Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

De novo Identifikation af aktivt oversatte åbne læserammer med ribosomprofileringsdata

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63366
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 1
1School of Basic Medical Sciences, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, 2MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University, 3Joint Graduate Program of Peking-Tsinghua-National Institute of Biological Science
* These authors contributed equally

Summary

Oversættelse af ribosomer afkoder tre nukleotider pr. Codon til peptider. Deres bevægelse langs mRNA, fanget ved ribosomprofilering, producerer fodsporene, der udviser karakteristisk tripletperioditet. Denne protokol beskriver, hvordan du bruger RiboCode til at dechiffrere denne fremtrædende funktion fra ribosomprofileringsdata for at identificere aktivt oversatte åbne læserammer på hele transkriptomniveau.

Abstract

Identifikation af åbne læserammer (ORF'er), især dem, der koder for små peptider og aktivt oversættes under specifikke fysiologiske sammenhænge, er afgørende for omfattende kommentarer til kontekstafhængige translatomer. Ribosomprofilering, en teknik til påvisning af bindingssteder og tætheder ved oversættelse af ribosomer på RNA, giver en mulighed for hurtigt at opdage, hvor translation sker på genom-bred skala. Det er dog ikke en triviel opgave inden for bioinformatik effektivt og omfattende at identificere de oversættende ORF'er til ribosomprofilering. Beskrevet her er en brugervenlig pakke, der hedder RiboCode, designet til aktivt at oversætte ORF'er af enhver størrelse fra forvrængede og tvetydige signaler i ribosomprofileringsdata. Med vores tidligere offentliggjorte datasæt som et eksempel indeholder denne artikel trinvise instruktioner til hele RiboCode-pipelinen, fra forbehandling af de rå data til fortolkning af de endelige outputresultatfiler. For at evaluere oversættelseshastighederne for de kommenterede ORF'er er procedurerne for visualisering og kvantificering af ribosomtætheder på hver ORF også beskrevet detaljeret. Sammenfattende er denne artikel en nyttig og rettidig instruktion for forskningsområderne relateret til oversættelse, små ORF'er og peptider.

Introduction

For nylig har en voksende mængde undersøgelser afsløret udbredt produktion af peptider oversat fra ORF'er af kodende gener og de tidligere kommenterede gener som ikke-kodende, såsom lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er)1,2,3,4,5,6,7,8. Disse oversatte ORF'er reguleres eller induceres af celler til at reagere på miljøændringer, stress og celledifferentiering1,8,9,10,11,12,13. Oversættelsesprodukterne fra nogle ORF'er har vist sig at spille vigtige regulerende roller i forskellige biologiske processer inden for udvikling og fysiologi. For eksempel opdagede Chng et al.14 et peptidhormon ved navn Elabela (Ela, også kendt som Apela / Ende / Toddler), som er kritisk for kardiovaskulær udvikling. Pauli et al. foreslog, at Ela også fungerer som et mitogen, der fremmer cellemigration i det tidlige fiskeembryo15. Magny et al. rapporterede to mikropeptider på mindre end 30 aminosyrer, der regulerer calciumtransport og påvirker regelmæssig muskelkontraktion i Drosophila-hjertet10.

Det er fortsat uklart, hvor mange sådanne peptider der er kodet af genomet, og om de er biologisk relevante. Derfor er systematisk identifikation af disse potentielt kodende ORF'er yderst ønskelig. Direkte bestemmelse af produkterne fra disse ORF'er (dvs. protein eller peptid) ved hjælp af traditionelle tilgange såsom evolutionær bevarelse16,17 og massespektrometri18,19 er imidlertid udfordrende, fordi detektionseffektiviteten af begge tilgange er afhængig af længden, overfloden og aminosyresammensætningen af de producerede proteiner eller peptider. Fremkomsten af ribosomprofilering, en teknik til identifikation af ribosombelægningen på mRNA'er ved nukleotidopløsning, har givet en præcis måde at evaluere kodningspotentialet for forskellige transkripter3,20,21, uanset deres længde og sammensætning. En vigtig og hyppigt anvendt funktion til identifikation af aktivt oversættelse af ORF'er ved hjælp af ribosomprofilering er tre-nukleotid (3-nt) periodiciteten af ribosomets fodaftryk på mRNA fra startkodonen til stopkodonen. Imidlertid har ribosomprofileringsdata ofte flere problemer, herunder lave og sparsomme sekventeringslæsninger langs ORF'er, høj sekventeringsstøj og ribosomal RNA (rRNA) forurening. Således svækker de forvrængede og tvetydige signaler, der genereres af sådanne data, 3-nt periodicitetsmønstrene for ribosomers fodaftryk på mRNA, hvilket i sidste ende gør identifikationen af de højtillidsoversatte ORF'er vanskelig.

