Summary
Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.
Abstract
Les microtubules, composés de dimères de α/β-tubuline, sont un composant crucial du cytosquelette des cellules eucaryotes. Ces polymères tubulaires présentent une instabilité dynamique lorsque les sous-unités hétérodimères de tubuline subissent une polymérisation et une dépolymérisation répétitives. Un contrôle précis de la stabilité et de la dynamique des microtubules, obtenu grâce à des modifications post-traductionnelles de la tubuline et à des protéines associées aux microtubules, est essentiel pour diverses fonctions cellulaires. Les dysfonctionnements des microtubules sont fortement impliqués dans la pathogenèse, y compris les troubles neurodégénératifs. Les recherches en cours se concentrent sur les agents thérapeutiques ciblant les microtubules qui modulent la stabilité, offrant des options de traitement potentielles pour ces maladies et cancers. Par conséquent, la compréhension de l’état dynamique des microtubules est cruciale pour évaluer la progression de la maladie et les effets thérapeutiques.
Traditionnellement, la dynamique des microtubules a été évaluée in vitro ou dans des cellules en culture par fractionnement approximatif ou immunoessai, à l’aide d’anticorps ciblant les modifications post-traductionnelles de la tubuline. Cependant, l’analyse précise du statut de la tubuline dans les tissus à l’aide de telles procédures pose des défis. Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple et innovante de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris.
La procédure a consisté à homogénéiser des tissus de souris disséqués dans un tampon stabilisateur de microtubules à un rapport de volume de 19 :1. Les homogénats ont ensuite été fractionnés par un processus d’ultracentrifugation en deux étapes après une centrifugation lente initiale (2 400 × g) pour éliminer les débris. La première étape d’ultracentrifugation (100 000 × g) a précipité les microtubules stables, tandis que le surnageant résultant a été soumis à une deuxième étape d’ultracentrifugation (500 000 × g) pour fractionner les microtubules labiles et les dimères de tubuline solubles. Cette méthode a permis de déterminer les proportions de tubuline constituant des microtubules stables ou labiles dans le cerveau de la souris. De plus, des variations tissulaires distinctes dans la stabilité des microtubules ont été observées qui étaient corrélées avec la capacité proliférative des cellules constitutives. Ces résultats mettent en évidence le potentiel important de cette nouvelle méthode pour l’analyse de la stabilité des microtubules dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Introduction
Les microtubules (MT) sont des structures tubulaires allongées comprenant des protofilaments constitués de sous-unités hétérodimères α/β-tubuline. Ils jouent un rôle essentiel dans divers processus cellulaires tels que la division cellulaire, la motilité, le maintien de la forme et le transport intracellulaire, ce qui en fait des composants intégraux du cytosquelette eucaryote1. L’extrémité négative des MT, où la sous-unité α-tubuline est exposée, est relativement stable, tandis que l’extrémité positive, où la sous-unité β-tubuline est exposée, subit une dépolymérisation dynamique et une polymérisation2. Ce cycle continu d’ajout et de dissociation des dimères de tubuline à l’extrémité positive, appelé instabilité dynamique, entraîne un processus répétitif de sauvetage et de catastrophe3. Les MT présentent des domaines focaux avec des variations localisées de l’instabilité dynamique, y compris des domaines stables et labiles4.
Un contrôle précis de l’instabilité dynamique des MT est crucial pour de nombreuses fonctions cellulaires, en particulier dans les neurones caractérisés par des morphologies complexes. L’adaptabilité et la durabilité des MT jouent un rôle essentiel dans le développement et le bon fonctionnement des cellules nerveuses 5,6,7. L’instabilité dynamique des MT s’est avérée être associée à diverses modifications post-traductionnelles (PTM) de la tubuline, telles que l’acétylation, la phosphorylation, la palmitoylation, la détyrosination, le delta 2, l’oxydation de la polyglutamine et la polyglycylation. De plus, la liaison des protéines associées aux microtubules (MAP) sert de mécanisme de régulation8. Les PTM, à l’exclusion de l’acétylation, se produisent principalement dans la région carboxy-terminale de la tubuline située sur la surface externe des MT. Ces modifications créent des conditions de surface diverses sur les MT, influençant leur interaction avec les MAP et, en fin de compte, régissant la stabilité des MT9. La présence d’un résidu de tyrosine carboxy-terminale dans la α-tubuline est révélatrice de MT dynamiques, qui sont rapidement remplacées par le pool de tubuline libre. À l’inverse, la détyrosination de l’extrémité carboxy et l’acétylation de Lys40 signifient des MT stables avec une instabilité dynamique réduite 9,10.
Les PTM de la tubuline ont été largement utilisés dans des expériences visant à évaluer la dynamique et la stabilité des MT 5,7,11,12,13,14,15. Par exemple, dans les études de culture cellulaire, les tubulines peuvent être séparées en deux pools : le pool de tubulines libres et le pool MT. Ceci est réalisé en libérant de la tubuline libre par perméabilisation cellulaire avant de fixer les MT restantes 15,16,17,18,19. Les méthodes biochimiques impliquent l’utilisation de stabilisateurs chimiques de MT qui protègent les MT d’une catastrophe, permettant la séparation des MT et de la tubuline libre par centrifugation20,21,22. Cependant, ces procédures ne font pas la différence entre les MT stables et moins stables (labiles), ce qui rend impossible la quantification des MT ou de la tubuline soluble dans des tissus comme le cerveau. Par conséquent, l’évaluation de la stabilité de la TA chez les organismes dans des conditions physiologiques et pathologiques s’est avérée difficile. Pour remédier à cette limite expérimentale, nous avons mis au point une nouvelle technique permettant de séparer avec précision les MT et la tubuline libre dans les tissus de souris23.
Cette méthode unique de fractionnement de la magnétoscopie implique l’homogénéisation des tissus dans des conditions qui maintiennent le statut de la tubuline dans les tissus et la centrifugation en deux étapes pour séparer les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre. Cette procédure simple peut être appliquée à de vastes études, y compris la recherche fondamentale sur les MT et les MAP dans les organismes vivants, les analyses physiologiques et pathologiques de la santé et des maladies associées à la stabilité des MT, et le développement de médicaments et d’autres thérapies qui ciblent les MT.
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Protocol
1. Méthode de fractionnement MT
REMARQUE : Toutes les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Doshisha. Des souris C57BL/6J des deux sexes, âgées de 3 à 4 mois, ont été utilisées ici. Dans ce protocole, les tissus disséqués, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, ont été immédiatement homogénéisés dans un tampon stabilisateur de microtubules (MSB) glacé, qui contenait du Taxol (stabilisateur MT) à une concentration qui empêchait non seulement la dépolymérisation, mais aussi la repolymérisation de la MT. L’homogénat a été séparé en trois fractions par un procédé d’ultracentrifugation en deux étapes (Figure 1). Toutes les étapes de ce protocole ont été réalisées sans interruption dans un environnement à température fraîche, et les tissus et les fractions n’ont pas été congelés jusqu’à ce qu’ils soient dissous dans un tampon d’échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS).
- Préparation de MSB et de microtubes
- Pour préparer le MSB, mélanger les réactifs suivants : 0,1 M d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES), pH 6,8 (neutralisé par KOH), 10 % de glycérol, 0,1 mM de DTT, 1 mM de MgSO 4, 1 mM d’EGTA, 0,5 % de Triton X-100, inhibiteurs de la phosphatase (1 mM de NaF, 1 mM de β-glycérophosphate, 1 mM de Na3VO 4, 0,5 μM d’acide okadaïque), 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase, et les inhibiteurs de la protéase (0,1 mM de PMSF, 0,1 mM de DIFP, 1 μg/mL de pepstatine, 1 μg/mL d’antidouleur, 10 μg/mL d’aprotinine, 10 μg/mL de leupeptine, 50 μg/mL de TLCK) (voir le tableau des matériaux) et désignés par MSB(-).
- Juste avant la dissection tissulaire, ajouter 10 μM de Taxol et 2 mM de GTP (voir le tableau des matériaux) à la MSB(-). Ce tampon est désigné MSB(+). Préparez le tampon le jour de l’utilisation et conservez-le sur de la glace.
- Préparez les microtubes pour l’échantillonnage. Microtube vide de 2,0 ml pour le stockage de l’homogénat ; microtube vide de 1,5 mL pour le lysat de surnageant1 (S1), l’échantillon de précipité2 (P2) et l’entreposage de l’échantillon de précipité3 (P3) ; Microtube de 1,5 mL avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour le stockage des tissus disséqués ; Microtube de 1,5 mL avec 200 μL de tampon d’échantillon SDS 2x (0,16 M Tris pH 6,8 ; glycérol 20 % ; 2-mercaptoéthanol 2 % ; 4 % SDS) pour le stockage de l’échantillon S1 et du surnageant3 (S3) ; et microtube de centrifugation pour rotors de centrifugation TLA55 et TLA120.2 (voir tableau des matériaux). Étiquetez tous les tubes et placez-les sur de la glace.
- Homogénéisation des tissus de souris
- Préparez une table réfrigérée pour la dissection des tissus. Tout d’abord, remplissez une boîte de glace pilée et placez deux boîtes de Pétri sur de la glace, l’une avec le côté intérieur vers le haut et l’autre avec le côté extérieur. Remplissez du PBS glacé dans un plat pour le lavage et le stockage transitoires des tissus disséqués. Posez du papier filtre imbibé de PBS sur un autre plat retourné.
- Pour sacrifier une souris, effectuez une luxation cervicale sous anesthésie profonde avec un anesthésique mixte de butorphanol, de midazolam et de médétomidine. Ensuite, disséquez immédiatement les tissus, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, et lavez-les avec du PBS glacé dans une boîte de Pétri.
REMARQUE : Tout type de tissu mou peut être analysé par cette méthode. Cependant, la taille du tissu est limitée par la plage de volume recommandée de l’homogénéisateur utilisé. Par exemple, si un volume de 2 ml d’homogénéisateur est utilisé, 50 à 100 mg de tissu sont recommandés. - Après avoir pesé les microtubes de 1,5 ml remplis de PBS pour le stockage des tissus disséqués, découpez et stockez les tissus à l’intérieur des microtubes, et pesez à nouveau chaque microtube. Le poids humide de chaque tissu peut être calculé en soustrayant le poids du tube avant et après l’ajout du tissu.
- Homogénéiser immédiatement le tissu dans un MSB(+) glacé à l’aide d’un homogénéisateur réfrigéré (voir le tableau des matériaux). Le volume de MSB(+) était 19 fois (μL) le poids humide des tissus (mg). Effectuez l’homogénéisation avec 20 coups jusqu’à ce que les morceaux de tissu disparaissent.
REMARQUE : Par exemple, 1 900 μL de MSB(+) sont utilisés pour 100 mg de tissu. Étant donné que le volume de MSB(+) à ajouter doit être ajusté pour chaque poids humide des morceaux de tissu analysés, il est nécessaire de peser chaque morceau de tissu avec précision.
- Centrifugation des homogénats de tissus de souris
- Déplacer l’homogénat entier dans un microtube de 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse à 2 400 × g pendant 3 min à 2 °C pour éliminer les débris par précipitation.
- Transférez le surnageant entier (fraction S1) dans un nouveau microtube de 1,5 mL et un vortex. Ensuite, aliquotez 200 μL de fraction S1 dans un microtube de centrifugation et centrifugez à 100 000 × g à l’aide d’un rotor TLA-55 pendant 20 min à 2 °C pour obtenir les protéines de poids moléculaire relativement important sous forme de précipité (fraction P2).
REMARQUE : Le volume de l’échantillon soumis aux étapes d’ultracentrifugation affecte le rayon de centrifugation et l’efficacité de précipitation des molécules. Maintenez le volume de l’échantillon à 200 μL ou moins après cette étape pour éviter un fractionnement inexact. - Centrifuger ensuite tout le surnageant résultant (fraction S2) à 500 000 × g à l’aide d’un rotor TLA-120.2 pendant 60 min à 2 °C pour séparer les complexes protéiques insolubles dans le précipité (fraction P3) des protéines solubles dans le surnageant (fraction S3).
- Ajouter 400 μL de tampon d’échantillon 1x SDS (0,08 M Tris pH 6,8 ; 10 % de glycérol ; 1 % de 2-mercaptoéthanol ; 2 % SDS) dans les tubes de fraction P2 et P3 et soniser brièvement pour dissoudre le précipité. Transférez ces échantillons de fraction dans un microtube vide de 1,5 ml.
- Dissoudre la fraction S3 totale dans 200 μL de tampon 2x SDS.
- Mélangez les fractions S1 restantes avec un volume égal de tampon d’échantillon 2x SDS pour l’utiliser comme courbe standard pour le transfert Western.
- Faites bouillir tous ces échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
- Quantification des protéines dans chaque fraction
- Quantifier les protéines dans les fractions P2, P3 et S3 par Western blot. Tout d’abord, utilisez l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS à 10 % (SDS-PAGE) pour séparer les protéines des fractions P2, P3 et S3 correctement diluées et de l’échantillon S1 dilué en série de n’importe quel individu comme courbe standard. Ensuite, vaporisez les échantillons sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (voir le tableau des matériaux).
NOTE : Le taux de dilution de chaque fraction dépend de la concentration d’une protéine objective et de la réactivité de l’anticorps. (p. ex., α-tubuline, TUBB3, β-tub et tubuline tyrosinée dans le tissu cérébral : S3 = 1/400, P3 = 1/2 000, P2 = 1/2 000, S1 = 1/50,000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 ; tubuline acétylée dans le tissu cérébral : S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000 ; α-tubuline dans le foie : S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 ; α-tubuline dans le thymus : S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 dilution de la concentration tissulaire). - Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris (50 mM de Tris-HCl pH 7,6 ; 152 mM de NaCl) avec 0,1 % de Tween 20 (TBS-T) pendant plus de 30 min.
- Immergez la membrane dans l’anticorps primaire contenant le TBS-T (voir le tableau des matériaux) pendant plus de 2 h. Après cela, lavez la membrane avec TBS-T pendant 3 min (3 fois).
- Marquer l’anticorps primaire à l’aide d’anticorps secondaires conjugués HRP (voir le tableau des matériaux) dans le TBS-T pendant plus de 1 h. Après cela, lavez la membrane avec TBS-T pendant 3 min (3 fois).
- Développer les membranes avec le réactif de chimiluminescence améliorée. Ensuite, analysez les bandes d’intérêt à l’aide d’un analyseur d’images luminescentes (voir Tableau des matériaux).
- Quantifier l’intensité des bandes protéiques à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir le tableau des matériaux) et créer une courbe standard en traçant les unités de dilution des échantillons S1 dilués utilisés pour la courbe standard le long de l’axe X et les intensités des bandes le long de l’axe Y.
- Lire la concentration en protéines (unité) correspondant aux échantillons de fraction diluée. Multipliez la concentration lue par le facteur de dilution de l’échantillon pour obtenir une unité protéique dans chaque fraction. Divisez l’unité mesurée de chaque fraction par l’unité protéique totale (P2 + P3 + S3) pour obtenir un pourcentage.
- Quantifier les protéines dans les fractions P2, P3 et S3 par Western blot. Tout d’abord, utilisez l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS à 10 % (SDS-PAGE) pour séparer les protéines des fractions P2, P3 et S3 correctement diluées et de l’échantillon S1 dilué en série de n’importe quel individu comme courbe standard. Ensuite, vaporisez les échantillons sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (voir le tableau des matériaux).
2. Évaluation des propriétés de la tubuline dans chaque fraction
REMARQUE : Cette méthode biochimique fournit trois groupes de complexes de tubuline définis par des propriétés de sédimentation. Ici, le statut des complexes de tubuline obtenus dans ces fractions a été identifié en fonction de la taille du complexe et des tubulines-PTM. Effectuez toutes les étapes de ce protocole sans interruption dans un environnement à température fraîche, mais ne congelez pas les échantillons de fraction jusqu’à ce qu’ils soient dissous dans le tampon d’échantillon SDS.
- Dosage du piège à filtre
- Filtrer les fractions S2 et S3 (500 μL chacune) à l’aide d’une colonne de centrifugation d’ultrafiltration de 300 kDa (voir Tableau des matériaux). Effectuer une centrifugation de 14 000 × g à 2 °C jusqu’à ce que l’ensemble du surnageant soit filtré, que les protéines éluées soient recueillies dans des tubes récepteurs et que les protéines piégées restent sur le filtre des tubes réservoirs.
- Traduire l’ensemble des filtrats (environ 500 μL) dans les tubes récepteurs en nouveaux microtubes de 1,5 mL et les dissoudre dans 500 μL de tampon d’échantillon SDS 2x.
- Solubiliser les résidus sur le filtre des tubes réservoirs dans 1 000 μL de tampon d’échantillon SDS 1x en pipetant et en transférant les échantillons dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
- Faites bouillir les échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
- Analyser les quantités de tubuline par Western blot avec DM1A (anticorps anti-α-tubuline, voir le tableau des matériaux).
- Chromatographie d’exclusion de taille
- Préparer le tampon porteur (0,1 M MES, pH 6,8 ; 10 % de glycérol ; 1 mM MgSO4 ; 1 mM EGTA ; 0,1 mM DTT) complété par une concentration de 1/10 d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase comme décrit à l’étape 1.1.1. Ensuite, filtrez la solution et stockez-la dans un environnement froid.
- Préparer une colonne de chromatographie par filtration sur gel équipée d’un système de chromatographie liquide préparative dans une chambre de chromatographie (voir tableau des matériaux) à 4 °C.
- Avant d’injecter des échantillons dans la colonne, faire couler 180 mL du tampon de support pour laver la colonne. Le débit est de 1 mL/min pendant 3 h.
- Injecter de la tubuline porcine purifiée disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) comme témoin ou la fraction S3 de cerveaux de souris (500 μL chacun) sur la colonne.
- Elute à un débit de 1,0 mL/min avec tampon porteur. Prélever les fractions de 1,5 mL pendant 120 minutes. Surveiller les protéines éluées par absorbance à 280 nm. Maintenez la pression maximale en dessous de 0,3 MPa.
- Après avoir vortex les fractions collectées, mélanger 50 μL d’entre elles avec 50 μL de tampon d’échantillon SDS 2x dans un microtube de 1,5 mL. Faites bouillir tous les échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
- Analyser les quantités de tubuline par Western blot avec DM1A, anticorps anti-α-tubuline et KMX-1, anticorps anti-β-tubuline (voir le tableau des matériaux).
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Representative Results
Quantification de la tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 du cerveau de souris par la méthode de fractionnement MT
La tubuline dans les tissus de souris a été séparée en fractions P2, P3 et S3 par la méthode de fractionnement MT et quantifiée par Western blot (Figure 1A). Le précipité de MT qui est resté dans la fraction P2 par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 20 min représentait 34,86 % ± 1,68 % de la tubuline totale dans un cerveau de souris. Le surnageant (S2) a ensuite été centrifugé à 500 000 × g pendant 60 min. Un précipité (fraction P3) et un surnageant (fraction S3) ont été obtenus, qui représentaient respectivement 56,13 % ± 2,12 % ou 9,01 % ± 0,68 % de la tubuline totale dans le cerveau des souris (Figure 1B).
Le cortex cérébral utilisé dans cette étude contient des cellules neuronales et non neuronales, telles que la glie. Afin d’évaluer sélectivement la stabilité de la TA dans les neurones du cerveau des souris, nous avons quantifié TUBB3, un sous-type de tubuline exclusivement exprimé dans les neurones du système nerveux central et périphérique, par Western blot avec Tuj1 (anticorps anti-TUBB3). Le pourcentage de TUBB3 dans la fraction P2, P3 ou S3 était de 32,65 % ± 2,20 %, 59,31 % ± 2,61 %, soit 8,04 % ± 0,74 %, respectivement. Ils n’étaient pas significativement différents de ceux de la α-tubuline (Figure 1B). Ces résultats suggèrent que les neurones et les cellules gliales présentent une stabilité MT similaire ou que les neurones contiennent des quantités beaucoup plus élevées de tubuline que celles des cellules gliales in vivo.
Caractéristiques de la tubuline récupérée dans chaque fraction
Ici, l’homogénat de tissu de souris a été séparé en trois fractions par ultracentrifugation en deux étapes avec différentes accélérations gravitationnelles ; Par conséquent, les coefficients de sédimentation entre les protéines ou leurs complexes dans chaque fraction différaient. Bien que la tubuline précipitée à 100 000 × g par ultracentrifugation ait été considérée comme une MT conventionnelle, il convient de préciser en quoi la tubuline nouvellement obtenue de la fraction P3 diffère ici de celle de la tubuline dans les fractions P2 et S3.
Pour caractériser la tubuline S3, la fraction S2 (P3 + S3) ou S3 a été soumise à une chromatographie d’ultrafiltration et d’exclusion granulométrique. Les complexes de tubuline de la fraction S3 pouvaient traverser complètement une colonne de spin d’ultrafiltration de 300 kDa, tandis que la quasi-totalité de la tubuline de la fraction S2 était piégée sur le filtre (Figure 2A). De plus, la masse moléculaire des complexes de tubuline dans la fraction S3 a été mesurée par chromatographie d’exclusion de taille. La tubuline S3 éluée à un pic correspondant à 100 kDa, ce qui est similaire à celui des dimères de tubuline purifiée disponibles dans le commerce (Figure 2B,C). De plus, les proportions de α et de β-tubuline récupérées dans chaque fraction par la méthode de fractionnement par magnétoscopie étaient égales (figure 2D). En fait, il a été démontré que la α et la β-tubuline peuvent légèrement exister sous forme de monomères dans les cellules vivantes24. Cependant, à en juger par la valeur estimée de kD (ordre nM) rapportée et la concentration de tubuline récupérée dans la fraction S3 (~11 μM), on pense que la plupart (> 98%) de la tubuline existe sous forme de dimères α/β. Par conséquent, la tubuline dans la fraction S3 est principalement un dimère α/β-tubuline soluble.
Les polymères de tubuline ont été séparés en deux fractions, P2 et P3, sur la base de leurs modifications post-traductionnelles (PTM). Pour différencier ces fractions, un Western blot a été réalisé à l’aide d’anticorps spécifiques. L’anticorps anti-acétylé α-tubuline, qui sert de marqueur pour les MT stables, a démontré que la fraction P2 était significativement enrichie de 97,40 % ± 0,52 % de α-tubuline acétylée (Figure 2E), tandis que la α-tubuline totale était récupérée dans les fractions P3 et S3 (Figure 1B). À l’inverse, l’anticorps anti-tyrosiné α-tubuline, révélateur de MT labiles, a révélé que 75,43 % ± 2,69 % de la tyrosinée α-tubuline était présente dans la fraction P3 (Figure 2F). Ces résultats confirment que la fraction P2 contient principalement de la tubuline dans des MT stables, tandis que la fraction P3 est constituée de tubuline dans des MT labiles.
Évaluation de la stabilité de la magnétoscopie sous congélation et traitement au nocodazole
L’effet de la congélation et du traitement au nocodazole sur la stabilité des MT intracérébrales de souris a été analysé afin de déterminer si des changements transitoires dans la stabilité des MT pouvaient être discernés par la méthode de fractionnement des MT. Les MT se démontent généralement à basse température, mais certains MT restent stables dans le froid. Après avoir pesé les cerveaux, ils ont été congelés dans de l’azote liquide et placés à -80 °C pendant 30 min. Le cerveau congelé transitoire et le cerveau cru en tant que témoins ont été homogénéisés et fractionnés en fractions P2, P3 et S3. Ensuite, la proportion de tubuline contenue dans les trois fractions a été quantifiée par Western blot. Une fois que le cerveau a été congelé avant l’homogénéisation, la α-tubuline dans la fraction P2 a diminué, et celle dans la fraction P3 a augmenté par rapport à celle du cerveau brut (Figure 3A). Des transferts avec du 6-11B1 (α-tubuline acétylée) ou du 1A2 (α-tubuline tyrosinée) ont également révélé que la congélation cérébrale diminuait le niveau d’acétylation (Figure 3B) et augmentait le niveau de tyrosination (Figure 3C) de la α-tubuline dans la fraction P2.
Le nocodazole est un agent ciblant les microtubules (MTA) qui empêche la polymérisation de la magnétoscopie en se liant à la β-tubuline et favorise la dépolymérisation de la magnétolisation. Des cerveaux de souris ont été homogénéisés dans des MSB(+) sans taxol avec ou sans 10 μM de nocodazole et placés à 4 °C pendant 20 min. L’homogénat non traité ou traité au nocodazole a été ajouté au Taxol 10 μM, ré-homogénéisé et fractionné en fractions P2, P3 et S3. Ensuite, la proportion de tubuline contenue dans les trois fractions a été quantifiée par Western blot. Les transferts avec DM1A (α-tubuline) ont montré que la α-tubuline dans la fraction P2 diminuait et que dans la fraction P3 avait tendance à augmenter avec le traitement au nocodazole (Figure 3D). Ces résultats indiquent que la tubuline P2 a été déstabilisée en réponse à une basse température ou au nocodazole et que la fraction P2 contenait des MT robustes qui ont résisté aux conditions expérimentales. Contrairement à la congélation, le nocodazole n’a pas affecté les PTM de la tubuline (Figure 3E,F). Sur la base des résultats et des données ci-dessus, la dépolymérisation des MT qui ne peuvent pas être détectées par l’analyse PTM peut être évaluée par cette méthode.
Comparaison du rapport entre les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre dans les tissus
La stabilité des MT varie d’un tissu à l’autre, en fonction de la capacité proliférative des cellules de ces tissus. Notamment, les MT stables sont plus abondants dans le système nerveux, qui se compose principalement de neurones non prolifératifs, par rapport aux autres tissus4. Afin d’évaluer la capacité de la méthode de fractionnement de la magnétoscopie développée à discerner les différences de stabilité de la magnétoscopie dans divers tissus, les foies et le thymi des souris ont été fractionnés, et la tubuline récupérée dans chaque fraction a été quantifiée. Les résultats ont révélé que, par rapport à d’autres tissus, le cerveau présentait un niveau significativement plus élevé de tubulines P2, tandis que les tubulines P3 étaient significativement enrichies dans les tissus contenant des cellules prolifératives (Figure 4). De plus, le transfert Western à l’aide d’anticorps 6-11B1 et 1A2 a confirmé la présence d’une plus grande stabilité de la MT dans le système nerveux. Les profils de distribution distincts des PTM de tubuline indiquaient clairement que la tubuline P2 spécifiquement trouvée dans le système nerveux provenait de MT stables (Figure 4). Ces résultats soutiennent en outre l’idée que les fractions P2 et P3 correspondent respectivement à des MT stables et labiles.
Figure 1 : Quantification de la tubuline dans les tissus de souris à l’aide de la méthode de fractionnement par magnétoscopie. (A) Résumé de la méthode de fractionnement par magnétose pour les tissus. Les MT stables (fraction P2), les MT labiles (fraction P3) et la tubuline libre (fraction S3) dans les tissus peuvent être séparés par ultracentrifugation en 2 étapes dans des conditions qui suppriment la polymérisation et la dépolymérisation MT pendant la préparation. (B) Les MT dans le cortex de la souris ont été précipitées par ultracentrifugation conventionnelle de 100 000 × g suivie d’une ultracentrifugation de 500 000 × g. Ensuite, les tubulines séparées en fractions P2, P3 et S3 ont été quantifiées par Western blot avec DM1A (α-tubuline) et anti-Tuj1 (TUBB3). La proportion de protéines dans chaque fraction (P2, P3 ou S3) par rapport à la fraction totale (P2 + P3 + S3) a été calculée comme décrit dans la section Protocole (moyennes ± écarts-types, n = 4). Ce chiffre a été modifié à partir de Hagita et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La méthode de fractionnement MT permet de séparer les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre dans le cortex cérébral de la souris. (A) Les fractions S2 ou S3 (entrée) ont été analysées par le test du piège à filtre à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 300 kDa. Les tubulines obtenues par filtration (récepteur) et piégeage (réservoir) ont été quantifiées par Western blot avec de la DM1A (α-tubuline). (B) Les tubulines porcines purifiées ont été soumises à la méthode de fractionnement MT et se sont avérées être principalement collectées dans la fraction S3. (C) Taille moléculaire de la tubuline dans la fraction S3. La fraction S3 a été séparée par chromatographie d’exclusion granulométrique à l’aide d’une colonne de chromatographie par filtration sur gel. Les protéines de chaque fraction ont été quantifiées par Western blot avec DM1A (α-tubuline) et KMX-1 (β-tubuline). La masse moléculaire théorique est indiquée en haut des panneaux. (D) Les proportions de α-tubuline et de β-tubuline dans chaque fraction étaient égales. Les tubulines séparées en fractions P2, P3 et S3 ont été quantifiées par Western blot avec KMX-1 (β-tubuline). Quantification de la proportion de α-tubuline et de β-tubuline dans chaque fraction par rapport à la somme de la fraction totale (moyennes ± écarts-types, n = 4). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du test t de Student. (E,F) Les modifications de la α-tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 ont été vérifiées par Western blot avec 6-11B1 (α-tubuline acétylée : E) et 1A2 (α-tubuline tyrosinée : F). Quantification de la proportion de α-tubuline tyrosinée ou acétylée dans chaque fraction par rapport à la fraction totale (moyennes ± écarts-types, n = 4). (A-C) ont été modifiés à partir de Hagita et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de la dépolymérisation de la magnétoscopie induite par la congélation ou la magnétoscopie (A-C) La stabilité de la magnétoscopie après 30 min de congélation à -80 °C a été évaluée. Les proportions de tubuline contenues dans les trois fractions du cerveau cru et congelé ont été quantifiées par Western blot avec DM1A (α-tubuline : A), 1A2 (α-tubuline tyrosinée : B) et 6-11B1 (α-tubuline acétylée : C). (D-F) L’effet du nocodazole sur la stabilité de la TA a été évalué. Les proportions de tubuline contenues dans les trois fractions de cerveaux de nocodazole non traités ou traités ont été quantifiées par Western blot avec DM1A (α-tubuline : D), 1A2 (tyrosinée α-tubuline : E) et 6-11B1 (acétylée α-tubuline : F). Les niveaux relatifs représentatifs de tyrosination (B,E) ou d’acétylation (C,F) ont été normalisés à la quantité de α-tubuline totale (A,D ) (signifie ±écarts-types, n = 4). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Proportions de MT stables, de MT labiles et de tubuline libre dans le cerveau, le foie et le thymus chez la souris. Les cerveaux, les foies et les thymis des souris ont été disséqués et soumis à la méthode de fractionnement MT. Les protéines séparées en chaque fraction ont été quantifiées par Western blot avec DM1A (α-tubuline), 6-11B1 (α-tubuline acétylée) et 1A2 (α-tubuline tyrosinée). La proportion de protéines dans chaque fraction (P2, P3 ou S3) par rapport à la fraction totale (P2 + P3 + S3) a été calculée comme décrit dans la section Protocole (moyennes ± écarts-types, n = 4). Les analyses statistiques ont été effectuées par ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La tâche la plus importante lors de l’étude de l’état de la tubuline dans les tissus d’organismes vivants est d’empêcher la polymérisation ou la dépolymérisation accidentelle de la magnétoscopie pendant la préparation. La stabilité des MT dans les échantillons est affectée par des facteurs tels que la concentration de Taxol dans la MSB, la proportion de quantité tissulaire à tamponner et la température pendant le processus allant du prélèvement des tissus à l’homogénéisation et à la centrifugation. Par conséquent, les conditions ont été optimisées à chaque étape du protocole d’analyse des tissus de souris avec un volume d’homogénat 20 fois supérieur. Une concentration plus élevée de Taxol peut induire une polymérisation MT in vitro, même dans des conditions réfrigérées25. Lors de l’analyse de tissus présentant des concentrations de tubuline significativement différentes ou lors de modifications substantielles du protocole, chaque opérateur doit optimiser les étapes en fonction des objectifs spécifiques de ses expériences.
Dans l’étude menée, une nouvelle population de MT, appelée P3, a été obtenue à partir de la « fraction soluble » conventionnelle par ultracentrifugation à 500 000 × g20. Des calculs théoriques basés sur des facteurs tels que le facteur K du rotor, la force centrifuge et la durée de la centrifugation suggèrent que les tubulines présentes dans la fraction S3 représentent très probablement des dimères de tubuline 6S. À l’inverse, la tubuline dans la fraction P3 peut correspondre à des MT de longueur plus courte que celles trouvées dans la fraction P2. Cette observation s’aligne sur le résultat montrant que la congélation des tissus avant l’homogénéisation, qui conduit à l’effondrement partiel des MTs26, a entraîné une augmentation significative de la tubuline dans la fraction P3 et une diminution concomitante de la fraction P2 (Figure 3A). De plus, l’analyse des PTM de tubuline et les propriétés de liaison de diverses MAP indiquent que la fraction P2 ou P3 contient respectivement des MT stables ou labiles. Par exemple, certaines MAP spécifiques aux MT stables, que l’on trouve principalement dans les neurones, étaient exclusivement présentes dans la fraction P223. Par conséquent, il est plausible de suggérer que la fraction P3 comprend des MT plus dynamiques et labiles que celles de la fraction P2.
Selon la théorie sous-jacente à la méthode, des conditions expérimentales inappropriées impliquées dans la stabilisation ou la centrifugation de la magnétoscopie peuvent entraîner un mauvais fractionnement. Par exemple, une faible concentration de Taxol entraîne une légère diminution de la tubuline P2, tandis qu’un excès de Taxol augmente la tubuline P2 en raison de la formation de MT lors de la préparation23. De même, le chauffage inapproprié des tissus et des échantillons peut provoquer une hyperpolymérisation des MT et une dégradation ou une fragmentation de la protéine tau23. De plus, les conditions centrifuges sont critiques pour séparer les fractions P3 et S3, et une légère diminution de l’accélération gravitationnelle réduit considérablement la récupération de la fraction P3. Par conséquent, il est recommandé de suivre strictement les étapes du protocole si des fractionnements anormaux sont observés.
Cette méthode de fractionnement simple peut être largement appliquée pour analyser les proportions de tubulines parmi les MT stables, les MT labiles et les dimères libres dans les tissus. Cette méthode offre plusieurs avantages, car elle permet de détecter des changements subtils dans l’état de la tubuline qui peuvent ne pas être apparents par la quantification des PTM de la tubuline. L’analyse de la stabilité de la TA est importante pour comprendre la signification physiologique des MT, en particulier dans les cellules neuronales volumineuses et complexes, et pour étudier les troubles associés à la dérégulation de la MT. Les mutations ou les dysfonctionnements des gènes de la tubuline ou de la PMA, par exemple, sont liés à des troubles neurodéveloppementaux et à des maladies neurodégénératives27,28. Dans la maladie d’Alzheimer, on sait que les MT sont réduites, peut-être en raison de la perte fonctionnelle de la protéine tau dans les neurones affectés 15,29,30,31,32,33. Les MTA qui modulent la stabilité de la MT et inhibent la division cellulaire ont été proposés comme thérapies potentielles pour les troubles neurologiques13,34. L’utilisation de cette méthode unique de fractionnement de la TA pour analyser la stabilité et le comportement des MT et des MAPs chez les animaux modèles de la maladie peut contribuer de manière significative à élucider la pathogenèse de la démence liée à la protéine tau et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par JST, la création de bourses universitaires pour la création d’innovations scientifiques et technologiques (A.HT. ; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT. ; JPMJSP2129), une subvention d’aide pour les boursiers de la JSPS (A.HT ; 23KJ2078), une subvention d’aide à la recherche scientifique (B) JSPS KAKENHI (22H02946 pour la MT), une subvention d’aide à la recherche scientifique dans des domaines innovants intitulée « Brain Protein Aging and Dementia Control » de MEXT (TM ; 26117004), et une bourse de recherche Uehara de la Fondation commémorative d’Uehara (TM ; 202020027). Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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