbung ist (Abbildung 4B, untere Tafel).
Danach wurden die erzeugten IPCs im Vergleich zu den uninduzierten Kontrollzellen genetisch auf die Expression der spezifischen β-Zell-Marker untersucht. Wie in Abbildung 5A-E gezeigt, waren die induzierten Zellen in der Lage, verschiedene spezifische β-Zell-Marker zu exprimieren, was auf ihre Fähigkeit hinweist, IPCs zu erzeugen. Was den definitiven Endodermmarker FOXA2-a (wie in Abbildung 5A gezeigt) betrifft, so wurde er bei der D3-Differenzierung im Vergleich zur Kontrolle stark exprimiert, erreichte fast das 30-fache und verringerte sich dann auf nur das 10-fache der Kontrolle in den endgültigen differenzierten Zellen (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; S. < 0,05). Was Pdx-1 (das als früher Marker für β-Zellen gilt) betrifft, so war es sowohl in D3- als auch in endgültigen differenzierten Zellen erhöht und erreichte im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen fast das 20-fache (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17,13 ± 0,342; S. < 0,05; Abbildung 5B). In Bezug auf die anderen β-Zellmarker, nämlich NKX6.1, MafA und Insulin-1 (Ins1), zeigten sie alle eine Erhöhung von D3 bis zur endgültigen Differenzierung und erreichten fast das 8-fache, 12-fache bzw. 300-fache im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Finale: 7,97 ± 1,34, S<0,05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Finale: 11,54 ± 2,40, S. < 0,05; und Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Finale: 318,20 ± 76,09, S. < 0,05) (Abbildung 5C-E). Dies deutet darauf hin, dass diese Ad-MSCs in IPCs differenzieren können, die β-Zell-Marker exprimieren.
Schließlich wurden diese Zellen auf die Sekretion von Insulin untersucht, wenn sie mit steigenden Glukosekonzentrationen konfrontiert wurden. Wie in Abbildung 5F gezeigt, war das Insulin, das im Überstand der induzierten IPCs sezerniert wurde, wenn es mit 20 mM Glukose herausgefordert wurde, signifikant höher als das, das sezerniert wurde, wenn die Zellen mit 2 mM Glukose herausgefordert wurden (HG: 390 pg/ml ± 33 pg/ml; LG: 234 pg/ml ± 32 pg/ml, p < 0,05; Abbildung 5F)
Diese Daten bestätigten, dass es dem verwendeten Protokoll gelang, die Ad-MSCs in IPCs zu differenzieren, was genetisch und funktionell bestätigt wurde.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Schritte des Protokolls, das zur Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs verwendet wird. Generiert von Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikrophotographische Aufnahmen, die die isolierten Ad-MSCs zeigen . (A) Isolierte Zellen mit kunststoffhaftender, fibroblastenähnlicher Morphologie beginnen am Tag nach der Isolierung zu erscheinen. (B) Im Laufe der Zeit vermehren sich diese adhärenten Ad-MSCs (mit fibroblastenähnlicher Morphologie) und nehmen an Zahl zu und erreichen eine homogenere fibroblastenähnliche Population in (C) P1 und (D) P3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung von Ad-MSCs. (A) Die durchflusszytometrische Analyse von Ad-MSCs zeigt, dass diese Zellen für CD34 (oberes Panel) fast negativ sind, während die Mehrheit der Zellen CD90 und CD105 exprimiert (unteres Panel). Ad-MSCs können sich in die drei mesenchymalen Linien unterscheiden, nämlich (B) Adipozyten (wo Öltröpfchen durch Öl rot gefärbt sind), (C) Osteozyten, die durch Alizarinrot gefärbt sind, und (D) Chondrozyten, die durch Alcian Blue gefärbt sind (im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen). Kontrolle: uninduzierte Zellen, Diff: differenzierte Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Differenzierung von Ad-MSCs in IPCs. (A) Schematische Darstellung des Differenzierungsprotokolls, das zur Erzeugung von IPCs aus Ad-MSCs verwendet wird, zusammen mit Mikroaufnahmen für die Zellen in jeder Phase während der Induktion der Differenzierung in Richtung IPCs. Bei der Differenzierung verlieren die Zellen ihre fibroblastische Morphologie und neigen dazu, sich bildende Cluster zu aggregieren, die dazu neigen, sich abzulösen und in Suspensionsmedien zu wachsen. (B) Mikroaufnahmen zeigen Kontroll-Ad-MSCs und IPCs, die durch das obige Protokoll erzeugt wurden, und zeigen runde morphologische Veränderungen (rechtes Feld) im Vergleich zur fibroblastenähnlichen Morphologie der uninduzierten Ad-MSCs (linkes Feld), entweder ungefärbt (oberes Feld) oder DTZ-gefärbt (unteres Panel).
