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Biochemistry

माउस ऊतकों में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, लैबिल माइक्रोट्यूबुल्स और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने के लिए मात्रात्मक सूक्ष्मनलिका विभाजन तकनीक

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/63358
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

Summary

माइक्रोट्यूबुल्स, जो ट्यूबुलिन पॉलिमर हैं, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में साइटोस्केलेटन घटक के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और उनकी गतिशील अस्थिरता के लिए जाने जाते हैं। इस अध्ययन ने विभिन्न माउस ऊतकों में सूक्ष्मनलिकाएं की स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए उन्हें स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं और मुक्त ट्यूबुलिन में अलग करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं अलग करने के लिए एक विधि विकसित की।

Abstract

α β-ट्यूबुलिन डिमर से बने सूक्ष्मनलिकाएं, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में साइटोस्केलेटन का एक महत्वपूर्ण घटक हैं। ये ट्यूब जैसे पॉलिमर गतिशील अस्थिरता प्रदर्शित करते हैं क्योंकि ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर सबयूनिट्स दोहराए जाने वाले पोलीमराइजेशन और डिपोलीमराइजेशन से गुजरते हैं। ट्यूबुलिन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन के माध्यम से प्राप्त सूक्ष्मनलिका स्थिरता और गतिशीलता का सटीक नियंत्रण, विभिन्न सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक है। सूक्ष्मनलिकाएं में शिथिलता को रोगजनन में दृढ़ता से फंसाया जाता है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार शामिल हैं। चल रहे शोध सूक्ष्मनलिका-लक्ष्यीकरण चिकित्सीय एजेंटों पर केंद्रित हैं जो स्थिरता को संशोधित करते हैं, इन बीमारियों और कैंसर के लिए संभावित उपचार विकल्प प्रदान करते हैं। नतीजतन, सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशील स्थिति को समझना रोग की प्रगति और चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

परंपरागत रूप से, सूक्ष्मनलिका की गतिशीलता का मूल्यांकन विट्रो या सुसंस्कृत कोशिकाओं में रफ फ्रैक्शनेशन या इम्यूनोएसे के माध्यम से किया गया है, जिसमें ट्यूबुलिन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया गया है। हालांकि, ऐसी प्रक्रियाओं का उपयोग करके ऊतकों में ट्यूबुलिन की स्थिति का सटीक विश्लेषण करना चुनौतियों का सामना करता है। इस अध्ययन में, हमने माउस ऊतकों में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने के लिए एक सरल और अभिनव सूक्ष्मनलिका विभाजन विधि विकसित की।

इस प्रक्रिया में 19: 1 वॉल्यूम अनुपात पर सूक्ष्मनलिका-स्थिर बफर में विच्छेदित माउस ऊतकों को होमोजेनाइज करना शामिल था। मलबे को हटाने के लिए प्रारंभिक धीमी सेंट्रीफ्यूजेशन (2,400 × ग्राम) के बाद दो-चरण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया के माध्यम से होमोजेनेट्स को अलग किया गया था। पहले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण (100,000 × ग्राम) ने स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं अवक्षेपित कीं, जबकि परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला को दूसरे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण (500,000 × ग्राम) के अधीन किया गया ताकि लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं और घुलनशील ट्यूबुलिन डिमर को अलग किया जा सके। इस विधि ने माउस मस्तिष्क में स्थिर या लेबिल सूक्ष्मनलिकाएं बनाने वाले ट्यूबुलिन के अनुपात को निर्धारित किया। इसके अतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका स्थिरता में अलग-अलग ऊतक भिन्नताएं देखी गईं जो घटक कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव क्षमता के साथ सहसंबद्ध थीं। ये निष्कर्ष शारीरिक और रोग स्थितियों में सूक्ष्मनलिका स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए इस नई विधि की महत्वपूर्ण क्षमता को उजागर करते हैं।

Introduction

सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) लम्बी ट्यूबलर संरचनाएं हैं जिनमें α/β-ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर सबयूनिट्स से युक्त प्रोटोफिलामेंट्स शामिल हैं। वे विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे कोशिका विभाजन, गतिशीलता, आकार रखरखाव और इंट्रासेल्युलर परिवहन में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे वे यूकेरियोटिक साइटोस्केलेटन1 के अभिन्न घटक बन जाते हैं। एमटी का माइनस-एंड, जहां α-ट्यूबुलिन सबयूनिट उजागर होता है, अपेक्षाकृत स्थिर होता है, जबकि प्लस-एंड, जहां β-ट्यूबुलिन सबयूनिट उजागर होता है, गतिशील डीपोलीमराइजेशन और पोलीमराइजेशन2 से गुजरता है। प्लस-एंड पर ट्यूबुलिन डिमर जोड़ और पृथक्करण का यह निरंतर चक्र, जिसे गतिशील अस्थिरता के रूप में जाना जाता है, के परिणामस्वरूप बचाव और तबाही की दोहराव वाली प्रक्रिया होतीहै। एमटी गतिशील अस्थिरता में स्थानीयकृत विविधताओं के साथ फोकल डोमेन प्रदर्शित करते हैं, जिसमें स्थिर और लेबिल डोमेनशामिल हैं।

एमटी की गतिशील अस्थिरता का सटीक नियंत्रण कई सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जटिल आकृति विज्ञान की विशेषता वाले न्यूरॉन्स में। एमटी की अनुकूलनशीलता और स्थायित्वतंत्रिका कोशिकाओं के विकास और उचित कार्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमटी की गतिशील अस्थिरता ट्यूबुलिन के विभिन्न पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) से जुड़ी हुई पाई गई है, जैसे कि एसिटिलीकरण, फॉस्फोराइलेशन, पामिटोनाइलेशन, डिटायरोसिनेशन, डेल्टा 2, पॉलीग्लूटामाइन ऑक्सीकरण, और पॉलीग्लाइसिलेशन। इसके अतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) का बंधन एक नियामक तंत्र8 के रूप में कार्य करता है। एसिटिलीकरण को छोड़कर पीटीएम, मुख्य रूप से एमटी की बाहरी सतह पर स्थित ट्यूबुलिन कार्बोक्सी-टर्मिनल क्षेत्र में होते हैं। ये संशोधन एमटी पर विविध सतह की स्थिति बनाते हैं, एमएपी के साथ उनकी बातचीत को प्रभावित करते हैं और अंततः एमटी स्थिरताको नियंत्रित करते हैं। α-ट्यूबुलिन में कार्बोक्सी-टर्मिनल टायरोसिन अवशेष की उपस्थिति गतिशील एमटी का संकेत है, जो तेजी से मुक्त ट्यूबुलिन पूल द्वारा प्रतिस्थापित की जाती है। इसके विपरीत, कार्बोक्सी टर्मिनस का विघटन और लिस 40 का एसिटिलीकरण कम गतिशील अस्थिरता 9,10 के साथ स्थिर एमटी का संकेत देता है।

