Summary
Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.
Abstract
Microtúbulos, compostos por dímeros de α/β-tubulina, são um componente crucial do citoesqueleto em células eucarióticas. Esses polímeros semelhantes a tubos exibem instabilidade dinâmica à medida que subunidades heterodímeras de tubulina sofrem polimerização e despolimerização repetitivas. O controle preciso da estabilidade e dinâmica dos microtúbulos, obtido através de modificações pós-traducionais da tubulina e proteínas associadas aos microtúbulos, é essencial para várias funções celulares. Disfunções nos microtúbulos estão fortemente implicadas na patogênese, incluindo doenças neurodegenerativas. A pesquisa em andamento concentra-se em agentes terapêuticos direcionados a microtúbulos que modulam a estabilidade, oferecendo opções potenciais de tratamento para essas doenças e cânceres. Consequentemente, a compreensão do estado dinâmico dos microtúbulos é crucial para avaliar a progressão da doença e os efeitos terapêuticos.
Tradicionalmente, a dinâmica dos microtúbulos tem sido avaliada in vitro ou em células cultivadas através de fracionamento rugoso ou imunoensaio, usando anticorpos visando modificações pós-traducionais da tubulina. No entanto, a análise precisa do estado da tubulina em tecidos usando tais procedimentos impõe desafios. Neste estudo, desenvolvemos um método simples e inovador de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos.
O procedimento envolveu a homogeneização de tecidos dissecados de camundongos em tampão estabilizador de microtúbulos na proporção de volume de 19:1. Os homogeneizados foram então fracionados através de um processo de ultracentrifugação em duas etapas após centrifugação lenta inicial (2.400 × g) para remoção de debris. A primeira etapa de ultracentrifugação (100.000 × g) precipitou microtúbulos estáveis, enquanto o sobrenadante resultante foi submetido a uma segunda etapa de ultracentrifugação (500.000 × g) para fracionar microtúbulos lábeis e dímeros de tubulina solúveis. Este método determinou as proporções de tubulina constituindo microtúbulos estáveis ou lábeis no cérebro de camundongos. Adicionalmente, variações teciduais distintas na estabilidade dos microtúbulos foram observadas que se correlacionaram com a capacidade proliferativa das células constituintes. Esses achados destacam o potencial significativo deste novo método para analisar a estabilidade de microtúbulos em condições fisiológicas e patológicas.
Introduction
Microtúbulos (MTs) são estruturas tubulares alongadas constituídas por protofilamentos constituídos por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempenham papéis essenciais em vários processos celulares, como divisão celular, motilidade, manutenção da forma e transporte intracelular, tornando-se componentes integrantes do citoesqueleto eucariótico1. A extremidade inferior das MTs, onde a subunidade α-tubulina é exposta, é relativamente estável, enquanto a extremidade superior, onde a subunidade β-tubulina é exposta, sofre despolimerização dinâmica e polimerização2. Esse ciclo contínuo de adição e dissociação de dímeros de tubulina na extremidade superior, denominado instabilidade dinâmica, resulta em um processo repetitivo de resgate e catástrofe3. As MTs exibem domínios focais com variações localizadas na instabilidade dinâmica, incluindo domínios estáveis e lábeis4.
O controle preciso da instabilidade dinâmica das MTs é crucial para inúmeras funções celulares, particularmente em neurônios caracterizados por morfologias intrincadas. A adaptabilidade e a durabilidade das MTs desempenham um papel vital no desenvolvimento e funcionamento adequado das células nervosas 5,6,7. A instabilidade dinâmica das MTs tem sido associada a várias modificações pós-traducionais (MPTs) da tubulina, tais como acetilação, fosforilação, palmitoilação, destirosinação, delta 2, oxidação de poliglutamina e poliglicilação. Além disso, a ligação de proteínas associadas a microtúbulos (MAPs) serve como mecanismo regulatório8. As MPTs, excluindo a acetilação, ocorrem predominantemente na região carboxi-terminal da tubulina, situada na superfície externa das MTs. Essas modificações criam diversas condições de superfície nas MTs, influenciando sua interação com as MAPs e, em última análise, governando a estabilidade das MTs9. A presença de um resíduo de tirosina carboxi-terminal na α-tubulina é indicativa de MTs dinâmicas, que são rapidamente substituídas pelo pool de tubulina livre. Por outro lado, a destirosinação do terminal carboxi e a acetilação de Lys40 significam MTs estáveis com reduzida instabilidade dinâmica 9,10.
As MPTs da tubulina têm sido extensivamente empregadas em experimentos para avaliar a dinâmica e estabilidade de MTs 5,7,11,12,13,14,15. Por exemplo, em estudos de cultura celular, as tubulinas podem ser segregadas em dois pools: o pool de tubulina livre e o pool de MT. Isso é conseguido liberando-se tubulina livre através da permeabilização celular antes da fixação das MTs remanescentes 15,16,17,18,19. Os métodos bioquímicos envolvem o uso de estabilizantes químicos de MT que protegem MTs de catástrofes, possibilitando a separação de MTs e tubulina livre através de centrifugação20,21,22. No entanto, esses procedimentos não diferenciam entre MTs estáveis e menos estáveis (lábeis), tornando impossível quantificar MTs ou tubulina solúvel em tecidos como o cérebro. Consequentemente, avaliar a estabilidade da MT em organismos sob condições fisiológicas e patológicas tem se mostrado um desafio. Para resolver essa limitação experimental, desenvolvemos uma nova técnica para separar com precisão MTs e tubulina livre em tecido decamundongos23.
Este método único de fracionamento de MT envolve homogeneização de tecidos sob condições que mantêm o status de tubulina nos tecidos e centrifugação em duas etapas para separar MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre. Este procedimento simples pode ser aplicado a estudos amplos, incluindo pesquisa básica sobre MTs e MAPs em organismos vivos, análises fisiológicas e patológicas de saúde e doenças associadas à estabilidade de MT, e desenvolvimento de drogas e outras terapêuticas que visam MTs.
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Protocol
1. Método de fracionamento MT
NOTA: Todos os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Doshisha. Camundongos C57BL/6J de ambos os sexos, com 3-4 meses de idade, foram usados aqui. Nesse protocolo, os tecidos dissecados, por exemplo, cérebro, fígado ou timo, foram imediatamente homogeneizados em tampão estabilizador de microtúbulos (MSB) gelado, que continha Taxol (estabilizador de MT) em uma concentração que impedia não apenas a despolimerização, mas também a repolimerização da MT. O homogeneizado foi separado em três frações por um processo de ultracentrifugação em duas etapas (Figura 1). Todas as etapas deste protocolo foram concluídas sem interrupção em ambiente de temperatura fria, e os tecidos e frações não foram congelados até que fossem dissolvidos em tampão de amostra dodecil sulfato de sódio (SDS).
- Preparo de MSB e microtubos
- Para preparar MSB, misturar os seguintes reagentes: 0,1 M 2-(N-morfolino)ácido etanossulfônico (MES), pH 6,8 (neutralizado por KOH), 10% glicerol, 0,1 mM TDT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, inibidores de fosfatase (1 mM NaF, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO 4, 0,5 μM ácido ocadaico), 1x coquetel inibidor de protease, e inibidores de protease (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/mL pepstatin, 1 μg/mL antipain, 10 μg/mL aprotinina, 10 μg/mL leupeptina, 50 μg/mL TLCK) (ver Tabela de Materiais) e denotam como MSB(-).
- Imediatamente antes da dissecção do tecido, adicione 10 μM de Taxol e 2 mM de GTP (ver Tabela de Materiais) ao MSB(-). Esse buffer é indicado como MSB (+). Prepare o tampão no dia do uso e mantenha-o no gelo.
- Prepare os microtubos para amostragem. Microtubo vazio de 2,0 mL para armazenamento homogeneizado; microtubo vazio de 1,5 mL para armazenamento do sobrenadante1 (S1) lisado, precipitado2 (P2) e precipitado3 (P3); 1,5 mL de microtubo com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) para armazenamento do tecido dissecado; 1,5 mL de microtubo com 200 μL de tampão 2x SDS-amostra (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glicerol; 2% 2-mercaptoetanol; 4% SDS) para armazenamento da amostra S1 e sobrenadante3 (S3); e microtubo de centrifugação para rotores centrífugos TLA55 e TLA120.2 (ver Tabela de Materiais). Rotule todos os tubos e coloque-os no gelo.
- Homogeneização de tecido de camundongo
- Prepare uma mesa gelada para dissecção de tecido. Primeiro, encha uma caixa com gelo esmagado e coloque duas placas de Petri no gelo, uma com o lado interno para cima e a outra com o lado externo. Encha PBS gelado em um prato para lavagem transitória e armazenamento de tecidos dissecados. Coloque papel filtro umedecido com PBS em outro prato virado.
- Para sacrificar um camundongo, realizar luxação cervical sob anestesia profunda com um anestésico misto de butorfanol, midazolam e medetomidina. Em seguida, disseque imediatamente os tecidos, por exemplo, cérebro, fígado ou timo, e lave-os com PBS gelado em uma placa de Petri.
NOTA: Qualquer tipo de tecido mole pode ser analisado por este método. No entanto, o tamanho do tecido é limitado pela faixa de volume recomendada do homogeneizador utilizado. Por exemplo, se um volume de 2 mL de homogeneizador é usado, 50-100 mg de tecido é recomendado. - Após pesar os microtubos de 1,5 mL preenchidos com PBS para armazenamento do tecido dissecado, recorte e armazene os tecidos dentro dos microtubos e pese novamente cada microtubo. O peso úmido de cada tecido pode ser calculado subtraindo-se o peso do tubo antes e depois da adição do tecido.
- Homogeneizar imediatamente o tecido em MSB gelado(+) com um homogeneizador refrigerado (ver Tabela de Materiais). O volume de MSB (+) foi 19 vezes (μL) o peso úmido do tecido (mg). Realizar homogeneização com 20 golpes até que os pedaços de tecido desapareçam.
NOTA: Por exemplo, 1.900 μL de MSB (+) é usado para 100 mg de tecido. Como o volume de MSB(+) a ser adicionado deve ser ajustado para cada peso úmido das peças de tecido analisadas, é necessário pesar cada pedaço de tecido com precisão.
- Centrifugação de homogeneizados de tecido de camundongo
- Mover todo o homogeneizado para um microtubo de 2 ml com uma pipeta de Pasteur e centrifugar a 2.400 × g durante 3 min a 2 °C para remover os detritos por precipitação.
- Transferir todo o sobrenadante (fração S1) para um novo microtubo e vórtice de 1,5 mL. Em seguida, aliquote 200 μL da fração S1 em um microtubo de centrifugação e centrifugação a 100.000 × g usando um rotor TLA-55 por 20 min a 2 °C para obter as proteínas de peso molecular relativamente grandes como precipitado (fração P2).
NOTA: O volume da amostra submetida às etapas de ultracentrifugação afeta o raio de centrifugação e a eficiência de precipitação das moléculas. Manter o volume da amostra a 200 μL ou menos após esta etapa para evitar fracionamento impreciso. - Centrifugar ainda mais todo o sobrenadante resultante (fração S2) a 500.000 × g usando um rotor TLA-120.2 por 60 min a 2 °C para separar os complexos proteicos insolúveis no precipitado (fração P3) das proteínas solúveis no sobrenadante (fração S3).
- Adicionar 400 μL de tampão 1x SDS-amostra (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glicerol; 1% 2-mercaptoetanol; 2% SDS) aos tubos de fração P2 e P3 e sonicar brevemente para dissolver o precipitado. Transfira essas amostras fracionadas para um microtubo vazio de 1,5 mL.
- Dissolver a fração S3 total em 200 μL de 2x tampão de amostra SDS.
- Misture as frações S1 restantes com um volume igual de buffer de amostra SDS 2x para uso como uma curva padrão para Western blotting.
- Ferva todas estas amostras a 100 °C durante 3 minutos. Depois de as amostras terem arrefecido à temperatura ambiente, conservar as amostras a -20 °C.
- Quantificação de proteínas em cada fração
- Quantificar proteínas nas frações P2, P3 e S3 por Western blotting. Primeiro, use eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10% (SDS-PAGE) para separar proteínas das frações P2, P3 e S3 adequadamente diluídas e amostra S1 diluída em série de qualquer indivíduo como uma curva padrão. Em seguida, eletroblot as amostras em membranas de fluoreto de polivinilideno (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A razão de diluição de cada fração depende da concentração de uma proteína objetiva e da reatividade do anticorpo. (por exemplo, α-tubulina, TUBB3, β-tub e tubulina tirosinada no tecido cerebral: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2,000,; 000, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; tubulina acetinada no tecido cerebral: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubulina no fígado: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubulina no timo: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 diluição da concentração tecidual). - Bloquear a membrana com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) com 0,1% Tween 20 (TBS-T) por mais de 30 min.
- Imergir a membrana em TBS-T contendo anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) por mais de 2 h. Em seguida, lave a membrana com TBS-T por 3 min (3 vezes).
- Rotular o anticorpo primário usando anticorpos secundários conjugados à HRP (ver Tabela de Materiais) na TBS-T por mais de 1 h. Em seguida, lave a membrana com TBS-T por 3 min (3 vezes).
- Desenvolver as membranas com o reagente de quimioluminescência Enhanced . Em seguida, analise as bandas de interesse com um analisador de imagem luminescente (ver Tabela de Materiais).
- Quantifique as intensidades da banda de proteínas usando um software de análise de imagem (veja Tabela de Materiais) e crie uma curva padrão plotando as unidades de diluição das amostras S1 diluídas usadas para a curva padrão ao longo do eixo X e as intensidades de banda ao longo do eixo Y.
- Ler a concentração de proteínas (unidade) correspondente às amostras de fracção diluída. Multiplique a concentração lida pelo fator de diluição da amostra para obter uma unidade proteica em cada fração. Divida a unidade medida de cada fração pela unidade proteica total (P2 + P3 + S3) para obter uma porcentagem.
- Quantificar proteínas nas frações P2, P3 e S3 por Western blotting. Primeiro, use eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10% (SDS-PAGE) para separar proteínas das frações P2, P3 e S3 adequadamente diluídas e amostra S1 diluída em série de qualquer indivíduo como uma curva padrão. Em seguida, eletroblot as amostras em membranas de fluoreto de polivinilideno (ver Tabela de Materiais).
2. Avaliação das propriedades da tubulina em cada fração
NOTA: Este método bioquímico fornece três grupos de complexos de tubulina definidos pelas propriedades de sedimentação. Aqui, o status dos complexos de tubulina obtidos nessas frações foi identificado com base no tamanho do complexo e das MPTs tubulinas. Conclua todas as etapas deste protocolo sem interrupção em um ambiente de temperatura fria, mas não congele as amostras de fração até que sejam dissolvidas no tampão de amostra SDS.
- Ensaio de armadilha de filtro
- Filtrar as frações S2 e S3 (500 μL cada) utilizando uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 kDa (ver Tabela de Materiais). Realizar centrifugação de 14.000 × g a 2 °C até que todo o sobrenadante seja filtrado, as proteínas eluídas sejam coletadas nos tubos receptores e as proteínas aprisionadas permaneçam no filtro dos tubos reservatório.
- Traduzir os filtrados inteiros (aproximadamente 500 μL) em tubos receptores em novos microtubos de 1,5 mL e dissolvê-los em 500 μL de 2x tampão de amostra SDS.
- Solubilizar os resíduos no filtro dos tubos reservatório em 1.000 μL de tampão de amostra 1x SDS pipetando e transferindo as amostras para um novo microtubo de 1,5 mL.
- Ferver as amostras a 100 °C durante 3 min. Depois de as amostras terem arrefecido à temperatura ambiente, conservar as amostras a -20 °C.
- Analise as quantidades de tubulina por Western blotting com DM1A (anticorpo anti-α-tubulina, ver Tabela de Materiais).
- Cromatografia de exclusão de tamanho
- Preparar o tampão transportador (0,1 M MES, pH 6,8; 10% glicerol; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM TDT) suplementado com 1/10 concentração de protease e inibidores da fosfatase, conforme descrito no passo 1.1.1. Em seguida, filtre a solução e armazene-a em um ambiente frio.
- Preparar uma coluna de cromatografia de filtração em gel equipada com um sistema de cromatografia líquida preparativa numa câmara de cromatografia (ver quadro de materiais) a 4 °C.
- Antes de injetar amostras na coluna, escoe 180 mL do tampão transportador para lavar a coluna. O fluxo é de 1 mL/min por 3 h.
- Injetar tubulina suína purificada comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) como controle ou a fração S3 de cérebros de camundongos (500 μL cada) na coluna.
- Eluir a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min com tampão carreador. Coletar as frações de 1,5 mL por 120 min. Monitorar proteínas eluídas por absorbância a 280 nm. Mantenha a pressão máxima abaixo de 0,3 MPa.
- Após vórtex das frações coletadas, misturar 50 μL delas com 50 μL de tampão de amostra 2x SDS em um microtubo de 1,5 mL. Ferva todas as amostras a 100 °C durante 3 min. Depois de as amostras terem arrefecido à temperatura ambiente, conservar as amostras a -20 °C.
- Analisar as quantidades de tubulina por Western blotting com DM1A, anticorpo anti-α-tubulina e KMX-1, anticorpo anti-β-tubulina (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
Quantificação de tubulina nas frações P2, P3 e S3 do cérebro de camundongos pelo método de fracionamento de MT
A tubulina em tecido de camundongo foi separada nas frações P2, P3 e S3 pelo método de fracionamento MT e quantificada por Western blotting (Figura 1A). O precipitado de MTs que permaneceram na fração P2 por ultracentrifugação a 100.000 × g por 20 min representou 34,86% ± 1,68% da tubulina total em cérebro de camundongo. O sobrenadante (S2) foi centrifugado a 500.000 × g por 60 min. Foram obtidos um precipitado (fração P3) e um sobrenadante (fração S3), que representaram 56,13% ± 2,12% ou 9,01% ± 0,68% da tubulina total no cérebro de camundongos, respectivamente (Figura 1B).
O córtex cerebral utilizado neste estudo contém células neuronais e não neuronais, como a glia. Para avaliar seletivamente a estabilidade da MT em neurônios de cérebros de camundongos, quantificamos TUBB3, um subtipo de tubulina expresso exclusivamente em neurônios do sistema nervoso central e periférico, por Western blotting com Tuj1 (anticorpo anti-TUBB3). O percentual de TUBB3 na fração P2, P3 ou S3 foi de 32,65% ± 2,20%, 59,31% ± 2,61%, ou 8,04% ± 0,74%, respectivamente. Não diferiram significativamente dos da α-tubulina (Figura 1B). Esses resultados sugerem que neurônios e células gliais exibem estabilidade semelhante à MT ou que os neurônios contêm quantidades muito maiores de tubulina do que as células gliais in vivo.
Características da tubulina recuperada em cada fração
Aqui, o homogeneizado de tecido de camundongo foi separado em três frações por ultracentrifugação em duas etapas com diferentes acelerações gravitacionais; portanto, os coeficientes de sedimentação entre proteínas ou seus complexos em cada fração diferiram. Embora a tubulina precipitada a 100.000 × g de ultracentrifugação tenha sido considerada MT convencional, deve-se esclarecer como a tubulina recém-obtida da fração P3 difere da tubulina nas frações P2 e S3.
Para caracterizar a tubulina S3, a fração S2 (P3 + S3) ou S3 foi submetida à cromatografia de ultrafiltração e exclusão de tamanho. Os complexos de tubulina da fração S3 podiam passar completamente por uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 kDa, enquanto quase toda a tubulina da fração S2 estava aprisionada no filtro (Figura 2A). Além disso, o peso molecular dos complexos de tubulina na fração S3 foi medido por cromatografia de exclusão de tamanho. A tubulina S3 eluída em um pico correspondente a 100 kDa, semelhante ao dos dímeros de tubulina purificada disponíveis comercialmente (Figura 2B,C). Além disso, as proporções de α e β-tubulina recuperadas em cada fração pelo método de fracionamento da MT foram iguais (Figura 2D). De fato, tem sido demonstrado que a α- e a β-tubulina podem existir ligeiramente como monômeros em células vivas24. No entanto, a julgar pelo valor estimado de kD (ordem nM) relatado, e pela concentração de tubulina recuperada na fração S3 (~11 μM), acredita-se que a maioria (> 98%) da tubulina exista como dímeros de α/β. Portanto, a tubulina na fração S3 é primariamente um dímero solúvel de α/β-tubulina.
Os polímeros da tubulina foram separados em duas frações, P2 e P3, com base em suas modificações pós-traducionais (MPTs). Para diferenciar essas frações, o Western blotting foi realizado usando anticorpos específicos. O anticorpo anti-α-tubulina acetilada, que serve como marcador para MTs estáveis, demonstrou que a fração P2 foi significativamente enriquecida com 97,40% ± 0,52% de α-tubulina acetilada (Figura 2E), enquanto a α-tubulina total foi recuperada nas frações P3 e S3 (Figura 1B). Por outro lado, o anticorpo antitirosina α-tubulina, indicativo de MTs lábeis, revelou que 75,43% ± 2,69% de tirosina α-tubulina estavam presentes na fração P3 (Figura 2F). Esses achados confirmam que a fração P2 contém principalmente tubulina dentro de MTs estáveis, enquanto a fração P3 consiste de tubulina dentro de MTs lábeis.
Avaliação da estabilidade da MT sob congelamento e tratamento com nocodazol
O efeito do congelamento e do tratamento com nocodazol na estabilidade de MTs intracerebrais de camundongos foi analisado para determinar se mudanças transitórias na estabilidade de MTs poderiam ser discernidas pelo método de fracionamento de MT. MTs geralmente se desmontam em baixas temperaturas, mas alguns MTs permanecem estáveis no frio. Após a pesagem dos cérebros, eles foram congelados em nitrogênio líquido e colocados a -80 °C por 30 min. O cérebro congelado transitório e o cérebro bruto como controle foram homogeneizados e fracionados nas frações P2, P3 e S3. Em seguida, a proporção de tubulina contida nas três frações foi quantificada por Western blotting. Uma vez congelado o cérebro antes da homogeneização, a α-tubulina na fração P2 diminuiu, e a fração P3 aumentou em comparação com a do cérebro bruto (Figura 3A). Blots com 6-11B1 (α-tubulina acetilada) ou 1A2 (α-tubulina tirosinada) também revelaram que o congelamento cerebral diminuiu o nível de acetilação (Figura 3B) e aumentou o nível de tirosinação (Figura 3C) da α-tubulina na fração P2.
Nocodazol é um agente de direcionamento de microtúbulos (MTA) que impede a polimerização de MT ligando-se à β-tubulina e promove a despolimerização de MT. Cérebros de camundongos foram homogeneizados em MSB livre de taxol (+) com ou sem 10 μM de nocodazol e colocados a 4 °C por 20 min. O homogeneizado não tratado ou tratado com nocodazol foi adicionado a 10 μM de Taxol, rehomogeneizado e fracionado nas frações P2, P3 e S3. Em seguida, a proporção de tubulina contida nas três frações foi quantificada por Western blotting. Blots com DM1A (α-tubulina) mostraram que a α-tubulina na fração P2 diminuiu e que na fração P3 tendeu a aumentar com o tratamento com nocodazol (Figura 3D). Estes resultados indicam que a tubulina P2 foi desestabilizada em resposta a baixa temperatura ou nocodazol e que a fração P2 continha MTs robustas que resistiram às condições experimentais. Ao contrário do congelamento, o nocodazol não afetou as MPT tubulinas (Figura 3E,F). Com base nos resultados e nos dados acima, a despolimerização de MTs que não podem ser detectadas pela análise de PTM pode ser avaliada por este método.
Comparação da proporção de MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre nos tecidos
A estabilidade das MTs varia entre os diferentes tecidos, dependendo da capacidade proliferativa das células dentro desses tecidos. Notadamente, as MTs estáveis são mais abundantes no sistema nervoso, que consiste primariamente de neurônios não proliferativos, em comparação com outrostecidos4. Para avaliar a capacidade do método de fracionamento de MT desenvolvido para discernir diferenças na estabilidade de MT em vários tecidos, os fígados e timos de camundongos foram fracionados, e a tubulina recuperada em cada fração foi quantificada. Os resultados revelaram que, em comparação com outros tecidos, o cérebro exibiu um nível significativamente maior de tubulinas P2, enquanto as tubulinas P3 foram notavelmente enriquecidas em tecidos contendo células proliferativas (Figura 4). Adicionalmente, Western blotting usando anticorpos 6-11B1 e 1A2 confirmou a presença de maior estabilidade de MT no sistema nervoso. Os distintos padrões de distribuição das MPT da tubulina indicaram claramente que a tubulina P2 especificamente encontrada no sistema nervoso originou-se de MTs estáveis (Figura 4). Esses achados reforçam ainda mais a noção de que as frações P2 e P3 correspondem a MTs estáveis e lábeis, respectivamente.
Figura 1: Quantificação da tubulina em tecido de camundongo pelo método de fracionamento de MT. (A) Resumo do método de fracionamento de MT para tecidos. MTs estáveis (fração P2), MTs lábeis (fração P3) e tubulina livre (fração S3) nos tecidos podem ser separadas por ultracentrifugação em 2 etapas sob condições que suprimem a polimerização e despolimerização de MT durante a preparação. (B) MTs no córtex de camundongos foram precipitadas por ultracentrifugação convencional de 100.000 × g seguida de ultracentrifugação de 500.000 × g. Em seguida, as tubulinas separadas nas frações P2, P3 e S3 foram quantificadas por Western blotting com DM1A (α-tubulina) e anti-Tuj1 (TUBB3). A proporção de proteínas em cada fração (P2, P3 ou S3) em relação à fração total (P2 + P3 + S3) foi calculada conforme descrito na seção Protocolo (médias ± DPs, n = 4). Esse valor foi modificado de Hagita et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O método de fracionamento de MT permite a separação de MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre no córtex cerebral de camundongos. (A) As frações S2 ou S3 (entrada) foram analisadas pelo ensaio de armadilha filtrante utilizando uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 kDa. As tubulinas obtidas por filtração (receptor) e aprisionamento (reservatório) foram quantificadas por Western blotting com DM1A (α-tubulina). (B) As tubulinas suínas purificadas foram submetidas ao método de fracionamento MT e foram coletadas principalmente na fração S3. (C) Tamanho molecular da tubulina na fração S3. A fração S3 foi separada por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna de cromatografia de filtração em gel. As proteínas de cada fração foram quantificadas por Western blotting com DM1A (α-tubulina) e KMX-1 (β-tubulina). O peso molecular teórico é mostrado na parte superior dos painéis. (D) As proporções de α-tubulina e β-tubulina em cada fração foram iguais. As tubulinas separadas nas frações P2, P3 e S3 foram quantificadas por Western blotting com KMX-1 (β-tubulina). Quantificação da proporção de α-tubulina e β-tubulina em cada fração em relação à soma da fração total (médias ± DPs, n = 4). As análises estatísticas foram realizadas pelo teste t de Student. (E,F) As modificações da α-tubulina nas frações P2, P3 e S3 foram verificadas por Western blotting com 6-11B1 (α-tubulina acetilada: E) e 1A2 (tirosina α-tubulina: F). Quantificação da proporção de α-tubulina tirosinada ou acetilada em cada fração em relação à fração total (média ± DPs, n = 4). (A-C) foram modificados a partir de Hagita et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da despolimerização da MT induzida por congelamento ou MTA. (A-C) A estabilidade da MT após 30 min de congelamento a -80 °C foi avaliada. As proporções de tubulina contidas nas três frações do cérebro bruto e congelado foram quantificadas por Western blotting com DM1A (α-tubulina: A), 1A2 (tirosina α-tubulina: B) e 6-11B1 (α-tubulina acetilada: C). (D-F) O efeito do nocodazol na estabilidade da MT foi avaliado. As proporções de tubulina contidas nas três frações de cérebros de nocodazol não tratados ou tratados foram quantificadas por Western blotting com DM1A (α-tubulina: D), 1A2 (tirosina α-tubulina: E) e 6-11B1 (α-tubulina acetilada: F). Níveis relativos representativos de tirosinação (B,E) ou acetilação (C,F) foram normalizados para a quantidade de α-tubulina total (A,D ) (média ± DP, n = 4). As análises estatísticas foram realizadas pelo teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Proporções de MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre no cérebro, fígado e timo em camundongos. Os cérebros, fígados e timos de camundongos foram dissecados e submetidos ao método de fracionamento de MT. As proteínas separadas em cada fração foram quantificadas por Western blotting com DM1A (α-tubulina), 6-11B1 (α-tubulina acetilada) e 1A2 (α-tubulina tirosinada). A proporção de proteínas em cada fração (P2, P3 ou S3) em relação à fração total (P2 + P3 + S3) foi calculada conforme descrito na seção Protocolo (médias ± DPs, n = 4). As análises estatísticas foram realizadas por ANOVA one-way seguida do teste post hoc de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A tarefa mais significativa ao investigar o estado da tubulina em tecidos de organismos vivos é prevenir a polimerização acidental de MT ou a despolimerização durante a preparação. A estabilidade das MTs nas amostras é afetada por fatores como a concentração de Taxol em MSB, a proporção da quantidade de tecido em tampão e a temperatura durante o processo, desde a remoção do tecido até a homogeneização e centrifugação. Portanto, as condições foram otimizadas em cada etapa do protocolo para análise de tecido de camundongo com um volume de homogeneizado de 20 vezes. Uma maior concentração de Taxol pode induzir a polimerização de MT in vitro, mesmo sob condições refrigeradas25. Ao analisar tecidos com concentrações de tubulina significativamente diferentes ou fazer modificações substanciais no protocolo, cada operador deve otimizar as etapas de acordo com os objetivos específicos de seus experimentos.
No estudo conduzido, uma nova população de MTs, denominada P3, foi obtida a partir da "fração solúvel" convencional usando ultracentrifugação a 500.000 × g20. Cálculos teóricos baseados em fatores como o fator K do rotor, força centrífuga e duração da centrifugação sugerem que as tubulinas presentes na fração S3 provavelmente representam dímeros de tubulina 6S. Por outro lado, a tubulina na fração P3 pode corresponder a MTs que são menores em comprimento em comparação com aquelas encontradas na fração P2. Essa observação está alinhada com o resultado de que o congelamento dos tecidos antes da homogeneização, que leva ao colapso parcial das MTs26, resultou em aumento significativo da tubulina dentro da fração P3 e diminuição concomitante da fração P2 (Figura 3A). Além disso, a análise das MPTs da tubulina e as propriedades de ligação de vários MAPs indicam que a fração P2 ou P3 contém MTs estáveis ou lábeis, respectivamente. Por exemplo, certos MAPs específicos para MTs estáveis, encontrados principalmente em neurônios, estavam presentes exclusivamente na fração P223. Consequentemente, é plausível sugerir que a fração P3 compreende MTs mais dinâmicos e lábeis em comparação com aqueles da fração P2.
De acordo com a teoria subjacente ao método, condições experimentais inadequadas envolvidas na estabilização ou centrifugação da MT podem resultar em fraca fracionamento. Por exemplo, uma baixa concentração de Taxol leva a uma ligeira diminuição na tubulina P2, enquanto o excesso de Taxol aumenta a tubulina P2 devido à formação de MT durante a preparação23. Da mesma forma, o aquecimento inadequado de tecidos e amostras pode causar hiperpolimerização das MTs e degradação ou fragmentação da tau23. Além disso, as condições centrífugas são críticas para separar as frações P3 e S3, e uma ligeira diminuição na aceleração gravitacional reduz significativamente a recuperação da fração P3. Portanto, recomenda-se seguir rigorosamente os passos do protocolo se algum fracionamento anormal for observado.
Este método simples de fracionamento pode ser amplamente aplicado para analisar as proporções de tubulinas entre MTs estáveis, MTs lábeis e dímeros livres em tecidos. Este método oferece várias vantagens, pois pode detectar mudanças sutis no estado da tubulina que podem não ser aparentes através da quantificação de MPTs tubulinas. Mutações ou disfunções nos genes da tubulina ou MAP, por exemplo, estão ligadas a distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neurodegenerativas27,28. Na doença de Alzheimer, sabe-se que as MTs estão reduzidas, possivelmente devido à perda funcional da proteína tau nos neurônios afetados 15,29,30,31,32,33. MTAs que modulam a estabilidade da MT e inibem a divisão celular têm sido propostos como potenciais terapias para distúrbios neurológicos13,34. A utilização deste método único de fracionamento de MT para analisar a estabilidade e o comportamento de MTs e MAPs em animais modelo de doença pode contribuir significativamente para elucidar a patogênese da demência relacionada à tau e identificar novos alvos terapêuticos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado, em parte, pela JST: o estabelecimento de bolsas universitárias para a criação de ciência, tecnologia, inovação (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), Grant-in-Aid for Scientific Research(B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas intitulado "Brain Protein Aging and Dementia Control" da MEXT (TM; 26117004), e pela Uehara Research Fellowship da Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| ÄKTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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