Summary
Mikrotubuli, som är tubulinpolymerer, spelar en avgörande roll som en cytoskelettkomponent i eukaryota celler och är kända för sin dynamiska instabilitet. Denna studie utvecklade en metod för fraktionering av mikrotubuli för att separera dem i stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fria tubuli för att utvärdera stabiliteten hos mikrotubuli i olika musvävnader.
Abstract
Mikrotubuli, som består av α/β-tubulindimerer, är en avgörande komponent i cytoskelettet i eukaryota celler. Dessa rörliknande polymerer uppvisar dynamisk instabilitet när tubulinheterodimersubenheter genomgår repetitiv polymerisation och depolymerisation. Exakt kontroll av mikrotubulistabilitet och dynamik, uppnådd genom tubulin posttranslationella modifieringar och mikrotubuliassocierade proteiner, är avgörande för olika cellulära funktioner. Dysfunktioner i mikrotubuli är starkt inblandade i patogenes, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Pågående forskning fokuserar på mikrotubuliriktade terapeutiska medel som modulerar stabiliteten, vilket erbjuder potentiella behandlingsalternativ för dessa sjukdomar och cancerformer. Att förstå mikrotubulis dynamiska tillstånd är därför avgörande för att bedöma sjukdomsprogression och terapeutiska effekter.
Traditionellt har mikrotubulidynamiken utvärderats in vitro eller i odlade celler genom grov fraktionering eller immunanalys, med hjälp av antikroppar riktade mot posttranslationella modifieringar av tubulin. Att noggrant analysera tubulinstatus i vävnader med hjälp av sådana procedurer innebär dock utmaningar. I denna studie utvecklade vi en enkel och innovativ mikrotubulifraktioneringsmetod för att separera stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fritt tubuli i musvävnader.
Proceduren innebar homogenisering av dissekerade musvävnader i en mikrotubulistabiliserande buffert med ett volymförhållande på 19:1. Homogenaten fraktionerades sedan genom en ultracentrifugeringsprocess i två steg efter en inledande långsam centrifugering (2 400 × g) för att avlägsna skräp. Det första ultracentrifugeringssteget (100 000 × g) fällde ut stabila mikrotubuli, medan den resulterande supernatanten utsattes för ett andra ultracentrifugeringssteg (500 000 × g) för att fraktionera labila mikrotubuli och lösliga tubulindimerer. Denna metod bestämde proportionerna av tubulin som utgör stabila eller labila mikrotubuli i mushjärnan. Dessutom observerades distinkta vävnadsvariationer i mikrotubulistabilitet som korrelerade med den proliferativa kapaciteten hos de ingående cellerna. Dessa fynd belyser den betydande potentialen hos denna nya metod för att analysera mikrotubulistabilitet vid fysiologiska och patologiska tillstånd.
Introduction
Mikrotubuli (MT) är långsträckta rörformiga strukturer som består av protofilament bestående av α/β-tubulinheterodimerunderenheter. De spelar viktiga roller i olika cellulära processer såsom celldelning, motilitet, formunderhåll och intracellulär transport, vilket gör dem till integrerade komponenter i det eukaryota cytoskelettet1. Minus-änden av MTs, där α-tubulin-subenheten är exponerad, är relativt stabil, medan plus-end, där β-tubulin-subenheten är exponerad, genomgår dynamisk depolymerisation och polymerisation2. Denna kontinuerliga cykel av tubulindimertillsats och dissociation i plusänden, kallad dynamisk instabilitet, resulterar i en repetitiv räddnings- och katastrofprocess3. MT:er uppvisar fokala domäner med lokaliserade variationer i dynamisk instabilitet, inklusive stabila och labila domäner4.
Exakt kontroll av den dynamiska instabiliteten hos MT är avgörande för många cellulära funktioner, särskilt i neuroner som kännetecknas av intrikata morfologier. MT:s anpassningsförmåga och hållbarhet spelar en viktig roll för nervcellernas utveckling och funktion 5,6,7. Den dynamiska instabiliteten hos MT har visat sig vara associerad med olika posttranslationella modifieringar (PTM) av tubulin, såsom acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoxidation och polyglylyylering. Dessutom fungerar bindningen av mikrotubuliassocierade proteiner (MAP) som en regleringsmekanism8. PTM, med undantag för acetylering, förekommer främst i den tubulinkarboxiterminala regionen som är belägen på den yttre ytan av MT. Dessa modifieringar skapar olika ytförhållanden på MT:er, vilket påverkar deras interaktion med MAPs och i slutändan styr MT-stabiliteten9. Förekomsten av en karboxiterminal tyrosinrest i α-tubulin tyder på dynamiska MTs, som snabbt ersätts av den fria tubulinpoolen. Omvänt innebär detyronisering av karboxiterminalen och acetylering av Lys40 stabila MT med minskad dynamisk instabilitet 9,10.
PTM av tubulin har använts i stor utsträckning i experiment för att bedöma dynamiken och stabiliteten hos MTs 5,7,11,12,13,14,15. Till exempel, i cellodlingsstudier, kan tubuliner delas upp i två pooler: den fria tubuliinpoolen och MT-poolen. Detta uppnås genom att frigöra fritt tubulin genom cellpermeabilisering innan de återstående MT fixeras 15,16,17,18,19. Biokemiska metoder innebär användning av kemiska MT-stabilisatorer som skyddar MT från katastrof, vilket möjliggör separation av MT och fritt tubulin genom centrifugering20,21,22. Dessa procedurer skiljer dock inte mellan stabila och mindre stabila (labila) MTs, vilket gör det omöjligt att kvantifiera MTs eller lösligt tubulin i vävnader som hjärnan. Följaktligen har det visat sig vara en utmaning att utvärdera MT-stabilitet hos organismer under fysiologiska och patologiska förhållanden. För att ta itu med denna experimentella begränsning har vi utvecklat en ny teknik för att exakt separera MT och fritt tubulin i musvävnad23.
Denna unika MT-fraktioneringsmetod involverar vävnadshomogenisering under förhållanden som bibehåller tubulinstatus i vävnader och tvåstegscentrifugering för att separera stabila MTs, labila MTs och fritt tubulin. Denna enkla procedur kan tillämpas på breda studier, inklusive grundforskning om MT och MAPs i levande organismer, fysiologiska och patologiska analyser av hälsa och sjukdomar som är förknippade med MT-stabilitet, och utveckling av läkemedel och andra terapier som riktar sig mot MT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metod för fraktionering av maskinton
OBS: Alla experiment som utförts i denna studie har godkänts av djuretikkommittén vid Doshisha University. C57BL/6J-möss av båda könen, 3-4 månader gamla, användes här. I detta protokoll homogeniserades dissekerade vävnader, t.ex. hjärna, lever eller bräss, omedelbart i iskall mikrotubulistabiliserande buffert (MSB), som innehöll Taxol (MT-stabilisator) i en koncentration som förhindrade inte bara depolymerisation utan även återpolymerisation av MT. Homogenatet separerades i tre fraktioner genom en ultracentrifugeringsprocess i två steg (figur 1). Alla steg i detta protokoll slutfördes utan avbrott i en miljö med sval temperatur, och vävnaderna och fraktionerna frystes inte förrän de löstes i natriumdodecylsulfat (SDS)-provbuffert.
- Beredning av MSB och mikrorör
- För att bereda MSB, blanda följande reagenser: 0,1 M 2-(N-morfolino)etansulfonsyra (MES), pH 6,8 (neutraliserad av KOH), 10% glycerol, 0,1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, fosfatashämmare (1 mM NaF, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na3VO4, 0,5 μM okadasyra), 1x cocktail av proteashämmare, och proteashämmare (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/ml pepstatin, 1 μg/ml antipain, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 50 μg/ml TLCK) (se Materialförteckning) och betecknas som MSB(-).
- Strax före vävnadsdissektion, tillsätt 10 μM Taxol och 2 mM GTP (se Materialtabell) till MSB(-). Denna buffert betecknas som MSB(+). Förbered bufferten på användningsdagen och förvara den på is.
- Förbered mikrorören för provtagning. Tomt 2,0 ml mikrorör för homogen lagring; Töm 1,5 ml mikrorör för supernatant1 (S1)lysat, fällning2 (P2) prov och fällning3 (P3) provförvaring. 1,5 ml mikrorör med 1 ml iskall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för dissekerad vävnadslagring; 1,5 ml mikrorör med 200 μL 2x SDS-provbuffert (0,16 M Tris pH 6,8; 20 % glycerol; 2 % 2-merkaptoetanol; 4 % SDS) för lagring av S1-prov och supernatant3 (S3) prov; och centrifugeringsmikrorör för TLA55 och TLA120.2 centrifugrotorer (se materialförteckning). Märk alla rör och lägg dem på is.