En pakke med navnet "RiboCode" tilpassede en modificeret Wilcoxon-signed-rank test og P-værdi integrationsstrategi for at undersøge, om ORF har betydeligt flere ribosombeskyttede fragmenter (RPF'er) i rammen end off-frame RPF'er22. Det blev påvist at være yderst effektivt, følsomt og nøjagtigt for de novo-annotation af translatomet i simulerede og reelle ribosomprofileringsdata. Her beskriver vi, hvordan du bruger dette værktøj til at registrere de potentielle oversættelses-ORF'er fra de rå ribosomprofileringssekventeringsdatasæt, der blev genereret af den foregående undersøgelse23. Disse datasæt var blevet brugt til at undersøge funktionen af EIF3-underenheden "E" (EIF3E) i oversættelse ved at sammenligne ribosombelægningsprofilerne for MCF-10A-celler transfekteret med kontrol (si-Ctrl) og EIF3E (si-eIF3e) småinterfererende RNA'er (siRNA'er). Ved at anvende RiboCode på disse eksempeldatasæt opdagede vi 5.633 nye ORF'er, der potentielt koder for små peptider eller proteiner. Disse ORF'er blev kategoriseret i forskellige typer baseret på deres placering i forhold til de kodende regioner, herunder opstrøms ORF'er (uORF'er), nedstrøms ORF'er (dORF'er), overlappede ORF'er, ORF'er fra nye proteinkodende gener (nye PCG'er) og ORF'er fra nye ikke-proteinkodende gener (nye ikke-PCG'er). RPF-læsetæthederne på uORF'er blev signifikant øget i EIF3E-mangelfulde celler sammenlignet med kontrolceller, hvilket i det mindste delvist kan være forårsaget af berigelsen af aktivt oversættende ribosomer. Den lokaliserede ribosomakkumulering i regionen fra den 25. til 75. codon af EIF3E-mangelfulde celler indikerede en blokering af translationsforlængelse i det tidlige stadium. Denne protokol viser også, hvordan man visualiserer RPF-densiteten i det ønskede område til undersøgelse af 3-nt periodicitetsmønstre af ribosomfodaftryk på identificerede ORF'er. Disse analyser viser RiboCodes stærke rolle i at identificere oversættelse af ORF'er og studere reguleringen af oversættelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Miljøopsætning og RiboCode-installation

  1. Åbn et Linux-terminalvindue, og opret et conda-miljø:
    conda create -n RiboCode python=3.8
  2. Skift til det oprettede miljø, og installer RiboCode og afhængigheder:
    conda aktiver RiboCode
    conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools

2. Forberedelse af data

  1. Hent genomreferencefiler.
    1. For referencesekvensen skal du gå til Ensemble-webstedet på https://www.ensembl.org/index.html, klikke på topmenuen Download og menuen FTP Download til venstre. I den præsenterede tabel skal du klikke på FASTA i kolonnen DNA (FASTA) og den række, hvor Species is Human. På den åbnede side skal du kopiere linket til Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz, og download og pak den derefter ud i terminalen:
      wget -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
    2. For referenceanmærkning skal du højreklikke på GTF i kolonnen Gensæt på den sidst åbnede webside. Kopier linket til Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz og download den ved hjælp af:
      wget -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.104.gtf.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz
      BEMÆRK: Det anbefales at hente GTF-filen fra Ensemble-webstedet, da den indeholder genomkommentarer organiseret i et hierarki på tre niveauer, dvs. hvert gen indeholder transkripter, der indeholder exons og valgfrie oversættelser (f.eks. Kodningssekvenser [CDS], oversættelsesstartsted, oversættelsesslutsted). Når et gens eller en transkripts anmærkninger mangler, f.eks. en GTF-fil hentet fra UCSC eller NCBI, skal du bruge GTFupdate til at generere en opdateret GTF med komplette parent-child-hierarkiannoteringer: GTFupdate original.gtf > updated.gtf. For anmærkningsfilen i .gff-formatet skal du bruge AGAT toolkit24 eller ethvert andet værktøj til at konvertere til .gtf-formatet.
  2. Få rRNA-sekvenser.
    1. Åbn UCSC Genome Browser på https://genome.ucsc.edu , og klik på Værktøjer | Tabelbrowser på rullelisten.
    2. På den åbne side skal du angive Pattedyr for klade, Menneske for genom, Alle tabeller for gruppe, rmask for tabel og genom for region. For filter skal du klikke på Opret for at gå til en ny side og indstille repClass, som det stemmer overens med rRNA.
    3. Klik på Send, og indstil derefter outputformatet til sekvens - og outputfilnavn som hg38_rRNA.fa. Til sidst skal du klikke på Hent output | Få sekvens for at hente rRNA-sekvensen.
  3. Hent ribosomprofileringsdatasæt fra Sequence Read Archive (SRA).
    1. Download replikatprøverne fra si-eIF3e-behandlingsgruppen, og omdøb dem:
      fastq-dump SRR9047190 SRR9047191 SRR9047192
      mv SRR9047190.fastq si-eIF3e-1.fastq
      mv SRR9047191.fastq si-eIF3e-2.fastq
      mv SRR9047192.fastq si-eIF3e-3.fastq
    2. Download replikateksemperne fra kontrolgruppen, og omdøb dem:
      fastq-dump SRR9047193 SRR9047194 SRR9047195
      mv SRR9047193.fastq si-Ctrl-1.fastq
      mv SRR9047194.fastq si-Ctrl-2.fastq
      mv SRR9047195.fastq si-Ctrl-3.fastq
      BEMÆRK: SRA-tiltrædelses-id'erne for disse eksempeldatasæt blev hentet fra GENE Expression Omnibus (GEO) website25 ved at søge efter GSE131074.

3. Trim adaptere og fjern rRNA-forurening

  1. (Valgfrit) Fjern adaptere fra sekventeringsdataene. Spring dette trin over, hvis adaptersekvenserne allerede er trimmet, som i dette tilfælde. Ellers skal du bruge cutadapt til at trimme adapterne fra læsninger.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    gøre
    cutadapt -m 15 --match-read-wildcards -a CTGTAGGCACCATCAAT \
    -o ${i}_trimmed.fastq ${i}.fastq
    Gjort
    BEMÆRK: Adaptersekvensen efter -a-parameteren varierer afhængigt af cDNA-biblioteksforberedelsen. Læsninger kortere end 15 (givet ved -m) kasseres, fordi de ribosombeskyttede fragmenter normalt er længere end denne størrelse.
  2. Fjern rRNA-forurening ved hjælp af følgende trin:
    1. Indeks rRNA referencesekvenser:
      butterfly-build -f hg38_rRNA.fa hg38_rRNA
    2. Juster læsningerne til rRNA-referencen for at udelukke de læsninger, der stammer fra rRNA:
      for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
      gøre
      butterfly -n 0 -y -a --norc --best --strata -S -p 4 -l 15 \
      --un=./${i}_noncontam.fastq hg38_rRNA -q ${i}.fastq ${i}.aln
      Gjort
      -p angiver antallet af tråde til parallel kørsel af opgaverne. I betragtning af RPF's relativt lille størrelse bør andre argumenter (f.eks. -n, -y, -a, -norc, --best, --strata og -l) specificeres for at sikre, at de rapporterede justeringer er bedst. Du kan finde flere oplysninger på Bowties hjemmeside26.

4. Juster de rene læsninger til genomet

  1. Opret et genomindeks.
    mkdir STAR_hg38_genome
    STAR --runThreadN 8 --runMode genomeGenerate --genomeDir ./STAR_hg38_genome --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf
  2. Juster de rene læsninger (ingen rRNA-forurening) til den oprettede reference.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    gøre
    STAR --runThreadN 8 --outFilterType Normal --outWigType wiggle --outWigStrand Stranded --outWigNorm RPM --outFilterMismatchNmax 1 --outFilterMultimapNmax 1 --genomeDir STAR_hg38_genome --readFilesIn ${i}_noncontam.fastq --outFileNamePrefix ${i}. --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts --outSAMattributes Alle
    Gjort
    BEMÆRK: Et ikke-skabeloneret nukleotid tilføjes ofte til 5'-enden af hver læsning af den omvendte transkriptase27, som effektivt vil blive trimmet af STAR, da den udfører soft-clipping som standard. Parametrene for STAR er beskrevet i STAR-manualen28.
  3. Sorter og indekser justeringsfiler.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    gøre
    samtools sort -T ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted \
    -o ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam \
    ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam
    samtools indeks ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam
    samtools indeks ${i}. Aligned.sortedByCoord.out.bam
    Gjort

5. Størrelsesvalg af RPMF'er og identifikation af deres P-sites

  1. Forbered afskriftskommentarerne.
    prepare_transcripts -g Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf \
    -f Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -o RiboCode_annot
    BEMÆRK: Denne kommando indsamler nødvendige oplysninger om mRNA-transkripter fra GTF-filen og ekstraherer sekvenserne for alle mRNA-transkripter fra FASTA-filen (hver transkription samles ved at flette exons i henhold til de strukturer, der er defineret i GTF-filen).
  2. Vælg RPMF'er af bestemte længder, og identificer deres P-site positioner.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    gøre
    metaplots -a RiboCode_annot -r ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam \
    -o ${i} -f0_percent 0.35 -pv1 0.001 -pv2 0.001
    Gjort
    BEMÆRK: Denne kommando afbilder de samlede profiler af 5'-enden af de justerede læsninger af hver længde omkring kommenterede oversættelsesstartkodoner (eller stop). Det læselængdeafhængige P-sted kan bestemmes manuelt ved at undersøge fordelingsdiagrammerne (f.eks. figur 1B) af forskudte afstande mellem 5' ender af de store læsninger og startkodonen. RiboCode genererer også en konfigurationsfil for hver prøve, hvor P-stedpositionerne for læsninger, der viser signifikante 3-nt periodicitetsmønstre, automatisk bestemmes. Parametrene -f0_percent, -pv1 og -pv2 definerer forholdstærsklen og p-værdiafskæringerne til valg af RPF-læsninger, der er beriget i læserammen. I dette eksempel defineres nukleotiderne +12, +13 og +13 fra 5'-enden af 29-, 30- og 31 nt-læsningerne manuelt i hver konfigurationsfil.
  3. Rediger konfigurationsfilerne for hvert eksempel, og flet dem
    BEMÆRK: For at generere et konsensussæt af unikke ORF'er og sikre tilstrækkelig dækning af læsninger til at udføre efterfølgende analyse flettes de valgte læsninger af alle prøver i det foregående trin. Læsningerne af specifikke længder, der er defineret i merged_config.txt fil (supplerende fil 1) og deres P-site-oplysninger, bruges til at evaluere ORF'ernes oversættelsespotentiale i det næste trin.

6. De novo kommentere oversættelse af ORF'er

  1. Kør RiboCode.
    RiboCode -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -l ja -g \
    -o RiboCode_ORFs_result -s ATG -m 5 -A CTG,GTG,TTG
    Hvor de vigtige parametre i denne kommando er som følger:
    -c, konfigurationsfil, der indeholder stien til inputfiler og oplysningerne om udvalgte læsninger og deres P-steder.
    -l, for transkripter med flere startkodoner opstrøms for stopkodonerne, om de længste ORF'er (regionen fra den mest distale startkodon til stopkodon) bruges til at evaluere deres oversættelsespotentiale. Hvis de er indstillet til Nej, bestemmes startkodonerne automatisk.
    -s, den eller de kanoniske startkodoner, der anvendes til identifikation af ORF'er.
    -A, (valgfrit) de ikke-kanoniske startkodoner (f.eks. CTG, GTG og TTG for mennesker), der anvendes til ORF-identifikation, og som kan variere i mitokondrier eller kerner af andre arter29.
    -m, ORF'ernes mindste længde (dvs. aminosyrer).
    -o, præfikset for outputfilnavnet, der indeholder detaljerne i forudsagte ORF'er (supplerende fil 2).
    -g og -b, output de forudsagte ORF'er til henholdsvis gtf eller sengeformat .

7. (Valgfrit) Kvantificering og statistik for ORF

  1. Tæl RPF-læsninger i hver ORF.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    gøre
    ORFcount -g RiboCode_ORFs_result_collapsed.gtf \
    -r ${i}. Aligned.sortedByCoord.out.bam -f 15 -l 5 -m 25 -M 35 \
    -o ${i}_ORF.counts -s ja -c kryds-streng
    Gjort
    BEMÆRK: For at udelukke de potentielle akkumulerende ribosomer omkring starten og slutningen af ORF'er tælles antallet af læsninger, der er tildelt i de første 15 (specificeret af -f) og de sidste 5 kodoner (specifikt med -l), ikke. Eventuelt er længderne af tællede RPMF'er begrænset til området fra 25 til 35 nt (almindelige størrelser af RPF'er).
  2. Beregn grundlæggende statistikker for de detekterede ORF'er ved hjælp af RiboCode:
    Rscript RiboCode_utils. R
    BEMÆRK: RiboCode_utils. R (Supplemental File 3) indeholder en række statistikker for RiboCode-outputtet, f.eks. optælling af antallet af identificerede ORF'er, visning af fordelingen af ORF-længder og beregning af de normaliserede RPF-tætheder (dvs. RPKM, læsninger pr. kilobase pr. Million kortlagte læsninger).

8. (Valgfrit) Visualisering af de forudsagte ORF'er

  1. Få de relative positioner af start- og stopkodonerne for den ønskede ORF (f.eks. ENSG00000100902_35292349_35292552_67) på dens transkript fra RiboCode_ORFs_result_collapsed.txt (supplerende fil 3). Derefter plottes tætheden af RPF læser i ORF:
    plot_orf_density -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -t ENST00000622405 \
    -s 33 -e 236 --start-codon ATG -o ENSG00000100902_35292349_35292552_67
    Hvor -s og -e angiver oversættelsens start- og stopposition for afbildning af ORF. --start-codon definerer ORF's startkodon, som vil fremgå af figurtitlen. -o definerer præfikset for outputfilnavnet.

9. (Valgfrit) Metagenanalyse ved hjælp af RiboMiner

BEMÆRK: Udfør metagenanalysen for at vurdere EIF3E-knockdowns indflydelse på oversættelsen af identificerede kommenterede ORF'er ved at følge nedenstående trin:

  1. Generer transkriptioner anmærkninger til RiboMiner, som udtrækker den længste transkription for hvert gen baseret på annotationsfilen genereret af RiboCode (trin 5.1).
    OutputTranscriptInfo -c RiboCode_annot/transcripts_cds.txt \
    -g Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf -f RiboCode_annot/transcripts_sequence.fa \
    -o longest.transcripts.info.txt -O all.transcripts.info.txt
  2. Forbered konfigurationsfilen til RiboMiner. Kopier konfigurationsfilen, der genereres af metaplots-kommandoen i RiboCode (trin 5.4), og omdøb den til "RiboMiner_config.txt". Rediger det derefter i henhold til det format, der er vist i Supplerende fil 4.
  3. Metagene analyser ved hjælp af RiboMiner
    1. Brug MetageneAnalysis til at generere en samlet og gennemsnitlig profil af RPFs tætheder på tværs af transkripter.
      MetageneAnalyse -f RiboMiner_config.txt -c longest.transcripts.info.txt \
      -o MA_normed -U codon -M RPKM -u 100 -d 400 -l 100 -n 10 -m 1 -e 5 --norm ja \
      -y 100 --type UTR
      Hvor vigtige parametre er: --type, analysere enten CDS- eller UTR-regioner ; --norm, om normaliseret læsetætheden; -y, antallet af kodoner, der anvendes til hver transkription; -U, plot RPF-tæthed enten på kodonniveau eller nt-niveau ; -u og -d, definer rækkevidden af analyseregioner i forhold til startkodon eller stopkodon; -l, minimumslængden (dvs. antallet af kodoner) af CDS -M, tilstanden til filtrering af transkripter, enten tæller eller RPKM; -n minimumstællinger eller RPKM i CDS til analyse. -m minimumsantal eller RPKM for CDS i det normaliserede område; -e, antallet af kodoner udelukket fra den normaliserede region.
    2. Generer et sæt pdf-filer til sammenligning af ribosombelægningerne på mRNA i kontrolceller og eIF3-mangelfulde celler.
      PlotMetageneAnalyse -i MA_normed_dataframe.txt -o MA_normed \
      -g si-Ctrl,si-eIF3e -r si-Ctrl-1,si-Ctrl-2,si-Ctrl-3__si-eIF3e-1,si-eIF3e-2,si-eIF3e-3 -u 100 -d 400 --mode mean
      BEMÆRK: PlotMetageneAnalysis genererer sættet af pdf-filer. Detaljer om brugen af MetageneAnalysis og PlotMetageneAnalysis er tilgængelige på RiboMiner hjemmeside30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksemplet med ribosomprofileringsdatasæt blev deponeret i GEO-databasen under tiltrædelsesnummeret GSE131074. Alle de filer og koder, der bruges i denne protokol, er tilgængelige fra supplerende filer 1-4. Ved at anvende RiboCode på et sæt offentliggjorte ribosomprofileringsdatasæt23 identificerede vi de nye ORF'er, der aktivt blev oversat i MCF-10A-celler behandlet med kontrol og EIF3E-siRNA'er. For at vælge de RPF-læsninger, der sandsynligvis er bundet af de oversættende ribosomer, blev længderne af sekventeringslæsningerne undersøgt, og en metagenanalyse blev udført ved hjælp af RPF'erne, der kortlagde de kendte oversættelsesgener. Frekvensfordelingen af læsningernes længder viste, at de fleste RPM'er var 25-35 nt (figur 1A), svarende til en nukleotidsekvens dækket af ribosomerne som forventet. P-stedets placeringer for forskellige længder af RPF'er blev bestemt ved at undersøge afstandene fra deres 5' ender til henholdsvis de kommenterede start- og stopkodoner (figur 1B). RPF læser inden for 28-32nt viste stærk 3-nt periodicitet, og deres P-steder var på +12. nt (Supplerende fil 1).

RiboCode søger efter kandidat-ORF'erne fra et kanonisk startkodon (AUG) eller alternative startkodoner (valgfrit, f.eks. CUG og GUG) til næste stopkodon. Baseret på kortlægningsresultaterne af RPF'er inden for det definerede område vurderer RiboCode derefter 3-nt-periodiciteten ved at evaluere, om antallet af RPF'er i rammen (dvs. deres P-steder tildelt på det første nukleotid af hvert kodon) er større end antallet af RPF'er uden for rammen (dvs. deres P-steder tildelt på det andet eller tredje nukleotid af hvert kodon). Vi identificerede 13.120 gener, der potentielt oversatte ORF'er med p < 0,05, blandt dem 10.394 gener (70,8%), der koder for kommenterede ORF'er, 168 (1,1%) gener, der koder for dORF'er, 509 (3,5%) gener, der koder for uORF'er, 939 (6,4%) gener, der koder for upstream eller downstream ORF'er overlappet med kendte kommenterede ORF'er (overlappede) og 68 (0,5%) proteinkodende gener, der koder for nye ORF'er, og 2,601 (17,7%), der tidligere var tildelt som ikke-kodende gener, der koder for nye ORF'er (figur 2 og supplerende fil 3)

Sammenligning af størrelser af forskellige ORF'er viste, at uORF'er og overlappede ORF'er er kortere (henholdsvis 195 og 188 nt i gennemsnit) end kommenterede ORF'er (~ 1.771 nt). Den samme tendens blev også observeret for nye ORF'er (670 og 385 nt i gennemsnit for henholdsvis nye PCG'er og nye ikke-PCGS) og dORF'er (~ 671 nt) (figur 3). Sammen havde de ikke-kanoniske ORF'er (ukommenterede) identificeret af RiboCode en tendens til at kode peptider, der er mindre end de kendte kommenterede ORF'er.

Der blev beregnet relative RPF-tællinger for hver ORF for at vurdere EIF3's funktion i oversættelsesprocesserne. Resultaterne antydede, at ribosomtæthederne af uORF'er var signifikant højere i EIF3E-mangelfulde celler end i kontrolceller (figur 4). Da mange uORF'er blev rapporteret at udøve hæmmende virkninger på oversættelsen af downstream-kodende ORF'er, undersøgte vi yderligere, om EIF3E-knockdown ændrer de globale tætheder af RPF'er nedstrøms for startkodonerne (figur 5). Metagenanalysen, hvor mange ORF'ers profiler blev justeret og derefter gennemsnitlige, afslørede, at en masse ribosomer gik i stå mellem kodonerne 25 og 75 nedstrøms for startkodonen, hvilket tyder på, at oversættelsesforlængelsen kan blokeres tidligt i EIF3E-mangelfulde celler. Yderligere undersøgelser er berettigede for at undersøge, om signal-støj-forholdet eller ændringerne i oversættelseseffektiviteten af ORF'er bidrager til stigningen i uORF RPKM og akkumuleringen af ribosomer mellem kodonerne 25 til 75 i fravær af EIF3E, det vil sige, om 1) mindre forurening (eller god bibliotekskvalitet) eller 2) aktiv oversættelse (eller ribosomophold) i prøverne uden EIF3E resulterer i flere læsninger i uORF'er og i det definerede område mellem den 25. og 75. kodon.

Endelig giver RiboCode også visualisering for tætheder af P-stederne for RPF'er på ønskede ORF'er, hvilket kan hjælpe brugerne med at undersøge 3-nt periodicitetsmønstre og tætheder af RPF'er. For eksempel viser figur 6 RPF-densiteterne på en uORF af PSMA6 og en dORF af SENP3-EIF4A1; begge blev valideret af offentliggjorte proteomics-data23 (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Vurdering af sekventeringslæsninger og P-stedspositioner. (A) Længdefordeling af ribosombeskyttede fragmenter (RPF'er) i EIF3E-mangelfulde celler i replikat 1 (si-eIF3e-1); (B) Udlede P-stedsposition for RPF'er på 29nt baseret på deres tætheder omkring den kendte start (øverst) og stopkodoner (nederst). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Procentdele af gener, der huser forskellige typer ORF'er identificeret ved RiboCode ved hjælp af alle prøver sammen. Forkortelser: ORF = åben læseramme; dORF = nedstrøms ORF; PCG = proteinkodende gen; NonPCG = ikke-proteinkodende gen; uORF = opstrøms ORF. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Længdefordelinger af forskellige ORF-typer. Forkortelser: ORF = åben læseramme; dORF = nedstrøms ORF; PCG = proteinkodende gen; NonPCG = ikke-proteinkodende gen; uORF = opstrøms ORF; nt = nukleotid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af normaliserede læsetal for forskellige ORF-typer mellem kontrol- og EIF3E-mangelfulde celler. p-værdier blev bestemt af Wilcoxon signeret rangtest. Forkortelse: ORF = åben læseramme; dORF = nedstrøms ORF; PCG = proteinkodende gen; NonPCG = ikke-proteinkodende gen; uORF = opstrøms ORF; RPKM = Læser pr. kilobase pr. million kortlagte læsninger; siRNA = småinterfererende RNA; si-Ctrl = kontrol siRNA; si-eIF3e = siRNA rettet mod EIF3E. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Metagenanalyse, der viser båsen af ribosomer ved den 25.-75. kodon nedstrøms for startkodonen af kommenterede ORF'er. Forkortelse: ORF = åben læseramme; siRNA = småinterfererende RNA; si-Ctrl = kontrol siRNA; si-eIF3e = siRNA rettet mod EIF3E; A. U., enhver enhed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: P-site densitetsprofiler for eksempel ORF'er, der koder for mikropeptider. (A) P-stedtætheder af forudsagt uORF og dens position i forhold til kommenteret CDS på transkript ENST00000622405; (B) samme som i A , men for den forudsagte dORF på afskrift ENST00000614237. Nederste panel, der viser den forstørrede visning af forudsagt uORF (A) eller dORF (B). Rød bjælke = læser i rammen; Grønne og blå søjler = off-frame læser. Forkortelse: ORF = åben læseramme; dORF = nedstrøms ORF; uORF = opstrøms ORF; CDS = kodningssekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende oplysninger: Evaluering af afhængigheden mellem to p-værdier og forklaring af RiboCode-resultater (uORF af ATF4 som eksempel). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Konfigurationsfilen til RiboCode, der definerer de valgte længder af RPF'er og P-site-positioner. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: RiboCode-outputfil, der indeholder oplysninger om forudsagte ORF'er. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: R-scriptfil til udførelse af grundlæggende statistik over RiboCode-output. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Konfigurationsfilen (for RiboMiner) ændret fra Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ribosomprofilering giver en hidtil uset mulighed for at studere ribosomernes virkning i celler på genomskala. Præcis dechifrering af de oplysninger, der bæres af ribosomprofileringsdataene, kan give indsigt i, hvilke regioner af gener eller transkripter der aktivt oversættes. Denne trinvise protokol giver vejledning i, hvordan du bruger RiboCode til at analysere ribosomprofileringsdata i detaljer, herunder pakkeinstallation, dataforberedelse, kommandoudførelse, resultatforklaring og datavisualisering. Analyseresultaterne af RiboCode viste, at oversættelse er gennemgribende og forekommer på ukommenterede ORF'er af kodende gener og mange transkripter, der tidligere blev antaget at være ikke-kodende. Downstream-analyserne gav bevis for, at ribosomerne bevæger sig langs de forudsagte ORF'er i 3-nukleotidtrin, når oversættelsen finder sted; Det er imidlertid fortsat uklart, om oversættelsesprocessen eller de producerede peptider tjener nogen funktion. Ikke desto mindre kan nøjagtige kommentarer til oversættelse af ORF'er på genomet give anledning til spændende muligheder for at identificere funktionerne i tidligere ukarakteriserede transkripter31.

Forudsigelsen af kodningspotentialet for hver ORF'er ved hjælp af ribosomprofileringsdata er i høj grad afhængig af 3-nt-periodiciteten af P-stedtæthederne på hvert kodon fra start til stopkodonerne for ORF'er. Derfor kræver det præcis detektion af P-stedets placeringer af læsninger af forskellig længde. Sådanne oplysninger tilvejebringes ikke direkte af ribosomprofileringsdata, men kan udledes af afstandene mellem 5'-enden af RPF'er og kommenterede start- eller stopkodoner (protokoltrin 5.3). Manglende kommentarer til kendte start/stop-kodoner i GTF-filen, f.eks. for de nymonterede genomer, kan medføre, at RiboCode ikke udfører nedstrømstrinnene, medmindre de nøjagtige P-stedplaceringer af læsningerne bestemmes på anden vis. I de fleste tilfælde er størrelsen af ribosombundne fragmenter og deres P-stedplaceringer konstant, for eksempel 28-30 nt lang og ved +12 nt fra 5' slutningen af læsninger i humane celler. RiboCode gør det muligt at vælge læsninger i et bestemt område for at definere P-site positioner baseret på erfaring. Imidlertid kan begge længder af RPF-læsninger og placeringen af deres P-steder være forskellige, når miljøforholdene (f.eks. Stress eller stimulus) eller den eksperimentelle procedure (f.eks. Nuklease, buffer, biblioteksforberedelse og sekventering) er blevet ændret. Derfor anbefaler vi, at du udfører metaplotterne (protokoltrin 5.3) for hver prøve for at udtrække de mest konficfidens RPF'er (dvs. læser, der viser 3-nt periodicitetsmønstre) og bestemme deres P-site-positioner under forskellige forhold. Selvom disse operationer automatisk kan udføres ved hjælp af metaplotfunktionen , er det ofte kun et mindretal af læsninger, der viser en næsten perfekt indramning eller fasning, der opfylder de strenge udvælgelseskriterier og statistiske test. Derfor er det stadig nødvendigt at løsne de visse parametre, især "-f0_percent", og derefter visuelt inspicere 3-nt periodiciteten af læsninger i hver længde og manuelt redigere konfigurationsfilen for at inkludere flere læsninger i overensstemmelse hermed, især når bibliotekskvaliteten er dårlig (protokoltrin 5.3).

RiboCode søger efter kandidat-ORF'erne fra kanoniske eller ikke-kanoniske startkodoner (NUG'er) til næste stopkodon. For transkripterne med flere startkodoner opstrøms for stopkodonerne bestemmes de mest sandsynlige startkodoner ved at vurdere 3-nt periodiciteten af RPF-læsningerne kortlagt mellem to nærliggende startkodoner eller blot vælge den opstrøms startkodon, der har mere in-frame end off-frame RPF-læsninger. En begrænsning af en sådan strategi er, at de faktiske startkodoner kan blive fejlidentificeret, hvis læsninger, der er tilpasset startkodonregionerne, er sparsomme eller fraværende. Heldigvis giver de seneste strategier, såsom global translation initiation sequencing (GTI-seq)32 og kvantitativ translationsinitieringssekventering (QTI-seq)33, mere direkte måder at lokalisere oversættelsesinitieringsstederne på. For NUG'er kræves der stadig flere undersøgelser for at undersøge deres gyldigheder som effektive startkodoner.

Vi udgav også en ny opdatering til RiboCode ved at tilføje tre nye funktioner: 1) den rapporterer de andre potentielle ORF-typer, der er tildelt i henhold til deres placeringer i forhold til andre udskrifter end den længste; 2) det giver mulighed for at justere kombinerede p-værdier, hvis testningen af RPF-læsninger i de to yderrammer ikke er uafhængige (se mere detaljeret forklaring i Supplerende oplysninger); 3) den udfører p-værdikorrektion for flere test, hvilket giver mulighed for screening af oversættelse af ORF'er mere stringent.

Da RiboCode identificerer de aktivt oversættende ORF'er ved at evaluere 3-nt periodiciteten af RPF læsertætheder, har den visse begrænsninger for de ORF'er, der er ekstremt korte (f.eks. Mindre end 3 kodoner). Spealman et al. sammenlignede RiboCodes ydeevne med uORF-seqr og rapporterede, at ingen uORF'er, der er kortere end 60 nt, forudsiges af RiboCode i deres datasæt34. Vi hævder, at parameteren for ORF-størrelsesvalg (-m) i den tidligere version af RiboCode ikke er korrekt indstillet. Vi har ændret standardværdien af dette argument til 5 i den opdaterede RiboCode.

RiboCode rapporterer de identificerede ORF'er i to filer: "RiboCode_ORFs_result.txt", der indeholder alle ORF'er, herunder overflødige ORF'er fra forskellige transkripter af det samme gen; "RiboCode_ORFs_result_collapsed.txt" (Supplerende fil 2), der integrerer de overlappende ORF'er med det samme stopkodon, men forskellige startkodoner, dvs. den, der har mest opstrøms startkodon i samme læseramme, bevares. I begge filer klassificeres de detekterede ORF'er i enten "nye" oversættelser af ORF'er eller andre forskellige typer i henhold til deres relative placering til kendte CDS (se en detaljeret forklaring af ORF-typer fra RiboCode paper22 eller på RiboCode-webstedet35). Vi illustrerede, hvordan man fortolker RiboCode-output ved hjælp af en forudsagt uORF af genet ATF4 som et eksempel (Supplerende information). RiboCode tæller også antallet af gener, der indeholder forskellige typer ORF'er og plotter dem sammen med deres procentdele (figur 2).

En undersøgelse rapporterede, at nogle udtrykte, men translationelt stillestående gener kan aktiveres til at oversætte til peptider ved oxidativ stress12, hvilket indikerer, at der sandsynligvis er andre ORF'er, der kun kan oversættes på en tilstandsafhængig måde. RiboCode kan udføres for forskellige eksperimentelle forhold separat (f.eks. si-Ctrl eller si-eIF3e) eller i fællesskab, som vist i denne protokol (trin 5.4 og 6.1). Multiplexing af flere prøver i en enkelt kørsel ved at definere længder og P-stedpositioner for udvalgte læsninger i "merged_config.txt" har flere fordele i forhold til at behandle hver prøve individuelt. For det første reducerer det de forstyrrelser, der er til stede i en enkelt prøve; For det andet sparer det programmets køretid; endelig giver den tilstrækkelige data til at udføre statistikkerne. Således fungerer det teoretisk bedre end enkeltprøvetilstanden, især for prøverne med lav sekventeringsdækning og høj baggrundsstøj. Yderligere kvantificering og sammenligning af antallet af RPF'er, der er tildelt forudsagte ORF'er mellem forskellige betingelser (f.eks. si-eIF3e vs. si-Ctrl), giver os mulighed for at opdage kontekstafhængige ORF'er eller udforske den translationelle regulering af ORF'erne.

Bemærk, at på grund af akkumuleringen af ribosomer i begyndelsen og slutningen af ORF'er, et fænomen kaldet "oversættelsesrampe", bør de RPF'er, der er tildelt i de første 15 kodoner og de sidste 5 kodoner, udelukkes fra læsningstællingen for at undgå analyse af differentiel ORF-oversættelse, der forspænder forskellene i initieringshastigheder3,5, 36. Disse resultater antydede, at overflod af uORF-typer er højere i celler uden EIF3 end kontrolceller, hvilket kan være forårsaget (eller i det mindste delvist) af de forhøjede niveauer af aktivt oversættende ribosomer. Metaanalysen af RPF-tætheder omkring startkodonerne foreslog også, at den tidlige oversættelsesforlængelse reguleres af EIF3E. Bemærk, at blot at tælle RPF-læsningerne i en ORF ikke er nøjagtig til oversættelseskvantificering, især når oversættelsesforlængelsen er alvorligt blokeret.

Sammenfattende viser denne protokol, at RiboCode let kunne anvendes til at identificere nye oversatte ORF'er af enhver størrelse, herunder dem, der koder for mikropeptider. Det ville være et værdifuldt redskab for forskersamfundet til at opdage forskellige typer ORF'er i forskellige fysiologiske sammenhænge eller eksperimentelle forhold. Yderligere validering af protein- eller peptidprodukterne fra disse ORF'er vil være nyttig for udviklingen af fremtidige anvendelser af ribosomprofilering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende støtten fra de beregningsmæssige ressourcer, der leveres af HPCC-platformen fra Xi'an Jiaotong University. Z.X. takker taknemmeligt Young Topnotch Talent Support Plan fra Xi'an Jiaotong University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A computer/server running Linux Any - -
Anaconda or Miniconda Anaconda - Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
R R Foundation - https://www.r-project.org/
Rstudio Rstudio - https://www.rstudio.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eisenberg, A. R., et al. Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast. Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).
  2. Spealman, P., et al. Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data. Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).
  3. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  4. Bazzini, A. A., et al. Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation. The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).
  5. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).
  6. Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish. Nature Communications. 7, 11663 (2016).
  7. Zhang, H., et al. Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes. Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).
  8. Guenther, U. P., et al. The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs. Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).
  9. Goldsmith, J., et al. Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control. Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).
  10. Magny, E. G., et al. Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames. Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).
  11. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  12. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  13. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biology. 16, 90 (2015).
  14. Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor. Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).
  15. Pauli, A., et al. Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors. Science. 343 (6172), 1248636 (2014).
  16. Stark, A., et al. Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures. Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).
  17. Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions. Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).
  18. Slavoff, S. A., et al. Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells. Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).
  19. Schwaid, A. G., et al. Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames. Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).
  20. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 1-19 (2013).
  21. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  22. Xiao, Z., et al. De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data. Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).
  23. Lin, Y., et al. eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health. Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).
  24. Dainat, J. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format. , Available from: https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html (2020).
  25. Edgar, R. Gene Expression Omnibus. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo (2002).
  26. Langmead, B. Bowtie: an ultrafast memory-efficient short read aligner. , Available from: http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml (2021).
  27. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  28. Dobin, A. STAR manual. , Available from: https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf (2022).
  29. Elzanowski, A. The genetic codes. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi (2019).
  30. Li, F. RiboMiner. , Available from: https://github.com/xryanglab/RiboMiner (2020).
  31. Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling: global views of translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).
  32. Lee, S., et al. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  33. Gao, X., et al. Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo. Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).
  34. Spealman, P., Naik, A., McManus, J. uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast. Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).
  35. Xiao, Z. RiboCode. , Available from: https://github.com/xryanglab/RiboCode (2018).
  36. Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments. Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).

Tags

Biologi Udgave 180 Ribosomprofilering åben læseramme mRNA-translation mikropeptid uORF dORF
<em>De novo</em> Identifikation af aktivt oversatte åbne læserammer med ribosomprofileringsdata
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, Y., Li, F., Yang, X., Xiao, Z.… More

Zhu, Y., Li, F., Yang, X., Xiao, Z. De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data. J. Vis. Exp. (180), e63366, doi:10.3791/63366 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter