Summary
تلعب الأنابيب الدقيقة ، وهي بوليمرات توبولين ، دورا مهما كمكون للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة ومعروفة بعدم استقرارها الديناميكي. طورت هذه الدراسة طريقة لتجزئة الأنابيب الدقيقة لفصلها إلى أنابيب دقيقة مستقرة ، وأنابيب دقيقة قابلة للتعديل ، وتوبولين حر لتقييم استقرار الأنابيب الدقيقة في أنسجة الفئران المختلفة.
Abstract
الأنابيب الدقيقة ، المكونة من دايمرات α / β-توبولين ، هي عنصر حاسم في الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. تظهر هذه البوليمرات الشبيهة بالأنبوب عدم استقرار ديناميكي حيث تخضع الوحدات الفرعية غير المتجانسة للتوبولين للبلمرة المتكررة وإزالة البلمرة. يعد التحكم الدقيق في استقرار وديناميكيات الأنابيب الدقيقة ، والذي يتحقق من خلال تعديلات توبولين بعد الترجمة والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ، أمرا ضروريا لمختلف الوظائف الخلوية. الاختلالات في الأنابيب الدقيقة متورطة بقوة في التسبب في المرض ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية. تركز الأبحاث الجارية على العوامل العلاجية التي تستهدف الأنابيب الدقيقة التي تعدل الاستقرار ، مما يوفر خيارات علاجية محتملة لهذه الأمراض والسرطانات. وبالتالي ، فإن فهم الحالة الديناميكية للأنابيب الدقيقة أمر بالغ الأهمية لتقييم تطور المرض والآثار العلاجية.
تقليديا ، تم تقييم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في المختبر أو في الخلايا المستزرعة من خلال التجزئة الخشنة أو المقايسة المناعية ، باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف تعديلات ما بعد الترجمة من توبولين. ومع ذلك ، فإن التحليل الدقيق لحالة التوبولين في الأنسجة باستخدام مثل هذه الإجراءات يشكل تحديات. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة تجزئة الأنابيب الدقيقة البسيطة والمبتكرة لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والتوبولين الحر في أنسجة الفئران.
تضمن الإجراء تجانس أنسجة الفئران المشرحة في مخزن مؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة بنسبة حجم 19: 1. ثم تم تجزئة التجانسات من خلال عملية طرد مركزي فائقة من خطوتين بعد الطرد المركزي البطيء الأولي (2400 × جم) لإزالة الحطام. أدت خطوة الطرد المركزي الفائق الأولى (100000 × جم) إلى ترسب الأنابيب الدقيقة المستقرة ، بينما تعرض العنصر الطافي الناتج لخطوة الطرد المركزي الفائقة الثانية (500000 × جم) لتجزئة الأنابيب الدقيقة القابلة للذوبان وثنائيات التوبولين القابلة للذوبان. حددت هذه الطريقة نسب التوبولين التي تشكل أنابيب دقيقة مستقرة أو قابلة للذوبان في دماغ الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت اختلافات الأنسجة المتميزة في استقرار الأنابيب الدقيقة التي ترتبط بالقدرة التكاثرية للخلايا المكونة. تسلط هذه النتائج الضوء على الإمكانات الكبيرة لهذه الطريقة الجديدة لتحليل استقرار الأنابيب الدقيقة في الظروف الفسيولوجية والمرضية.
Introduction
الأنابيب الدقيقة (MTs) هي هياكل أنبوبية ممدودة تتكون من خيوط أولية تتكون من وحدات فرعية غير متجانسة α / β-توبولين. تلعب أدوارا أساسية في العمليات الخلوية المختلفة مثل انقسام الخلايا والحركة والحفاظ على الشكل والنقل داخل الخلايا ، مما يجعلها مكونات متكاملة للهيكل الخلوي حقيقي النواة1. الطرف السالب من MTs ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية α-tubulin ، مستقر نسبيا ، في حين أن الطرف الزائد ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية β-tubulin ، يخضع لإزالة البلمرة الديناميكيةوالبلمرة 2. هذه الدورة المستمرة من إضافة توبولين ديمر وتفككه في الطرف الزائد ، يشار إليها باسم عدم الاستقرار الديناميكي ، تؤدي إلى عملية متكررة للإنقاذ والكارثة3. تعرض MTs مجالات محورية مع اختلافات محلية في عدم الاستقرار الديناميكي ، بما في ذلك المجالات المستقرة والمرنة4.
يعد التحكم الدقيق في عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs أمرا بالغ الأهمية للعديد من الوظائف الخلوية ، لا سيما في الخلايا العصبية التي تتميز بأشكال معقدة. تلعب القدرة على التكيف والمتانة في MTs دورا حيويا في تطوير الخلايا العصبية5،6،7 وحسن سيرها. تم العثور على عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs مرتبطا بالعديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) للتوبولين ، مثل الأستلة ، والفسفرة ، وبالميتويل ، وإزالة التيروزين ، ودلتا 2 ، وأكسدة البولي جلوتامين ، و polyglycylation. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل ارتباط البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) كآلية تنظيمية8. تحدث PTMs ، باستثناء الأستيل ، في الغالب في منطقة كربوكسي توبولين الطرفية الواقعة على السطح الخارجي ل MTs. تخلق هذه التعديلات ظروفا سطحية متنوعة على MTs ، مما يؤثر على تفاعلها مع MAPs ويحكم في النهاية استقرار MT9. يدل وجود بقايا التيروزين الكربوكسي الطرفي في α-tubulin على MTs الديناميكي ، والذي يتم استبداله بسرعة بتجمع توبولين مجاني. على العكس من ذلك ، فإن إزالة التيروزين من نهاية الكربوكسي وأستلة Lys40 تدل على MTs مستقرة مع انخفاض عدم الاستقرار الديناميكي 9,10.
تم استخدام PTMs من توبولين على نطاق واسع في التجارب لتقييم ديناميكيات واستقرار MTs5،7،11،12،13،14،15. على سبيل المثال ، في دراسات زراعة الخلايا ، يمكن فصل الأنابيب إلى مجموعتين: تجمع توبولين مجاني وتجمع MT. يتم تحقيق ذلك عن طريق إطلاق توبولين مجاني من خلال نفاذية الخلية قبل تثبيت MTsالمتبقية 15،16،17،18،19. تتضمن الطرق البيوكيميائية استخدام مثبتات MT الكيميائية التي تحمي MTs من الكارثة ، مما يتيح فصل MTs والتوبولين الحر من خلال الطرد المركزي20،21،22. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات لا تفرق بين MTs المستقرة والأقل استقرارا (المتقلبة) ، مما يجعل من المستحيل تحديد MTs أو التوبولين القابل للذوبان في أنسجة مثل الدماغ. وبالتالي ، فقد ثبت أن تقييم استقرار MT في الكائنات الحية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية يمثل تحديا. لمعالجة هذا القيد التجريبي ، قمنا بتطوير تقنية جديدة لفصل MTs والتوبولين الحر بدقة في أنسجة الفئران23.
تتضمن طريقة تجزئة MT الفريدة هذه تجانس الأنسجة في ظل ظروف تحافظ على حالة التوبولين في الأنسجة والطرد المركزي من خطوتين لفصل MTs المستقر و MTs المرن والتوبولين الحر. يمكن تطبيق هذا الإجراء البسيط على دراسات واسعة ، بما في ذلك البحوث الأساسية على MTs و MAPs في الكائنات الحية ، والتحليلات الفسيولوجية والمرضية للصحة والأمراض المرتبطة باستقرار MT ، وتطوير الأدوية والعلاجات الأخرى التي تستهدف MTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. طريقة تجزئة MT
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة دوشيشا. تم استخدام الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين ، 3-4 أشهر من العمر ، هنا. في هذا البروتوكول ، تم تجانس الأنسجة المقطعة ، على سبيل المثال ، الدماغ أو الكبد أو الغدة الصعترية ، على الفور في محلول تثبيت الأنابيب الدقيقة الباردة (MSB) ، والذي يحتوي على Taxol (مثبت MT) بتركيز لا يمنع فقط إزالة البلمرة ولكن أيضا إعادة بلمرة MT. تم فصل التجانس إلى ثلاثة أجزاء من خلال عملية الطرد المركزي الفائق المكونة من خطوتين (الشكل 1). تم الانتهاء من جميع الخطوات في هذا البروتوكول دون انقطاع في بيئة درجة حرارة باردة ، ولم يتم تجميد الأنسجة والكسور حتى تم إذابتها في محلول عينة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS).
- إعداد MSB والأنابيب الدقيقة
- لتحضير MSB ، امزج الكواشف التالية: 0.1 M 2- (N- مورفولينو) حمض إيثان سلفونيك (MES) ، درجة الحموضة 6.8 (تحييدها بواسطة KOH) ، 10٪ جلسرين ، 0.1 مللي متر DTT ، 1 مللي متر MgSO 4 ، 1 mM EGTA ، 0.5٪ Triton X-100 ، مثبطات الفوسفاتيز (1 mM NaF ، 1 mM β-glycerophosphate ، 1 mM Na3VO4 ، 0.5 μM حمض okadaic) ، 1x كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، ومثبطات الأنزيم البروتيني (0.1 ملليمتر PMSF ، 0.1 مللي متر DIFP ، 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين ، 1 ميكروغرام / مل مضاد للألم ، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين ، 10 ميكروغرام / مل ليوبتين ، 50 ميكروغرام / مل TLCK) (انظر جدول المواد) وتدل على MSB (-).
- قبل تشريح الأنسجة مباشرة ، أضف 10 ميكرومتر تاكسول و 2 مللي متر GTP (انظر جدول المواد) إلى MSB (-). يشار إلى هذا المخزن المؤقت باسم MSB (+). تحضير المخزن المؤقت في يوم الاستخدام والاحتفاظ به على الجليد.
- تحضير الأنابيب الدقيقة لأخذ العينات. أنبوب دقيق فارغ سعة 2.0 مل لتخزين متجانس ؛ أنبوب دقيق فارغ سعة 1.5 مل لتخزين العينات الطافية 1 (S1) ، وعينة الترسب 2 (P2) ، وتخزين العينات المترسبة 3 (P3) ؛ 1.5 مل microtube مع 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) لتخزين الأنسجة المشرحة ؛ 1.5 مل ميكروتيوب مع 200 ميكرولتر من 2x SDS-عينة عازلة (0.16 م تريس درجة الحموضة 6.8 ؛ 20٪ جليسرول ؛ 2٪ 2-ميركابتوإيثانول ؛ 4٪ SDS) لعينة S1 وتخزين العينات الطافية 3 (S3) ؛ وأنبوب الطرد المركزي الدقيق لدوارات الطرد المركزي TLA55 و TLA120.2 (انظر جدول المواد). قم بتسمية جميع الأنابيب ووضعها على الثلج.
- تجانس أنسجة الفأر
- تحضير طاولة مبردة لتشريح الأنسجة. أولا ، املأ صندوقا بالثلج المجروش وضع طبقين بتري على الجليد ، أحدهما مع الجانب الداخلي لأعلى والآخر مع الجانب الخارجي. ملء برنامج تلفزيوني بارد الجليد في طبق واحد لغسل عابرة وتخزين الأنسجة تشريح. وضع ورقة الترشيح المبللة مع برنامج تلفزيوني على طبق آخر انقلبت.
- للتضحية بالفأر ، قم بإجراء خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق باستخدام مخدر مختلط من بوتورفانول ، ميدازولام ، وميديتوميدين. بعد ذلك ، قم بتشريح الأنسجة على الفور ، على سبيل المثال ، الدماغ أو الكبد أو الغدة الصعترية ، واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني بارد في طبق بتري.
ملاحظة: يمكن تحليل أي نوع من الأنسجة الرخوة بهذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن حجم الأنسجة محدود بنطاق الحجم الموصى به للخالط المستخدم. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام حجم 2 مل من الخالط ، يوصى باستخدام 50-100 ملغ من الأنسجة. - بعد وزن الأنابيب الدقيقة سعة 1.5 مل المملوءة ب PBS لتخزين الأنسجة المشرحة ، قم بقص الأنسجة وتخزينها داخل الأنابيب الدقيقة ، وأعد وزن كل أنبوب دقيق. يمكن حساب الوزن الرطب لكل نسيج عن طريق طرح وزن الأنبوب قبل وبعد إضافة الأنسجة.
- قم بتجانس الأنسجة على الفور في MSB البارد المثلج (+) باستخدام خالط مبرد (انظر جدول المواد). كان حجم MSB (+) 19 مرة (ميكرولتر) الوزن الرطب للأنسجة (ملغ). أداء التجانس مع 20 السكتات الدماغية حتى تختفي قطع الأنسجة.
ملاحظة: على سبيل المثال، يتم استخدام 1900 ميكرولتر من MSB (+) ل 100 ملغ من الأنسجة. نظرا لأنه يجب تعديل حجم MSB (+) المراد إضافته لكل وزن رطب لقطع الأنسجة التي تم تحليلها ، فمن الضروري وزن كل قطعة مناديل بدقة.
- الطرد المركزي لمتجانسات أنسجة الفأر
- انقل التجانس بالكامل إلى أنبوب دقيق سعة 2 مل مع ماصة باستور وأجهزة طرد مركزي عند 2400 × جم لمدة 3 دقائق عند 2 درجة مئوية لإزالة الحطام عن طريق هطول الأمطار.
- انقل المادة الطافية بأكملها (جزء S1) إلى أنبوب دقيق ودوامة جديدة سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، قم بقسمة 200 ميكرولتر من جزء S1 في أنبوب دقيق للطرد المركزي وأجهزة طرد مركزي عند 100000 × جم باستخدام دوار TLA-55 لمدة 20 دقيقة عند 2 درجة مئوية للحصول على بروتينات الوزن الجزيئي الكبيرة نسبيا كراسب (جزء P2).
ملاحظة: يؤثر حجم العينة الخاضعة لخطوات الطرد المركزي الفائق على نصف قطر الطرد المركزي وكفاءة ترسيب الجزيئات. حافظ على حجم العينة عند 200 ميكرولتر أو أقل بعد هذه الخطوة لمنع التجزئة غير الدقيقة. - مزيد من أجهزة الطرد المركزي جميع المواد الطافية الناتجة (جزء S2) عند 500000 جم × باستخدام دوار TLA-120.2 لمدة 60 دقيقة عند 2 درجة مئوية لفصل معقدات البروتين غير القابلة للذوبان في الراسب (جزء P3) عن البروتينات القابلة للذوبان في المادة الطافية (جزء S3).
- أضف 400 ميكرولتر من 1x SDS-sample buffer (0.08 M Tris pH 6.8 ؛ 10٪ جلسرين ؛ 1٪ 2-ميركابتوإيثانول ؛ 2٪ SDS) إلى أنابيب الكسر P2 و P3 وصوتيها لفترة وجيزة لإذابة الراسب. انقل عينات الكسر هذه إلى أنبوب دقيق فارغ سعة 1.5 مل.
- قم بإذابة إجمالي جزء S3 في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS 2x.
- امزج كسور S1 المتبقية بحجم متساو من المخزن المؤقت لعينة 2x SDS لاستخدامها كمنحنى قياسي للنشاف الغربي.
- تغلي كل هذه العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
- القياس الكمي للبروتينات في كل جزء
- تحديد كمية البروتينات في الكسور P2 و P3 و S3 عن طريق النشاف الغربي. أولا ، استخدم 10٪ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) لفصل البروتينات عن الكسور P2 و P3 و S3 المخففة بشكل صحيح ، وعينة S1 المخففة بشكل متسلسل من أي فرد كمنحنى قياسي. بعد ذلك ، قم بمسح العينات كهربائيا على أغشية فلوريد البولي فينيليدين (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تعتمد نسبة التخفيف لكل جزء على تركيز البروتين الموضوعي وتفاعل الجسم المضاد. (على سبيل المثال ، α-tubulin ، TUBB3 ، β-tub ، والتوبولين التيروزين في أنسجة المخ: S3 = 1/400 ، P3 = 1/2,000 ، P2 = 1/2 ، 000 ، S1 = 1 / 50,000 ، 1/20,000 ، 1 / 10,000 ، 1 / 5,000 ، 1 / 2,000 ؛ توبولين الأسيتيل في أنسجة المخ: S3 = 1/200 ، P3 = 1/400 ، P2 = 1/8000 ، S1 = 1/100000 ، 1/40000 ، 1/20000 ، 1/10000 ، 1/4000 ؛ α-توبولين في الكبد: S3 = 1/20 ، P3 = 1/100 ، P2 = 1/20 ، S1 = 1 / 50000 ، 1 / 20000 ، 1 / 10000 ، 1 / 5000 ، 1 / 2000 ؛ α-توبولين في الغدة الصعترية: S3 = 1/100 ، P3 = 1/400 ، P2 = 1/20 ، S1 = 1 / 50,000 ، 1/20,000 ، 1/10,000 ، 1/5,000 ، 1/2,000 تخفيف تركيز الأنسجة). - سد الغشاء ب 5٪ حليب منزوع الدسم في محلول ملحي مخزن تريس (50 مللي متر Tris-HCl pH 7.6 ؛ 152 مللي متر كلوريد الصوديوم) مع 0.1٪ توين 20 (TBS-T) لأكثر من 30 دقيقة.
- اغمر الغشاء في TBS-T الذي يحتوي على جسم مضاد أولي (انظر جدول المواد) لأكثر من 2 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام TBS-T لمدة 3 دقائق (3 مرات).
- قم بتسمية الجسم المضاد الأولي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة HRP (انظر جدول المواد) في TBS-T لأكثر من 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام TBS-T لمدة 3 دقائق (3 مرات).
- تطوير الأغشية باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن. بعد ذلك ، قم بتحليل نطاقات الاهتمام باستخدام محلل الصور المضيئة (انظر جدول المواد).
- قم بتحديد شدة نطاق البروتين باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) وإنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم وحدات التخفيف لعينات S1 المخففة المستخدمة للمنحنى القياسي على طول المحور X وشدة النطاق على طول المحور Y.
- اقرأ تركيز البروتين (الوحدة) المقابلة لعينات الكسر المخفف. اضرب التركيز المقروء بعامل تخفيف العينة للحصول على وحدة بروتين في كل كسر. قسم الوحدة المقاسة لكل كسر على وحدة البروتين الكلية (P2 + P3 + S3) للحصول على نسبة مئوية.
- تحديد كمية البروتينات في الكسور P2 و P3 و S3 عن طريق النشاف الغربي. أولا ، استخدم 10٪ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) لفصل البروتينات عن الكسور P2 و P3 و S3 المخففة بشكل صحيح ، وعينة S1 المخففة بشكل متسلسل من أي فرد كمنحنى قياسي. بعد ذلك ، قم بمسح العينات كهربائيا على أغشية فلوريد البولي فينيليدين (انظر جدول المواد).
2. تقييم خصائص توبولين في كل كسر
ملاحظة: توفر هذه الطريقة البيوكيميائية ثلاث مجموعات من معقدات التوبولين المحددة بخصائص الترسيب. هنا ، تم تحديد حالة مجمعات التوبولين التي تم الحصول عليها في هذه الكسور بناء على حجم المجمع و tubulin-PTMs. أكمل جميع الخطوات في هذا البروتوكول دون انقطاع في بيئة ذات درجة حرارة باردة ولكن لا تجمد عينات الكسر حتى يتم إذابتها في المخزن المؤقت لعينة SDS.
- فحص مصيدة المرشح
- قم بتصفية كسور S2 و S3 (500 ميكرولتر لكل منهما) باستخدام عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون (انظر جدول المواد). إجراء 14000 × غرام من الطرد المركزي عند 2 درجة مئوية حتى يتم ترشيح المادة الطافية بأكملها ، ويتم جمع البروتينات المستخلصة في أنابيب الاستقبال ، وتبقى البروتينات المحاصرة على مرشح أنابيب الخزان.
- ترجمة الترشيحات بأكملها (حوالي 500 ميكرولتر) في أنابيب الاستقبال إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 مل وإذابتها في 500 ميكرولتر من 2x SDS-sample buffer.
- إذابة المخلفات على مرشح أنابيب الخزان في 1000 ميكرولتر من 1x SDS-عينة عازلة عن طريق سحب العينات ونقلها إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 مل.
- تغلي العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
- تحليل كميات توبولين عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (الجسم المضاد للتوبولين α ، انظر جدول المواد).
- كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
- تحضير المخزن المؤقت الناقل (0.1 M MES ، الرقم الهيدروجيني 6.8 ؛ 10٪ الجلسرين ؛ 1 mM MgSO4 ؛ 1 mM EGTA ؛ 0.1 mM DTT) المكمل بتركيز 1/10 من مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. ثم قم بتصفية المحلول وتخزينه في بيئة باردة.
- قم بإعداد عمود كروماتوغرافيا ترشيح هلامي مجهز بنظام كروماتوغرافيا سائل تحضيري في غرفة كروماتوغرافيا (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
- قبل حقن العينات على العمود ، قم بتدفق 180 مل من المخزن المؤقت الناقل لغسل العمود. معدل التدفق هو 1 مل / دقيقة لمدة 3 ساعات.
- حقن توبولين الخنازير المنقى المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) كعنصر تحكم أو جزء S3 من أدمغة الفئران (500 ميكرولتر لكل منهما) على العمود.
- Elute بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت للحامل. اجمع كسور 1.5 مل لمدة 120 دقيقة. مراقبة البروتينات المستخلصة عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر. حافظ على أقصى ضغط أقل من 0.3 ميجا باسكال.
- بعد دوامة الكسور التي تم جمعها ، امزج 50 ميكرولتر منها مع 50 ميكرولتر من 2x SDS-sample buffer في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل. تغلي جميع العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
- قم بتحليل كميات التوبولين عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A ، والجسم المضاد ل α-tubulin و KMX-1 ، والجسم المضاد ل β-tubulin (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
القياس الكمي للتوبولين في الكسور P2 و P3 و S3 من دماغ الفأر بطريقة تجزئة MT
تم فصل التوبولين في أنسجة الفئران إلى كسور P2 و P3 و S3 بواسطة طريقة تجزئة MT وتم قياسها كميا بواسطة النشاف الغربي (الشكل 1 أ). تمثل رواسب MTs التي بقيت في جزء P2 عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100000 × جم لمدة 20 دقيقة 34.86٪ ± 1.68٪ من إجمالي التوبولين في دماغ الفأر. تم طرد المادة الطافية (S2) بشكل أكبر عند 500000 × جم لمدة 60 دقيقة. تم الحصول على راسب (جزء P3) وطاف (جزء S3) ، والذي يمثل 56.13٪ ± 2.12٪ أو 9.01٪ ± 0.68٪ من إجمالي التوبولين في أدمغة الفئران ، على التوالي (الشكل 1 ب).
تحتوي القشرة الدماغية المستخدمة في هذه الدراسة على خلايا عصبية وغير عصبية ، مثل الخلايا الدبقية. لتقييم استقرار MT بشكل انتقائي في الخلايا العصبية لأدمغة الفئران ، قمنا بقياس TUBB3 ، وهو نوع فرعي من التوبولين يتم التعبير عنه حصريا في الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي ، عن طريق النشاف الغربي باستخدام Tuj1 (الجسم المضاد ل TUBB3). كانت النسبة المئوية ل TUBB3 في الكسر P2 أو P3 أو S3 32.65٪ ± 2.20٪ أو 59.31٪ ± 2.61٪ أو 8.04٪ ± 0.74٪ على التوالي. لم تكن مختلفة بشكل كبير عن تلك الموجودة في α-tubulin (الشكل 1B). اقترحت هذه النتائج أن الخلايا العصبية والخلايا الدبقية تظهر استقرارا مشابها في MT أو أن الخلايا العصبية تحتوي على كميات أعلى بكثير من التوبولين مقارنة بالخلايا الدبقية في الجسم الحي.
خصائص التوبولين المستعاد في كل كسر
هنا ، تم فصل تجانس أنسجة الفأر إلى ثلاثة أجزاء عن طريق الطرد المركزي الفائق المكون من خطوتين مع تسارع جاذبية مختلف. لذلك ، اختلفت معاملات الترسيب بين البروتينات أو مجمعاتها في كل جزء. على الرغم من أن توبولين المترسب عند 100000 × غرام من الطرد المركزي الفائق كان يعتبر MT تقليديا ، إلا أنه يجب توضيح كيفية اختلاف التوبولين الذي تم الحصول عليه حديثا من جزء P3 هنا عن التوبولين في الكسور P2 و S3.
لتوصيف توبولين S3 ، تعرض جزء S2 (P3 + S3) أو S3 للترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن أن تمر مجمعات التوبولين في جزء S3 عبر عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون تماما ، بينما تم احتجاز جميع التوبولين تقريبا في جزء S2 على المرشح (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، تم قياس الوزن الجزيئي لمعقدات التوبولين في جزء S3 بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. تم استخلاص توبولين S3 عند قمة واحدة تقابل 100 كيلو دالتون ، وهو مشابه لتلك الخاصة بثنائيات التوبولين المنقاة المتاحة تجاريا (الشكل 2B ، C). بالإضافة إلى ذلك ، كانت نسب α و β توبولين المستردة في كل كسر بواسطة طريقة تجزئة MT متساوية (الشكل 2D). في الواقع، لقد ثبت أن α و β-توبولين يمكن أن توجد قليلا في صورة مونومرات في الخلايا الحية24. ومع ذلك ، انطلاقا من القيمة المقدرة ل kD (ترتيب نانومتر) المبلغ عنها ، وتركيز التوبولين المستعاد في جزء S3 (~ 11 μM) ، يعتقد أن معظم (> 98٪) من التوبولين موجود على شكل α / β ثنائيات. لذلك ، فإن التوبولين في جزء S3 هو في الأساس ثنائي قابل للذوبان α / β-tubulin.
تم فصل بوليمرات التوبولين إلى جزأين ، P2 و P3 ، بناء على تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs). للتمييز بين هذه الكسور ، تم إجراء النشاف الغربي باستخدام أجسام مضادة محددة. أظهر الجسم المضاد α-tubulin المضاد للأسيتيل ، والذي يعمل كعلامة ل MTs المستقر ، أن جزء P2 قد تم إثراؤه بشكل كبير بنسبة 97.40٪ ± 0.52٪ من α-tubulin الأسيتيل (الشكل 2E) ، بينما تم استرداد إجمالي α-tubulin في كسور P3 و S3 (الشكل 1B). على العكس من ذلك ، كشف الجسم المضاد للتيروزين α-tubulin ، الذي يدل على MTs القابل للطي ، أن 75.43٪ ± 2.69٪ من التيروزين α-tubulin كان موجودا في جزء P3 (الشكل 2F). تؤكد هذه النتائج أن جزء P2 يحتوي بشكل أساسي على توبولين داخل MTs مستقر ، في حين أن جزء P3 يتكون من توبولين داخل MTs المستقرة.
تقييم استقرار MT تحت التجميد وعلاج النوكودازول
تم تحليل تأثير التجميد والعلاج بالنوكودازول على استقرار MTs داخل المخ للفأر لتحديد ما إذا كان يمكن تمييز التغييرات العابرة في استقرار MTs بواسطة طريقة تجزئة MT. يتم تفكيك MTs بشكل عام في درجات حرارة منخفضة ، لكن بعض MTs تظل مستقرة في البرد. بعد وزن الأدمغة ، تم تجميدها في النيتروجين السائل ووضعها في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم تجانس الدماغ المجمد العابر والدماغ الخام كعنصر تحكم وتجزئته إلى كسور P2 و P3 و S3. بعد ذلك ، تم تحديد نسبة التوبولين الموجودة في الكسور الثلاثة عن طريق النشاف الغربي. بمجرد تجميد الدماغ قبل التجانس ، انخفض α-tubulin في جزء P2 ، وزاد ذلك في جزء P3 مقارنة بالجزء الموجود في الدماغ الخام (الشكل 3A). كشفت البقع التي تحتوي على 6-11B1 (أسيتيل α-توبولين) أو 1A2 (التيروزين α-توبولين) أيضا أن تجميد الدماغ قلل من مستوى الأستيل (الشكل 3B) وزاد من مستوى التيروزين (الشكل 3C) من α-توبولين في جزء P2.
Nocodazole هو عامل استهداف الأنابيب الدقيقة (MTA) الذي يمنع بلمرة MT عن طريق الارتباط ب β-tubulin ويعزز إزالة بلمرة MT. تم تجانس أدمغة الفئران في MSB (+) الخالي من Taxol مع أو بدون 10 ميكرومتر نوكودازول ووضعها عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تمت إضافة التجانس غير المعالج أو المعالج بالنوكودازول إلى 10 ميكرومتر تاكسول ، وإعادة تجانسه ، وتجزئته إلى كسور P2 و P3 و S3. بعد ذلك ، تم تحديد نسبة التوبولين الموجودة في الكسور الثلاثة عن طريق النشاف الغربي. أظهرت البقع التي تحتوي على DM1A (α-tubulin) أن α-tubulin في جزء P2 انخفض وأنه في جزء P3 يميل إلى الزيادة مع علاج nocodazole (الشكل 3D). تشير هذه النتائج إلى أن توبولين P2 قد زعزع استقراره استجابة لدرجة الحرارة المنخفضة أو النوكودازول وأن جزء P2 يحتوي على MTs قوي قاوم الظروف التجريبية. على عكس التجميد ، لم يؤثر نوكودازول على توبولين PTMs (الشكل 3E ، F). بناء على النتائج والبيانات المذكورة أعلاه ، يمكن تقييم إزالة بلمرة MTs التي لا يمكن اكتشافها بواسطة تحليل PTM بهذه الطريقة.
مقارنة بين نسبة MTs المستقر ، MTs المرن ، والتوبولين الحر في الأنسجة
يختلف استقرار MTs بين الأنسجة المختلفة ، اعتمادا على القدرة التكاثرية للخلايا داخل تلك الأنسجة. والجدير بالذكر أن MTs المستقرة أكثر وفرة في الجهاز العصبي ، والذي يتكون بشكل أساسي من الخلايا العصبية غير التكاثرية ، مقارنة بالأنسجةالأخرى 4. لتقييم قدرة طريقة تجزئة MT المطورة على تمييز الاختلافات في استقرار MT عبر الأنسجة المختلفة ، تم تجزئة الكبد والغدة الصعترية للفئران ، وتم تحديد كمية التوبولين المستعاد في كل جزء. كشفت النتائج أنه بالمقارنة مع الأنسجة الأخرى ، أظهر الدماغ مستوى أعلى بكثير من الأنابيب P2 ، في حين تم إثراء توبولين P3 بشكل ملحوظ في الأنسجة التي تحتوي على خلايا تكاثرية (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، أكد النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة 6-11B1 و 1A2 وجود استقرار MT أعلى في الجهاز العصبي. تشير أنماط التوزيع المميزة ل PTMs tubulin بوضوح إلى أن توبولين P2 الموجود على وجه التحديد في الجهاز العصبي نشأ من MTs مستقر (الشكل 4). تدعم هذه النتائج أيضا فكرة أن كسور P2 و P3 تتوافق مع MTs المستقرة والمرنة ، على التوالي.
الشكل 1: القياس الكمي للتوبولين في أنسجة الفئران باستخدام طريقة تجزئة MT. (أ) ملخص طريقة تجزئة MT للأنسجة. يمكن فصل MTs المستقر (جزء P2) ، و MTs المرن (جزء P3) ، والتوبولين الحر (جزء S3) في الأنسجة عن طريق الطرد المركزي الفائق بخطوتين في ظل ظروف تمنع بلمرة MT وإزالة البلمرة أثناء التحضير. (ب) تم ترسيب MTs في قشرة الفأر بواسطة الطرد المركزي الفائق التقليدي 100000 × جم متبوعا بالطرد المركزي الفائق 500000 × جم . بعد ذلك ، تم تحديد كمية الأنابيب المنفصلة إلى كسور P2 و P3 و S3 عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (α-tubulin) ومضاد Tuj1 (TUBB3). تم حساب نسبة البروتينات في كل كسر (P2 أو P3 أو S3) إلى الكسر الكلي (P2 + P3 + S3) كما هو موضح في قسم البروتوكول (يعني ± SDs ، n = 4). تم تعديل هذا الرقم من Hagita et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تتيح طريقة تجزئة MT فصل MTs المستقر و MTs المرن والتوبولين الحر في القشرة الدماغية للفأر. (أ) تم تحليل الكسور S2 أو S3 (المدخلات) بواسطة مقايسة مصيدة المرشح باستخدام عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون. تم قياس كمية الأنابيب التي تم الحصول عليها عن طريق الترشيح (المستقبل) والاصطياد (الخزان) عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (α-tubulin). (ب) خضعت أنابيب الخنازير المنقاة لطريقة تجزئة MT ووجد أنها جمعت في الغالب في جزء S3. ج: الحجم الجزيئي للتوبولين في الجزء S3. تم فصل جزء S3 بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم باستخدام عمود كروماتوغرافيا ترشيح هلام. تم قياس البروتينات في كل جزء عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (α-tubulin) و KMX-1 (β-tubulin). يظهر الوزن الجزيئي النظري في الجزء العلوي من اللوحات. (د) كانت نسب α-توبولين و β-توبولين في كل كسر متساوية. تم تحديد كمية الأنابيب المنفصلة إلى كسور P2 و P3 و S3 عن طريق النشاف الغربي باستخدام KMX-1 (β-tubulin). التحديد الكمي لنسبة α-توبولين و β-توبولين في كل كسر بالنسبة إلى مجموع الكسر الكلي (يعني ± SDs ، n = 4). تم إجراء التحليلات الإحصائية بواسطة اختبار t للطالب. (ه، و) تم التحقق من تعديلات α-توبولين في الكسور P2 و P3 و S3 عن طريق النشاف الغربي باستخدام 6-11B1 (أسيتيل α-توبولين: E) و 1A2 (التيروزين α-توبولين: F). التحديد الكمي لنسبة التيروزين أو الأسيتيل α-توبولين في كل كسر بالنسبة إلى الكسر الكلي (يعني ± SDs ، n = 4). (A-C) من Hagita et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم إزالة بلمرة MT الناجم عن التجميد أو MTA. (A-C) تم تقييم استقرار MT بعد 30 دقيقة من التجميد عند -80 درجة مئوية. تم تحديد نسب التوبولين الموجودة في الأجزاء الثلاثة من الدماغ الخام والمجمد عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (α-tubulin: A) و 1A2 (التيروزين α-tubulin: B) و 6-11B1 (الأسيتيل α-توبولين: C). (D-F) تم تقييم تأثير النوكودازول على استقرار MT. تم تحديد نسب التوبولين الموجودة في الأجزاء الثلاثة من أدمغة نوكودازول غير المعالجة أو المعالجة عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (α-tubulin: D) و 1A2 (التيروزين α-tubulin: E) و 6-11B1 (الأسيتيل α-توبولين: F). تم تطبيع المستويات النسبية التمثيلية للتيروزين (B ، E) أو الأستيل (C ، F) إلى كمية إجمالي α-توبولين (A ، D ) (تعني ± SDs، ن = 4). تم إجراء التحليلات الإحصائية بواسطة اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نسب MTs المستقر ، و MTs المرن ، والتوبولين الحر في الدماغ والكبد والغدة الصعترية في الفأر. تم تشريح أدمغة الفئران وكبدها وزعترها وإخضاعها لطريقة تجزئة MT. تم قياس البروتينات المنفصلة في كل جزء عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (α-tubulin) و 6-11B1 (أسيتيل α-tubulin) و 1A2 (التيروزين α-tubulin). تم حساب نسبة البروتينات في كل كسر (P2 أو P3 أو S3) إلى الكسر الكلي (P2 + P3 + S3) كما هو موضح في قسم البروتوكول (يعني ± SDs ، n = 4). تم إجراء التحليلات الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المهمة الأكثر أهمية عند التحقيق في حالة توبولين في الأنسجة من الكائنات الحية هي منع بلمرة MT العرضية أو إزالة البلمرة أثناء التحضير. يتأثر استقرار MTs في العينات بعوامل مثل تركيز Taxol في MSB ، ونسبة كمية الأنسجة إلى المخزن المؤقت ، ودرجة الحرارة أثناء العملية من إزالة الأنسجة إلى التجانس والطرد المركزي. لذلك ، تم تحسين الظروف في كل خطوة من خطوات البروتوكول لتحليل أنسجة الفئران بحجم 20 ضعفا من التجانس. يمكن أن يؤدي التركيز العالي من Taxol إلى بلمرة MT في المختبر ، حتى في ظل الظروف الباردة25. عند تحليل الأنسجة ذات تركيزات التوبولين المختلفة بشكل كبير أو إجراء تعديلات جوهرية على البروتوكول ، يجب على كل مشغل تحسين الخطوات وفقا للأهداف المحددة لتجاربهم.
في الدراسة التي أجريت ، تم الحصول على مجموعة جديدة من MTs ، يشار إليها باسم P3 ، من "الجزء القابل للذوبان" التقليدي باستخدام الطرد المركزي الفائق عند 500000 × g20. تشير الحسابات النظرية المستندة إلى عوامل مثل العامل K للدوار وقوة الطرد المركزي ومدة الطرد المركزي إلى أن الأنابيب الموجودة في جزء S3 تمثل على الأرجح ثنائيات توبولين 6S. على العكس من ذلك ، قد يتوافق التوبولين في جزء P3 مع MTs التي تكون أقصر في الطول مقارنة بتلك الموجودة في جزء P2. تتوافق هذه الملاحظة مع النتيجة التي تظهر أن تجميد الأنسجة قبل التجانس ، مما يؤدي إلى الانهيار الجزئي ل MTs26 ، أدى إلى زيادة كبيرة في التوبولين داخل جزء P3 وانخفاض متزامن في جزء P2 (الشكل 3A). علاوة على ذلك ، يشير تحليل PTMs tubulin وخصائص الربط لمختلف MAPs إلى أن جزء P2 أو P3 يحتوي على MTs مستقرة أو قابلة للسحب ، على التوالي. على سبيل المثال ، كانت بعض MAPs الخاصة ب MTs المستقرة ، الموجودة بشكل أساسي في الخلايا العصبية ، موجودة حصريا في الجزء P223. وبالتالي ، فمن المعقول الإشارة إلى أن جزء P3 يشتمل على MTs أكثر ديناميكية ومرونة مقارنة بتلك الموجودة في جزء P2.
وفقا للنظرية الكامنة وراء الطريقة ، يمكن أن تؤدي الظروف التجريبية غير المناسبة التي ينطوي عليها تثبيت MT أو الطرد المركزي إلى ضعف التجزئة. على سبيل المثال ، يؤدي التركيز المنخفض للتاكسول إلى انخفاض طفيف في توبولين P2 ، بينما يزيد Taxol الزائد من توبولين P2 بسبب تكوين MT أثناء التحضير23. وبالمثل ، يمكن أن يؤدي تسخين الأنسجة والعينات بشكل غير لائق إلى فرط بلمرة MTs وتحلل تاو أو تفتيته23. علاوة على ذلك ، تعتبر ظروف الطرد المركزي حاسمة لفصل الكسور P3 و S3 ، كما أن الانخفاض الطفيف في تسارع الجاذبية يقلل بشكل كبير من استعادة جزء P3. لذلك ، يوصى باتباع خطوات البروتوكول بدقة في حالة ملاحظة أي تجزؤات غير طبيعية.
يمكن تطبيق طريقة التجزئة البسيطة هذه على نطاق واسع لتحليل نسب التوبولين بين MTs المستقرة ، و MTs المرنة ، و dimers الحرة في الأنسجة. توفر هذه الطريقة العديد من المزايا ، حيث يمكنها اكتشاف التغييرات الطفيفة في حالة التوبولين التي قد لا تكون واضحة من خلال القياس الكمي ل tubulin PTMs. يعد تحليل استقرار MT مهما لفهم الأهمية الفسيولوجية ل MTs ، خاصة في الخلايا العصبية الكبيرة والمعقدة ، وللتحقيق في الاضطرابات المرتبطة بعدم تنظيم MT. ترتبط الطفرات أو الاختلالات في جينات توبولين أو MAP ، على سبيل المثال ، باضطرابات النمو العصبي والأمراض التنكسية العصبية27,28. في مرض الزهايمر ، من المعروف أن MTs ينخفض ، ربما بسبب الفقدان الوظيفي لبروتين تاو في الخلايا العصبية المصابة15،29،30،31،32،33. تم اقتراح MTAs التي تعدل استقرار MT وتمنع انقسام الخلايا كعلاجات محتملة للاضطرابات العصبية13,34. يمكن أن يساهم استخدام طريقة تجزئة MT الفريدة هذه لتحليل استقرار وسلوك MTs و MAPs في نموذج المرض بشكل كبير في توضيح التسبب في الخرف المرتبط ب tau وتحديد أهداف علاجية جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JST لإنشاء زمالات جامعية نحو إنشاء ابتكار تكنولوجيا العلوم (A.HT. JPMJFS2145) ، JST SPRING (A.HT. ؛ JPMJSP2129) ، منحة مساعدة لزملاء JSPS (A.HT ؛ 23KJ2078) ، منحة مساعدة للبحث العلمي (B) JSPS KAKENHI (22H02946 ل TM) ، منحة مساعدة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة بعنوان "شيخوخة بروتين الدماغ والتحكم في الخرف" من MEXT (TM ؛ 26117004) ، وزمالة Uehara Research من مؤسسة Uehara Memorial Foundation (TM ؛ 202020027). يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C.
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al.
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D.
