Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

טכניקת שבירת מיקרוטובולים כמותית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/63358
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

Summary

מיקרוטובולים, שהם פולימרי טובולין, ממלאים תפקיד מכריע כמרכיב שלד ציטוקריוטי בתאים אאוקריוטים וידועים בחוסר היציבות הדינמי שלהם. מחקר זה פיתח שיטה להפרדת מיקרוטובולים כדי להפריד אותם למיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וטובולין חופשי כדי להעריך את יציבותם של מיקרוטובולים ברקמות עכבר שונות.

Abstract

מיקרוטובולים, המורכבים מדימרים α/β-טובולין, הם מרכיב חיוני של שלד הציטו-שלד בתאים איקריוטים. פולימרים דמויי צינור אלה מפגינים חוסר יציבות דינמית כאשר תת-יחידות הטרודימר טובולין עוברות פילמור חוזר ונשנה ודה-פולימריזציה. בקרה מדויקת של יציבות ודינמיקה של מיקרוטובולים, המושגת באמצעות שינויים לאחר תרגום טובולין וחלבונים הקשורים למיקרוטובול, חיונית לתפקודים תאיים שונים. תפקוד לקוי במיקרוטובולים מעורב מאוד בפתוגנזה, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות. המחקר המתמשך מתמקד בחומרים טיפוליים ממוקדי מיקרוטובולים המווסתים את היציבות, ומציעים אפשרויות טיפול פוטנציאליות למחלות וסוגי סרטן אלה. כתוצאה מכך, הבנת המצב הדינמי של מיקרוטובולים חיונית להערכת התקדמות המחלה וההשפעות הטיפוליות.

באופן מסורתי, דינמיקה של מיקרוטובולים הוערכה במבחנה או בתאים בתרבית באמצעות שבירה גסה או אימונואסיה, תוך שימוש בנוגדנים המכוונים לשינויים שלאחר תרגום של טובולין. עם זאת, ניתוח מדויק של מצב טובולין ברקמות באמצעות הליכים כאלה מציב אתגרים. במחקר זה פיתחנו שיטה פשוטה וחדשנית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר.

ההליך כלל הומוגניזציה של רקמות עכבר מנותחות במאגר מייצב מיקרוטובול ביחס נפח של 19:1. לאחר מכן חולקו ההומוגנטים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי לאחר צנטריפוגה איטית ראשונית (2,400 × גרם) כדי לפנות פסולת. שלב האולטרה-צנטריפוגה הראשון (100,000 × גרם) זירז מיקרוטובולים יציבים, בעוד שהסופרנאטנט שהתקבל היה נתון לשלב אולטרה-צנטריפוגה שני (500,000 × גרם) לשבר מיקרוטובולים לאביליים ודימרים מסיסים. שיטה זו קבעה את הפרופורציות של טובולין המהווה microtubules יציב או labile במוח העכבר. בנוסף, נצפו שינויים ברורים ברקמה ביציבות המיקרוטובולים שהיו בקורלציה עם יכולת ההתרבות של התאים המרכיבים. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל המשמעותי של שיטה חדשנית זו לניתוח יציבות מיקרוטובולים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

מיקרוטובולים (MTs) הם מבנים צינוריים מוארכים הכוללים פרוטופילמנטים המורכבים מתת-יחידות הטרודימר α/β-טובולין. הם ממלאים תפקידים חיוניים בתהליכים תאיים שונים כגון חלוקת תאים, תנועתיות, תחזוקת צורה והובלה תוך-תאית, מה שהופך אותם למרכיבים אינטגרליים של שלד התא האיקריוטי1. הקצה המינוס של MTs, שבו תת-היחידה α-טובולין נחשפת, יציב יחסית, ואילו ה-plus-end, שבו תת-היחידה β-טובולין נחשפת, עובר דה-פולימריזציה דינמית ופילמור2. מחזור מתמשך זה של חיבור דימר טובולין ודיסוציאציה בקצה הפלוס, המכונה חוסר יציבות דינמי, גורם לתהליך חוזר ונשנה של הצלה וקטסטרופה3. MTs מציגים תחומי מוקד עם וריאציות מקומיות באי יציבות דינמית, כולל תחומים יציבים ושפתיים4.

בקרה מדויקת של חוסר היציבות הדינמית של MTs חיונית לתפקודים תאיים רבים, במיוחד בתאי עצב המאופיינים במורפולוגיות מורכבות. יכולת ההסתגלות והעמידות של MTs ממלאים תפקיד חיוני בהתפתחות ובתפקוד תקין של תאי עצב 5,6,7. חוסר היציבות הדינמי של MTs נמצא קשור לשינויים שונים לאחר תרגום (PTM) של טובולין, כגון אצטילציה, זרחון, פלמיטוילציה, דטרוזינציה, דלתא 2, חמצון פוליגלוטמין ופוליגליצילציה. בנוסף, קשירת חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs) משמשת כמנגנון ויסות8. PTMs, למעט אצטילציה, מתרחשים בעיקר באזור מסוף קרבוקסי טובולין הממוקם על פני השטח החיצוניים של MTs. שינויים אלה יוצרים תנאי שטח מגוונים ב- MTs, משפיעים על האינטראקציה שלהם עם MAPs ובסופו של דבר שולטים ביציבות MT9. נוכחותם של שאריות טירוזין מסוף קרבוקסי ב-α-טובולין מעידה על MTs דינמיים, המוחלפים במהירות על ידי בריכת טובולין חופשית. לעומת זאת, דה-טירוזינציה של מסוף הקרבוקסי ואצטילציה של Lys40 מסמנים MTs יציבים עם פחות יציבות דינמית 9,10.

PTMs של טובולין שימשו באופן נרחב בניסויים כדי להעריך את הדינמיקה והיציבות של MTs 5,7,11,12,13,14,15. לדוגמה, במחקרי תרביות תאים, ניתן להפריד טובולינים לשתי בריכות: בריכת טובולין חופשית ובריכת MT. זה מושג על ידי שחרור טובולין חופשי דרך חדירת תאים לפני תיקון MTs 15,16,17,18,19 הנותרים. שיטות ביוכימיות כוללות שימוש במייצבי MT כימיים המגינים על MTs מפני אסון, ומאפשרים הפרדה של MTs וטובולין חופשי באמצעות צנטריפוגה20,21,22. עם זאת, הליכים אלה אינם מבדילים בין MTs יציבים ופחות יציבים (labile), ובכך הופכים את זה לבלתי אפשרי לכמת MTs או טובולין מסיס ברקמות כמו המוח. כתוצאה מכך, הערכת יציבות MT באורגניזמים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים הוכחה כמאתגרת. כדי להתמודד עם מגבלה ניסיונית זו, פיתחנו טכניקה חדשנית להפרדה מדויקת של MTs וטובולין חופשי ברקמת עכבר23.

שיטת שבירת MT ייחודית זו כוללת הומוגניזציה של רקמות בתנאים השומרים על מצב טובולין ברקמות וצנטריפוגה דו-שלבית להפרדת MTs יציבים, MTs labile וטובולין חופשי. הליך פשוט זה יכול להיות מיושם במחקרים רחבים, כולל מחקר בסיסי על MTs ו- MAPs באורגניזמים חיים, ניתוחים פיזיולוגיים ופתולוגיים של בריאות ומחלות הקשורות ליציבות MT, ופיתוח תרופות וטיפולים אחרים המכוונים ל- MTs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיטת שבר MT

הערה: כל הניסויים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת דושישה. עכברי C57BL/6J משני המינים, בני 3-4 חודשים, שימשו כאן. בפרוטוקול זה, רקמות שנותחו, כגון מוח, כבד או בלוטת התימוס, עברו הומוגניות מיידית במאגר מייצב מיקרוטובול קר כקרח (MSB), שהכיל טקסול (מייצב MT) בריכוז שמנע לא רק דה-פולימריזציה אלא גם רה-פילמריזציה של MT. ההומוגנט הופרד לשלושה שברים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי (איור 1). כל השלבים בפרוטוקול זה הושלמו ללא הפרעה בסביבה בטמפרטורה קרירה, והרקמות והשברים לא הוקפאו עד שהומסו במאגר דגימת נתרן דודציל סולפט (SDS).