ट्यूबुलिन के पीटीएम को एमटी 5,7,11,12,13,14,15 की गतिशीलता और स्थिरता का आकलन करने के लिए प्रयोगों में बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। उदाहरण के लिए, सेल कल्चर अध्ययन में, ट्यूबुलिन को दो पूलों में अलग किया जा सकता है: मुक्त ट्यूबुलिन पूल और एमटी पूल। यह शेष एमटी15,16,17,18,19 को ठीक करने से पहले सेल परमेबिलाइजेशन के माध्यम से मुक्त ट्यूबुलिन जारी करके प्राप्त किया जाता है। जैव रासायनिक विधियों में रासायनिक एमटी स्टेबलाइजर्स का उपयोग शामिल है जो एमटी को तबाही से बचाता है, सेंट्रीफ्यूजेशन20,21,22 के माध्यम से एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने में सक्षम बनाता है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं स्थिर और कम स्थिर (लेबिल) एमटी के बीच अंतर नहीं करती हैं, जिससे मस्तिष्क जैसे ऊतकों में एमटी या घुलनशील ट्यूबुलिन की मात्रा निर्धारित करना असंभव हो जाता है। नतीजतन, शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत जीवों में एमटी स्थिरता का मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। इस प्रयोगात्मक सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने माउस ऊतक23 में एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को ठीक से अलग करने के लिए एक नई तकनीक विकसित की है।

इस अद्वितीय एमटी फ्रैक्शनेशन विधि में ऊतकों में ट्यूबुलिन की स्थिति बनाए रखने वाली स्थितियों के तहत ऊतक समरूपीकरण और स्थिर एमटी, लेबिल एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने के लिए दो-चरण सेंट्रीफ्यूजेशन शामिल है। इस सरल प्रक्रिया को व्यापक अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें जीवित जीवों में एमटी और एमएपी पर बुनियादी शोध, एमटी स्थिरता से जुड़े स्वास्थ्य और बीमारियों के शारीरिक और पैथोलॉजिकल विश्लेषण, और एमटी को लक्षित करने वाली दवाओं और अन्य चिकित्सीय दवाओं को विकसित करना शामिल है।

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Protocol

1. एमटी फ्रैक्शनेशन विधि

नोट: इस अध्ययन में किए गए सभी प्रयोगों को दोशीशा विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। 3-4 महीने की उम्र के किसी भी लिंग के C57BL/6J चूहों का उपयोग यहां किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, विच्छेदित ऊतकों, जैसे, मस्तिष्क, यकृत, या थाइमस, को तुरंत बर्फ-ठंडे सूक्ष्मनलिका स्थिरीकरण बफर (एमएसबी) में समरूप किया गया था, जिसमें एक एकाग्रता पर टैक्सोल (एमटी स्टेबलाइजर) शामिल था जो न केवल डिपोलीमराइजेशन को रोकता था बल्कि एमटी के पुन: पोलीमराइजेशन को भी रोकता था। होमोजेनेट को दो-चरण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया (चित्रा 1) द्वारा तीन अंशों में विभाजित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों को ठंडे तापमान वाले वातावरण में रुकावट के बिना पूरा किया गया था, और ऊतकों और अंशों को तब तक जमे नहीं हुए थे जब तक कि वे सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) -नमूना बफर में भंग नहीं हो गए थे।

  1. एमएसबी और माइक्रोट्यूब की तैयारी
    1. एमएसबी तैयार करने के लिए, निम्नलिखित अभिकर्मकों को मिलाएं: 0.1 एम 2-(एन-मोर्फोलिनो) एथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस), पीएच 6.8 (केओएच द्वारा बेअसर), 10% ग्लिसरॉल, 0.1 एमएम डीटीटी, 1 एमएम एमजीएसओ 4, 1 एमएम ईजीटीए, 0.5% ट्राइटन एक्स -100, फॉस्फेटइनहिबिटर (1 एमएम एनएएफ, 1 एमएम β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 1 एमएम एनए 3 वीओ 4, 0.5 एमएम ओकेडक एसिड, 1 एमएम एनए3वीओ 4, 0.5 एमएम ओकेडइक एसिड, 1 एमएम एनए 3 वीओ 4, 0.5 एमएम ओकेडइक एसिड, 1 एमएम एनए 3 वीओ 4, 0.5 एमएम ओकेडइक एसिड, 1 एमएम एनए 3 वीओ 4, 0.5 एम प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल, 1 एमएम एनए 3 वीओ 4, 0.5 एम और प्रोटीज अवरोधक (0.1 एमएम पीएमएसएफ, 0.1 एमएम डीआईएफपी, 1 μg / mL पेप्स्टैटिन, 1 μg / mL एंटीपेन, 10 μg / mL एप्रोटिनिन, 10 μg / mL ल्यूपेप्टिन, 50 μg / mL TLCK) (सामग्री की तालिका देखें) और एमएसबी (-) के रूप में निरूपित करें।
    2. ऊतक विच्छेदन से ठीक पहले, एमएसबी (-) में 10 μM Taxol और 2 mM GTP ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। इस बफर को MSB(+) के रूप में निरूपित किया जाता है। उपयोग के दिन बफर तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें।
    3. नमूने के लिए माइक्रोट्यूब तैयार करें। होमोजेनेट भंडारण के लिए खाली 2.0 एमएल माइक्रोट्यूब; सुपरनैटेंट 1 (एस 1) लाइसेट, अवक्षेप 2 (पी 2) नमूना, और अवक्षेप 3 (पी 3) नमूना भंडारण के लिए खाली 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब; विच्छेदित ऊतक भंडारण के लिए 1.5 एमएल बर्फ-कोल्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब; एस 1 नमूने और सुपरनैटेंट 3 (एस 3) नमूना भंडारण के लिए 2एक्स एसडीएस-नमूना बफर (0.16 एम ट्रिस पीएच 6.8; 20% ग्लिसरॉल; 2% 2-मर्कैप्टोइथेनॉल; 4% एसडीएस) के 200 μL के साथ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब; और टीएलए 55 और टीएलए 120.2 सेंट्रीफ्यूज रोटर के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन माइक्रोट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें)। सभी ट्यूबों को लेबल करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
  2. माउस ऊतक समरूपीकरण।
    1. ऊतक विच्छेदन के लिए एक ठंडी तालिका तैयार करें। सबसे पहले, कुचल बर्फ के साथ एक बॉक्स भरें और बर्फ पर दो पेट्री व्यंजन रखें, एक आंतरिक पक्ष के साथ और दूसरा बाहरी पक्ष के साथ। विच्छेदित ऊतकों के क्षणिक धोने और भंडारण के लिए एक डिश में बर्फ-ठंडा पीबीएस भरें। एक अन्य डिश पर पीबीएस के साथ गीला फिल्टर पेपर बिछाएं।
    2. माउस का बलिदान करने के लिए, ब्यूट्रोफानॉल, मिडाज़ोलम और मेडेटोमिडीन के मिश्रित एनेस्थेटिक के साथ गहरे संज्ञाहरण के तहत ग्रीवा अव्यवस्था करें। फिर, तुरंत ऊतकों को विच्छेदित करें, जैसे, मस्तिष्क, यकृत, या थाइमस, और उन्हें पेट्री डिश में बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ धोएं।
      नोट: इस विधि द्वारा किसी भी प्रकार के नरम ऊतक का विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, ऊतक का आकार उपयोग किए गए होमोजिनाइज़र की अनुशंसित मात्रा सीमा से सीमित है। उदाहरण के लिए, यदि होमोजिनाइज़र की 2 एमएल मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो 50-100 मिलीग्राम ऊतक की सिफारिश की जाती है।
    3. विच्छेदित ऊतक भंडारण के लिए पीबीएस से भरे 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब का वजन करने के बाद, माइक्रोट्यूब के अंदर ऊतकों को काट लें और स्टोर करें, और प्रत्येक माइक्रोट्यूब को फिर से तौलें। ऊतक जोड़े जाने से पहले और बाद में ट्यूब के वजन को घटाकर प्रत्येक ऊतक के गीले वजन की गणना की जा सकती है।
    4. तुरंत बर्फ के ठंडे एमएसबी (+) में ऊतक को ठंडा होमोजिनाइज़र के साथ समरूप करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एमएसबी (+) की मात्रा ऊतक गीले वजन (मिलीग्राम) का 19 गुना (μL) थी। ऊतक के टुकड़े गायब होने तक 20 स्ट्रोक के साथ होमोजेनाइजेशन करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, 100 मिलीग्राम ऊतक के लिए एमएसबी (+) के 1,900 μL का उपयोग किया जाता है। चूंकि जोड़े जाने वाले एमएसबी (+) की मात्रा को विश्लेषण किए गए ऊतक टुकड़ों के प्रत्येक गीले वजन के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, इसलिए प्रत्येक ऊतक टुकड़े को सटीक रूप से तौलना आवश्यक है।
  3. माउस ऊतक होमोजेनेट्स का सेंट्रीफ्यूजेशन।
    1. वर्षा के माध्यम से मलबे को हटाने के लिए पूरे होमोजेनेट को पाश्चर पिपेट और सेंट्रीफ्यूज के साथ 2,400 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर 2 एमएल माइक्रोट्यूब में ले जाएं।
    2. पूरे सुपरनैटेंट (एस 1 अंश) को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब और भंवर में स्थानांतरित करें। फिर, एक सेंट्रीफ्यूजेशन माइक्रोट्यूब में एस 1 अंश के 200 μL और 100,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज को 2 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए टीएलए -55 रोटर का उपयोग करके अपेक्षाकृत बड़े आणविक भार प्रोटीन को अवक्षेप (पी 2 अंश) के रूप में प्राप्त करने के लिए 100,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के अधीन नमूने की मात्रा सेंट्रीफ्यूजेशन की त्रिज्या और अणुओं की वर्षा दक्षता को प्रभावित करती है। गलत फ्रैक्शनेशन को रोकने के लिए इस चरण के बाद नमूना मात्रा 200 μL या उससे कम रखें।
    3. इसके अलावा 500,000 × ग्राम पर सभी परिणामी सुपरनैटेंट (एस 2 अंश) को 2 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए टीएलए -120.2 रोटर का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला (एस 3 अंश) में घुलनशील प्रोटीन से अवक्षेप (पी 3 अंश) में अघुलनशील प्रोटीन को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. पी 2 और पी 3 अंश ट्यूबों में 1x SDS-नमूना बफर (0.08 M Tris pH 6.8; 10% ग्लिसरॉल; 1% 2-मर्कैप्टोइथेनॉल; 2% SDS) के 400 μL जोड़ें और अवक्षेप को भंग करने के लिए संक्षेप में सोनिकेटेड करें। इन अंश नमूनों को एक खाली 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 2x SDS-नमूना बफर के 200 μL में कुल S3 अंश को घोलें।
    6. पश्चिमी सोख्ता के लिए मानक वक्र के रूप में उपयोग के लिए शेष एस 1 अंशों को 2x SDS नमूना बफर की समान मात्रा के साथ मिलाएं।
    7. इन सभी नमूनों को 3 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। नमूने कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद, नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. प्रत्येक अंश में प्रोटीन का परिमाणीकरण।
    1. पश्चिमी सोख्ता द्वारा पी 2, पी 3 और एस 3 अंशों में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। सबसे पहले, पी 2, पी 3, और एस 3 अंशों से प्रोटीन को अलग करने के लिए 10% एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) का उपयोग करें, और मानक वक्र के रूप में किसी भी व्यक्ति से क्रमिक रूप से पतला एस 1 नमूना। फिर, पॉलीविनाइलिडेन फ्लोराइड झिल्ली पर नमूनों को इलेक्ट्रोब्लॉट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: प्रत्येक अंश का कमजोर पड़ने का अनुपात एक उद्देश्य प्रोटीन की एकाग्रता और एंटीबॉडी की प्रतिक्रियाशीलता पर निर्भर करता है। (उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों में α-ट्यूबुलिन, टीयूबीबी 3, β-टब और टायरोसिनेटेड ट्यूबुलिन: एस 3 = 1/400, पी 3 = 1/2,000, पी 2 = 1/2, 000, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000; मस्तिष्क के ऊतकों में एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8,000, S1 = 1/100,000, 1/40,000, 1/40,000, 1/20,000, 1/20,000, 1/20,000, 1/20,000; जिगर में α-ट्यूबुलिन: S3 = 1/20, P3 = 1/10, P2 = 1/50,000, 1/20,000, 1/20,000; थाइमस में α-ट्यूबुलिन: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000 ऊतक एकाग्रता का कमजोर पड़ना)।
    2. ट्रिस-बफर्ड सेलाइन (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.6; 152 एमएम एनएसीएल) में 5% स्किम्ड दूध के साथ झिल्ली को 0.1% ट्वीन 20 (टीबीएस-टी) के साथ 30 मिनट से अधिक समय तक अवरुद्ध करें।
    3. झिल्ली को टीबीएस-टी में प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त ( सामग्री की तालिका देखें) 2 घंटे से अधिक समय तक डुबोएं। उसके बाद, 3 मिनट (3 बार) के लिए टीबीएस-टी के साथ झिल्ली को धो लें।
    4. 1 घंटे से अधिक समय के लिए टीबीएस-टी में एचआरपी-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल करें। उसके बाद, 3 मिनट (3 बार) के लिए टीबीएस-टी के साथ झिल्ली को धो लें।
    5. एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस अभिकर्मक के साथ झिल्ली विकसित करें। फिर, एक लुमिनेसेंट छवि विश्लेषक के साथ रुचि के बैंड का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रोटीन बैंड तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें और एक्स-अक्ष के साथ मानक वक्र और वाई-अक्ष के साथ बैंड तीव्रता के लिए उपयोग किए जाने वाले पतला एस 1 नमूनों की कमजोर पड़ने वाली इकाइयों को प्लॉट करके एक मानक वक्र बनाएं।
    7. पतला अंश नमूने के अनुरूप प्रोटीन एकाग्रता (इकाई) पढ़ें। प्रत्येक अंश में एक प्रोटीन इकाई प्राप्त करने के लिए नमूना कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ पढ़ी गई एकाग्रता को गुणा करें। प्रतिशत प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अंश की मापी गई इकाई को कुल प्रोटीन इकाई (पी 2 + पी 3 + एस 3) से विभाजित करें।

2. प्रत्येक अंश में ट्यूबुलिन के गुणों का मूल्यांकन

नोट: यह जैव रासायनिक विधि अवसादन गुणों द्वारा परिभाषित ट्यूबुलिन कॉम्प्लेक्स के तीन समूह प्रदान करती है। यहां, इन अंशों में प्राप्त ट्यूबुलिन कॉम्प्लेक्स की स्थिति को कॉम्प्लेक्स और ट्यूबुलिन-पीटीएम के आकार के आधार पर पहचाना गया था। ठंडे तापमान वाले वातावरण में रुकावट के बिना इस प्रोटोकॉल में सभी चरणों को पूरा करें, लेकिन अंश नमूनों को तब तक फ्रीज न करें जब तक कि वे एसडीएस-नमूना बफर में भंग न हो जाएं।

  1. फ़िल्टर जाल परख
    1. 300 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्पिन कॉलम का उपयोग करके एस 2 और एस 3 अंशों (500 μL प्रत्येक) को फ़िल्टर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 2 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 × ग्राम सेंट्रीफ्यूजेशन करें जब तक कि पूरे सुपरनैटेंट को फ़िल्टर नहीं किया जाता है, इल्यूटेड प्रोटीन रिसीवर ट्यूबों में एकत्र किए जाते हैं, और फंसे हुए प्रोटीन जलाशय ट्यूबों के फिल्टर पर रहते हैं।
    2. रिसीवर ट्यूबों में पूरे फिल्ट्रेट (लगभग 500 μL) को नए 1.5 mL माइक्रोट्यूब में अनुवाद करें और उन्हें 2x SDS-नमूना बफर के 500 μL में भंग करें।
    3. 1x SDS-नमूना बफर के 1,000 μL में जलाशय ट्यूबों के फ़िल्टर पर अवशेषों को पाइप िंग और नमूने को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करके घुलनशील करें।
    4. 3 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूने उबालें। नमूने कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद, नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. डीएम 1 ए (एंटी-α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा ट्यूबुलिन की मात्रा का विश्लेषण करें।
  2. आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी।
    1. वाहक बफर (0.1 एमईएस, पीएच 6.8; 10% ग्लिसरॉल; 1 एमएम एमजीएसओ4; 1 एमएम ईजीटीए; 0.1 एमएम डीटीटी) तैयार करें, जो चरण 1.1.1 में वर्णित प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर की 1/10 एकाग्रता के साथ पूरक है। फिर, घोल को छान लें और इसे ठंडे वातावरण में स्टोर करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर क्रोमैटोग्राफी कक्ष ( सामग्री की तालिका देखें) में एक प्रारंभिक तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली से लैस एक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी कॉलम तैयार करें।
    3. कॉलम पर नमूने इंजेक्ट करने से पहले, कॉलम को धोने के लिए वाहक बफर के 180 एमएल का प्रवाह करें। प्रवाह दर 3 घंटे के लिए 1 एमएल / मिनट है।
    4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध पोर्सिन ट्यूबुलिन ( सामग्री की तालिका देखें) को नियंत्रण के रूप में या माउस दिमाग (500 μL प्रत्येक) से S3 अंश को स्तंभ पर इंजेक्ट करें।
    5. वाहक बफर के साथ 1.0 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर। 120 मिनट के लिए 1.5 एमएल अंश एकत्र करें। 280 एनएम पर अवशोषण द्वारा प्रोटीन की निगरानी करें। अधिकतम दबाव 0.3 एमपीए से कम रखें।
    6. एकत्र किए गए अंशों को भंवर में डालने के बाद, उनमें से 50 μL को 1.5 mL माइक्रोट्यूब में 2x SDS-नमूना बफर के 50 μL के साथ मिलाएं। 3 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूने उबालें। नमूने कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद, नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. डीएम 1 ए, एंटी-α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी और केएमएक्स -1, एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा ट्यूबुलिन की मात्रा का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

एमटी फ्रैक्शनेशन विधि द्वारा माउस मस्तिष्क से पी 2, पी 3 और एस 3 अंशों में ट्यूबुलिन का परिमाणीकरण
माउस ऊतक में ट्यूबुलिन को एमटी फ्रैक्शनेशन विधि द्वारा पी 2, पी 3 और एस 3 अंशों में अलग किया गया था और पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 1 ए) द्वारा निर्धारित किया गया था। 20 मिनट के लिए 100,000 × ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पी 2 अंश में रहने वाले एमटी का अवक्षेप माउस मस्तिष्क में कुल ट्यूबुलिन का 34.86% ± 1.68% था। सुपरनैटेंट (एस 2) को 60 मिनट के लिए 500,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। एक अवक्षेप (पी 3 अंश) और एक सुपरनैटेंट (एस 3 अंश) प्राप्त किया गया था, जो माउस दिमाग में कुल ट्यूबुलिन का क्रमशः 56.13% ± 2.12% या 9.01% ± 0.68% था (चित्रा 1 बी)।

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सेरेब्रल कॉर्टेक्स में न्यूरोनल और नॉनन्यूरोनल कोशिकाएं होती हैं, जैसे कि ग्लिया। माउस दिमाग के न्यूरॉन्स में एमटी स्थिरता का चुनिंदा आकलन करने के लिए, हमने टीयूबी 3, एक ट्यूबुलिन उपप्रकार जो विशेष रूप से केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, को टुज 1 (एंटी-टीयूबीबी 3 एंटीबॉडी) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है। पी 2, पी 3, या एस 3 अंश में टीयूबीबी 3 का प्रतिशत क्रमशः 32.65% ± 2.20%, 59.31% ± 2.61%, या 8.04% ± 0.74% था। वे α-ट्यूबुलिन (चित्रा 1 बी) से काफी अलग नहीं थे। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाएं समान एमटी स्थिरता प्रदर्शित करती हैं या न्यूरॉन्स में विवो में ग्लियल कोशिकाओं की तुलना में ट्यूबुलिन की बहुत अधिक मात्रा होती है।

प्रत्येक अंश में बरामद ट्यूबुलिन के लक्षण
यहां, माउस ऊतक होमोजेनेट को विभिन्न गुरुत्वाकर्षण त्वरण के साथ दो-चरण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा तीन अंशों में विभाजित किया गया था; इसलिए, प्रत्येक अंश में प्रोटीन या उनके परिसरों के बीच अवसादन गुणांक भिन्न होते हैं। यद्यपि ट्यूबुलिन 100,000 × ग्राम अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पर अवक्षेपित था, लेकिन यहां पी 3 अंश का नया प्राप्त ट्यूबुलिन पी 2 और एस 3 अंशों में ट्यूबुलिन से कैसे भिन्न होता है, इसे स्पष्ट किया जाना चाहिए।

एस 3 ट्यूबुलिन को चिह्नित करने के लिए, एस 2 (पी 3 + एस 3) या एस 3 अंश को अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया था। एस 3 अंश में ट्यूबुलिन कॉम्प्लेक्स पूरी तरह से 300 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्पिन कॉलम से गुजर सकता है, जबकि एस 2 अंश में लगभग सभी ट्यूबुलिन फिल्टर पर फंस गए थे (चित्रा 2 ए)। इसके अलावा, एस 3 अंश में ट्यूबुलिन कॉम्प्लेक्स का आणविक भार आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा मापा गया था। एस 3 ट्यूबुलिन 100 केडीए के अनुरूप एक शिखर पर होता है, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध ट्यूबुलिन डिमर (चित्रा 2 बी, सी) के समान है। इसके अलावा, एमटी फ्रैक्शनेशन विधि द्वारा प्रत्येक अंश में बरामद α- और β-ट्यूबुलिन का अनुपात बराबर था (चित्रा 2 डी)। दरअसल, यह दिखाया गया है कि α- और β-ट्यूबुलिन जीवित कोशिकाओंमें मोनोमर्स के रूप में थोड़ा मौजूद हो सकते हैं। हालांकि, रिपोर्ट किए गए अनुमानित केडी मान (एनएम ऑर्डर) और एस 3 अंश (~ 11 μM) में बरामद ट्यूबुलिन की एकाग्रता को देखते हुए, अधिकांश (> 98%) ट्यूबुलिन को α / β-डिमर के रूप में मौजूद माना जाता है। इसलिए, एस 3 अंश में ट्यूबुलिन मुख्य रूप से एक घुलनशील α / β-ट्यूबुलिन डिमर है।

ट्यूबुलिन पॉलिमर को उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के आधार पर दो अंशों, पी 2 और पी 3 में विभाजित किया गया था। इन अंशों के बीच अंतर करने के लिए, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता किया गया था। एंटी-एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी, जो स्थिर एमटी के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है, ने प्रदर्शित किया कि पी 2 अंश एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन (चित्रा 2 ई) के 97.40% ± 0.52% के साथ काफी समृद्ध था, जबकि कुल α-ट्यूबुलिन पी 3 और एस 3 अंशों (चित्रा 1 बी) में बरामद किया गया था। इसके विपरीत, एंटी-टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी, जो लेबिल एमटी का संकेत है, ने खुलासा किया कि 75.43% ± 2.69% टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन पी 3 अंश (चित्रा 2 एफ) में मौजूद था। ये निष्कर्ष पुष्टि करते हैं कि पी 2 अंश में मुख्य रूप से स्थिर एमटी के भीतर ट्यूबुलिन होता है, जबकि पी 3 अंश में लेबिल एमटी के भीतर ट्यूबुलिन होता है।

फ्रीजिंग और नोकोडाज़ोल उपचार के तहत एमटी स्थिरता का आकलन।
माउस इंट्रासेरेब्रल एमटी की स्थिरता पर ठंड और नोकोडाज़ोल उपचार के प्रभाव का विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि एमटी की स्थिरता में क्षणिक परिवर्तन एमटी फ्रैक्शनेशन विधि द्वारा समझा जा सकता है या नहीं। एमटी आमतौर पर कम तापमान पर अलग हो जाते हैं, लेकिन कुछ एमटी ठंड में स्थिर रहते हैं। दिमाग का वजन करने के बाद, उन्हें तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे और 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। नियंत्रण के रूप में क्षणिक जमे हुए मस्तिष्क और कच्चे मस्तिष्क को समरूप किया गया और पी 2, पी 3 और एस 3 अंशों में विभाजित किया गया। फिर, तीन अंशों में निहित ट्यूबुलिन का अनुपात पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। एक बार जब मस्तिष्क होमोजेनाइजेशन से पहले जम गया था, तो पी 2 अंश में α-ट्यूबुलिन कम हो गया, और पी 3 अंश में कच्चे मस्तिष्क की तुलना में वृद्धि हुई (चित्रा 3 ए)। 6-11 बी 1 (एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन) या 1 ए 2 (टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन) वाले धब्बे से यह भी पता चला कि मस्तिष्क की ठंड ने एसिटिलीकरण स्तर (चित्रा 3 बी) को कम कर दिया और पी 2 अंश में α-ट्यूबुलिन के टायरोसिनेशन स्तर (चित्रा 3 सी) में वृद्धि की।

नोकोडाज़ोल एक सूक्ष्मनलिका-लक्ष्यीकरण एजेंट (एमटीए) है जो β-ट्यूबुलिन से बंधकर एमटी पोलीमराइजेशन को रोकता है और एमटी डीपोलीमराइजेशन को बढ़ावा देता है। माउस दिमाग को 10 μM nocodazole के साथ या उसके बिना टैक्सोल-मुक्त MSB (+) में समरूप किया गया था और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। गैर-उपचारित या नोकोडाज़ोल-उपचारित होमोजेनेट को 10 μM Taxol में जोड़ा गया, फिर से होमोजिनाइज़ किया गया, और P2, P3 और S3 अंशों में विभाजित किया गया। फिर, तीन अंशों में निहित ट्यूबुलिन का अनुपात पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन) के साथ ब्लॉट्स से पता चला है कि पी 2 अंश में α-ट्यूबुलिन कम हो गया है और पी 3 अंश में नोकोडाज़ोल उपचार (चित्रा 3 डी) के साथ वृद्धि हुई है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि पी 2 ट्यूबुलिन कम तापमान या नोकोडाज़ोल के जवाब में अस्थिर हो गया था और पी 2 अंश में मजबूत एमटी थे जो प्रयोगात्मक स्थितियों का विरोध करते थे। ठंड के विपरीत, नोकोडाज़ोल ने ट्यूबुलिन पीटीएम (चित्रा 3 ई, एफ) को प्रभावित नहीं किया। परिणामों और उपरोक्त आंकड़ों के आधार पर, एमटी के डीपोलीमराइजेशन का मूल्यांकन किया जा सकता है जिसे पीटीएम विश्लेषण द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है।

ऊतकों में स्थिर एमटी, लेबिल एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन के अनुपात की तुलना
एमटी की स्थिरता विभिन्न ऊतकों के बीच भिन्न होती है, जो उन ऊतकों के भीतर कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव क्षमता पर निर्भर करती है। विशेष रूप से, तंत्रिका तंत्र में स्थिर एमटी अधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं, जिसमें मुख्य रूप से अन्य ऊतकों की तुलना में नॉनप्रोलिफेरेटिव न्यूरॉन्सहोते हैं। विभिन्न ऊतकों में एमटी स्थिरता में अंतर को समझने के लिए विकसित एमटी फ्रैक्शनेशन विधि की क्षमता का आकलन करने के लिए, चूहों के यकृत और थाइमी को अलग किया गया था, और प्रत्येक अंश में बरामद ट्यूबुलिन की मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणामों से पता चला कि, अन्य ऊतकों की तुलना में, मस्तिष्क ने पी 2 ट्यूबुलिन के काफी उच्च स्तर का प्रदर्शन किया, जबकि पी 3 ट्यूबुलिन विशेष रूप से प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं वाले ऊतकों में समृद्ध थे (चित्रा 4)। इसके अतिरिक्त, 6-11 बी 1 और 1 ए 2 एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता ने तंत्रिका तंत्र में उच्च एमटी स्थिरता की उपस्थिति की पुष्टि की। ट्यूबुलिन पीटीएम के अलग-अलग वितरण पैटर्न ने स्पष्ट रूप से संकेत दिया कि विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र में पाए जाने वाले पी 2 ट्यूबुलिन की उत्पत्ति स्थिर एमटी (चित्रा 4) से हुई है। ये निष्कर्ष इस धारणा का समर्थन करते हैं कि पी 2 और पी 3 अंश क्रमशः स्थिर और लेबिल एमटी के अनुरूप हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एमटी फ्रैक्शनेशन विधि का उपयोग करके माउस ऊतक में ट्यूबुलिन का परिमाणीकरण। (ए) ऊतकों के लिए एमटी फ्रैक्शनेशन विधि का सारांश। ऊतकों में स्थिर एमटी (पी 2 अंश), लेबिल एमटी (पी 3 अंश), और मुक्त ट्यूबुलिन (एस 3 अंश) को तैयारी के दौरान एमटी पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन को दबाने वाली स्थितियों के तहत 2-चरण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जा सकता है। (बी) माउस कॉर्टेक्स में एमटी को पारंपरिक 100,000 × जी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अवक्षेपित किया गया था, जिसके बाद 500,000 × जी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन था। फिर, पी 2, पी 3 और एस 3 अंशों में अलग किए गए ट्यूबुलिन को डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन) और एंटी-ट्यूज 1 (टीयूबीबी 3) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा परिमाणित किया गया था। प्रत्येक अंश (पी 2, पी 3, या एस 3) में कुल अंश (पी 2 + पी 3 + एस 3) में प्रोटीन के अनुपात की गणना प्रोटोकॉल अनुभाग (± एसडी, एन = 4) में वर्णित के रूप में की गई थी। इस आंकड़े को Hagita et al.23 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमटी फ्रैक्शनेशन विधि माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स में स्थिर एमटी, लेबिल एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन को अलग करने में सक्षम बनाती है। (ए) एस 2 या एस 3 अंशों (इनपुट) का विश्लेषण फिल्टर ट्रैप परख द्वारा 300 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्पिन कॉलम का उपयोग करके किया गया था। निस्पंदन (रिसीवर) और ट्रैपिंग (जलाशय) द्वारा प्राप्त ट्यूबुलिन को डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। (बी) शुद्ध पोर्सिन ट्यूबुलिन को एमटी फ्रैक्शनेशन विधि के अधीन किया गया था और ज्यादातर एस 3 अंश में एकत्र किया गया था। (सी) एस 3 अंश में ट्यूबुलिन का आणविक आकार। एस 3 अंश को जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग करके आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया गया था। प्रत्येक अंश में प्रोटीन को डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन) और केएमएक्स -1 (β-ट्यूबुलिन) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। सैद्धांतिक आणविक भार पैनलों के शीर्ष पर दिखाया गया है। (डी) प्रत्येक अंश में α-ट्यूबुलिन और β-ट्यूबुलिन का अनुपात बराबर था। पी 2, पी 3 और एस 3 अंशों में अलग किए गए ट्यूबुलिन को केएमएक्स -1 (β-ट्यूबुलिन) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। कुल अंश के योग के सापेक्ष प्रत्येक अंश में α-ट्यूबुलिन और β-ट्यूबुलिन के अनुपात का परिमाणीकरण (± एसडी, एन = 4)। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया गया था। (E, F) पी 2, पी 3, और एस 3 अंशों में α-ट्यूबुलिन के संशोधनों को पश्चिमी सोख्ता द्वारा 6-11 बी 1 (एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन: ई) और 1 ए 2 (टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन: एफ) के साथ सत्यापित किया गया था। कुल अंश के सापेक्ष प्रत्येक अंश में टायरोसिनेटेड या एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन के अनुपात का परिमाणीकरण (± एसडी, एन = 4)। (ए-सी) को हागिता एट अल.23 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: फ्रीजिंग या एमटीए द्वारा प्रेरित एमटी डीपोलीमराइजेशन का आकलन (ए-सी) -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड के 30 मिनट के बाद एमटी की स्थिरता का मूल्यांकन किया गया था। कच्चे और जमे हुए मस्तिष्क के तीन अंशों में निहित ट्यूबुलिन के अनुपात को डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन: ए), 1 ए 2 (टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन: बी), और 6-11 बी 1 (एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन: सी) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। नोकोडाज़ोल अनुपचारित या उपचारित मस्तिष्क के तीन अंशों में निहित ट्यूबुलिन के अनुपात को पश्चिमी सोख्ता द्वारा डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन: डी), 1 ए 2 (टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन: ई), और 6-11 बी 1 (एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन: एफ) के साथ परिमाणित किया गया था। टायरोसिनेशन (बी, ई) या एसिटिलीकरण (सी, एफ) के प्रतिनिधि सापेक्ष स्तर को कुल α-ट्यूबुलिन (ए, डी) की मात्रा में सामान्यीकृत किया गया था। ) (इसका मतलब ± एसडी, एन = 4)। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस में मस्तिष्क, यकृत और थाइमस में स्थिर एमटी, लेबिल एमटी और मुक्त ट्यूबुलिन का अनुपात। चूहों के दिमाग, यकृत और थाइमी को विच्छेदित किया गया और एमटी फ्रैक्शनेशन विधि के अधीन किया गया। प्रत्येक अंश में अलग किए गए प्रोटीन को डीएम 1 ए (α-ट्यूबुलिन), 6-11 बी 1 (एसिटाइलेटेड α-ट्यूबुलिन), और 1 ए 2 (टायरोसिनेटेड α-ट्यूबुलिन) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। प्रत्येक अंश (पी 2, पी 3, या एस 3) में कुल अंश (पी 2 + पी 3 + एस 3) में प्रोटीन के अनुपात की गणना प्रोटोकॉल अनुभाग (± एसडी, एन = 4) में वर्णित के रूप में की गई थी। सांख्यिकीय विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया था, जिसके बाद टुकी का पोस्ट-हॉक परीक्षण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जीवित जीवों से ऊतक में ट्यूबुलिन की स्थिति की जांच करते समय सबसे महत्वपूर्ण कार्य तैयारी के दौरान आकस्मिक एमटी पोलीमराइजेशन या डीपोलीमराइजेशन को रोकना है। नमूनों में एमटी की स्थिरता एमएसबी में टैक्सोल की एकाग्रता, बफर में ऊतक की मात्रा का अनुपात, और ऊतक हटाने से होमोजेनाइजेशन और सेंट्रीफ्यूजेशन तक की प्रक्रिया के दौरान तापमान जैसे कारकों से प्रभावित होती है। इसलिए, होमोजेनेट की 20 गुना मात्रा के साथ माउस ऊतक का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में शर्तों को अनुकूलित किया गया था। टैक्सोल की उच्च सांद्रता इन विट्रो में एमटी पोलीमराइजेशन को प्रेरित कर सकती है, यहां तक किठंडी परिस्थितियों में भी। काफी अलग ट्यूबुलिन सांद्रता वाले ऊतकों का विश्लेषण करते समय या पर्याप्त प्रोटोकॉल संशोधन करते समय, प्रत्येक ऑपरेटर को अपने प्रयोगों के विशिष्ट उद्देश्यों के अनुसार चरणों को अनुकूलित करना चाहिए।

आयोजित अध्ययन में, एमटी की एक नई आबादी, जिसे पी 3 के रूप में संदर्भित किया गया था, को 500,000 × जी20 पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके पारंपरिक "घुलनशील अंश" से प्राप्त किया गया था। रोटर के के-कारक, केन्द्रापसारक बल और सेंट्रीफ्यूजेशन की अवधि जैसे कारकों के आधार पर सैद्धांतिक गणना से पता चलता है कि एस 3 अंश में मौजूद ट्यूबुलिन सबसे अधिक संभावना 6 एस ट्यूबुलिन डिमर का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके विपरीत, पी 3 अंश में ट्यूबुलिन एमटी के अनुरूप हो सकता है जो पी 2 अंश में पाए जाने वाले लोगों की तुलना में लंबाई में कम हैं। यह अवलोकन परिणाम के साथ संरेखित होता है कि होमोजेनाइजेशन से पहले ठंड के ऊतक, जो एमटी26 के आंशिक पतन की ओर जाता है, के परिणामस्वरूप पी 3 अंश के भीतर ट्यूबुलिन में उल्लेखनीय वृद्धि और पी 2 अंश में समवर्ती कमी होती है (चित्रा 3 ए)। इसके अलावा, ट्यूबुलिन पीटीएम के विश्लेषण और विभिन्न एमएपी के बाध्यकारी गुणों से संकेत मिलता है कि पी 2 या पी 3 अंश में क्रमशः स्थिर या लेबिल एमटी होते हैं। उदाहरण के लिए, स्थिर एमटी के लिए विशिष्ट कुछ एमएपी, मुख्य रूप से न्यूरॉन्स में पाए जाते हैं, विशेष रूप से पी 2 अंश23 में मौजूद थे। नतीजतन, यह सुझाव देना प्रशंसनीय है कि पी 3 अंश में एमटी शामिल हैं जो पी 2 अंश की तुलना में अधिक गतिशील और अस्थिर हैं।

विधि के अंतर्निहित सिद्धांत के अनुसार, एमटी स्थिरीकरण या सेंट्रीफ्यूजेशन में शामिल अनुचित प्रयोगात्मक स्थितियों के परिणामस्वरूप खराब विभाजन हो सकता है। उदाहरण के लिए, टैक्सोल की कम सांद्रता से पी 2 ट्यूबुलिन में थोड़ी कमी आती है, जबकि अतिरिक्त टैक्सोल तैयारी के दौरान एमटी गठनके कारण पी 2 ट्यूबुलिन को बढ़ाता है। इसी तरह, ऊतकों और नमूनों को अनुचित रूप से गर्म करने से एमटी हाइपरपॉलीमराइज्ड हो सकते हैं और ताऊ को नीचा या टुकड़ाहो सकता है। इसके अलावा, केन्द्रापसारक स्थितियां पी 3 और एस 3 अंशों को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, और गुरुत्वाकर्षण त्वरण में मामूली कमी पी 3 अंश की वसूली को काफी कम कर देती है। इसलिए, यदि कोई असामान्य विभाजन देखा जाता है तो प्रोटोकॉल चरणों का सख्ती से पालन करने की सिफारिश की जाती है।

इस सरल विभाजन विधि को मोटे तौर पर स्थिर एमटी, लेबिल एमटी और ऊतकों में मुक्त डिमर के बीच ट्यूबुलिन के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह विधि कई फायदे प्रदान करती है, क्योंकि यह ट्यूबुलिन की स्थिति में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगा सकती है जो ट्यूबुलिन पीटीएम की मात्रा का ठहराव के माध्यम से स्पष्ट नहीं हो सकती है। एमटी स्थिरता का विश्लेषण एमटी के शारीरिक महत्व को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से बड़े और जटिल न्यूरोनल कोशिकाओं में, और एमटी डिसरेग्यूलेशन से जुड़े विकारों की जांच के लिए। ट्यूबुलिन या एमएपी जीन में उत्परिवर्तन या शिथिलता, उदाहरण के लिए, न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े होतेहैं27,28. अल्जाइमर रोग में, एमटी को कम करने के लिए जाना जाता है, संभवतः प्रभावित न्यूरॉन्स 15,29,30,31,32,33 में ताऊ प्रोटीन के कार्यात्मक नुकसान के कारण। एमटीए जो एमटी स्थिरता को नियंत्रित करते हैं और कोशिका विभाजन को रोकते हैं, उन्हें न्यूरोलॉजिकल विकारों13,34 के लिए संभावित उपचार के रूप में प्रस्तावित किया गया है। रोग मॉडल जानवरों में एमटी और एमएपी की स्थिरता और व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस अद्वितीय एमटी फ्रैक्शनेशन विधि का उपयोग करने से ताऊ से संबंधित मनोभ्रंश के रोगजनन को स्पष्ट करने और नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने में महत्वपूर्ण योगदान मिल सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जेएसटी द्वारा विज्ञान प्रौद्योगिकी नवाचार (A.HT) के निर्माण की दिशा में विश्वविद्यालय फैलोशिप की स्थापना द्वारा समर्थित किया गया था; JPMJFS2145), जेएसटी स्प्रिंग (A.HT); JPMJSP2129), जेएसपीएस अध्येताओं के लिए सहायता अनुदान (A.HT; 23केजे2078), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (बी) जेएसपीएस काकेन्ही (टीएम के लिए 22एच02946), एमईएक्सटी (टीएम; 26117004) से "ब्रेन प्रोटीन एजिंग एंड डिमेंशिया कंट्रोल" नामक अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान, और यूहारा मेमोरियल फाउंडेशन (टीएम; 202020027) से यूहारा रिसर्च फैलोशिप। लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500 Beckman Coulter 357448
1A2 Sigma-Aldrich T9028 1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Nacalai Tesque 02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column Aproscience PT-1013
6-11B1 Sigma-Aldrich T7451 1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus Cytiva 11001313
anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-035-146 1:5,000 dilution
antipain Peptide Institute Inc. 4062
aprotinin Nacalai Tesque 03346-84
Chemi-Lumi One L Nacalai Tesque 07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system Corning 430758 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP Sigma-Aldrich 55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 AS ONE 1-2050-11
DM1A Sigma-Aldrich T9026 1:5,000 dilution
DTT Nacalai Tesque 14128-46
EGTA Nacalai Tesque 37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll Pall Corporation BSP0161
glycerol Nacalai Tesque 17018-25
GTP Nacalai Tesque 17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman TOMY KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column Cytiva 28-9893-35
Image Gauge Software  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation 292-69903
KMX-1 Millipore MAB3408 1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin Peptide Institute Inc. 43449-62
MgSO4 Nacalai Tesque 21003-75
Na3VO4 Nacalai Tesque 32013-92
NaF Nacalai Tesque 31420-82
okadaic acid LC Laboratories O-2220 
OPTIMA MAX-XP Beckman Coulter 393315
pepstatin Nacalai Tesque 26436-52
PMSF Nacalai Tesque 27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 Beckman Coulter 343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) Roche 11873580001
Purified tubulin  Cytoskeleton T240
QSONICA Q55 QSonica Q55
Taxol LC Laboratories P-9600
TLA-120.2 rotor Beckman Coulter 357656
TLA-55 rotor Beckman Coulter 366725
TLCK Nacalai Tesque 34219-94
Triton X-100 Nacalai Tesque 12967-45
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

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References

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Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T.… More

Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T. Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (201), e63358, doi:10.3791/63358 (2023).

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