Summary
Mikrotubuli, som er tubulinpolymerer, spiller en afgørende rolle som cytoskeletkomponent i eukaryote celler og er kendt for deres dynamiske ustabilitet. Denne undersøgelse udviklede en metode til fraktionering af mikrotubuli for at adskille dem i stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin for at evaluere stabiliteten af mikrotubuli i forskellige musevæv.
Abstract
Mikrotubuli, der består af α/β-tubulindimerer, er en afgørende komponent i cytoskelettet i eukaryote celler. Disse rørlignende polymerer udviser dynamisk ustabilitet, da tubulinheterodimerunderenheder gennemgår gentagen polymerisation og depolymerisering. Præcis kontrol af mikrotubulus stabilitet og dynamik, opnået gennem tubulin posttranslationelle modifikationer og mikrotubulus-associerede proteiner, er afgørende for forskellige cellulære funktioner. Dysfunktioner i mikrotubuli er stærkt impliceret i patogenese, herunder neurodegenerative lidelser. Igangværende forskning fokuserer på mikrotubuli-målrettede terapeutiske midler, der modulerer stabilitet, hvilket tilbyder potentielle behandlingsmuligheder for disse sygdomme og kræftformer. Derfor er forståelse af mikrotubulis dynamiske tilstand afgørende for vurdering af sygdomsprogression og terapeutiske virkninger.
Traditionelt er mikrotubulusdynamikken blevet vurderet in vitro eller i dyrkede celler gennem grov fraktionering eller immunoassay ved hjælp af antistoffer rettet mod posttranslationelle modifikationer af tubulin. Imidlertid udgør en nøjagtig analyse af tubulinstatus i væv ved hjælp af sådanne procedurer udfordringer. I denne undersøgelse udviklede vi en enkel og innovativ mikrotubulusfraktioneringsmetode til at adskille stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin i musevæv.
Proceduren involverede homogenisering af dissekeret musevæv i en mikrotubulusstabiliserende buffer i et volumenforhold på 19:1. Homogenaterne blev derefter fraktioneret gennem en to-trins ultracentrifugeringsproces efter indledende langsom centrifugering (2.400 × g) for at fjerne snavs. Det første ultracentrifugeringstrin (100.000 × g) udfældede stabile mikrotubuli, mens den resulterende supernatant blev underkastet et andet ultracentrifugeringstrin (500.000 × g) for at fraktionere labile mikrotubuli og opløselige tubulindimerer. Denne metode bestemte proportionerne af tubulin, der udgør stabile eller labile mikrotubuli i musehjernen. Derudover blev der observeret forskellige vævsvariationer i mikrotubulusstabilitet, der korrelerede med de cellers proliferative kapacitet. Disse resultater fremhæver det betydelige potentiale i denne nye metode til analyse af mikrotubulusstabilitet under fysiologiske og patologiske tilstande.
Introduction
Mikrotubuli (MT'er) er aflange rørformede strukturer bestående af protofilamenter bestående af α/β-tubulin heterodimerunderenheder. De spiller væsentlige roller i forskellige cellulære processer såsom celledeling, motilitet, formvedligeholdelse og intracellulær transport, hvilket gør dem til integrerede komponenter i det eukaryote cytoskelet1. Minus-enden af MT'er, hvor α-tubulin-underenheden eksponeres, er relativt stabil, mens plus-enden, hvor β-tubulin-underenheden eksponeres, gennemgår dynamisk depolymerisering og polymerisering2. Denne kontinuerlige cyklus af tubulindimertilsætning og dissociation i plus-enden, kaldet dynamisk ustabilitet, resulterer i en gentagen proces med redning og katastrofe3. MT'er udviser fokusdomæner med lokaliserede variationer i dynamisk ustabilitet, herunder stabile og labile domæner4.
Præcis kontrol af den dynamiske ustabilitet af MT'er er afgørende for adskillige cellulære funktioner, især i neuroner karakteriseret ved indviklede morfologier. MT'ernes tilpasningsevne og holdbarhed spiller en afgørende rolle for nervecellernes udvikling og korrekte funktion 5,6,7. Den dynamiske ustabilitet af MT'er har vist sig at være forbundet med forskellige posttranslationelle modifikationer (PTM'er) af tubulin, såsom acetylering, phosphorylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoxidation og polyglycylering. Derudover tjener bindingen af mikrotubulusassocierede proteiner (MAP'er) som en reguleringsmekanisme8. PTM'er, bortset fra acetylering, forekommer overvejende i det tubulincarboxyterminale område beliggende på den ydre overflade af MT'er. Disse ændringer skaber forskellige overfladeforhold på MT'er, påvirker deres interaktion med MAP'er og styrer i sidste ende MT-stabilitet9. Tilstedeværelsen af en carboxyterminal tyrosinrest i α-tubulin er tegn på dynamiske MT'er, som hurtigt erstattes af den frie tubulinpulje. Omvendt betyder detyrosinering af carboxyterminalen og acetylering af Lys40 stabile MT'er med reduceret dynamisk ustabilitet 9,10.
PTM'erne af tubulin er blevet anvendt i vid udstrækning i eksperimenter til at vurdere dynamikken og stabiliteten af MT'er 5,7,11,12,13,14,15. For eksempel kan tubuliner i cellekulturundersøgelser adskilles i to puljer: den frie tubulinpool og MT-poolen. Dette opnås ved at frigive frit tubulin gennem cellepermeabilisering, før de resterende MT'er fikseres 15,16,17,18,19. Biokemiske metoder involverer anvendelse af kemiske MT-stabilisatorer, der beskytter MT'er mod katastrofe, hvilket muliggør adskillelse af MT'er og frit tubulin gennem centrifugering20,21,22. Disse procedurer skelner imidlertid ikke mellem stabile og mindre stabile (labile) MT'er, hvilket gør det umuligt at kvantificere MT'er eller opløseligt tubulin i væv som hjernen. Derfor har evaluering af MT-stabilitet i organismer under fysiologiske og patologiske forhold vist sig at være udfordrende. For at imødegå denne eksperimentelle begrænsning har vi udviklet en ny teknik til præcis adskillelse af MT'er og frit tubulin i musevæv23.
Denne unikke MT-fraktioneringsmetode involverer vævshomogenisering under betingelser, der opretholder tubulinstatus i væv og totrinscentrifugering for at adskille stabile MT'er, labile MT'er og frit tubulin. Denne enkle procedure kan anvendes til brede undersøgelser, herunder grundforskning i MT'er og MAP'er i levende organismer, fysiologiske og patologiske analyser af sundhed og sygdomme forbundet med MT-stabilitet og udvikling af lægemidler og andre terapeutiske midler, der er målrettet mod MT'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MT-fraktioneringsmetode
BEMÆRK: Alle eksperimenter udført i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Ethics Committee of Doshisha University. C57BL/6J mus af begge køn, 3-4 måneder gamle, blev brugt her. I denne protokol blev dissekerede væv, fx hjerne, lever eller thymus, straks homogeniseret i iskold mikrotubulusstabiliserende buffer (MSB), som indeholdt Taxol (MT-stabilisator) i en koncentration, der forhindrede ikke kun depolymerisering, men også repolymerisering af MT. Homogenatet blev separeret i tre fraktioner ved en totrins ultracentrifugeringsproces (figur 1). Alle trin i denne protokol blev gennemført uden afbrydelse i et køligt temperaturmiljø, og væv og fraktioner blev ikke frosset, før de blev opløst i natriumdodecylsulfat (SDS) -prøvebuffer.
- Fremstilling af MSB og mikrorør
- For at forberede MSB blandes følgende reagenser: 0,1 M 2-(N-morpholino) ethanesulfonsyre (MES), pH 6,8 (neutraliseret af KOH), 10% glycerol, 0,1 mM DTT, 1 mMMgSO4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, fosfatasehæmmere (1 mM NaF, 1 mM β-glycerophosphat, 1 mMNa3VO4, 0,5 μM okadainsyre), 1x proteasehæmmercocktail, og proteasehæmmere (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/ml pepstatin, 1 μg/ml antipain, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 50 μg/ml TLCK) (se materialetabel) og betegnes som MSB(-).
- Lige før vævsdissektion tilsættes 10 μM Taxol og 2 mM GTP (se materialetabel) til MSB(-). Denne buffer betegnes som MSB(+). Forbered bufferen på brugsdagen og hold den på is.
- Forbered mikrorørene til prøveudtagning. Tøm 2,0 ml mikrorør til homogenatopbevaring; tømme 1,5 ml mikrorør til supernatant1 (S1)-lysat, bundfald2 (P2)-prøve og opbevaring af bundfald3 (P3) prøver; 1,5 ml mikrorør med 1 ml iskold fosfatbufret saltvand (PBS) til opbevaring af dissekeret væv; 1,5 ml mikrorør med 200 μL 2x SDS-prøvebuffer (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glycerol; 2% 2-mercaptoethanol; 4% SDS) til opbevaring af S1-prøver og supernatant3 (S3) prøver; og centrifugeringsmikrorør til TLA55 og TLA120.2 centrifugerotorer (se materialetabel). Mærk alle rør og læg dem på is.
- Homogenisering af musevæv
- Forbered et kølet bord til vævsdissektion. Fyld først en kasse med knust is og læg to petriskåle på is, den ene med indersiden opad og den anden med ydersiden. Fyld iskold PBS i en skål til forbigående vask og opbevaring af dissekeret væv. Læg filterpapir fugtet med PBS på en anden skål, der vendes.
- For at ofre en mus skal du udføre cervikal dislokation under dyb anæstesi med en blandet bedøvelse af butorphanol, midazolam og medetomidin. Derefter dissekeres vævene straks, f.eks. hjerne, lever eller thymus, og vask dem med iskold PBS i en petriskål.
BEMÆRK: Enhver type blødt væv kan analyseres ved denne metode. Imidlertid er vævets størrelse begrænset af det anbefalede volumenområde for den anvendte homogenisator. For eksempel, hvis der anvendes et 2 ml volumen homogenisator, anbefales 50-100 mg væv. - Efter vejning af de 1,5 ml mikrorør fyldt med PBS til dissekeret vævsopbevaring, skæres væv ud og opbevares inde i mikrorørene, og hvert mikrorør vejes igen. Hvert vævs vådvægt kan beregnes ved at trække rørets vægt før og efter vævet er tilsat.
- Homogeniser straks vævet i iskold MSB (+) med en kølet homogenisator (se materialetabel). Volumenet af MSB(+) var 19 gange (μL) vævets vådvægt (mg). Udfør homogenisering med 20 slag, indtil vævsstykkerne forsvinder.
BEMÆRK: For eksempel anvendes 1.900 μL MSB(+) til 100 mg væv. Da mængden af MSB(+), der skal tilsættes, skal justeres for hver vådvægt af de analyserede vævsstykker, er det nødvendigt at veje hvert vævsstykke nøjagtigt.
- Centrifugering af musevævshomogenater
- Hele homogenatet flyttes til et 2 ml mikrorør med en Pasteur-pipette og centrifugeres ved 2.400 × g i 3 minutter ved 2 °C for at fjerne affaldet via nedbør.
- Hele supernatanten (S1-fraktionen) overføres til et nyt 1,5 ml mikroglas og hvirvelstrøm. Derefter alikvotes 200 μL S1-fraktion i et centrifugeringsmikrorør og centrifugeres ved 100.000 × g ved hjælp af en TLA-55-rotor i 20 minutter ved 2 °C for at opnå proteinerne med relativt stor molekylvægt som bundfald (P2-fraktion).
BEMÆRK: Volumenet af prøven, der udsættes for ultracentrifugeringstrinnene, påvirker centrifugeringsradius og molekylernes udfældningseffektivitet. Hold prøvevolumenet på 200 μL eller mindre efter dette trin for at forhindre unøjagtig fraktionering. - Alle resulterende supernatanter (S2-fraktioner) centrifugeres yderligere ved 500.000 × g med en TLA-120,2-rotor i 60 minutter ved 2 °C for at separere de uopløselige proteinkomplekser i bundfaldet (P3-fraktionen) fra opløselige proteiner i supernatanten (S3-fraktionen).
- Tilsæt 400 μL 1x SDS-prøvebuffer (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glycerol; 1% 2-mercaptoethanol; 2% SDS) til P2- og P3-fraktionsrørene og kort sonikeret for at opløse bundfaldet. Overfør disse fraktionsprøver til et tomt 1,5 ml mikrorør.
- Den totale S3-fraktion opløses i 200 μL 2x SDS-prøvebuffer.
- Bland de resterende S1-fraktioner med et tilsvarende volumen 2x SDS-prøvebuffer til brug som standardkurve for Western blotting.
- Kog alle disse prøver ved 100 °C i 3 min. Når prøverne er afkølet til stuetemperatur, opbevares prøverne ved -20 °C.
- Kvantificering af proteiner i hver fraktion
- Kvantificer proteiner i P2-, P3- og S3-fraktionerne ved Western blotting. Brug først 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) til at adskille proteiner fra korrekt fortyndede P2-, P3- og S3-fraktioner og serielt fortyndet S1-prøve fra ethvert individ som en standardkurve. Derefter elektroblottet prøverne på polyvinylidenfluoridmembraner (se materialetabel).
BEMÆRK: Fortyndingsforholdet for hver fraktion afhænger af koncentrationen af et objektivt protein og antistoffets reaktivitet. (fx α-tubulin, TUBB3, β-tub og tyrosineret tubulin i hjernevæv: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2, 000, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; acetyleret tubulin i hjernevæv: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubulin i leveren: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubulin i thymus: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 fortynding af vævskoncentration). - Bloker membranen med 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) med 0,1% Tween 20 (TBS-T) i over 30 min.
- Nedsænk membranen i TBS-T-indeholdende primært antistof (se materialetabel) i over 2 timer. Derefter vaskes membranen med TBS-T i 3 minutter (3 gange).
- Primær antistof mærkes ved hjælp af HRP-konjugerede sekundære antistoffer (se materialetabel) i TBS-T i over 1 time. Derefter vaskes membranen med TBS-T i 3 minutter (3 gange).
- Udvikl membranerne med forbedret kemiluminescensreagens. Analysér derefter de relevante bånd med en selvlysende billedanalysator (se Materialetabel).
- Kvantificer proteinbåndintensiteterne ved hjælp af billedanalysesoftware (se materialetabel), og opret en standardkurve ved at plotte fortyndingsenhederne for de fortyndede S1-prøver, der anvendes til standardkurven langs X-aksen og båndintensiteterne langs Y-aksen.
- Proteinkoncentrationen (enheden) svarende til prøverne af den fortyndede fraktion aflæses. Den aflæste koncentration multipliceres med prøvefortyndingsfaktoren for at opnå en proteinenhed i hver fraktion. Del den målte enhed for hver fraktion med den samlede proteinenhed (P2 + P3 + S3) for at opnå en procentdel.
- Kvantificer proteiner i P2-, P3- og S3-fraktionerne ved Western blotting. Brug først 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) til at adskille proteiner fra korrekt fortyndede P2-, P3- og S3-fraktioner og serielt fortyndet S1-prøve fra ethvert individ som en standardkurve. Derefter elektroblottet prøverne på polyvinylidenfluoridmembraner (se materialetabel).
2. Evaluering af tubulins egenskaber i hver fraktion
BEMÆRK: Denne biokemiske metode tilvejebringer tre grupper af tubulinkomplekser defineret ved sedimenteringsegenskaber. Her blev status for tubulinkomplekser opnået i disse fraktioner identificeret baseret på størrelsen af komplekset og tubulin-PTM'erne. Gennemfør alle trin i denne protokol uden afbrydelse i et køligt temperaturmiljø, men frys ikke fraktionsprøverne, før de er opløst i SDS-prøvebufferen.
- Analyse af filterfælder
- S2- og S3-fraktionerne (500 μL hver) filtreres ved hjælp af en 300 kDa ultrafiltreringscentrifugeringskolonne (se materialetabellen). Der centrifugeres 14 000 × g ved 2 °C, indtil hele supernatanten er filtreret, eluerede proteiner opsamles i beholderrørene, og der forbliver fangede proteiner på reservoirrørenes filter.
- Oversæt hele filtraterne (ca. 500 μL) i modtagerrør til nye 1,5 ml mikrorør og opløs dem i 500 μL 2x SDS-prøvebuffer.
- Opløs resterne på filteret i reservoirrør i 1.000 μL 1x SDS-prøvebuffer ved pipettering og overførsel af prøverne til et nyt 1,5 ml mikrorør.
- Kog prøverne ved 100 °C i 3 min. Når prøverne er afkølet til stuetemperatur, opbevares prøverne ved -20 °C.
- Analyser mængderne af tubulin ved Western blotting med DM1A (anti-α-tubulin antistof, se Tabel over materialer).
- Størrelseseksklusionskromatografi
- Bærerbufferen (0,1 M MES, pH 6,8; 10% glycerol; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) suppleret med 1/10 koncentration af protease- og fosfatasehæmmere som beskrevet i trin 1.1.1. Derefter filtreres opløsningen og opbevares i et koldt miljø.
- Der fremstilles en gelfiltreringskromatografikolonne udstyret med et præparativt væskekromatografisystem i et kromatografikammer (se materialetabel) ved 4 °C.
- Før du injicerer prøver på søjlen, flyder 180 ml af bærebufferen for at vaske søjlen. Strømningshastigheden er 1 ml / min i 3 timer.
- Kommercielt tilgængeligt renset svinetubulin (se materialetabel) injiceres som kontrol eller S3-fraktionen fra musehjerner (500 μL hver) på søjlen.
- Eluer ved en strømningshastighed på 1,0 ml/min med bærebuffer. Opsaml de 1,5 ml fraktioner i 120 min. Eluerede proteiner overvåges ved absorbans ved 280 nm. Hold det maksimale tryk under 0,3 MPa.
- Efter hvirvelstrøm blandes de indsamlede fraktioner 50 μL af dem med 50 μL 2x SDS-prøvebuffer i et 1,5 ml mikrorør. Kog alle prøver ved 100 °C i 3 min. Når prøverne er afkølet til stuetemperatur, opbevares prøverne ved -20 °C.
- Analyser mængderne af tubulin ved Western blotting med DM1A, anti-α-tubulin-antistof og KMX-1, anti-β-tubulin-antistof (se materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantificering af tubulin i P2-, P3- og S3-fraktionerne fra musehjerne ved hjælp af MT-fraktioneringsmetoden
Tubulin i musevæv blev separeret i P2-, P3- og S3-fraktionerne ved MT-fraktioneringsmetoden og kvantificeret ved Western blotting (figur 1A). Bundfaldet af MT'er, der forblev i P2-fraktionen ved ultracentrifugering ved 100.000 × g i 20 minutter, tegnede sig for 34,86% ± 1,68% af det samlede tubulin i en musehjerne. Supernatanten (S2) blev yderligere centrifugeret ved 500.000 × g i 60 minutter. Der blev opnået et bundfald (P3-fraktion) og en supernatant (S3-fraktion), som tegnede sig for henholdsvis 56,13% ± 2,12% eller 9,01% ± 0,68% af det totale tubulin i musehjernerne (figur 1B).
Den cerebrale cortex, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder neuronale og ikke-neuronale celler, såsom glia. For selektivt at vurdere MT-stabiliteten i neuronerne i musehjerner kvantificerede vi TUBB3, en tubulin-subtype, der udelukkende udtrykkes i neuroner i det centrale og perifere nervesystem, ved Western blotting med Tuj1 (anti-TUBB3-antistof). Procentdelen af TUBB3 i P2-, P3- eller S3-fraktionen var henholdsvis 32,65% ± 2,20%, 59,31% ± 2,61% eller 8,04% ± 0,74%. De adskilte sig ikke signifikant fra α-tubulin (figur 1B). Disse resultater antydede, at neuroner og gliaceller udviser lignende MT-stabilitet, eller at neuroner indeholder meget højere mængder tubulin end gliaceller in vivo.
Karakteristik af tubulin genvundet i hver fraktion
Her blev musevævshomogenatet adskilt i tre fraktioner ved to-trins ultracentrifugering med forskellige gravitationsaccelerationer; Derfor varierede sedimenteringskoefficienterne blandt proteiner eller deres komplekser i hver fraktion. Selvom tubulin udfældet ved 100.000 × g ultracentrifugering blev betragtet som konventionel MT, bør det præciseres, hvordan det nyopnåede tubulin af P3-fraktionen her adskiller sig fra tubulin i P2- og S3-fraktionerne.
For at karakterisere S3-tubulin blev S2 (P3 + S3) eller S3-fraktionen udsat for ultrafiltrering og størrelseseksklusionskromatografi. Tubulinkomplekserne i S3-fraktionen kunne passere gennem en 300 kDa ultrafiltreringsspinsøjle fuldstændigt, mens næsten alt tubulin i S2-fraktionen blev fanget på filteret (figur 2A). Endvidere blev molekylvægten af tubulinkomplekser i S3-fraktionen målt ved størrelseseksklusionskromatografi. S3-tubulin elueret ved en top svarende til 100 kDa, hvilket svarer til det for kommercielt tilgængelige rensede tubulindimerer (figur 2B,C). Desuden var andelene af α- og β-tubulin genfundet i hver fraktion ved MT-fraktioneringsmetoden ens (figur 2D). Faktisk har det vist sig, at α- og β-tubulin let kan eksistere som monomerer i levende celler24. At dømme ud fra den estimerede rapporterede kD-værdi (nM-rækkefølge) og koncentrationen af tubulin genfundet i S3-fraktionen (~11 μM) menes de fleste (> 98%) tubulin imidlertid at eksistere som α/β-dimerer. Derfor er tubulin i S3-fraktionen primært en opløselig α/β-tubulindimer.
Tubulinpolymererne blev adskilt i to fraktioner, P2 og P3, baseret på deres posttranslationelle modifikationer (PTM'er). For at skelne mellem disse fraktioner blev Western blotting udført under anvendelse af specifikke antistoffer. Det anti-acetylerede α-tubulin-antistof, der tjener som markør for stabile MT'er, viste, at P2-fraktionen var signifikant beriget med 97,40% ± 0,52% acetyleret α-tubulin (figur 2E), mens det totale α-tubulin blev genfundet i P3- og S3-fraktionerne (figur 1B). Omvendt afslørede det anti-tyrosinerede α-tubulin-antistof, der indikerer labile MT'er, at 75,43% ± 2,69% af tyrosinerede α-tubulin var til stede i P3-fraktionen (figur 2F). Disse resultater bekræfter, at P2-fraktionen primært indeholder tubulin inden for stabile MT'er, mens P3-fraktionen består af tubulin inden for labile MT'er.
Vurdering af MT-stabilitet under frysning og nocodazolbehandling
Effekten af frysning og nocodazolbehandling på stabiliteten af intracerebrale MT'er hos mus blev analyseret for at bestemme, om forbigående ændringer i stabiliteten af MT'er kunne skelnes ved MT-fraktioneringsmetoden. MT'er adskilles generelt ved lave temperaturer, men nogle MT'er forbliver stabile i kulden. Efter vejning af hjernerne blev de frosset ned i flydende nitrogen og anbragt ved -80 °C i 30 minutter. Den forbigående frosne hjerne og rå hjerne som kontrol blev homogeniseret og fraktioneret i P2-, P3- og S3-fraktionerne. Derefter blev andelen af tubulin indeholdt i de tre fraktioner kvantificeret ved Western blotting. Når hjernen var frosset før homogenisering, faldt α-tubulin i P2-fraktionen, og det i P3-fraktionen steg i forhold til det i den rå hjerne (figur 3A). Blodpropper med 6-11B1 (acetyleret α-tubulin) eller 1A2 (tyrosineret α-tubulin) afslørede også, at hjernefrysning reducerede acetyleringsniveauet (figur 3B) og øgede tyrosineringsniveauet (figur 3C) af α-tubulin i P2-fraktionen.
Nocodazol er et mikrotubuli-målretningsmiddel (MTA), der forhindrer MT-polymerisering ved binding til β-tubulin og fremmer MT-depolymerisering. Musehjerner blev homogeniseret i taxolfri MSB(+) med eller uden 10 μM nocodazol og anbragt ved 4 °C i 20 minutter. Det ubehandlede eller nocodazolbehandlede homogenat blev tilsat til 10 μM Taxol, rehomogeniseret og fraktioneret i P2-, P3- og S3-fraktionerne. Derefter blev andelen af tubulin indeholdt i de tre fraktioner kvantificeret ved Western blotting. Blodpropper med DM1A (α-tubulin) viste, at α-tubulin i P2-fraktionen faldt, og at der i P3-fraktionen var tendens til at stige med nocodazolbehandling (figur 3D). Disse resultater indikerer, at P2-tubulin blev destabiliseret som reaktion på lav temperatur eller nocodazol, og at P2-fraktionen indeholdt robuste MT'er, der modstod de eksperimentelle betingelser. I modsætning til frysning påvirkede nocodazol ikke tubulin-PTM'er (figur 3E,F). Baseret på resultaterne og ovenstående data kan depolymeriseringen af MT'er, der ikke kan detekteres ved PTM-analyse, evalueres ved denne metode.
Sammenligning af forholdet mellem stabile MT'er, labile MT'er og frit tubulin i væv
Stabiliteten af MT'er varierer mellem forskellige væv afhængigt af cellernes proliferative kapacitet i disse væv. Især stabile MT'er er mere rigelige i nervesystemet, som primært består af ikke-proliferative neuroner sammenlignet med andre væv4. For at vurdere evnen af den udviklede MT-fraktioneringsmetode til at skelne forskelle i MT-stabilitet på tværs af forskellige væv blev lever og thymi hos mus fraktioneret, og det genvundne tubulin i hver fraktion blev kvantificeret. Resultaterne afslørede, at hjernen i sammenligning med andre væv udviste et signifikant højere niveau af P2-tubuliner, mens P3-tubuliner især blev beriget i væv indeholdende proliferative celler (figur 4). Derudover bekræftede Western blotting ved hjælp af 6-11B1 og 1A2 antistoffer tilstedeværelsen af højere MT-stabilitet i nervesystemet. De forskellige fordelingsmønstre for tubulin PTM'er indikerede tydeligt, at P2-tubulin, der specifikt findes i nervesystemet, stammer fra stabile MT'er (figur 4). Disse resultater understøtter yderligere forestillingen om, at P2- og P3-fraktionerne svarer til henholdsvis stabile og labile MT'er.
Figur 1: Kvantificering af tubulin i musevæv ved hjælp af MT-fraktioneringsmetoden. A) Resumé af MT-fraktioneringsmetoden for væv. Stabile MT'er (P2-fraktion), labile MT'er (P3-fraktion) og frit tubulin (S3-fraktion) i væv kan adskilles ved 2-trins ultracentrifugering under betingelser, der undertrykker MT-polymerisering og depolymerisering under fremstilling. (B) MT'er i musecortex blev udfældet ved konventionel 100.000 × g ultracentrifugering efterfulgt af 500.000 × g ultracentrifugering. Derefter blev tubuliner adskilt i P2-, P3- og S3-fraktionerne kvantificeret ved Western blotting med DM1A (α-tubulin) og anti-Tuj1 (TUBB3). Andelen af proteiner i hver fraktion (P2, P3 eller S3) til den samlede fraktion (P2 + P3 + S3) blev beregnet som beskrevet i protokolafsnittet (betyder ± SD'er, n = 4). Dette tal er ændret fra Hagita et al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: MT-fraktioneringsmetoden muliggør adskillelse af stabile MT'er, labile MT'er og frit tubulin i musens hjernebark. (A) S2- eller S3-fraktionerne (input) blev analyseret ved hjælp af filterfældeanalysen ved hjælp af en 300 kDa ultrafiltreringsspinsøjle. Tubuliner opnået ved filtrering (modtager) og fældefangst (reservoir) blev kvantificeret ved Western blotting med DM1A (α-tubulin). B) Renset tubuliner fra svin blev underkastet MT-fraktioneringsmetoden og fandtes hovedsagelig at være indsamlet i S3-fraktionen. C) Molekylstørrelsen af tubulin i S3-fraktionen. S3-fraktionen blev adskilt ved størrelsesekskluderingskromatografi under anvendelse af en gelfiltreringskromatografikolonne. Proteiner i hver fraktion blev kvantificeret ved Western blotting med DM1A (α-tubulin) og KMX-1 (β-tubulin). Den teoretiske molekylvægt vises øverst på panelerne. (D) Andelene af α-tubulin og β-tubulin i hver fraktion var ens. Tubuliner adskilt i P2-, P3- og S3-fraktionerne blev kvantificeret ved Western blotting med KMX-1 (β-tubulin). Kvantificering af andelen af α-tubulin og β-tubulin i hver fraktion i forhold til summen af den samlede fraktion (gennemsnit ± SD'er, n = 4). Statistiske analyser blev udført af Student's t-test. (E,F) Modifikationerne af α-tubulin i P2-, P3- og S3-fraktionerne blev verificeret ved Western blotting med 6-11B1 (acetyleret α-tubulin: E) og 1A2 (tyrosineret α-tubulin: F). Kvantificering af andelen af tyrosineret eller acetyleret α-tubulin i hver fraktion i forhold til den samlede fraktion (gennemsnit ± SD'er, n = 4). (A-C) er blevet ændret fra Hagita et al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af MT-depolymerisering induceret ved frysning eller MTA. (A-C) MT's stabilitet efter 30 minutters frysning ved -80 °C blev evalueret. Proportionerne af tubulin indeholdt i de tre fraktioner af den rå og frosne hjerne blev kvantificeret ved Western blotting med DM1A (α-tubulin: A), 1A2 (tyrosineret α-tubulin: B) og 6-11B1 (acetyleret α-tubulin: C). (D-F) Nocodazols virkning på MT-stabiliteten blev evalueret. Proportionerne af tubulin indeholdt i de tre fraktioner af nocodazol ubehandlede eller behandlede hjerner blev kvantificeret ved Western blotting med DM1A (α-tubulin: D), 1A2 (tyrosineret α-tubulin: E) og 6-11B1 (acetyleret α-tubulin: F). Repræsentative relative niveauer af tyrosination (B, E) eller acetylering (C, F) blev normaliseret til mængden af total α-tubulin (A, D ) (betyder ± SD'er, n = 4). Statistiske analyser blev udført af Student's t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Andele af stabile MT'er, labile MT'er og frit tubulin i hjernen, leveren og thymus i mus. Musens hjerner, lever og thymi blev dissekeret og udsat for MT-fraktioneringsmetoden. Proteiner adskilt i hver fraktion blev kvantificeret ved Western blotting med DM1A (α-tubulin), 6-11B1 (acetyleret α-tubulin) og 1A2 (tyrosineret α-tubulin). Andelen af proteiner i hver fraktion (P2, P3 eller S3) til den samlede fraktion (P2 + P3 + S3) blev beregnet som beskrevet i protokolafsnittet (betyder ± SD'er, n = 4). Statistiske analyser blev udført af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vigtigste opgave ved undersøgelse af tubulins status i væv fra levende organismer er at forhindre utilsigtet MT-polymerisation eller depolymerisering under fremstillingen. Stabiliteten af MT'er i prøver påvirkes af faktorer som koncentrationen af Taxol i MSB, andelen af vævsmængde til buffer og temperatur under processen fra vævsfjernelse til homogenisering og centrifugering. Derfor blev betingelserne optimeret i hvert trin i protokollen til analyse af musevæv med et 20 gange volumen homogenat. En højere koncentration af Taxol kan inducere MT-polymerisation in vitro, selv under nedkølede forhold25. Ved analyse af væv med signifikant forskellige tubulinkoncentrationer eller væsentlige protokolændringer bør hver operatør optimere trinene i henhold til de specifikke mål for deres eksperimenter.
I den gennemførte undersøgelse blev en ny population af MT'er, kaldet P3, opnået fra den konventionelle "opløselige fraktion" ved anvendelse af ultracentrifugering ved 500.000 × g20. Teoretiske beregninger baseret på faktorer som rotorens K-faktor, centrifugalkraft og centrifugeringsvarighed tyder på, at de tubuliner, der er til stede i S3-fraktionen, sandsynligvis repræsenterer 6S tubulindimerer. Omvendt kan tubulin i P3-fraktionen svare til MT'er, der er kortere i længden sammenlignet med dem, der findes i P2-fraktionen. Denne observation stemmer overens med resultatet, der viser, at frysning af væv før homogenisering, hvilket fører til delvis sammenbrud af MT'er26, resulterede i en signifikant stigning i tubulin inden for P3-fraktionen og et samtidigt fald i P2-fraktionen (figur 3A). Desuden indikerer analysen af tubulin-PTM'er og bindingsegenskaberne for forskellige MAP'er, at P2- eller P3-fraktionen indeholder henholdsvis stabile eller labile MT'er. For eksempel var visse MAP'er, der var specifikke for stabile MT'er, primært fundet i neuroner, udelukkende til stede i P2-fraktionen23. Det er derfor plausibelt at antyde, at P3-fraktionen omfatter MT'er, der er mere dynamiske og labile sammenlignet med dem i P2-fraktionen.
Ifølge teorien bag metoden kan uhensigtsmæssige eksperimentelle betingelser involveret i MT-stabilisering eller centrifugering resultere i dårlig fraktionering. For eksempel fører en lav koncentration af Taxol til et lille fald i P2-tubulin, mens overskydende Taxol øger P2-tubulin på grund af MT-dannelse under fremstilling23. På samme måde kan opvarmning af væv og prøver uhensigtsmæssigt få MT'er til at hyperpolymerisere og tau til at nedbrydes eller fragmentere23. Desuden er centrifugalforholdene kritiske for adskillelsen af P3- og S3-fraktionerne, og et lille fald i tyngdeaccelerationen reducerer signifikant genvindingen af P3-fraktionen. Derfor anbefales det at følge protokoltrinnene nøje, hvis der observeres unormale fraktioneringer.
Denne enkle fraktioneringsmetode kan bredt anvendes til at analysere proportionerne af tubuliner blandt stabile MT'er, labile MT'er og frie dimerer i væv. Denne metode giver flere fordele, da den kan detektere subtile ændringer i tubulinstatus, som muligvis ikke er tydelige gennem kvantificering af tubulin-PTM'er. Analyse af MT-stabilitet er vigtig for at forstå den fysiologiske betydning af MT'er, især i store og komplekse neuronale celler, og for at undersøge lidelser forbundet med MT-dysregulering. Mutationer eller dysfunktioner i tubulin- eller MAP-gener er for eksempel forbundet med neuroudviklingsforstyrrelser og neurodegenerative sygdomme27,28. I Alzheimers sygdom er MT'er kendt for at blive reduceret, muligvis på grund af det funktionelle tab af tau-protein i berørte neuroner 15,29,30,31,32,33. MTA'er, der modulerer MT-stabilitet og hæmmer celledeling, er blevet foreslået som potentielle terapier for neurologiske lidelser13,34. Brug af denne unikke MT-fraktioneringsmetode til at analysere stabiliteten og adfærden af MT'er og MAP'er i sygdomsmodeldyr kan bidrage væsentligt til at belyse patogenesen af tau-relateret demens og identificere nye terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvis støttet af JST, oprettelsen af universitetsstipendier med henblik på skabelse af videnskabelig teknologisk innovation (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), et Grant-in-Aid for Scientific Research (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), et Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas med titlen "Brain Protein Aging and Dementia Control" fra MEXT (TM; 26117004) og af Uehara Research Fellowship fra Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C.
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al.
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D.
