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Developmental Biology

Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline

Published: August 29, 2022 doi: 10.3791/63348
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2,3
1Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2Pharmacology and Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 3Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt

Summary

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être une source potentielle de CSM qui se différencient en cellules productrices d’insuline (IPC). Dans ce protocole, nous fournissons des étapes détaillées pour l’isolement et la caractérisation des Ad-MSC épididymiques de rat, suivies d’un protocole simple et court pour la génération d’IPC à partir des mêmes Ad-MSC de rat.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), en particulier celles isolées du tissu adipeux (CSA) , ont fait l’objet d’une attention particulière en tant que source renouvelable et abondante de cellules souches qui ne pose aucun problème éthique. Cependant, les méthodes actuelles pour isoler les Ad-MSC ne sont pas normalisées et utilisent des protocoles compliqués qui nécessitent un équipement spécial. Nous avons isolé les CSAd de la graisse épididymale de rats Sprague-Dawley à l’aide d’une méthode simple et reproductible. Les Ad-MSC isolés apparaissent généralement dans les 3 jours suivant l’isolement, car les cellules adhérentes présentent une morphologie fibroblastique. Ces cellules atteignent 80% de confluence dans les 1 semaine suivant l’isolement. Par la suite, au passage 3-5 (P3-5), une caractérisation complète a été effectuée pour les CSA isolés par immunophénotypage des marqueurs de surface du groupe de différenciation (CD) MSC caractéristiques tels que CD90, CD73 et CD105, ainsi que par induction de la différenciation de ces cellules dans les lignées ostéogéniques, adipogènes et chondrogènes. Ceci, à son tour, implique la multipotence des cellules isolées. De plus, nous avons induit la différenciation des Ad-MSC isolés vers la lignée des cellules productrices d’insuline (IPC) via un protocole simple et relativement court en incorporant le milieu Eagle modifié de Dulbecco (HG-DMEM), le β-mercaptoéthanol, le nicotinamide et l’exendine-4. La différenciation des IPC a été évaluée génétiquement, tout d’abord, en mesurant les niveaux d’expression de marqueurs β cellulaires spécifiques tels que MafA, NKX6.1, Pdx-1 et Ins1, ainsi que la coloration à la dithizone pour les IPC générés. Deuxièmement, l’évaluation a également été réalisée fonctionnellement par un test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). En conclusion, les Ad-MSC peuvent être facilement isolés, présentant tous les critères de caractérisation des CSM, et ils peuvent en effet fournir une source abondante et renouvelable de PIC en laboratoire pour la recherche sur le diabète.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), également connues sous le nom de cellules stromales mésenchymateuses, sont parmi les types de cellules les plus largement utilisés pour la médecine régénérative 1,2. Elles sont classées comme cellules souches adultes et caractérisées par un potentiel de différenciation multiligne et une capacité d’auto-renouvellement3. Les CSM peuvent être isolés et obtenus à partir de diverses sources, y compris le tissu adipeux, la moelle osseuse, le sang périphérique, le tissu et le sang du cordon ombilical, les follicules pileux et les dents 4,5.

L’isolement des cellules souches du tissu adipeux est considéré comme à la fois attrayant et prometteur en raison de leur accès facile, de leur expansion rapide in vitro et de leur rendement élevé6. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être isolées de différentes espèces telles que les humains, les bovins, les souris, les rats et, plus récemment, les chèvres7. Il a été prouvé que les Ad-MSC sont maintenant des candidats potentiels pour l’ingénierie tissulaire et la thérapie génique / cellulaire qui peuvent même être utilisés pour développer une alternative autologue pour la réparation à long terme des lésions ou des défauts des tissus mous 7,8.

L’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) a défini trois critères minimaux qui doivent être présentés par les MSC pour une caractérisation complète9. Tout d’abord, ils doivent être adhérents au plastique. Deuxièmement, les CSM devraient exprimer des marqueurs mésenchymateux de la surface des cellules souches tels que CD73, CD90 et CD105 et manquer d’expression des marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 et HLA-DR. Enfin, les CSM devraient présenter la capacité de se différencier en trois lignées mésenchymateuses: adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Fait intéressant, les CSM peuvent également se différencier en d’autres lignées telles que les cellules neuronales, les cardiomyocytes, les hépatocytes et les cellules épithéliales10,11.

En fait, les CSM possèdent des propriétés uniques qui leur permettent d’être appliquées en tant qu’agents thérapeutiques potentiels dans la thérapie régénérative pour différentes maladies. Les CSM peuvent sécréter des facteurs solubles pour induire un environnement immunomodulateur qui procure des avantages thérapeutiques12. En outre, les CSM peuvent migrer vers des sites de blessures et des microenvironnements tumoraux pour administrer un traitement ciblé; toutefois, les mécanismes ne sont pas entièrement élucidés13. En outre, les CSM ont la capacité de sécréter des exosomes, des vésicules extracellulaires à l’échelle nanométrique qui transportent une cargaison d’ARN non codants, de protéines et de facteurs solubles, qui ont récemment émergé comme un nouveau mécanisme du potentiel thérapeutique des CSM dans diverses maladies14.

Plus important encore, les CSM ont suscité une attention marquée pour leur potentiel à se différencier en cellules productrices d’insuline (IPC), soit par modification génétique15,16, soit en utilisant divers facteurs extrinsèques dans les milieux de culture in vitro17. La période d’induction de l’IPC varie considérablement, car elle dépend du protocole d’induction utilisé et des facteurs extrinsèques utilisés. Le processus de différenciation peut durer de quelques jours à plusieurs mois, et il nécessite une combinaison de facteurs exogènes qui doivent être ajoutés et / ou retirés à différentes étapes. Bon nombre de ces facteurs qui ont été utilisés pour la différenciation pancréatique endocrinienne sont des composés biologiquement actifs dont il a été démontré qu’ils favorisent la prolifération ou la différenciation/néogenèse des cellules β sécrétant de l’insuline et/ou augmentent la teneur en insuline des IPC 18,19,20,21. Il convient de noter ici que les CSM ont également été signalés pour avoir des effets thérapeutiques dans le diabète et ses complications via plusieurs mécanismes, y compris leur sécrétome, ainsi qu’un large éventail d’actions immunomodulatrices 22,23,24.

Dans ce protocole, nous présentons un protocole détaillé par étapes pour l’isolement et la caractérisation des CSAd à partir de graisse épididymale de rat, suivi d’un protocole simple et relativement court pour la génération de CPI à partir d’Ad-MSC.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté de pharmacie de l’Université britannique en Égypte (BUE), au Caire, en Égypte. Le protocole d’isolement Ad-MSC a été adopté par Lopez et Spencer, avec les modifications15.

1. Isolement des Ad-MSC des coussinets de graisse épididymiques de rat

  1. Utilisez des rats Sprague-Dawley mâles pesant de 250 à 300 g et n’ayant pas plus de 1 mois (deux par isolement). Anesthésier les animaux, puis les euthanasier par luxation cervicale. Vaporisez l’animal euthanasié avec 70% d’éthanol. Excisez la peau et le muscle dans la partie inférieure de l’abdomen, puis retirez les deux testicules pour exposer les coussinets adipeux épididymiques.
  2. Coupez doucement les coussinets de graisse épididymale et veillez à ne pas couper les vaisseaux sanguins.
  3. Isolez le tissu adipeux entourant l’épididyme, puis placez-le dans une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  4. Dans l’armoire de biosécurité, coupez ces coussinets de graisse en petits morceaux à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Transférer ces morceaux de tissu adipeux coupés dans un tube centrifuge de 50 mL contenant 10 mL de PBS stérile.
  5. Lavez les tissus adipeux hachés 5 fois avec 10 ml de PBS à chaque fois pour éliminer le sang contaminant. Les procédures de lavage suivantes doivent être méticuleusement effectuées.
    1. Ajouter 10 mL de PBS au tissu et bien mélanger pendant 45 s. Ensuite, laissez le tissu se déposer par gravité en maintenant le tube debout pendant 5 minutes pour le séparer en deux couches.
    2. Aspirer le PBS de l’infranageant à l’aide d’une seringue de 10 ml et remplacer par 10 mL de PBS frais pour un autre lavage.
    3. Répétez cette étape de lavage 4 à 5 fois jusqu’à ce que le PBS soit exempt de sang. Cela indique que la plupart, sinon la totalité, du sang est enlevé.
  6. Après le lavage, remettre en suspension le tissu adipeux dans 10 mL de solution de collagénase (0,1 % de collagénase de type 1 dans le PBS). Scellez hermétiquement le tube avec du parafilm, puis incubez-le dans un bain-marie (37 °C, 80 tr/min, pendant 45 min) jusqu’à ce que le tissu soit presque homogène.
    REMARQUE: Évitez la digestion complète du tissu (lorsque la solution devient complètement homogène avec la disparition complète de tous les résidus / morceaux de tissu), car elle affecte négativement la culture des cellules par la suite. Habituellement, la digestion prend 30-45 min.
  7. Une fois la digestion de la collagénase terminée, vortex le tube pendant 15 s, puis centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Vortex le tube à nouveau pendant 10 s, suivi d’une autre centrifugation de 5 min. Trois couches seront alors observées. Jetez soigneusement la couche d’huile, suivie de la couche aqueuse, sans perturber la pastille de fraction vasculaire stromale (SVF).
    REMARQUE: Retirez le surnageant contenant les adipocytes et la solution de collagénase. Tout d’abord, retirez les adipocytes et la couche d’huile qui l’accompagne avec une pipette de 10 mL pour assurer l’élimination complète des gouttelettes d’huile, puis retirez la couche aqueuse inférieure.
  8. Remettre en suspension la pastille de SVF au fond du tube dans 10 mL de solution stérile de BSA (albumine à 1%, solution de fraction V de sérum bovin dans PBS), puis centrifuger le tube pendant 5 min à 300 x g.
  9. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre la pastille de SVF dans 8,5 mL de milieu complet pour les CSA (composé du mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] de Dulbecco complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine).
  10. Cultiver les cellules dans une fiole de25 cm 2 à 37 °C sous 5 % de CO2. Le lendemain, vérifiez les cellules attachées, retirez les cellules suspendues et remplacez le support. Ensuite, changez de média tous les deux jours.
  11. Passage des cellules tous les 5-7 jours quand elles sont confluentes à 80% à 90% en utilisant trypsine-EDTA. Utilisez des cellules entre les passages 3 à 5 pour les expériences ultérieures décrites dans ce protocole. Une présentation schématique de toutes les étapes d’isolement est fournie à la figure 1.
    REMARQUE: Habituellement, la puissance de Trypisn-EDTA peut varier entre les différents fournisseurs, alors essayez de minimiser le temps de trypsinisation pour éviter les effets toxiques sur les cellules.

2. Caractérisation des CSAd par immunophénotypage à l’aide d’analyses de cytométrie en flux

  1. Au passage 3, divisez les cellules à l’aide de trypsine-EDTA. Laver avec PBS 2 fois, puis compter les cellules avec un hémocytomètre.
  2. Incuber 100 000 cellules à 4 °C dans l’obscurité pendant 20 min avec un anticorps monoclonal anti-rat CD90 ou CD105 (marqueurs mésenchymateux) ou CD34 (marqueur hématopoïétique) marqué avec de la fluorescéine-isothiocyanate (FITC).
  3. Lavez les cellules et suspendez-les dans 500 μL de tampon FACS. Analyser par cytométrie en flux25.

3. Évaluation du potentiel de différenciation des CSA isolés en diverses lignées mésenchymateuses

  1. Différenciation adipogénique
    1. Remettre en suspension les cellules dans un milieu complet (comme décrit à l’étape 1.9.), puis cultiver les cellules à une densité de 3,7 x 104 cellules/puits dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2. Ensuite, changez le média tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent presque 100% de confluence, ce qui prend généralement 3 jours.
    2. Lorsque les cellules atteignent la confluence souhaitée, remplacer le milieu de prolifération par le milieu de différenciation adipogénique (composé de milieux LG-DMEM complétés par 10 % de FBS, de 100 U/mL de pénicilline, de 100 μg/mL de streptomycine, de 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et de 2 mM de L-glutamine avec 1x supplément adipogène, fourni avec le kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses) pour induire l’adipogenèse. Ensuite, changez le média tous les 3 jours (0,5 mL/puits). Prenez soin d’effectuer le remplacement du support en douceur afin de ne pas perturber les vacuoles lipidiques.
    3. Après 21 jours, évaluer la différenciation adipogénique par examen microscopique de l’apparence des vacuoles lipidiques et par coloration rouge huile.
    4. Préparez une solution mère d’huile rouge en dissolvant 30 mg de tache rouge huile dans 10 ml d’isopropanol, puis conservez-la pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une solution de travail en mélangeant 3 parties de solution mère avec 2 parties d’eau double distillée (ddH2O), mélangez-les bien et conservez-la pendant 10 minutes à température ambiante, puis filtrez ensuite par papier filtre.
    5. Pour documenter la différenciation adipogénique, lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné neutre à 10% (0,75 ml / puits) pendant 15 min. Après cela, lavez les cellules 2 fois avec du PBS en utilisant 1 mL / puits et incubez les cellules pendant 5 minutes à chaque fois. Il est important d’aspirer complètement le PBS avant d’ajouter la solution de travail Oil Red.
    6. Après le dernier lavage, ajouter la solution de travail Oil Red aux cellules et les incuber pendant 60 min à 37 °C. Ensuite, retirez la solution de coloration et lavez doucement les cellules 2 fois avec DU PBS. Observez les gouttelettes lipidiques colorées au microscope.
  2. Différenciation ostéogénique
    1. Ensemencez 7,4 x 103 cellules/puits (0,5 mL de milieu/puits) dans une plaque de 24 puits et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 en milieu complet (tel que décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 70 % de confluence.
    2. Induire les cellules avec le supplément ostéogénique (fourni avec le kit) dans un milieu LG-DMEM complété par 10% FBS, 100 U / mL pénicilline, 100 μg / mL streptomycine, 0,25 μg / mL amphotéricine B et 2 mM L-glutamine.
    3. Poursuivre l’induction ostéogénique pendant 21 jours, en changeant le milieu de différenciation tous les 3 jours.
    4. Préparer une solution de travail de la tache Alizarin Red S en dissolvant 200 mg de teinture Alizarin Red S dans 9 mL de ddH2O, puis ajuster le pH à 4,1-4,3 en utilisant de l’hydroxyde d’ammonium et du HCl. Ensuite, augmentez le volume à 10 mL par ddH2O. Ensuite, éliminez les précipités par filtration à l’aide de papier filtre.
    5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné à 10% (0,75 mL / puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules 2 fois à l’aide de PBS (1 mL / puits). A chaque fois, incuber les cellules pendant 5 min.
    6. Incuber les cellules fixes avec la solution préparée à 2% d’Alizarine-Red S pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
    7. Après cela, retirez la solution de coloration, lavez les cellules 2 fois avec ddH2O et une fois avec PBS, puis observez la matrice extracellulaire riche en calcium colorée pour évaluer la différenciation ostéogénique au microscope.
  3. Différenciation chondrogène
    1. Ensemencez 7,4 x 103 cellules/puits (0,5 mL de milieu/puits) dans une plaque de 24 puits et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 en milieu complet (tel que décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 70 % de confluence.
    2. Lorsque la confluence souhaitée est atteinte, induire la différenciation chondrogène des cellules avec du DMEM/F12 sans sérum contenant du sélénium insulino-transferrine (ITS), un supplément chondrogène (fourni avec le kit), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine21.
    3. Incuber les cellules avec le milieu chondrogène pendant 21 jours, tout en changeant le milieu de différenciation chondrogène tous les 3 jours.
    4. Préparez une solution de travail de teinture Alcian Blue 8GX comme suit: Tout d’abord, préparez une solution d’acide acétique glacial à 3% dans ddH2O en ajoutant 3 mL d’acide acétique glacial à 97 mL de ddH2O. Ensuite, préparez une solution de travail de teinture Alcian Blue 8GX en mélangeant 0,1 g dans 100 mL de solution d’acide glacial à 3% et éliminez les précipités par filtration à l’aide de papier filtre.
    5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné à 10% (0,75 mL / puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules 2 fois à l’aide de PBS (1 mL / puits). A chaque fois, incuber les cellules pendant 5 min.
    6. L’étape suivante consiste à incuber les cellules de la teinture Alcian Blue 8GX préparée à 0,1% dans de l’acide acétique glacial à 3% pendant 60 min à 37 °C. Lavez les cellules colorées 2 fois avec ddH2O et une fois avec PBS, puis observez les protéoglycanes sulfatés colorés au microscope.

4. Différenciation des Ad-MSC en IPC

  1. Au passage 3, divisez les Ad-MSC en utilisant Trypsin-EDTA. Tout d’abord, retirez le milieu, puis lavez les cellules tout en restant attachées dans la fiole de culture avec 5 mL de PBS. Ensuite, ajoutez 5 mL de trypsine-EDTA dans la fiole de 75 cm2 et incubez à 37 °C pendant 3 à 10 min.
    REMARQUE: Essayez d’induire les cellules aux premiers passages, généralement entre P3 et P5, car les passages tardifs affectent négativement les propriétés et les capacités de différenciation des cellules17,24.
  2. Ensuite, inspectez les cellules pour le détachement et pour être une suspension à cellule unique. Ajouter 5 mL de milieu DMEM/F12 complet à la fiole pour inhiber l’action de la trypsine. Recueillez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 15 mL, puis ajoutez 5 mL supplémentaires de milieu DMEM/F12 complet au tube.
  3. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
  4. Lavez les cellules une fois avec du PBS, centrifugez à nouveau à 300 x g pendant 2 min, puis remettez en suspension la pastille de cellule dans 3 à 5 mL de milieu DMEM/F12 complet.
  5. Comptez les cellules à l’aide d’un colorant d’exclusion bleu trypan et d’un hémocytomètre.
  6. Ensuite, ensemencez les cellules dans des plaques de 6 puits (1 x 106 cellules / plaque) et une plaque de 12 puits (pour le test GSIS; 1 x 106 cellules / plaque) et incubez dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO2 dans un milieu complet (comme décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 90% de confluence.
  7. Le jour de l’induction, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS, puis pré-induisez les cellules pendant 2 jours par un milieu de pré-induction (DMEM/F12 complété par 10% fbS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine, 10 mM de nicotinamide [NA] et 1mM de β-mercaptoéthanol [β-ME]).
  8. Induire les cellules pendant 1 jour supplémentaire en utilisant un DMEM à haute teneur en glucose (HG-DMEM, 4,5 g / L de glucose) complété par 2,5% FBS, 100 U / mL pénicilline, 100 μg / mL streptomycine, 0,25 μg / mL amphotéricine B, 2 mM L-glutamine, 10 mM NA et 1mM β-mercaptoéthanol. Collecter des pastilles cellulaires à la fin de cette étape (cellules D3 désignées dans ce protocole).
  9. Incuber les cellules pendant 7 jours supplémentaires dans le milieu d’induction de différenciation finale composé de HG-DMEM complété par 2,5% de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoéthanol et 10 nM d’exendine-4.
  10. À la fin de la période spécifiée, recueillir les pastilles cellulaires (nommées Final dans ce protocole) et évaluer la différenciation réussie des cellules par coloration DTZ et test GSIS, comme suit dans ce protocole.
  11. Évaluez les IPC générés en suivant les étapes 5 et 6 ci-dessous.

5. Coloration à la dithizone

  1. Préparer la solution mère de teinture de dithizone (DTZ) comme suit : Dissoudre complètement 25 mg de DTZ dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), diviser en aliquotes et conserver à −20 °C dans l’obscurité jusqu’à utilisation.
  2. Pour la coloration, préparer une solution de travail 1:100 (volume/volume) en diluant la solution mère dans un milieu de culture complet (HG-DMEM complété par 5% FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine). Ensuite, filtrez la solution de travail à travers un filtre à seringue de 0,2 μm.
  3. Ensuite, pour les cellules de culture de coloration DTZ spécifiées dans une plaque de 6 puits et, après avoir aspiré le milieu de culture, lavez les cellules une fois avec DU PBS, puis ajoutez 2 mL de solution de travail DTZ dans chaque puits. Incuber pendant au moins 2 h à 37 °C dans l’incubateur à CO2 .
  4. Lavez soigneusement les cellules 2 fois avec PBS. Après le dernier lavage, ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits. Ensuite, observez les IPC tachés de rouge cramoisi sous un microscope inversé. Utilisez des Ad-MSC non induits initialement cultivés dans un milieu de croissance complet (10% FBS - DMEM / F12) comme contrôle.

6. Expression génique des marqueurs β cellules par RT-qPCR

  1. Extraction de l’ARN
    1. Après différenciation, recueillir les pastilles cellulaires et les conserver à −80 °C jusqu’à leur utilisation. Suspendre chaque pastille cellulaire (dérivée des six puits d’une plaque de 6 puits regroupée) dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN de thiocyanate de guanidium dans un tube sans nucléase de 1,5 mL, avec pipetage de haut en bas plusieurs fois. Incuber les échantillons lysés à température ambiante pendant 5 min pour permettre une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.
    2. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de réactif d’extraction d’ARN et boucher solidement les tubes pour les serrer vigoureusement à la main pendant 15 s. Ensuite, incuber pendant 3 min à température ambiante.
    3. Centrifuger les échantillons à 13 800 x g pendant 15 min à 4 °C. Cela conduira à la séparation du mélange en une phase chloroforme inférieure, une phase interphase et une phase aqueuse supérieure incolore, l’ARN restant dans la phase aqueuse.
    4. Placez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, tout en évitant soigneusement de toucher l’interphase.
    5. Ajouter 600 μL d’isopropanol à 100% à la phase aqueuse (volume 1:1), puis bien mélanger les échantillons par inversion 25 fois, et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    6. Centrifuger les échantillons à 18 800 x g pendant 30 min à 4 °C. L’ARN précipité forme une petite pastille en forme de gel du côté du tube.
    7. Retirez le surnageant et lavez les granulés avec 1 mL d’éthanol glacé à 80 %. Après avoir ajouté l’éthanol, effectuez lentement un pipetage multiple de la pastille d’ARN pendant 10 s.
    8. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 9 600 x g à 4 °C. Jetez le surnageant et laissez sécher les pastilles d’ARN à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
    9. Après séchage, dissoudre les pastilles d’ARN dans 25 à 100 μL d’eau sans RNase (selon la taille initiale de la pastille) en pipetant plusieurs fois de haut en bas jusqu’à la solubilisation complète dans des tubes sans nucléase de 1,5 mL. Évitez le séchage excessif de la pastille d’ARN.
      REMARQUE: Habituellement, la pastille devient transparente lorsqu’elle sèche. Cependant, une fois qu’il est clair, remettez-le rapidement en suspension pour éviter une sécheresse excessive de la pastille.
    10. Quantifier l’ARN en déterminant les densités optiques (OD) à 260 nm et 280 nm, en utilisant de l’eau sans nucléase comme blanc.
    11. Assurez-vous que les échantillons ont OD260/OD280 = 1,8-2,0.
  2. Synthèse de l’ADNc
    1. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN total isolé à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc.
    2. Effectuer la réaction de synthèse de l’ADNc selon les instructions du fabricant. Dans un tube PCR de 200 μL, ajouter un volume de solution d’ARN contenant 0,5 μg d’ARN total au mélange maître de réaction présenté dans le tableau 1.
    3. Après avoir ajouté l’ARN au mélange maître, entrez le mélange par un programme de cycle de 50 °C pendant 30 min pendant un cycle, suivi d’un cycle d’inactivation de 95 °C pendant 2 min, à l’aide d’un cycleur thermique.
    4. Diluer l’ADNc à l’aide d’eau sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 2 ng/μL. Conserver à −20 °C pour une RT-qPCR ultérieure.
  3. RT-qPCR utilisant SYBR Green Master Mix
    1. Effectuer la réaction RT-qPCR pour chaque gène cible à l’aide d’un modèle d’ADNc selon le mélange de réactions présenté dans le tableau 2. Faites toutes les mesures en trois exemplaires.
    2. Les ensembles d’amorces utilisés sont présentés dans le tableau 3. Effectuez toutes les procédures RT-qPCR sur la glace.
    3. Effectuez la réaction RT-qPCR à l’aide d’une machine PCR en temps réel sur les paramètres du programme par défaut. Les conditions de cycle thermique comprenaient une dénaturation initiale de 95 °C pendant 10 min, suivie de 45 cycles de dénaturation (95 °C, 15 s) et d’un recuit/extension combiné (60 °C, 1 min).
    4. Déterminer les valeurs Ct et détecter les niveaux d’expression conformément à 2-ΔΔCt, avec β-actine comme contrôle interne.

Mélange maître de synthèse d’ADNc Volume (μl)
5x tampon de synthèse d’ADNc 4
dNTP 2
Amorce d’ARN 1
Mélange d’enzymes Verso 1
Amplificateur RT 1
Eau sans nucléase Variable
ARN total Variable
Volume total de réaction 20

Tableau 1 : Volumes de mélange maître de synthèse d’ADNc.

Mélange de réactions RT-qPCR Volume (μl) Concentration finale en 10 μL
ADNc 2 2 ng/puits
Amorce avant RT-qPCR (3 μM) 1 300 nM
Amorce inverse RT-qPCR (3 μM) 1 300 nM
Eau sans nucléase 1 -------
2x SYBR Green master mix 5 1x
Volume total de réaction 10

Tableau 2 : Mélange réactionnel RT-qPCR.

Gène Amorce avant Amorce inversée
FOXA2 GAGCCGTGAAGATGGAAGG ATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1 ATCCACCTCCCGGACCTTTC CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1 ACACCAGACCCACATTCTCCG ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
MafA TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT CCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1 CACCTTTGTGGTCCTCACCT CTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-actine TGGAGAAGATTTGGCACCAC AACACAGCCTGGATGGCTAC

Tableau 3 : Séquences d’amorces avant et arrière.

7. Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose

  1. Préparation du tampon de bicarbonate de Ringer (KRB) de Kreb
    1. Préparez la solution tampon de bicarbonate de Ringer (KRB) de Kreb avec des concentrations de glucose de 2 mM (faible teneur en glucose) et de 20 mM de glucose (glucose élevé) pour le test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). Les composants utilisés pour la préparation du tampon KRB sont donnés dans le tableau 4.
    2. Ajuster le pH du tampon à l’aide de 1 N HCl à environ 7,25-7,35 (c.-à-d. 0,1-0,2 unités en dessous du pH souhaité de 7,4, car il peut augmenter pendant la filtration).
    3. Ajouter l’albumine sérique bovine (BSA) fraîchement à une concentration de 0,1 % (poids/volume).
    4. Ajouter du glucose par la suite (18 mg pour 50 mL de KRB pour préparer le tampon KRB à faible teneur en glucose de 2 mM, et 180 mg pour 50 mL de KRB pour préparer le tampon KRB à haute teneur en glucose de 20 mM).
    5. Stériliser les tampons LG et HG KRB préparés par filtration à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour être prêt pour le test GSIS.
  2. Essai GSIS
    1. Initialement, ensemencez 1 x 105 cellules / puits dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits et induisez ces cellules en utilisant exactement le même protocole d’induction de différenciation.
    2. À la fin du protocole d’induction, lavez doucement les IPC générés (en plaque) 2 fois avec PBS et une fois avec LG-KRB.
    3. Ensuite, incuber les IPC avec 300 μL de LG-KRB/puits pendant 1 h, puis jeter ce tampon.
    4. Ensuite, incubez les IPC avec 300 μL de tampon KRB de 2 mM (LG) ou 20 mM (HG) pendant 1 h supplémentaire. À la fin de la période d’incubation, prélever le surnageant et le conserver à −80 °C pour le test d’insuline sécrété ultérieur à l’aide d’un kit ELISA commercial et en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi doux que possible lors de l’aspiration ou de l’ajout du tampon PBS et KRB lors de l’exécution du test GSIS.
Composant Concentration
Chlorure de magnésium (anhydre) 0,0468 g/L
Chlorure de potassium 0,34 g/L
Chlorure de sodium 7,00 g/L
Phosphate de sodium dibasique (anhydre) 0,1 g/L
Phosphate de sodium monobasique (anhydre) 0,18 g/L
Sodium Bicarbonate 1,26 g/L
Chlorure de calcium 0,2997 g/L

Tableau 4 : Composants utilisés pour la préparation du tampon KRB.

8. Analyse statistique

  1. Exprimer toutes les données en moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). Toutes les comparaisons ont été effectuées à l’aide de l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et du test post-hoc de Tukey à l’aide d’un logiciel statistique. Les résultats avec des valeurs de p **p ≤ 0,01 et *p ≤ 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.

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Representative Results

Isolement et caractérisation des Ad-MSC
Comme le montre la figure 2, les cellules isolées du tissu adipeux ont montré une population hétérogène de cellules arrondies et ressemblant à des fibroblastes à partir du jour suivant de l’isolement (figure 2A). 4 jours après l’isolement, les cellules fibroblastiques ont commencé à augmenter en nombre et en taille et à croître en tant que population homogène au passage 1 (Figure 2B, C). Ces cellules ont continué à se développer en tant que cellules de type fibroblastique adhérentes au plastique, comme indiqué jusqu’au passage 3, remplissant le premier critère des caractéristiques du CSM (figure 2D). Ces Ad-MSC ont montré de très bonnes caractéristiques de culture, et ce protocole s’est avéré être un protocole pertinent, facile et relativement rapide pour isoler les Ad-MSC des coussinets de graisse épididymiques.

L’étape suivante consistait à caractériser les Ad-MSC isolés. Selon ISCT, les CSM devraient suivre les trois critères d’adhérence plastique, d’expression des CD mésenchymateux avec un manque de marqueurs hématopoïétiques et de la capacité de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Comme le montre la figure 3A, l’analyse par cytométrie en flux a montré que la plupart de ces cellules exprimaient CD90 et CD105 (76,4 % et 73,6 %, respectivement). Pendant ce temps, ils étaient presque négatifs pour le CD34 (0,1 %).

De plus, lors de l’induction de la différenciation de ces cellules, elles ont montré la capacité de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Comme le montre la figure 3B (panneau supérieur), les adipocytes ont montré une coloration rouge huile des vacuoles lipidiques par rapport aux cellules non induites de contrôle. Les ostéocytes ont montré une coloration rouge Alizarine caractéristique (Figure 3B, panneau du milieu) par rapport aux cellules témoins. Enfin, les cellules induites par les chondrocytes ont montré une coloration bleue de la matrice extracellulaire par rapport aux cellules témoins non induites (Figure 3B, panneau inférieur).

Ces données indiquent clairement que les cellules isolées du tissu adipeux présentent non seulement de bonnes caractéristiques de culture, mais présentent également tous les critères proposés pour les CSM.

Différenciation des Ad-MSC en cellules productrices d’insuline (IPC)
Comme le montre la figure 4A, nous avons utilisé un protocole relativement simple et court afin de différencier les Ad-MSC en IPC. Après l’induction de la différenciation, les IPC induits ont été évalués de plusieurs manières. Les cellules induites ont montré des changements morphologiques marqués. Comme le montre la figure 4B (panneau supérieur), les cellules induites ont montré une morphologie arrondie en forme de grappe par rapport à la morphologie fibroblastique normale des CSA ad-MSC. Fait intéressant, lors de la coloration avec du dithizone, ces grappes ont montré une tache pourpre, qui est une caractéristique des granules de zinc de la tache à cellules β (Figure 4B, panneau inférieur).

Par la suite, les IPC générés ont été génétiquement évalués pour l’expression des marqueurs spécifiques des cellules β par rapport aux cellules témoins non induites. Comme le montre la figure 5A-E, les cellules induites ont pu exprimer divers marqueurs spécifiques β cellules, indiquant leur capacité à générer des IPC. Quant à FOXA2 - un marqueur endodermique définitif (comme le montre la figure 5A)-, il a été fortement exprimé à la différenciation D3 par rapport au contrôle, atteignant près de 30 fois puis diminuant à seulement 10 fois le contrôle dans les cellules différenciées finales (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). Quant à Pdx-1 (qui est considéré comme un marqueur précoce des cellules β), il a été élevé à la fois dans les cellules différenciées D3 et finales, atteignant près de 20 fois par rapport aux cellules témoins non induites (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17,13 ± 0,342; p < 0,05; Figure 5B). En ce qui concerne les autres marqueurs β cellules, à savoir NKX6.1, MafA et insuline-1 (Ins1), ils ont tous montré une élévation à partir de D3 jusqu’à la différenciation finale, atteignant près de 8 fois, 12 fois et 300 fois, respectivement, par rapport aux cellules non induites de contrôle (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Final: 7,97 ± 1,34, p<0,05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Finale: 11,54 ± 2,40, p < 0,05; et Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Finale: 318,20 ± 76,09, p < 0,05) (Figure 5C-E). Cela indique que ces Ad-MSC peuvent se différencier en IPC exprimant des marqueurs β cellules.

Enfin, ces cellules ont été évaluées pour la sécrétion d’insuline lorsqu’elles étaient confrontées à des concentrations croissantes de glucose. Comme le montre la figure 5F, l’insuline sécrétée dans le surnageant des IPC induits lorsqu’elle était confrontée à un défi avec 20 mM de glucose était significativement plus élevée que celle sécrétée lorsque les cellules étaient confrontées à un défi de 2 mM de glucose (HG: 390 pg / mL ± 33 pg / mL; LG : 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0,05 ; Figure 5F)

Ces données ont confirmé que le protocole utilisé a réussi à différencier les Ad-MSC en IPC, ce qui a été confirmé génétiquement et fonctionnellement.

Figure 1
Figure 1 : Présentation schématique des étapes du protocole utilisé pour l’isolation et la caractérisation des Ad-MSC. Généré par Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Photomicrographies montrant les CSA isolés. (A) Des cellules isolées présentant une morphologie semblable à celle des fibroblastes adhérents au plastique commencent à apparaître le lendemain de l’isolement. (B) Au fil du temps, ces Ad-MSC adhérents (avec une morphologie semblable à celle des fibroblastes) prolifèrent et augmentent en nombre, atteignant une population plus homogène de fibroblastes dans (C) P1 et (D) P3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation des CSAd. (A) L’analyse cytométrique en flux des CSAd montre que ces cellules sont presque négatives pour cd34 (panneau supérieur), tandis que la majorité des cellules expriment CD90 et CD105 (panneau inférieur). Les CSDD peuvent se différencier en trois lignées mésenchymateuses, à savoir (B) les adipocytes (où les gouttelettes d’huile sont colorées par le rouge d’huile), (C) les ostéocytes, colorés par le rouge alizarine, et (D) les chondrocytes, colorés par le bleu Alcian (par rapport aux cellules non induites témoins). Contrôle : cellules non induites, Diff : cellules différenciées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Différenciation des Ad-MSC en IPC. (A) Présentation schématique du protocole de différenciation utilisé pour générer des IPC à partir d’Ad-MSC, ainsi que des photomicrographies pour les cellules à chaque étape de l’induction de la différenciation vers les IPC. Lors de la différenciation, les cellules perdent leur morphologie fibroblastique et ont tendance à s’agréger en formant des grappes, qui ont tendance à se détacher et à se développer dans des milieux en suspension. (B) Les photomicrographies montrent des Ad-MSC et des IPC de contrôle générés par le protocole ci-dessus montrant des changements morphologiques de grappes rondes (panneau de droite) par rapport à la morphologie de type fibroblaste des Ad-MSC non induits (panneau de gauche), soit non colorés (panneau supérieur), soit colorés DTZ (panneau inférieur).
Contrôle: cellules non induites; IPC: cellules productrices d’insuline; NA: nicotinamide; β-ME: bêta-mercaptoéthanol; D3 : Cellules induites au jour 3 lors de l’induction de la différenciation vers les IPC ; D10: IPC différenciés finaux à la fin du protocole d’induction; Ex-4 : exendine-4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Niveaux d’expression relatifs des marqueurs β cellules et GSIS pour les IPC. Niveaux d’expression relatifs par qRT-PCR pour (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA et (E) Ins-1. (F) Niveaux d’insuline sécrétée dans le surnageant lors de la contestation des IPC générés avec 2mM de glucose (LG) ou 20mM de glucose (HG). Contrôle : Ad-MSC non induits, Jour-3 : cellules différenciées collectées à D3 ; Finale: IPC différenciés finaux; LG: faible taux de glucose; HG: glucose élevé. a: la moyenne est différente du contrôle à p < 0,05; b: la moyenne est différente du jour 3 à p < 0,05; *: la moyenne de LG est différente de HG à p < 0,05; la comparaison a été effectuée à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons réussi à présenter un protocole détaillé pour l’isolement des Ad-MSC de la graisse épididymale de rat et la différenciation de ces Ad-MSC en IPC. En fait, la graisse épidydimale de rat est une source facilement accessible de tissu adipeux pour l’obtention d’Ad-MSC et ne nécessite aucun équipement spécial, ni pour la collecte ni pour le traitement 15,26,27. Les Ad-MSC isolés ont montré une excellente expansion de la culture et présentaient tous les critères à définir comme MSC. Le protocole utilisé a été décrit précédemment avec de légères modifications15. Ce protocole s’est avéré efficace et reproductible. Les cellules ont montré une morphologie de type fibroblastique à partir du jour 1 après l’isolement et ont continué à se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent une population homogène. Fait intéressant, nous avons utilisé le même protocole pour isoler les Ad-MSC humains des lipo-aspirations avec un succès comparable à celui du tissu de rat (données non présentées). La seule limitation de ce processus est la digestion chimique à l’aide de la collagénase lorsqu’elle est mise côte à côte avec la digestion mécanique dans d’autres protocoles28. Cette étape représente également une mesure critique, car la digestion chimique des cellules peut nuire à leur viabilité29,30. Sinon, ce protocole offre un bon départ pour tout chercheur qui envisagerait de lancer une ligne de recherche Ad-MSC dans son laboratoire.

L’utilisation des CSM dans le traitement du diabète a ouvert de nouvelles voies et donné de nouveaux espoirs pour le traitement du diabète. Cependant, la génération de PIC pleinement matures à partir de MSC est encore un sujet de débat et de défi31. Actuellement, il existe plusieurs protocoles pour induire la différenciation des MSC vers les IPC dans la littérature. Ces protocoles utilisent une pléthore de composés chimiques et de facteurs de croissance pendant diverses périodes de temps 20,32,33. Ces facteurs dépendent principalement du type et de la source du MSC pour commencer avec34,35. Néanmoins, l’obtention de PIC fonctionnels matures auprès des MSC fait encore l’objet de débats et de recherches dans le domaine20.

Dans le protocole présenté, nous fournissons un moyen court, relativement simple et efficace d’obtenir des IPC fonctionnels auprès d’Ad-MSC. Les cellules résultantes ont montré des changements morphologiques marqués avec une coloration DTZ positive, ont exprimé la plupart des marqueurs β cellules et ont montré une augmentation de la sécrétion d’insuline en réponse à une augmentation de la concentration de glucose. Toutes ces preuves confirment l’efficacité de ce protocole en tant que protocole d’induction à cellules β d’Ad-MSC. Nous avons utilisé ce protocole dans un autre type de CSM, à savoir les MSC de gelée de Wharton humaine (WJ-MSC), dérivés du cordon ombilical, et il a en fait montré des résultats similaires21,36. Ces résultats justifient l’essai de notre protocole sur d’autres types et sources de CSM, faisant de la procédure un protocole universel pour la génération de CPI à partir de CSM. Il convient de souligner l’importance d’induire les cellules aux premiers passages, généralement entre P3 et P5, car les passages tardifs affectent négativement les propriétés et les capacités de différenciation des cellules17,24.

Comme mentionné précédemment, l’obtention de cellules β pleinement matures à partir de CSM est un sujet de débat et loin d’être complètement élucidé. Cependant, des protocoles tels que ceux décrits ici fournissent un moyen simple et rapide de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la différenciation des Ad-MSC, ou même d’autres types de MSC, en IPC. La capacité des composés ajoutés pour l’induction des CSM ad à exprimer des marqueurs β cellulaires spécifiques fournit un outil utile pour étudier les facteurs génétiques et épigénétiques qui régissent la différenciation des CSM en IPC. En outre, le protocole simple et rapide permet aux chercheurs d’étudier d’autres facteurs intrinsèques susceptibles d’améliorer le résultat d’une telle différenciation. Ces facteurs peuvent représenter soit un traitement adjuvant avec des cellules souches, soit même fournir une modalité thérapeutique pour le diabète. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé une approche similaire pour prouver que l’obéstatine, une hormone intestinale, peut être un nouveau facteur potentiel pour la génération de CPI à partir de WJ-MSCs37.

Il convient également de mentionner que le protocole actuel présente deux limites principales. Tout d’abord, comme mentionné précédemment, nous avons utilisé la digestion chimique par collagénase, ce qui peut nuire à la viabilité des cellules29,30. Deuxièmement, nous avons utilisé le processus de différenciation in vitro et n’avons pas étudié la maturation et l’amélioration de la différenciation attendues des IPC générés in vivo. Il est important de souligner que la transplantation de CSM in vitro différenciés dans des IPC a montré une induction profonde de l’expression de divers marqueurs de cellules β. Cette augmentation a atteint environ 100 fois 12-18 mois après la transplantation in vivo38. Ainsi, de futures études visant à étudier plus avant la maturation in vivo des IPC générés par ce protocole simple seront d’une bonne valeur.

En conclusion, nous avons fourni un protocole détaillé pour l’isolement et la caractérisation des Ad-MSC, suivi d’un protocole relativement simple, rapide et efficace pour la génération d’IPC à partir d’Ad-MSC. Ces protocoles fournissent non seulement un outil efficace pour initier une ligne de recherche sur la thérapie par cellules souches, mais peuvent également aider à développer le domaine en croissance constante de la thérapie cellulaire MSC pour le diabète.

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Disclosures

Tous les co-auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, vétérinaire spécialiste, Faculté de pharmacie, Université britannique d’Égypte (BUE) pour son aide à la dissection des rats.

Nous tenons également à remercier et à apprécier les efforts de la Faculté de communication de masse de l’Université britannique en Égypte (BUE) pour la production et le montage de la vidéo de ce manuscrit.

Nous tenons à remercier Mlle Fatma Masoud, MSc, maître de conférences en anglais, The British University in Egypt (BUE) pour la révision et la relecture en anglais du manuscrit.

Ce travail a été partiellement financé par le Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculté de pharmacie, Université britannique en Égypte (BUE), Le Caire, Égypte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin, bovine serum Fraction V MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX Sigma-Aldrich, USA A3157
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, USA A5533
Ammonium hydroxide Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC Stem Cell Technologies 60024FI
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3912
Calcium Chloride Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA PA5-85917
Chloroform Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder Gibco, Thermo Fisher, USA 17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure Fisher Scientific, Germany G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific, Germany BP231-100
Dithizone staining Sigma-Aldrich, USA D5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/L Lonza, Switzerland 12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/L Lonza, Switzerland 12-707F
DMEM/F12 medium Lonza, Switzerland BE12-719F
DNAse/RNAse free water Gibco Thermo Fisher, USA 10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade Sigma-Aldrich, Germany 24103
Exendin-4 Sigma-Aldrich, Germany E7144
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco Thermo Fisher, Brazil 10270-106
Formaldehyde 37% Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade Fisher Scientific, USA BP2618500
L-Glutamine Gibco Thermo Fisher, USA 25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit R&D systems Inc., MN, USA SC006
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Germany N0636
Oil Red Stain Sigma-Aldrich, USA O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Gibco Thermo Fisher, USA 15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg Lonza, Switzerland BE17-516F
Potassium Chloride Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit Cloud-Clone Corp., USA CEA682Ra
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima Thermo Scientific, USA K0221
Syringe filter, 0.2 micron Corning, USA 431224
TRIzol Thermo Scientific, USA 15596026
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA 15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X Lonza, Switzerland CC-5012
Verso cDNA synthesis kit Thermo Scientific, USA AB-1453/A
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Germany M3148

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References

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Biologie du développement numéro 186 Cellules souches cellules souches mésenchymateuses diabète cellules productrices d’insuline tissu adipeux différenciation
Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline
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Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr,… More

Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells. J. Vis. Exp. (186), e63348, doi:10.3791/63348 (2022).

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