Kontrolle: uninduzierte Zellen; IPCs: insulinproduzierende Zellen; NA: Nicotinamid; β-ME: Beta-Mercaptoethanol; D3: Induzierte Zellen an Tag 3 während der Induktion der Differenzierung in Richtung IPCs; D10: endgültige differenzierte IPCs am Ende des Induktionsprotokolls; Ex-4: exendin-4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Relative Expressionsniveaus von β-Zell-Markern und GSIS für IPCs. Relative Expressionsniveaus nach qRT-PCR für (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA und (E) Ins-1. (F) Spiegel von sezerniertem Insulin im Überstand, wenn die erzeugten IPCs mit 2mM Glucose (LG) oder 20mM Glucose (HG) herausgefordert werden. Kontrolle: uninduzierte Ad-MSCs, Tag-3: differenzierte Zellen, die bei D3 gesammelt wurden; Finale: endgültige differenzierte IPCs; LG: wenig Glukose; HG: hohe Glukose. a: Der Mittelwert unterscheidet sich von der Kontrolle bei p < 0,05; b: Mittelwert unterscheidet sich von Tag-3 bei p < 0,05; *: Der Mittelwert von LG unterscheidet sich von HG bei p < 0,05; Der Vergleich wurde mit einem unabhängigen T-Test durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Protokoll ist es uns gelungen, ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Ad-MSCs aus Ratten-Nebenhodenfett und die Differenzierung dieser Ad-MSCs in IPCs vorzustellen. Tatsächlich ist das epidydimale Fett der Ratte eine leicht zugängliche Quelle von Fettgewebe zur Gewinnung von Ad-MSCs und erfordert keine spezielle Ausrüstung, weder für die Sammlung noch für die Verarbeitung 15,26,27. Die isolierten Ad-MSCs zeigten eine ausgezeichnete Kulturerweiterung und zeigten alle Kriterien, die als MSCs definiert werden sollten. Das verwendete Protokoll wurde zuvor mit leichten Modifikationen15 beschrieben. Dieses Protokoll hat sich als effektiv und reproduzierbar erwiesen. Die Zellen zeigten ab Tag 1 nach der Isolierung eine fibroblastische Morphologie und dehnten sich weiter aus, bis sie eine homogene Population erreichten. Interessanterweise verwendeten wir das gleiche Protokoll, um menschliche Ad-MSCs von Lipo-Aspirate mit vergleichbarem Erfolg wie Rattengewebe zu isolieren (Daten nicht gezeigt). Die einzige Einschränkung dieses Prozesses ist der chemische Aufschluss unter Verwendung von Kollagenase, wenn er in anderen Protokollen Seite an Seite mit mechanischem Aufschluss gestellt wird28. Dieser Schritt stellt auch eine kritische Maßnahme dar, da die chemische Verdauung der Zellen ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigen kann29,30. Andernfalls bietet dieses Protokoll einen guten Start für jeden Forscher, der erwägen würde, eine Ad-MSC-Forschungslinie in seinem Labor zu starten.
Der Einsatz von MSCs bei der Behandlung von Diabetes hat neue Wege eröffnet und neue Hoffnungen für die Behandlung von Diabetes geweckt. Die Generierung voll ausgereifter IPCs aus MSCs ist jedoch immer noch Gegenstand von Debatten und Herausforderungen31. Derzeit gibt es in der Literatur mehrere Protokolle, um die Differenzierung von MSCs gegenüber IPCs zu induzieren. Diese Protokolle verwenden eine Fülle von chemischen Verbindungen und Wachstumsfaktoren für verschiedene Zeiträume 20,32,33. Diese Faktoren hängen hauptsächlich vom MSC-Typ und der MSC-Quelle ab, um mit34,35 zu beginnen. Dennoch ist die Beschaffung ausgereifter funktionsfähiger IPCs von MSCs immer noch Gegenstand von Debatten und Forschungen auf dem Gebiet20.
Im vorgestellten Protokoll bieten wir eine kurze, relativ einfache und effiziente Möglichkeit, funktionale IPCs von Ad-MSCs zu erhalten. Die resultierenden Zellen zeigten deutliche morphologische Veränderungen mit positiver DTZ-Färbung, exprimierten die meisten β-Zell-Marker und zeigten eine erhöhte Insulinsekretion als Reaktion auf eine erhöhte Glukosekonzentrationsherausforderung. All diese Beweise bestätigen die Effizienz dieses Protokolls als β-Zell-Induktionsprotokoll von Ad-MSCs. Wir verwendeten dieses Protokoll in einer anderen Art von MSCs, nämlich menschlichen Wharton-Gelee-MSCs (WJ-MSCs), abgeleitet von der Nabelschnur, und es zeigte tatsächlich ähnliche Ergebnisse 21,36. Diese Ergebnisse rechtfertigen es, unser Protokoll an anderen Arten und Quellen von MSCs auszuprobieren, wodurch das Verfahren zu einem universellen Protokoll für die Generierung von IPCs aus MSCs wird. Es ist bemerkenswert, die Bedeutung der Induktion der Zellen in frühen Passagen, normalerweise zwischen P3-P5, hervorzuheben, da späte Passagen die Eigenschaften und Differenzierungsfähigkeiten der Zellen beeinträchtigen17,24.
Wie bereits erwähnt, ist das Erreichen voll ausgereifter β-Zellen aus MSCs eine Frage der Debatte und bei weitem keine vollständige Aufklärung. Solche Protokolle wie die hier beschriebenen bieten jedoch ein einfaches, schnelles Mittel, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Differenzierung von Ad-MSCs oder sogar anderen Arten von MSCs in IPCs besser zu verstehen. Die Fähigkeit der hinzugefügten Verbindungen für die Induktion der Ad-MSCs, spezifische β-Zell-Marker zu exprimieren, bietet ein nützliches Werkzeug, um die genetischen und epigenetischen Faktoren zu untersuchen, die die Differenzierung von MSCs in IPCs steuern. Darüber hinaus ermöglicht das schnelle, einfache Protokoll den Forschern, andere intrinsische Faktoren zu untersuchen, die das Ergebnis einer solchen Differenzierung verbessern können. Diese Faktoren können entweder eine adjuvante Therapie mit Stammzellen darstellen oder sogar eine therapeutische Modalität für Diabetes darstellen. In unserem Labor haben wir einen ähnlichen Ansatz verwendet, um zu beweisen, dass Obestatin, ein Darmhormon, ein neuer potenzieller Faktor für die Erzeugung von IPCs aus WJ-MSCs37 sein kann.
Es ist auch erwähnenswert, dass das aktuelle Protokoll zwei Haupteinschränkungen aufweist. Erstens haben wir, wie bereits erwähnt, die chemische Verdauung durch Kollagenase verwendet, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann29,30. Zweitens setzten wir das Differenzierungsverfahren in vitro ein und untersuchten nicht die erwartete weitere Reifung und Differenzierungsverbesserung der erzeugten IPCs in vivo. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die Transplantation von in vitro-differenzierten MSCs in IPCs eine tiefgreifende Induktion der Expression verschiedener β-Zellmarker zeigte. Dieser Anstieg erreichte etwa das 100-fache 12-18 Monate nach der Transplantation in vivo38. Daher werden zukünftige Studien zur weiteren Untersuchung der In-vivo-Reifung der erzeugten IPCs durch dieses einfache Protokoll von gutem Wert sein.
Abschließend haben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs bereitgestellt, gefolgt von einem relativ einfachen, schnellen und effizienten Protokoll für die Generierung von IPCs aus Ad-MSCs. Diese Protokolle bieten nicht nur ein effizientes Werkzeug, um eine Stammzelltherapie-Forschungslinie zu initiieren, sondern können auch dazu beitragen, das ständig wachsende Feld der MSC-Zelltherapie für Diabetes zu entwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle Co-Autoren erklären keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dieser Arbeit.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Tierarzt, Fakultät für Pharmazie, The British University of Egypt (BUE) für die Hilfe bei der Sezierung der Ratten.
Wir möchten auch die Bemühungen der Fakultät für Massenkommunikation der British University in Egypt (BUE) für die Produktion und Bearbeitung des Videos dieses Manuskripts anerkennen und schätzen.
Wir danken Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) für die Überarbeitung und das Korrekturlesen des Manuskripts in englischer Sprache.
Diese Arbeit wurde teilweise vom Center for Drug Research and Development (CDRD), Fakultät für Pharmazie, The British University in Egypt (BUE), Kairo, Ägypten, finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S.
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