- Homogenisering av musvävnad
- Förbered ett kylt bord för vävnadsdissektion. Fyll först en låda med krossad is och lägg två petriskålar på is, en med insidan uppåt och den andra med utsidan. Fyll iskall PBS i en skål för tillfällig tvätt och förvaring av dissekerade vävnader. Lägg filterpapper fuktat med PBS på en annan skål som vänds.
- För att offra en mus, utför cervikal dislokation under djup anestesi med ett blandbedövningsmedel av butorfanol, midazolam och medetomidin. Dissekera sedan omedelbart vävnaderna, t.ex. hjärna, lever eller bräss, och tvätta dem med iskall PBS i en petriskål.
OBS: Alla typer av mjukvävnad kan analyseras med denna metod. Vävnadens storlek begränsas dock av det rekommenderade volymintervallet för den homogenisator som används. Till exempel, om en 2 ml volym homogenisator används, rekommenderas 50-100 mg vävnad. - Efter att ha vägt de 1,5 ml mikrorören fyllda med PBS för dissekerad vävnadsförvaring, klipp ut och förvara vävnader inuti mikrorören och väg varje mikrorör igen. Varje vävnads våtvikt kan beräknas genom att subtrahera rörets vikt före och efter att vävnaden har tillsatts.
- Homogenisera omedelbart vävnaden i iskall MSB(+) med en kyld homogenisator (se materialförteckning). Volymen av MSB(+) var 19 gånger (μL) vävnadens våtvikt (mg). Utför homogenisering med 20 slag tills vävnadsbitarna försvinner.
OBS: Till exempel används 1 900 μL MSB(+) för 100 mg vävnad. Eftersom volymen MSB(+) som ska tillsättas måste justeras för varje våtvikt av de analyserade vävnadsbitarna, är det nödvändigt att väga varje vävnadsbit noggrant.
- Centrifugering av musvävnadshomogenaten
- Flytta hela homogenatet till ett 2 ml mikrorör med en Pasteurpipett och centrifugera vid 2 400 × g i 3 minuter vid 2 °C för att avlägsna skräpet via nederbörd.
- Överför hela supernatanten (S1-fraktionen) till ett nytt 1,5 ml mikrorör och virvel. Alikvot 200 μl S1-fraktion i ett mikrorör för centrifugering och centrifugering vid 100 000 × g med hjälp av en TLA-55-rotor i 20 minuter vid 2 °C för att erhålla proteiner med relativt stor molekylvikt som fällning (P2-fraktion).
OBS: Volymen på provet som utsätts för ultracentrifugeringsstegen påverkar centrifugeringsradien och molekylernas utfällningseffektivitet. Håll provvolymen på 200 μL eller mindre efter detta steg för att förhindra felaktig fraktionering. - Centrifugera sedan all resulterande supernatant (S2-fraktion) vid 500 000 × g med hjälp av en TLA-120.2-rotor i 60 minuter vid 2 °C för att separera de olösliga proteinkomplexen i fällningen (P3-fraktionen) från lösliga proteiner i supernatanten (S3-fraktion).
- Tillsätt 400 μL 1x SDS-provbuffert (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glycerol; 1% 2-merkaptoetanol; 2% SDS) till P2- och P3-fraktionsrören och sonikerat kort för att lösa upp fällningen. Överför dessa fraktionsprover till ett tomt 1.5 ml mikrorör.
- Lös upp den totala S3-fraktionen i 200 μl 2x SDS-provbuffert.
- Blanda de återstående S1-fraktionerna med en lika stor volym 2x SDS-provbuffert för användning som en standardkurva för Western blotting.
- Koka alla dessa prover vid 100 °C i 3 minuter. När proverna har svalnat till rumstemperatur, förvara proverna vid -20 °C.
- Kvantifiering av proteiner i varje fraktion
- Kvantifiera proteiner i P2-, P3- och S3-fraktionerna genom Western blotting. Använd först 10 % SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) för att separera proteiner från korrekt utspädda P2-, P3- och S3-fraktionerna och serieutspädda S1-prov från vilken individ som helst som en standardkurva. Elektroblotera sedan proverna på polyvinylidenfluoridmembran (se materialförteckning).
Anmärkning: Utspädningsförhållandet för varje fraktion beror på koncentrationen av ett objektivt protein och antikroppens reaktivitet. (t.ex. α-tubulin, TUBB3, β-tub och tyrosinerat tubulin i hjärnvävnad: S3 = 1/400, P3 = 1/2 000, P2 = 1/2 000, S1 = 1/50, 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; acetylerat tubulin i hjärnvävnad: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000; α-tubulin i levern: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; α-tubulin i brässen: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 utspädning av vävnadskoncentrationen). - Blockera membranet med 5 % skummjölk i Tris-buffrad koksaltlösning (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) med 0,1 % Tween 20 (TBS-T) i mer än 30 minuter.
- Sänk ner membranet i TBS-T innehållande primär antikropp (se materialförteckning) i mer än 2 timmar. Tvätta sedan membranet med TBS-T i 3 minuter (3 gånger).
- Märk primär antikropp med HRP-konjugerade sekundära antikroppar (se materialförteckning) i TBS-T i mer än 1 timme. Tvätta sedan membranet med TBS-T i 3 minuter (3 gånger).
- Utveckla membranen med förstärkt kemiluminescensreagens. Analysera sedan de intressanta banden med en självlysande bildanalysator (se materialförteckning).
- Kvantifiera proteinbandsintensiteterna med hjälp av bildanalysprogram (se materialtabell) och skapa en standardkurva genom att plotta utspädningsenheterna för de utspädda S1-proverna som används för standardkurvan längs X-axeln och bandintensiteterna längs Y-axeln.
- Läs av proteinkoncentrationen (enheten) som motsvarar de utspädda fraktionsproverna. Multiplicera den avlästa koncentrationen med provets utspädningsfaktor för att erhålla en proteinenhet i varje fraktion. Dividera den uppmätta enheten av varje fraktion med den totala proteinenheten (P2 + P3 + S3) för att få en procentandel.
- Kvantifiera proteiner i P2-, P3- och S3-fraktionerna genom Western blotting. Använd först 10 % SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) för att separera proteiner från korrekt utspädda P2-, P3- och S3-fraktionerna och serieutspädda S1-prov från vilken individ som helst som en standardkurva. Elektroblotera sedan proverna på polyvinylidenfluoridmembran (se materialförteckning).
2. Utvärdering av egenskaperna hos tubulin i varje fraktion
OBS: Denna biokemiska metod ger tre grupper av tubulinkomplex definierade av sedimentationsegenskaper. Här identifierades statusen för tubulinkomplex som erhölls i dessa fraktioner baserat på storleken på komplexet och tubulin-PTM. Slutför alla steg i detta protokoll utan avbrott i en miljö med sval temperatur, men frys inte fraktionsproverna förrän de har lösts upp i SDS-provbufferten.
- Analys av filterfälla
- Filtrera S2- och S3-fraktionerna (500 μL vardera) med hjälp av en 300 kDa ultrafiltreringskolonn (se materialförteckning). Centrifugering på 14 000 × g vid 2 °C tills hela supernatanten har filtrerats, eluerade proteiner har samlats upp i mottagarrör och instängda proteiner finns kvar på reservoarrörens filter.
- Översätt hela filtratet (ca 500 μL) i mottagarrören till nya 1,5 ml mikrorör och lös upp dem i 500 μL 2x SDS-provbuffert.
- Solubilisera resterna på filtret i reservoarrören i 1 000 μL 1x SDS-provbuffert genom att pipettera och överföra proverna till ett nytt 1,5 ml mikrorör.
- Koka proverna vid 100 °C i 3 min. När proverna har svalnat till rumstemperatur, förvara proverna vid -20 °C.
- Analysera mängden tubulin genom Western blotting med DM1A (anti-α-tubulinantikropp, se Materialförteckning).
- Storleksuteslutningskromatografi
- Bered bärarbufferten (0,1 M MES, pH 6,8; 10 % glycerol; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) kompletterad med 1/10 koncentration av proteas- och fosfatashämmare enligt beskrivningen i steg 1.1.1. Filtrera sedan lösningen och förvara den i en kall miljö.
- Bered en gelfiltreringskolonn med ett preparativt vätskekromatografisystem i en kromatografikammare (se materialtabell) vid 4 °C.
- Innan proverna injiceras i kolonnen ska 180 ml bärarbuffert flöda för att tvätta kolonnen. Flödeshastigheten är 1 ml/min i 3 timmar.
- Injicera kommersiellt tillgängligt renat svintubulin (se materialtabell) som kontroll eller S3-fraktionen från mushjärna (500 μl vardera) på kolonnen.
- Eluera med en flödeshastighet på 1,0 ml/min med bärarbuffert. Samla upp 1,5 ml fraktionerna i 120 minuter. Övervaka eluerade proteiner genom absorbans vid 280 nm. Håll det maximala trycket under 0.3 MPa.
- Efter virvling av de uppsamlade fraktionerna, blanda 50 μL av dem med 50 μL 2x SDS-provbuffert i ett 1,5 ml mikrorör. Koka alla prover vid 100 °C i 3 min. När proverna har svalnat till rumstemperatur, förvara proverna vid -20 °C.
- Analysera mängden tubulin med Western blotting med DM1A, anti-α-tubulinantikropp och KMX-1, anti-β-tubulinantikropp (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantifiering av tubulin i P2-, P3- och S3-fraktionerna från mushjärna med MT-fraktioneringsmetoden
Tubulin i musvävnad separerades i P2-, P3- och S3-fraktioner med MT-fraktioneringsmetoden och kvantifierades med Western blotting (figur 1A). Utfällningen av MTs som stannade kvar i P2-fraktionen genom ultracentrifugering vid 100 000 × g i 20 minuter stod för 34,86 % ± 1,68 % av det totala tubulinet i en mushjärna. Supernatanten (S2) centrifugerades ytterligare vid 500 000 × g i 60 minuter. En fällning (P3-fraktion) och en supernatant (S3-fraktion) erhölls, vilka stod för 56,13 % ± 2,12 % respektive 9,01 % ± 0,68 % av det totala tubulinet i mushjärnan (Figur 1B).
Hjärnbarken som användes i denna studie innehåller neuronala och icke-neuronala celler, såsom glia. För att selektivt bedöma MT-stabiliteten i nervcellerna i mushjärnor kvantifierade vi TUBB3, en tubulinsubtyp som uteslutande uttrycks i nervceller i centrala och perifera nervsystemet, genom Western blotting med Tuj1 (anti-TUBB3-antikropp). Andelen TUBB3 i P2-, P3- eller S3-fraktionen var 32,65 % ± 2,20 %, 59,31 % ± 2,61 % respektive 8,04 % ± 0,74 %. De skilde sig inte signifikant från dem för α-tubulin (Figur 1B). Dessa resultat tyder på att neuroner och gliaceller uppvisar liknande MT-stabilitet eller att neuroner innehåller mycket högre mängder tubulin än gliaceller in vivo.
Egenskaper hos tubulin som återvinns i varje fraktion
Här separerades musvävnadshomogenatet i tre fraktioner genom tvåstegs ultracentrifugering med olika gravitationsaccelerationer; Därför skilde sig sedimentationskoefficienterna mellan proteiner eller deras komplex i varje fraktion åt. Även om tubulin utfällt vid 100 000 × g ultracentrifugering ansågs vara konventionell MT, bör det klargöras hur det nyligen erhållna tubulinet i P3-fraktionen här skiljer sig från det för tubulin i P2- och S3-fraktionerna.
För att karakterisera S3-tubulin utsattes S2 (P3 + S3) eller S3-fraktionen för ultrafiltrering och storleksuteslutningskromatografi. Tubulinkomplexen i S3-fraktionen kunde passera genom en 300 kDa ultrafiltreringskolonn helt och hållet, medan nästan allt tubulin i S2-fraktionen fångades på filtret (Figur 2A). Dessutom mättes molekylvikten för tubulinkomplex i S3-fraktionen med storleksuteslutningskromatografi. S3-tubulin elueras vid en topp motsvarande 100 kDa, vilket liknar det för kommersiellt tillgängliga renade tubulindimerer (figur 2B,C). Dessutom var proportionerna av α- och β-tubulin som återfanns i varje fraktion med MT-fraktioneringsmetoden lika (figur 2D). Det har faktiskt visat sig att α- och β-tubulin kan existera något som monomerer i levande celler24. Att döma av det uppskattade kD-värdet (nM-ordning) som rapporterats och koncentrationen av tubulin som återvunnits i S3-fraktionen (~11 μM) tros dock det mesta (> 98 %) tubulin existera som α/β-dimerer. Därför är tubulin i S3-fraktionen i första hand en löslig α/β-tubulindimer.
Tubulinpolymererna separerades i två fraktioner, P2 och P3, baserat på deras posttranslationella modifieringar (PTM). För att skilja mellan dessa fraktioner utfördes Western blotting med hjälp av specifika antikroppar. Anti-acetylerade α-tubulinantikroppen, som fungerar som en markör för stabila MTs, visade att P2-fraktionen var signifikant anrikad med 97,40 % ± 0,52 % acetylerat α-tubulin (Figur 2E), medan det totala α-tubulinet återfanns i P3- och S3-fraktionerna (Figur 1B). Omvänt visade anti-tyrosinerad α-tubulinantikropp, som indikerar labila MTs, att 75,43 % ± 2,69 % tyrosinerat α-tubulin fanns i P3-fraktionen (Figur 2F). Dessa fynd bekräftar att P2-fraktionen huvudsakligen innehåller tubulin inom stabila MTs, medan P3-fraktionen består av tubulin inom labila MTs.
Bedömning av MT-stabilitet vid frysning och nocodazolbehandling
Effekten av frysning och nocodazolbehandling på stabiliteten hos mus intracerebrala MTs analyserades för att avgöra om övergående förändringar i MTs stabilitet kunde urskiljas med MT-fraktioneringsmetoden. MT demonteras vanligtvis vid låga temperaturer, men vissa MT förblir stabila i kyla. Efter att ha vägt hjärnorna frystes de in i flytande kväve och placerades vid -80 °C i 30 minuter. Den transienta frusna hjärnan och den råa hjärnan som kontroll homogeniserades och fraktionerades till P2-, P3- och S3-fraktionerna. Därefter kvantifierades andelen tubulin i de tre fraktionerna genom Western blotting. När hjärnan var nedfryst före homogenisering minskade α-tubulin i P2-fraktionen, och det i P3-fraktionen ökade jämfört med det i den råa hjärnan (Figur 3A). Blodproppar med 6-11B1 (acetylerat α-tubulin) eller 1A2 (tyrosinerat α-tubulin) visade också att hjärnfrysning minskade acetyleringsnivån (Figur 3B) och ökade tyrosinationsnivån (Figur 3C) av α-tubulin i P2-fraktionen.
Nocodazol är ett MTA-medel (Microtubule-Targeting Agent) som förhindrar MT-polymerisation genom att binda till β-tubulin och främjar MT-depolymerisation. Mushjärnor homogeniserades i taxolfri MSB(+) med eller utan 10 μM nocodazol och placerades vid 4 °C i 20 minuter. Det obehandlade eller nocodazolbehandlade homogenatet tillsattes till 10 μM Taxol, homogeniserades på nytt och fraktionerades till P2-, P3- och S3-fraktionerna. Därefter kvantifierades andelen tubulin i de tre fraktionerna genom Western blotting. Blottningar med DM1A (α-tubulin) visade att α-tubulin i P2-fraktionen minskade och att det i P3-fraktionen tenderade att öka med nocodazolbehandling (Figur 3D). Dessa resultat indikerar att P2-tubulin destabiliserades som svar på låg temperatur eller nocodazol och att P2-fraktionen innehöll robusta MTs som motstod de experimentella förhållandena. Till skillnad från frysning påverkade nocodazol inte tubulin PTM (figur 3E,F). Baserat på resultaten och ovanstående data kan depolymerisationen av MT som inte kan detekteras genom PTM-analys utvärderas med denna metod.
Jämförelse av förhållandet mellan stabila MTs, labila MTs och fritt tubulin i vävnader
MT:s stabilitet varierar mellan olika vävnader, beroende på den proliferativa kapaciteten hos cellerna i dessa vävnader. Noterbart är att stabila MTs är rikligare i nervsystemet, som främst består av icke-proliferativa neuroner, jämfört med andra vävnader4. För att bedöma förmågan hos den utvecklade MT-fraktioneringsmetoden att urskilja skillnader i MT-stabilitet mellan olika vävnader, fraktionerades levern och thymi hos möss, och det återvunna tubulinet i varje fraktion kvantifierades. Resultaten visade att hjärnan, i jämförelse med andra vävnader, uppvisade en signifikant högre nivå av P2-tubuliner, medan P3-tubuliner var särskilt anrikade i vävnader som innehöll proliferativa celler (Figur 4). Dessutom bekräftade Western blotting med 6-11B1- och 1A2-antikroppar närvaron av högre MT-stabilitet i nervsystemet. De distinkta distributionsmönstren för tubulin-PTM indikerade tydligt att P2-tubulinet som specifikt finns i nervsystemet härstammade från stabila MT (Figur 4). Dessa fynd stöder ytterligare uppfattningen att P2- och P3-fraktionerna motsvarar stabila respektive labila MT.
Figur 1: Kvantifiering av tubulin i musvävnad med hjälp av MT-fraktioneringsmetoden. A) Sammanfattning av MT-fraktioneringsmetoden för vävnader. Stabila MT (P2-fraktion), labila MT (P3-fraktion) och fritt tubulin (S3-fraktion) i vävnader kan separeras genom 2-stegs ultracentrifugering under förhållanden som undertrycker MT-polymerisation och depolymerisation under beredningen. (B) MT i musbarken fälldes ut med konventionell 100 000 × g ultracentrifugering följt av 500 000 × g ultracentrifugering. Därefter kvantifierades tubuliner i P2-, P3- och S3-fraktionerna genom Western blotting med DM1A (α-tubulin) och anti-Tuj1 (TUBB3). Andelen proteiner i varje fraktion (P2, P3 eller S3) i förhållande till den totala fraktionen (P2 + P3 + S3) beräknades enligt beskrivningen i avsnittet Protokoll (medelvärden ± SD, n = 4). Denna siffra har modifierats från Hagita et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: MT-fraktioneringsmetoden möjliggör separation av stabila MTs, labila MTs och fritt tubulin i musens hjärnbark. (A) S2- eller S3-fraktionerna (indata) analyserades med filterfällan med hjälp av en 300 kDa ultrafiltreringskolonn. Tubuliner erhållna genom filtrering (mottagare) och fångst (reservoar) kvantifierades genom Western blotting med DM1A (α-tubulin). B) Renade svintubuliner utsattes för MT-fraktioneringsmetoden och befanns till största delen samlas in i S3-fraktionen. C) Molekylstorleken för tubulin i S3-fraktionen. S3-fraktionen separerades med storleksuteslutningskromatografi med hjälp av en gelfiltreringskromatografikolonn. Proteiner i varje fraktion kvantifierades genom Western blotting med DM1A (α-tubulin) och KMX-1 (β-tubulin). Den teoretiska molekylvikten visas högst upp på panelerna. (D) Proportionerna av α-tubulin och β-tubulin i varje fraktion var lika. Tubuliner separerade i P2-, P3- och S3-fraktionerna kvantifierades genom Western blotting med KMX-1 (β-tubulin). Kvantifiering av andelen α-tubulin och β-tubulin i varje fraktion i förhållande till summan av den totala fraktionen (medelvärden ± SD, n = 4). Statistiska analyser utfördes med hjälp av Students t-test. (E,F) Modifieringarna av α-tubulin i P2-, P3- och S3-fraktionerna verifierades genom Western blotting med 6-11B1 (acetylerat α-tubulin: E) och 1A2 (tyrosinerat α-tubulin: F). Kvantifiering av andelen tyrosinerat eller acetylerat α-tubulin i varje fraktion i förhållande till den totala fraktionen (medelvärden ± SD, n = 4). (A-C) har modifierats från Hagita et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av MT-depolymerisation inducerad av frysning eller MTA. (A-C) MT:s stabilitet efter 30 minuters frysning vid -80 °C utvärderades. Proportionerna av tubulin i de tre fraktionerna av den råa och frysta hjärnan kvantifierades genom Western blotting med DM1A (α-tubulin: A), 1A2 (tyrosinerat α-tubulin: B) och 6-11B1 (acetylerat α-tubulin: C). (D-F) Effekten av nocodazol på MT-stabiliteten utvärderades. Proportionerna av tubulin i de tre fraktionerna av nocodazol obehandlade eller behandlade hjärnor kvantifierades genom Western blotting med DM1A (α-tubulin: D), 1A2 (tyrosinerat α-tubulin: E) och 6-11B1 (acetylerat α-tubulin: F). Representativa relativa nivåer av tyrosination (B,E) eller acetylering (C,F) normaliserades till mängden totalt α-tubulin (A,D ) (betyder ± SD, n = 4). Statistiska analyser utfördes med hjälp av Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Proportioner av stabila MTs, labila MTs och fritt tubulin i hjärnan, levern och thymus i mus. Hjärnor, lever och thymi från möss dissekerades och utsattes för MT-fraktioneringsmetoden. Proteiner separerade i varje fraktion kvantifierades genom Western blotting med DM1A (α-tubulin), 6-11B1 (acetylerat α-tubulin) och 1A2 (tyrosinerat α-tubulin). Andelen proteiner i varje fraktion (P2, P3 eller S3) i förhållande till den totala fraktionen (P2 + P3 + S3) beräknades enligt beskrivningen i avsnittet Protokoll (medelvärden ± SD, n = 4). Statistiska analyser utfördes av envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigaste uppgiften när man undersöker statusen för tubulin i vävnad från levande organismer är att förhindra oavsiktlig MT-polymerisation eller depolymerisation under beredningen. Stabiliteten hos MT i prover påverkas av faktorer som koncentrationen av Taxol i MSB, andelen vävnadsmängd i buffert och temperatur under processen från vävnadsavlägsnande till homogenisering och centrifugering. Därför optimerades förhållandena i varje steg av protokollet för analys av musvävnad med en 20-faldig volym homogenat. En högre koncentration av Taxol kan inducera MT-polymerisation in vitro, även under kylda förhållanden25. Vid analys av vävnader med signifikant olika tubulinkoncentrationer eller vid väsentliga protokolländringar bör varje operatör optimera stegen i enlighet med de specifika målen för sina experiment.
I den genomförda studien erhölls en ny population av MTs, kallad P3, från den konventionella "lösliga fraktionen" med hjälp av ultracentrifugering vid 500 000 × g20. Teoretiska beräkningar baserade på faktorer som rotorns K-faktor, centrifugalkraft och centrifugeringstid tyder på att tubulinerna som finns i S3-fraktionen sannolikt representerar 6S-tubulindimerer. Omvänt kan tubulin i P3-fraktionen motsvara MT som är kortare i längd jämfört med de som finns i P2-fraktionen. Denna observation är i linje med resultatet som visar att frysning av vävnader före homogenisering, vilket leder till partiell kollaps av MT26, resulterade i en signifikant ökning av tubulin inom P3-fraktionen och en samtidig minskning av P2-fraktionen (Figur 3A). Analysen av tubulin-PTM och bindningsegenskaperna hos olika MAP indikerar dessutom att P2- eller P3-fraktionen innehåller stabila respektive labila MT. Till exempel fanns vissa MAPs som är specifika för stabila MTs, främst i neuroner, uteslutande i P2-fraktionen23. Följaktligen är det rimligt att föreslå att P3-fraktionen består av MT som är mer dynamiska och labila jämfört med dem i P2-fraktionen.
Enligt den teori som ligger till grund för metoden kan olämpliga experimentella förhållanden i samband med MT-stabilisering eller -centrifugering resultera i dålig fraktionering. Till exempel leder en låg koncentration av Taxol till en liten minskning av P2-tubulin, medan överskott av Taxol ökar P2-tubulin på grund av MT-bildning under beredning23. På samma sätt kan upphettning av vävnader och prover på ett olämpligt sätt leda till att MT hyperpolymeriseras och tau bryts ned eller fragmenteras23. Dessutom är centrifugalförhållanden kritiska för att separera P3- och S3-fraktionerna, och en liten minskning av gravitationsaccelerationen minskar avsevärt återvinningen av P3-fraktionen. Därför rekommenderas det att strikt följa protokollstegen om några onormala fraktioneringar observeras.
Denna enkla fraktioneringsmetod kan användas brett för att analysera proportionerna av tubuliner bland stabila MTs, labila MTs och fria dimerer i vävnader. Denna metod erbjuder flera fördelar, eftersom den kan upptäcka subtila förändringar i tubulinstatus som kanske inte är uppenbara genom kvantifiering av tubulin-PTM. Att analysera MT-stabilitet är viktigt för att förstå den fysiologiska betydelsen av MT, särskilt i stora och komplexa neuronala celler, och för att undersöka störningar i samband med MT-dysreglering. Mutationer eller dysfunktioner i tubulin- eller MAP-gener är till exempel kopplade till neuropsykiatriska funktionsnedsättningar och neurodegenerativa sjukdomar27,28. Vid Alzheimers sjukdom är MT känt för att vara reducerat, möjligen på grund av den funktionella förlusten av tau-protein i drabbade nervceller 15,29,30,31,32,33. MTA:er som modulerar MTA-stabilitet och hämmar celldelning har föreslagits som potentiella terapier för neurologiska sjukdomar13,34. Att använda denna unika MT-fraktioneringsmetod för att analysera stabiliteten och beteendet hos MT och MAPs hos sjukdomsmodelldjur kan avsevärt bidra till att belysa patogenesen av tau-relaterad demens och identifiera nya terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av JST, inrättandet av universitetsstipendier för att skapa vetenskap, teknik, innovation (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), ett bidrag till vetenskaplig forskning (B) JSPS KAKENHI (22H02946 för TM), ett bidrag till vetenskaplig forskning inom innovativa områden med titeln "Brain Protein Aging and Dementia Control" från MEXT (TM; 26117004), och av Uehara Research Fellowship från Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C.
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al.
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D.