  1. הכנת MSB ומיקרו-צינוריות
    1. להכנת MSB, ערבבו את הריאגנטים הבאים: 0.1 M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), pH 6.8 (מנוטרל על ידי KOH), 10% גליצרול, 0.1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0.5% Triton X-100, מעכבי phosphatase (1 mM NaF, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 0.5 μM חומצה אוקדאית), 1x קוקטייל מעכב פרוטאז, ומעכבי פרוטאז (0.1 mM PMSF, 0.1 mM DIFP, 1 μg/mL pepstatin, 1 μg/mL antipain, 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin, 50 μg/mL TLCK) (ראה טבלת חומרים) ומסומנים כ-MSB(-).
    2. ממש לפני דיסקציה של רקמות, הוסף 10 מיקרומטר טקסול ו-2 מילימטר GTP (ראה טבלת חומרים) ל-MSB(-). מאגר זה מסומן כ- MSB(+). הכינו את החיץ ביום השימוש ושמרו אותו על קרח.
    3. הכינו את המיקרו-צינוריות לדגימה. מיקרו-צינור ריק של 2.0 מ"ל לאחסון הומוגני; מיקרו-צינור ריק של 1.5 מ"ל עבור סופר-נטנט1 (S1) ליזט, דגימת משקע2 (P2) ואחסון דגימה של precipitate3 (P3); מיקרו-צינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS) לאחסון רקמות מנותחות; מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל עם 200 מיקרוליטר של חיץ דגימת SDS כפול (0.16 M Tris pH 6.8; 20% גליצרול; 2% 2-מרקפטואתנול; 4% SDS) עבור דגימת S1 ואחסון דגימות סופר-נטנט3 (S3); ומיקרו-צינור צנטריפוגה עבור רוטורי צנטריפוגות TLA55 ו-TLA120.2 (ראה טבלת חומרים). תייגו את כל הצינורות והניחו אותם על קרח.
  2. הומוגניזציה של רקמת עכבר
    1. הכינו שולחן צונן לדיסקציה של רקמות. ראשית, מלאו קופסה בקרח כתוש והניחו שתי צלחות פטרי על קרח, אחת עם הצד הפנימי למעלה והשנייה עם הצד החיצוני. מלאו PBS קר כקרח בצלחת אחת לשטיפה ארעית ואחסון של רקמות מנותחות. הניחו נייר פילטר רטוב עם PBS על צלחת אחרת הפוכה.
    2. כדי להקריב עכבר, לבצע נקע צוואר הרחם תחת הרדמה עמוקה עם הרדמה מעורבת של butorphanol, midazolam, ו medetomidine. לאחר מכן, נתחו מיד את הרקמות, למשל המוח, הכבד או בלוטת התימוס, ושטפו אותן עם PBS קר כקרח בצלחת פטרי.
      הערה: ניתן לנתח כל סוג של רקמה רכה בשיטה זו. עם זאת, גודל הרקמה מוגבל על ידי טווח הנפח המומלץ של הומוגנייזר בשימוש. לדוגמה, אם נעשה שימוש בנפח 2 מ"ל של הומוגנייזר, מומלץ 50-100 מ"ג רקמה.
    3. לאחר שקילת המיקרו-צינוריות בנפח 1.5 מ"ל המלאות ב-PBS לאחסון רקמות מנותחות, חתכו ואחסנו רקמות בתוך המיקרו-צינוריות, ושקלו מחדש כל מיקרו-צינור. ניתן לחשב את משקלה הרטוב של כל רקמה על ידי הפחתת משקל הצינור לפני ואחרי הוספת הרקמה.
    4. הומוגניזציה מיידית של הרקמה ב- MSB קר כקרח(+) עם הומוגנייזר צונן (ראה טבלת חומרים). נפח MSB(+) היה פי 19 (μL) מהמשקל הרטוב של הרקמה (mg). בצע הומוגניזציה עם 20 שבץ עד חתיכות הרקמה להיעלם.
      הערה: לדוגמה, 1,900 μL של MSB(+) משמש עבור 100 מ"ג רקמה. מכיוון שיש להתאים את נפח MSB(+) שיש להוסיף לכל משקל רטוב של חלקי הרקמה שנותחו, יש צורך לשקול כל פיסת רקמה במדויק.
  3. צנטריפוגה של רקמת העכבר הומוגנאטים
    1. העבר את כל ההומוגנט למיקרו-צינור של 2 מ"ל עם פיפטה פסטר וצנטריפוגה ב 2,400 × גרם למשך 3 דקות ב -2 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפסולת באמצעות משקעים.
    2. מעבירים את כל הסופרנאטנט (חלק S1) למיקרו-צינור ומערבולת חדשים בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן, aliquot 200 μL של שבר S1 לתוך מיקרו-צינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 100,000 × גרם באמצעות רוטור TLA-55 במשך 20 דקות ב 2 ° C כדי לקבל את חלבוני המשקל המולקולרי הגדול יחסית כמשקע (שבר P2).
      הערה: נפח הדגימה הנתונה לשלבי האולטרה-צנטריפוגה משפיע על רדיוס הצנטריפוגה ועל יעילות המשקעים של המולקולות. שמור על נפח הדגימה על 200 μL או פחות לאחר שלב זה כדי למנוע שבירה לא מדויקת.
    3. צנטריפוגה נוספת של כל הסופרנאטנט המתקבל (שבר S2) במהירות של 500,000 × גרם באמצעות רוטור TLA-120.2 למשך 60 דקות ב-2°C כדי להפריד את קומפלקסי החלבונים הבלתי מסיסים במשקע (מקטע P3) מחלבונים מסיסים בסופרנאטנט (שבר S3).
    4. הוסף 400 μL של חיץ דגימת SDS 1x (0.08 M Tris pH 6.8; 10% גליצרול; 1% 2-מרקפטואתנול; 2% SDS) לצינורות השבר P2 ו- P3 וסונק לזמן קצר כדי להמיס את המשקע. העבר דגימות שבר אלה למיקרו-צינור ריק של 1.5 מ"ל.
    5. המס את מקטע S3 הכולל ב- 200 μL של מאגר דגימת SDS 2x.
    6. ערבב את שברי S1 הנותרים עם נפח שווה של 2x מאגר דגימת SDS לשימוש כעקומה סטנדרטית עבור כתמים מערביים.
    7. מרתיחים את כל הדגימות הללו ב 100 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
  4. כימות חלבונים בכל שבר
    1. כימות חלבונים בשברים P2, P3 ו-S3 על ידי כתמים מערביים. ראשית, השתמש באלקטרופורזה של ג'ל 10% SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) כדי להפריד חלבונים ממדוללים כראוי של שברי P2, P3 ו- S3, ודגימת S1 מדוללת סדרתית מכל אדם כעקומה סטנדרטית. לאחר מכן, אלקטרובלוט הדגימות על קרום פוליווינילידן פלואוריד (ראה טבלת חומרים).
      הערה: יחס הדילול של כל שבר תלוי בריכוז של חלבון אובייקטיבי ובתגובתיות של הנוגדן. (לדוגמה, α-טובולין, TUBB3, β-tubulin וטירוזין ברקמת המוח: S3 = 1/400, P3 = 1/2,000, P2 = 1/2,000, P2 = 1/2,000, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000; טובולין אצטילט ברקמת המוח: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8,000, S1 = 1/100,000, 1/40,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/4,000; α-טובולין בכבד: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000; α-טובולין בבלוטת התימוס: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000 דילול ריכוז הרקמות).
    2. חסום את הממברנה עם 5% חלב דל שומן במי מלח חוצצים של Tris (50 mM Tris-HCl pH 7.6; 152 mM NaCl) עם 0.1% Tween 20 (TBS-T) למשך יותר מ-30 דקות.
    3. יש לטבול את הממברנה ב-TBS-T המכיל נוגדן ראשוני (ראו טבלת חומרים) במשך יותר משעתיים. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם TBS-T במשך 3 דקות (3 פעמים).
    4. יש לתייג נוגדנים ראשוניים באמצעות נוגדנים משניים מצומדים של HRP (ראו טבלת חומרים) ב-TBS-T במשך יותר משעה אחת. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם TBS-T במשך 3 דקות (3 פעמים).
    5. לפתח את הממברנות עם מגיב Chemiluminescence משופר. לאחר מכן, נתח את הפסים המעניינים באמצעות מנתח תמונות זוהר (ראה טבלת חומרים).
    6. כמת את עוצמות רצועת החלבונים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים) וצור עקומה סטנדרטית על ידי התוויית יחידות הדילול של דגימות S1 המדוללות המשמשות לעקומה הסטנדרטית לאורך ציר X ועוצמות הפס לאורך ציר Y.
    7. קרא את ריכוז החלבון (יחידה) המתאים לדגימות השבר המדולל. הכפל את הריכוז הנקרא עם גורם דילול הדגימה כדי לקבל יחידת חלבון בכל שבר. חלק את היחידה הנמדדת של כל שבר ביחידת החלבון הכוללת (P2 + P3 + S3) כדי לקבל אחוז.

2. הערכת המאפיינים של טובולין בכל שבר

הערה: שיטה ביוכימית זו מספקת שלוש קבוצות של קומפלקסים טובולין המוגדרים על ידי תכונות שיקוע. כאן, המצב של מתחמי טובולין המתקבלים בשברים אלה זוהה בהתבסס על גודל הקומפלקס וטובולין-PTMs. השלם את כל השלבים בפרוטוקול זה ללא הפרעה בסביבה עם טמפרטורה קרירה, אך אל תקפיא את דגימות השברים עד שהן מומסות במאגר דגימת SDS.

  1. בדיקת השמנת מסנן
    1. סנן את שברי S2 ו- S3 (500 μL כל אחד) באמצעות עמודת סיבוב אולטרה-סינון של 300 kDa (ראה טבלת חומרים). בצעו צנטריפוגה של 14,000 × גרם ב-2°C עד שכל הסופרנאטנט מסונן, חלבונים מדוללים נאספים לצינורות מקלט, וחלבונים לכודים נשארים על המסנן של צינורות המאגר.
    2. תרגם את כל התסנין (כ- 500 μL) בצינורות מקלט למיקרו-צינורות חדשים של 1.5 מ"ל והמיס אותם ב- 500 μL של חיץ דגימת SDS 2x.
    3. יש להמיס את השאריות על מסנן צינורות המאגר ב-1,000 μL של מאגר דגימת SDS 1x על ידי צנרת והעברת הדגימות למיקרו-צינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    4. מרתיחים את הדגימות ב 100 ° C במשך 3 דקות. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
    5. לנתח את כמויות טובולין על ידי כתם מערבי עם DM1A (נוגדן נגד α-טובולין, ראה טבלת חומרים).
  2. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל
    1. הכינו את מאגר הנשא (0.1 M MES, pH 6.8; 10% גליצרול; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0.1 mM DTT) בתוספת ריכוז 1/10 של מעכבי פרוטאז ופוספטאז כמתואר בשלב 1.1.1. לאחר מכן, סנן את הפתרון ואחסן אותו בסביבה קרה.
    2. הכינו עמודת כרומטוגרפיה לסינון ג'ל המצוידת במערכת כרומטוגרפיה נוזלית מכינה בתא כרומטוגרפיה (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C.
    3. לפני הזרקת דגימות על העמודה, זרימה של 180 מ"ל של חיץ המוביל כדי לשטוף את העמודה. קצב הזרימה הוא 1 מ"ל/דקה למשך 3 שעות.
    4. הזריקו טובולין חזירי מטוהר זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) כבקרה או את מקטע S3 ממוחות עכברים (500 מיקרוליטר כל אחד) על העמודה.
    5. Elute בקצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה עם חיץ מוביל. אסוף את השברים של 1.5 מ"ל למשך 120 דקות. נטר חלבונים מדוללים על ידי ספיגה ב 280 ננומטר. שמור על הלחץ המרבי מתחת ל- 0.3 מגפ"ס.
    6. לאחר ערבול השברים שנאספו, מערבבים 50 μL מהם עם 50 μL של חיץ דגימת SDS 2x במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל. מרתיחים את כל הדגימות בטמפרטורה של 100°C למשך 3 דקות. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
    7. לנתח את כמויות טובולין על ידי כתם מערבי עם DM1A, נוגדן אנטי α-טובולין ונוגדן KMX-1, אנטי β-טובולין (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כימות טובולין בשברים P2, P3 ו-S3 ממוח עכבר בשיטת שבר MT
טובולין ברקמת עכבר הופרד לשברים P2, P3 ו-S3 בשיטת שבר MT וכומת על-ידי כתם מערבי (איור 1A). המשקע של MTs שנשאר בשבר P2 על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב 100,000 × גרם במשך 20 דקות היווה 34.86% ± 1.68% מכלל טובולין במוח עכבר. הסופרנאטנט (S2) עבר צנטריפוגה נוספת במהירות של 500,000 × גרם למשך 60 דקות. התקבל משקע (שבר P3) וסופרנאטנט (שבר S3), שהיוו 56.13% ± 2.12% או 9.01% ± 0.68% מכלל הטובולין במוחות העכברים, בהתאמה (איור 1B).

קליפת המוח המשמשת במחקר זה מכילה תאים עצביים ולא עצביים, כגון גליה. כדי להעריך באופן סלקטיבי את יציבות MT בתאי העצב במוחות של עכברים, כימתנו את TUBB3, תת-סוג טובולין המתבטא באופן בלעדי בתאי עצב במערכת העצבים המרכזית וההיקפית, על ידי כתם מערבי עם Tuj1 (נוגדן נגד TUBB3). אחוז TUBB3 בשבר P2, P3 או S3 היה 32.65% ± 2.20%, 59.31% ± 2.61%, או 8.04% ± 0.74%, בהתאמה. הם לא היו שונים באופן משמעותי מאלה של α-טובולין (איור 1B). תוצאות אלה הצביעו על כך שתאי עצב ותאי גלייה מפגינים יציבות MT דומה או שתאי עצב מכילים כמויות גבוהות בהרבה של טובולין מאשר תאי גלייה in vivo.

מאפייני טובולין התאושש בכל שבר
כאן, הומוגנט רקמת העכבר הופרד לשלושה שברים על ידי אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבית עם תאוצות כבידה שונות; לכן, מקדמי השקיעה בין חלבונים או קומפלקסים שלהם בכל שבר היו שונים. למרות שטובולין המואץ באולטרה-צנטריפוגה של 100,000 × גרם נחשב ל-MT קונבנציונלי, יש להבהיר כיצד הטובולין החדש שהתקבל של חלק P3 כאן שונה מזה של טובולין בשברים P2 ו-S3.

כדי לאפיין טובולין S3, החלק S2 (P3 + S3) או S3 היה נתון לאולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. קומפלקסי הטובולין במקטע S3 יכלו לעבור דרך עמודת ספין אולטרה-סינון של 300 kDa לחלוטין, בעוד שכמעט כל הטובולין במקטע S2 היה לכוד על המסנן (איור 2A). יתר על כן, המשקל המולקולרי של קומפלקסים טובולין בשבר S3 נמדד על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. טובולין S3 מדולל בשיא אחד המתאים ל-100 kDa, בדומה לזה של דימרים מטוהרים מטוהרים הזמינים מסחרית (איור 2B,C). נוסף על כך, הפרופורציות של α ו-β-טובולין שנמצאו בכל שבר בשיטת השבר MT היו שוות (איור 2D). למעשה, הוכח כי α- ו- β- tubulin יכולים להתקיים מעט כמונומרים בתאים חיים24. עם זאת, אם לשפוט על פי הערך המשוער של kD (סדר nM) שדווח, וריכוז הטובולין שהתאושש בשבר S3 (~ 11 מיקרומטר), רוב הטובולין (> 98%) נחשב לקיים כ-α/β-דימרים. לכן, טובולין בחלק S3 הוא בעיקר דימר מסיס α/β-טובולין.

פולימרי הטובולין הופרדו לשני שברים, P2 ו-P3, בהתבסס על השינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM). כדי להבדיל בין שברים אלה, בוצעה הכתמה מערבית באמצעות נוגדנים ספציפיים. נוגדן α-טובולין נגד אצטילציה, המשמש סמן ל-MTs יציבים, הראה כי מקטע P2 הועשר באופן משמעותי ב-97.40% ±-0.52% של α-טובולין שעבר אצטילציה (איור 2E), בעוד שסך ה-α-טובולין נמצא בשברים P3 ו-S3 (איור 1B). לעומת זאת, נוגדן α-טובולין נגד טירוזין, המעיד על MTs שפתיים, גילה כי 75.43% ±-2.69% מה-α-טובולין שעבר טירוזין היה נוכח בחלק P3 (איור 2F). ממצאים אלה מאשרים כי מקטע P2 מכיל בעיקר טובולין בתוך MTs יציבים, בעוד שחלק P3 מכיל טובולין בתוך MTs לאביליים.

הערכת יציבות MT תחת הקפאה וטיפול nocodazole
ההשפעה של הקפאה וטיפול בנוקודזול על יציבות MTs תוך-מוחיים בעכברים נותחה כדי לקבוע אם ניתן להבחין בשינויים חולפים ביציבות של MTs בשיטת שבר MT. MTs בדרך כלל מתפרקים בטמפרטורות נמוכות, אך חלק מה- MTs נשארים יציבים בקור. לאחר שקילת המוחות, הם הוקפאו בחנקן נוזלי והושמו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. המוח הקפוא הארעי והמוח הגולמי כבקרה עברו הומוגניות וחולקו לשברים P2, P3 ו-S3. לאחר מכן, שיעור הטובולין הכלול בשלושת השברים כומת על ידי כתם מערבי. ברגע שהמוח קפא לפני ההומוגניזציה, α-טובולין בחלק P2 ירד, וזה במקטע P3 גדל בהשוואה לזה שבמוח הגולמי (איור 3A). כתמים עם 6-11B1 (אצטילציה α-טובולין) או 1A2 (טירוזין α-טובולין) גילו גם שהקפאה מוחית הפחיתה את רמת האצטילציה (איור 3B) והעלתה את רמת הטירוזינציה (איור 3C) של α-טובולין בחלק P2.

Nocodazole הוא סוכן מיקוד microtubule (MTA) המונע פילמור MT על ידי קשירה β-tubulin ומקדם depolymerization MT. מוחות עכברים עברו הומוגניות ב-MSB(+) נטול טקסול עם או בלי 10 מיקרומטר נוקודזול והונחו בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות. ההומוגנאט שלא טופל או טופל בנוקודזול נוסף לטקסול של 10 מיקרומטר, הומוגני מחדש וחולק לשברים P2, P3 ו-S3. לאחר מכן, שיעור הטובולין הכלול בשלושת השברים כומת על ידי כתם מערבי. כתמים עם DM1A (α-tubulin) הראו כי α-tubulin בחלק P2 ירד, וכי בחלק P3 נטו לעלות עם טיפול nocodazole (איור 3D). תוצאות אלה מצביעות על כך שטובולין P2 התערער בתגובה לטמפרטורה נמוכה או נוקודזול, וכי החלק P2 הכיל MTs חזקים שעמדו בתנאי הניסוי. בניגוד להקפאה, נוקודזול לא השפיע על טובולין PTM (איור 3E,F). בהתבסס על התוצאות והנתונים לעיל, ניתן להעריך את דה-פולימריזציה של MTs שלא ניתן לזהות על ידי ניתוח PTM בשיטה זו.

השוואה בין היחס בין MTs יציבים, MTs labile וטובולין חופשי ברקמות
היציבות של MTs משתנה בין רקמות שונות, בהתאם ליכולת ההתרבות של התאים בתוך רקמות אלה. יש לציין כי MTs יציבים נפוצים יותר במערכת העצבים, המורכבת בעיקר מנוירונים לא מתרבים, בהשוואה לרקמות אחרות4. כדי להעריך את יכולתה של שיטת שבירת MT שפותחה להבחין בהבדלים ביציבות MT בין רקמות שונות, הכבדים והתימי של עכברים חולקו, והטובולין שהתאושש בכל שבר כומת. התוצאות הראו כי בהשוואה לרקמות אחרות, המוח הציג רמה גבוהה משמעותית של טובולינים P2, בעוד שטובולינים P3 הועשרו באופן בולט ברקמות המכילות תאים מתרבים (איור 4). בנוסף, בדיקות מערביות באמצעות נוגדנים 6-11B1 ו-1A2 אישרו נוכחות של יציבות MT גבוהה יותר במערכת העצבים. דפוסי הפיזור הברורים של טובולין PTM הצביעו בבירור על כך שטובולין P2 שנמצא באופן ספציפי במערכת העצבים מקורו ב-MTs יציבים (איור 4). ממצאים אלה תומכים עוד יותר ברעיון כי שברי P2 ו- P3 תואמים MTs יציבים ושבריריים, בהתאמה.

Figure 1
איור 1: כימות של טובולין ברקמת עכבר באמצעות שיטת השבר MT. (A) סיכום שיטת שבירת MT לרקמות. MTs יציבים (מקטע P2), MTs labile (חלק P3) וטובולין חופשי (חלק S3) ברקמות ניתנים להפרדה על ידי אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבית בתנאים המדכאים פילמור MT ודה-פולימריזציה במהלך ההכנה. (B) MTs בקליפת המוח של העכבר הואצו על-ידי אולטרה-צנטריפוגה קונבנציונלית של 100,000 × גרם ואחריה אולטרה-צנטריפוגה של 500,000 × גרם . לאחר מכן, טובולינים שהופרדו לשברים P2, P3 ו-S3 כומתו על ידי כתם מערבי עם DM1A (α-טובולין) ואנטי-Tuj1 (TUBB3). היחס בין החלבונים בכל שבר (P2, P3 או S3) לשבר הכולל (P2 + P3 + S3) חושב כמתואר בסעיף הפרוטוקול (פירושו ± SDs, n = 4). נתון זה שונה מ- Hagita et al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיטת השבר MT מאפשרת הפרדה של MTs יציבים, MTs שפתיים וטובולין חופשי בקליפת המוח של העכבר. (A) שברי S2 או S3 (קלט) נותחו על-ידי בדיקת מלכודת המסנן באמצעות עמודת ספין אולטרה-סינון של 300 kDa. טובולינים שהתקבלו על ידי סינון (מקלט) ולכידה (מאגר) כומתו על ידי כתם מערבי עם DM1A (α-טובולין). (B) טובולינים חזיריים מטוהרים עברו את שיטת השבר MT ונמצאו נאספים בעיקר במקטע S3. (C) גודל מולקולרי של טובולין במקטע S3. שבר S3 הופרד על ידי כרומטוגרפיית אי הכללת גודל באמצעות עמודת כרומטוגרפיית סינון ג'ל. החלבונים בכל חלק כומתו על ידי כתם מערבי עם DM1A (α-טובולין) ו-KMX-1 (β-טובולין). המשקל המולקולרי התיאורטי מוצג בחלק העליון של הלוחות. (D) הפרופורציות של α-טובולין ו-β-טובולין בכל שבר היו שוות. טובולינים שהופרדו לשברים P2, P3 ו-S3 כומתו על ידי כתם מערבי עם KMX-1 (β-טובולין). כימות חלקם של α-טובולין ו-β-טובולין בכל שבר ביחס לסכום השבר הכולל (פירושו ± SDs, n = 4). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו על ידי מבחן t של סטודנט. (ה,ו) השינויים של α-טובולין בשברים P2, P3 ו-S3 אומתו על ידי כתם מערבי עם 6-11B1 (אצטילאט α-טובולין: E) ו-1A2 (טירוזין α-טובולין: F). כימות היחס של טירוזין או אצטילאט α-טובולין בכל שבר ביחס לשבר הכולל (פירושו ± SDs, n = 4). (A-C) שונו מ-Hagita et al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכה של דה-פולימריזציה של MT הנגרמת על-ידי הקפאה או MTA. (A-C) הוערכה היציבות של MT לאחר 30 דקות של הקפאה בטמפרטורה של -80°C. הפרופורציות של טובולין הכלולות בשלושת השברים של המוח הגולמי והקפוא כומתו על ידי כתם מערבי עם DM1A (α-טובולין: A), 1A2 (טירוזין α-טובולין: B) ו-6-11B1 (אצטילאט α-טובולין: C). (D-F) ההשפעה של nocodazole על יציבות MT הוערך. הפרופורציות של טובולין הכלולות בשלושת השברים של מוחות נוקודזול שלא טופלו או טופלו כומתו על ידי כתם מערבי עם DM1A (α-טובולין: D), 1A2 (טירוזין α-טובולין: E) ו-6-11B1 (אצטילציה α-טובולין: F). רמות יחסיות מייצגות של טירוזינציה (B,E) או אצטילציה (C,F) נורמלו לכמות הכוללת של α-טובולין (A,D ) (פירושו ± SDs, n = 4). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו על ידי מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פרופורציות של MTs יציבים, MTs לאבליים וטובולין חופשי במוח, בכבד ובבלוטת התימוס בעכבר. המוחות, הכבדים והתימי של עכברים נותחו ועברו את שיטת השבר MT. חלבונים שהופרדו לכל חלק כומתו על ידי כתם מערבי עם DM1A (α-טובולין), 6-11B1 (אצטילט α-טובולין) ו-1A2 (טירוזין α-טובולין). היחס בין החלבונים בכל שבר (P2, P3 או S3) לשבר הכולל (P2 + P3 + S3) חושב כמתואר בסעיף הפרוטוקול (פירושו ± SDs, n = 4). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו על ידי ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המשימה המשמעותית ביותר בעת חקירת מצב טובולין ברקמה מאורגניזמים חיים היא מניעת פילמור MT בשוגג או דה-פולימריזציה במהלך ההכנה. יציבות MTs בדגימות מושפעת מגורמים כגון ריכוז טקסול ב- MSB, שיעור כמות הרקמה לחיץ, והטמפרטורה בתהליך מהסרת רקמות להומוגניזציה וצנטריפוגה. לכן, התנאים היו אופטימליים בכל שלב של הפרוטוקול לניתוח רקמת עכבר עם נפח 20 פעמים של הומוגנאט. ריכוז גבוה יותר של טקסול יכול לגרום לפילמור MT במבחנה, אפילו בתנאים צוננים25. בעת ניתוח רקמות עם ריכוזי טובולין שונים באופן משמעותי או ביצוע שינויים משמעותיים בפרוטוקול, כל מפעיל צריך לייעל את השלבים בהתאם למטרות הספציפיות של הניסויים שלהם.

במחקר שנערך התקבלה אוכלוסייה חדשה של MTs, המכונה P3, מ"החלק המסיס" הקונבנציונלי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ב-500,000 × גרם20. חישובים תיאורטיים המבוססים על גורמים כגון פקטור K של הרוטור, הכוח הצנטריפוגלי ומשך הצנטריפוגה מצביעים על כך שהטובולינים הנמצאים בשבר S3 מייצגים ככל הנראה דימרים של טובולין 6S. לעומת זאת, טובולין בשבר P3 עשוי להתאים ל-MTs קצרים יותר באורכם בהשוואה לאלה הנמצאים במקטע P2. תצפית זו מתיישבת עם התוצאה המראה כי הקפאת רקמות לפני הומוגניזציה, אשר הובילה לקריסה חלקית של MTs26, הביאה לעלייה משמעותית בטובולין בתוך חלק P3 ולירידה במקביל במקטע P2 (איור 3A). יתר על כן, ניתוח של tubulin PTMs ואת תכונות הקישור של MAPs שונים מצביעים על כך שחלק P2 או P3 מכיל MTs יציבים או labile, בהתאמה. לדוגמה, מפות מסוימות ספציפיות ל-MTs יציבים, שנמצאו בעיקר בתאי עצב, היו קיימות באופן בלעדי במקטע P223. כתוצאה מכך, סביר להציע כי מקטע P3 מורכב MTs שהם דינמיים יותר וגמישים יותר בהשוואה לאלה בשבר P2.

על פי התיאוריה העומדת בבסיס השיטה, תנאי ניסוי בלתי הולמים המעורבים בייצוב MT או בצנטריפוגה עלולים לגרום לשבירה גרועה. לדוגמה, ריכוז נמוך של טקסול מוביל לירידה קלה בטובולין P2, בעוד שעודף טקסול מעלה את P2 טובולין עקב היווצרות MT במהלך הכנה23. באופן דומה, חימום רקמות ודגימות באופן לא הולם יכול לגרום MTs hyperpolymerize ו tau להתפרק או שבר23. יתר על כן, התנאים הצנטריפוגליים קריטיים להפרדת שברי P3 ו-S3, וירידה קלה בתאוצת הכבידה מפחיתה משמעותית את התאוששות מקטע ה-P3. לכן, מומלץ להקפיד על שלבי הפרוטוקול אם נצפים שברים חריגים.

שיטת שבירה פשוטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לנתח את הפרופורציות של טובולינים בין MTs יציבים, MTs labile ודימרים חופשיים ברקמות. שיטה זו מציעה מספר יתרונות, שכן היא יכולה לזהות שינויים עדינים במצב טובולין שאולי לא נראים לעין באמצעות כימות של טובולין PTM. ניתוח יציבות MT חשוב להבנת המשמעות הפיזיולוגית של MTs, במיוחד בתאים עצביים גדולים ומורכבים, ולחקירת הפרעות הקשורות לחוסר ויסות MT. מוטציות או תפקוד לקוי בגנים טובולין או MAP, למשל, קשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירודגנרטיביות27,28. במחלת אלצהיימר, MTs ידועים כמופחתים, אולי בגלל אובדן תפקודי של חלבון טאו בנוירונים מושפעים 15,29,30,31,32,33. MTAs המווסתים את יציבות MT ומעכבים חלוקת תאים הוצעו כטיפולים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות13,34. שימוש בשיטת שבר MT ייחודית זו לניתוח היציבות וההתנהגות של MTs ו- MAPs בחיות מודל מחלה יכול לתרום באופן משמעותי להבהרת הפתוגנזה של דמנציה הקשורה לטאו ולזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי JST הקמת מלגות אוניברסיטאיות ליצירת חדשנות טכנולוגית מדעית (A.HT.; JPMJFS2145), JST אביב (A.HT.; JPMJSP2129), מענק סיוע לעמיתי JSPS (A.HT; 23KJ2078), מענק סיוע למחקר מדעי (B) JSPS KAKENHI (22H02946 עבור מדיטציה טרנסנדנטלית), מענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים שכותרתו "הזדקנות חלבון המוח ובקרת דמנציה" מ-MEXT (TM; 26117004), ומלגת מחקר של Uehara מקרן הזיכרון של אואהארה (TM; 202020027). המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500 Beckman Coulter 357448
1A2 Sigma-Aldrich T9028 1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Nacalai Tesque 02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column Aproscience PT-1013
6-11B1 Sigma-Aldrich T7451 1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus Cytiva 11001313
anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-035-146 1:5,000 dilution
antipain Peptide Institute Inc. 4062
aprotinin Nacalai Tesque 03346-84
Chemi-Lumi One L Nacalai Tesque 07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system Corning 430758 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP Sigma-Aldrich 55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 AS ONE 1-2050-11
DM1A Sigma-Aldrich T9026 1:5,000 dilution
DTT Nacalai Tesque 14128-46
EGTA Nacalai Tesque 37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll Pall Corporation BSP0161
glycerol Nacalai Tesque 17018-25
GTP Nacalai Tesque 17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman TOMY KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column Cytiva 28-9893-35
Image Gauge Software  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation 292-69903
KMX-1 Millipore MAB3408 1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin Peptide Institute Inc. 43449-62
MgSO4 Nacalai Tesque 21003-75
Na3VO4 Nacalai Tesque 32013-92
NaF Nacalai Tesque 31420-82
okadaic acid LC Laboratories O-2220 
OPTIMA MAX-XP Beckman Coulter 393315
pepstatin Nacalai Tesque 26436-52
PMSF Nacalai Tesque 27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 Beckman Coulter 343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) Roche 11873580001
Purified tubulin  Cytoskeleton T240
QSONICA Q55 QSonica Q55
Taxol LC Laboratories P-9600
TLA-120.2 rotor Beckman Coulter 357656
TLA-55 rotor Beckman Coulter 366725
TLCK Nacalai Tesque 34219-94
Triton X-100 Nacalai Tesque 12967-45
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 201 טובולין מיקרוטובול שפתיים מיקרוטובול יציב שינוי לאחר תרגום חלבון הקשור למיקרוטובול שבר סוכני מיקוד מיקרוטובול
טכניקת שבירת מיקרוטובולים כמותית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T.… More

Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T. Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (201), e63358, doi:10.3791/63358 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter