Summary
本方案论证了电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）生物传感器的发展及其在生物标志物免疫球蛋白G（IgG）检测中的应用。
Abstract
在目前的研究中，石墨烯及其衍生物已被研究并用于许多应用，包括电子，传感，储能和光催化。合成和制造高质量、良好均匀性和低缺陷的石墨烯对于高性能和高灵敏度器件至关重要。在许多合成方法中，化学气相沉积（CVD）被认为是制造石墨烯的领先方法，可以控制石墨烯层的数量并产生高质量的石墨烯。CVD石墨烯需要从其生长的金属基板上转移到绝缘基板上，以用于实际应用。然而，石墨烯的分离和转移到新的基板上对于在不损害或影响石墨烯的结构和性能的情况下均匀层具有挑战性。此外，电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）由于其高灵敏度和标准器件配置，已在各种生物分子检测中的广泛应用得到证明。本文介绍了聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）辅助的石墨烯转移方法，石墨烯场效应晶体管（GFET）的制备以及生物标志物免疫球蛋白G（IgG）检测。应用拉曼光谱和原子力显微镜对转移石墨烯进行表征.该方法被证明是一种实用的方法，用于转移清洁和无残留的石墨烯，同时将底层石墨烯晶格保留在绝缘基板上，用于电子或生物传感应用。
Introduction
石墨烯及其衍生物已被研究并用于许多应用，包括电子1，2，传感3，4，5，储能6，7和光催化1，6，8。合成和制造高质量、良好均匀性和低缺陷的石墨烯对于高性能和高灵敏度器件至关重要。自2009年化学气相沉积（CVD）的发展以来，它已经显示出巨大的前景，并已成为石墨烯家族9，10，11，12，13的重要成员。它生长在金属基板上，后来用于实际用途，转移到绝缘基板14上。最近有几种转移方法用于转移CVD石墨烯。聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）辅助方法是不同技术中最常用的。该方法特别适合工业用途，因为它具有大规模，低成本和高质量的转移石墨烯14，15。该方法的关键方面是摆脱CVD石墨烯应用中的PMMA残留物，因为残留物会导致石墨烯14，15，16的电子特性的偏角，对生物传感器的灵敏度和性能造成影响17，18，并产生显着的器件间变化19。
在过去的几十年中，基于纳米材料的生物传感器得到了广泛的研究，包括硅纳米线（SiNW），碳纳米管（CNT）和石墨烯20。由于其单原子层结构和独特的性能，石墨烯表现出优越的电子特性，良好的生物相容性和简单的功能化，使其成为开发生物传感器的有吸引力的材料14，21，22，23。由于场效应晶体管（FET）具有高灵敏度、标准配置和高性价比的质量生产性21，24等特性，FET在便携式和护理点实施中比其他基于电子的生物传感设备更受欢迎。电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）生物传感器是所述FET21，24的示例。EGGFET可以检测各种靶向分析物，如核酸25，蛋白质24，26，代谢物27和其他生物相关分析物28。这里提到的技术确保了CVD石墨烯在无标记生物传感纳米电子器件中的实现，该器件比其他生物传感器件29提供更高的灵敏度和准确的时间检测。
在这项工作中，展示了开发EGGFET生物传感器并将其用于生物标志物检测的功能化的整个过程，包括将CVD石墨烯转移到绝缘基板上，拉曼和转移石墨烯的AFM表征。此外，这里还讨论了EGGFET的制备以及与聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品输送良好的整合，生物感受器功能化以及通过尖峰和恢复实验从血清中成功检测人免疫球蛋白G（IgG）。
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Protocol
1. 石墨烯的转移化学气相沉积
- 使用剪刀将铜基板上的石墨烯片切成两半（2.5 cm x 5 cm）。使用耐热胶带将石墨烯方块的四个角固定在微调器垫片上（参见 材料表）。
注：购买的石墨烯尺寸为5厘米x 5厘米（见 材料表）。 - 用PMMA 495K A4的薄层（100-200nm）旋转涂覆石墨烯片，以500rpm旋转10秒，然后以2000rpm旋转50秒。然后将样品在150°C下烘烤5分钟。
- 用氧等离子体（见 材料表）以30 W，15 sccm去除石墨烯的背面5分钟。
- 将等离子体处理的石墨烯正方形切割成更小的尺寸（1 cm x 2 cm）以进行器件制造。
- 将预清洁的基材（SiO2）切成小块，尺寸约为2.5 cm x 2 cm。
- 使用石墨烯商业蚀刻剂（氯化铁）蚀刻铜（见 材料表）。不要稀释蚀刻剂。将样品漂浮在液体蚀刻剂上，铜面朝下，PMMA面朝上。
- 铜蚀刻后，使用等离子体处理的基板缓慢提升石墨烯膜。
- 将转移的石墨烯风干2小时，然后在80°C下烘烤15分钟。
- 按照以下步骤删除 PMMA。
- 在70°C下用丙酮蒸气加热样品。 将样品保持在丙酮蒸气上方约2厘米处4分钟，PMMA面朝下。然后将样品浸入丙酮中5分钟。
- 用去离子水小心地洗涤样品，并在显微镜下观察转移的石墨烯。最后，用N2轻轻吹干样品。
- 进行原子力显微镜（AFM）观察，以确保PMMA无残留石墨烯。如果在图像中可以看到PMMA残留物，请再次进行丙酮蒸汽清洁和浸泡。
- 执行拉曼和AFM表征以确认石墨烯转移的单层并观察表面特性（图1A，B）。
2. 石墨烯场效应晶体管（GFET）的制造
- 用丙酮，IPA和DI水用转移的石墨烯洗涤基材;然后将基材在75°C的热板上烘烤30分钟（图2A）。
- 使用电子束蒸发器30 （参见 材料表），在石墨烯样品上沉积5nm镍和45nm金（图2B）。
- 使用掩模A（补充图1）应用第一光刻30工艺进行电极图案化（图2C）。
- 在样品上旋转阳性光刻胶（AZ 5214E，参见 材料表）（2000rpm持续45秒），并在120°C下固化样品1分钟。
- 将样品置于紫外线泛光曝光系统中，并在200 mJ/ cm 2下曝光约10秒。
- 用光刻胶显影剂（AZ300 MIF，见 材料表）显影样品约2分钟，然后用去离子水冲洗。
- 将样品浸入金蚀刻剂中以蚀刻金层10秒;用去离子水冲洗，并通过浸入丙酮10分钟除去剩余的光刻胶层（图2C）。
- 使用丙酮，IPA和去离子水，洗涤样品;在75°C的热板上烘烤30分钟。然后使用掩模B（补充图1）应用第二次光刻工艺来图案化石墨烯通道。
注：使用与第一个相同的工艺参数（步骤2.4-2.6），但掩模对准器中的紫外线曝光系统除外（图2D）。 - 将样品浸入60°C的镍蚀刻剂中，以蚀刻镍层10秒;用去离子水冲洗;使用N2吹干（图2D）。
- 将样品置于等离子体中，并使用氧等离子体（100 W，90 s，氧流量为49 sccm）除去暴露的石墨烯;之后，通过浸入丙酮10分钟除去光刻胶层（图2E）。
- 用丙酮，IPA和去离子水洗涤样品;在75°C的热板上烘烤30分钟，并使用掩模C（补充图1）应用第三次光刻工艺，以绘制钝化光刻胶层的图案，以保护基板上的底层石墨烯。使用与第一个相同的工艺参数（步骤2.4-2.6），但掩模对准器中的紫外线曝光系统除外（图2F）。
- 第三次光刻过程后，将样品浸入60°C的镍蚀刻剂中10s以除去剩余的镍层;然后用去离子水冲洗并使用N2 吹干（图2G）。最后，将样品在120°C的电炉上烘烤30分钟（图2H）。
3. 用于IgG检测的GFET的功能化
- 组装样品交付渠道。
- 使用软光刻技术在PDMS中制造样品输送通道31.
- 将石墨烯器件浸入0.1M NaOH溶液中30秒;用去离子水冲洗，并在设备表面留下薄薄的水层，以帮助PDMS井的对准和粘合。然后使用氧等离子体激活PDMS孔的表面。
- 在显微镜下对齐样品递送通道和石墨烯器件;将对齐的设备放在60°C烘箱中3小时以允许粘合。组装好的器件如图 3A所示。
- 使 GFET 功能化。
- 用IgG适配体使石墨烯表面功能化（见 材料表）。使用移液器从PDMS孔中加载和除去每种试剂或缓冲液。原理图过程如图 4所示。
注：以下步骤在室温下操作。 - 用DMSO冲洗石墨烯表面三次后，应用1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（PBASE，10mM溶解在DMSO中，见 材料表）并保持2小时。
- 用DMSO冲洗后，应用5'氨基修饰的IgG适配体（20μM在1x PBS中），孵育3小时，并用1x PBS冲洗三次。
- 将牛血清白蛋白（BSA，10%w / v在1x PBS中）涂抹在石墨烯上1小时，并用1x PBS冲洗三次。
- 用IgG适配体使石墨烯表面功能化（见 材料表）。使用移液器从PDMS孔中加载和除去每种试剂或缓冲液。原理图过程如图 4所示。
4. 免疫球蛋白检测
- 用 0.01x PBS 冲洗设备三次。用0.01x PBS（检测缓冲液）填充PDMS孔（图3A，B）。
- 用高性能参数分析仪连接电极（见 材料表）。将源极连接到地面、漏极和栅极，分别连接到分别配备参数分析仪的源极测量单元（SMU 1 和 SMU 2）（图 3C）。
- 设置测量参数并打开采样过程。
- 通过连续监测漏极电流来测试 EGGFET 对 IgG 的响应。将IgG溶解在不同浓度的0.01x PBS中，将溶液加入检测室，并连续监测漏极电流。保存数据。
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Representative Results
代表性的结果表明，转移的CVD石墨烯分别具有拉曼和AFM的特征。拉曼图像的G峰和2D峰提供了有关转移的单层石墨烯32 的存在和质量的全面信息（图1）。采用标准光刻工艺30、31 对GFET器件进行制造，如图 2所示。 图3 显示了装配的PDMS样品输送孔和实验设置的制造的GFET。PDMS以10：1的重量比混合并浇注到培养皿中。然后将装有PDMS混合物的整道菜在60°C的烤箱中烘烤3小时。将腌制的PDMS从培养皿上剥下并切成立方体（1 cm x 1 cm ×1 cm）。然后，通过用打孔机冲孔PDMS立方体来创建孔（直径6毫米）。
通过EGGFET检测IgG的功能化过程示意图如图 4所示， 图5 显示了不同电解质条件下的IgG检测24。PBASE是一种广泛使用的石墨烯功能化试剂，可以通过π-π相互作用24 吸附在石墨烯表面，而不会损害石墨烯的电性能（图4A）。5′氨基修饰的IgG适配体通过PBASE中反应性 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯与IgG适配体5′端的胺基团之间的酰胺键键缀合（图4B）。牛血清白蛋白（BSA）孵育是生物传感器检测的标准方法，用于在用1x PBS冲洗设备后阻断剩余的未结合位点（图4C）。更详细的讨论可以在我们之前发表的工作24中找到。在检测过程中应用Ag/AgCl参比电极来定义栅极电位。对于 EGGFET 器件，检测范围（即传感器可以可靠测量的浓度范围）被确定为约 2-50 nM。关于IgG检测中涉及的化学和测量原理以及EGFET的灵敏度和检测限的更详细的讨论之前已报告了24。
图1：CVD石墨烯通过拉曼光谱和AFM光谱表征。 （A）转移石墨烯的代表性拉曼光谱。G峰和2D峰是原始石墨烯的主要峰。（B）石墨烯的代表性AFM图像。AFM 图像中相应的高度配置文件显示在底部面板中，沿着蓝色虚线显示。 请点击此处查看此图的大图。
图2：石墨烯场效应晶体管的制造示意图。 （A）转移到二氧化硅衬底上的单层石墨烯。（B）沉积在转移的石墨烯上的镍和金。（C）第一次光刻工艺后的金蚀刻。（D）镍蚀刻后经过第二次光刻工艺。（E）使用氧等离子体去除未受保护的石墨烯。（F）用光刻胶涂覆图案以进行钝化分层并进行第三次光刻工艺。（G）第三次光刻工艺后的镍蚀刻。（H）镍蚀刻后退火。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用于 IgG 检测的设备和实验装置。 （A） EGGFET 生物传感器与标准 Ag/AgCl 参比电极和用于盛放样品的 PDMS 孔集成在一起。（B）石墨烯通道的放大视图。（C） 使用 EGGFET 生物传感器检测 IgG 的电路连接示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图4：用于IgG检测的石墨烯表面的功能化。 经参考文献24 许可转载。 请点击此处查看此图的大图。
图5：EGGFET生物传感器在不同稀释剂下对生物标志物IgG的反应。 经参考文献24 许可转载。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：用于光刻工艺的掩模设计。 （A）第一次光刻工艺中使用的掩模设计。电极的尺寸在放大图像A1中给出。（B）掩模设计用于第二次光刻的尺寸。（三）掩模设计采用在第三光刻工艺中。电极的尺寸在放大图像C1中给出。（D）所有三种光刻工艺的最终产品和放大图像D1显示了电极配置。尺寸的单位以毫米 （mm） 为单位。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
购买的铜膜上的CVD石墨烯需要修剪成合适的尺寸，以进行以下制造步骤。薄膜的切割会导致起皱，这需要防止。制造步骤中提供的参数可以参考石墨烯的等离子体蚀刻，并且在使用不同的仪器时，这些数字可以改变。必须密切监测和检查蚀刻样品，以确保完整的石墨烯蚀刻。可以应用多种预清洁方法来清洁基材，例如在丙酮，IPA和去离子水中超声处理5分钟，去离子水冲洗，氮气干燥或用O2 等离子体处理（300 W，在〜100 sccm下5分钟）。使用商用氯化铁铜蚀刻剂时，铜蚀刻速率约为1.25-1.67微米/分钟。蚀刻过程需要密切观察。蚀刻后，需要用去离子水进行充分的冲洗。
协议中提到的丙酮清洁技术是最佳的残留物清洁技术。等离子清洗有损害单层石墨烯的风险。因此，最石墨烯层友好的技术是丙酮清洁。但是，去除PMMA残留物也是最重要的，因为它会影响后一过程。做拉曼光谱和AFM可以给出石墨烯和PMMA残留物的实时质量。协议中使用的仪器和化学品至关重要，因为这些直接影响制造设备的质量。因此，需要检查和更新仪器的质量和化学品的有效性。
PBASE需要保持干燥并储存在-20°C的冰箱中，以避免生物受体功能化的水解。储存的小瓶在打开之前需要达到室温;否则，水可能会在小瓶内凝结并水解PBASE。要制造10 mM的PBASE，首先需要通过将38.5mg PBASE溶解在1 mL DMSO中，然后将其稀释10倍来制备100 mM的PBASE溶液。
由于试剂和缓冲液是通过直接移液到PDMS孔中添加或删除的，因此手稿中演示的设备不允许使用阴性对照进行现场校准。为此，需要将多通道阵列与适当设计的微流体装置集成在一起。该装置的进一步发展，例如将其与侧流平台相结合，将为护理点应用33提供巨大的潜力。此外，固体和液体之间的界面是一个具有重大科学和技术意义的话题34.例如，在水介质和石墨烯的特定情况下，它在石墨烯的许多新兴应用中起着至关重要的作用，例如，分析化学35，储能和转换36，水过滤37和生物传感38。解开界面处的行为具有重要的科学和技术意义，特别是对于准确和更深入地了解石墨烯的性质和实际应用39，40。
在本工作中，提供了一个详细的方案来演示EGGFET生物传感器的发展及其在生物标志物检测中的应用。对于通过PMMA方法转移的CVD石墨烯的实际应用，完全去除PMMA残留物以获得清洁的表面至关重要。该方法有效地去除了PMMA残留物，同时保留了下面的石墨烯晶格。该功能设备显示用于检测人类IgG的一致结果。有兴趣的研究人员可以使用该协议作为参考，为特定应用构建设备，例如研究界面相互作用，生物传感，使用其他纳米材料开发类似设备等。
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Disclosures
作者没有竞争利益或冲突利益需要披露。
Acknowledgments
实验是在西弗吉尼亚大学进行的。我们感谢西弗吉尼亚大学用于器件制造和材料表征的共享研究设施。这项工作得到了美国国家科学基金会的支持，授予号。NSF1916894.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-pyreneutyric acid N- hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | 457078-1G | functionalization |
| Asylum MFP-3D Atomic Force Microscope | Oxford Instruments | graphene characterization | |
| AZ 300 MIF | MicroChemicals | AZ 300 MIF | photoresist developer |
| AZ 300 MIF | MicroChemicals | AZ 300 MIF | photoresist |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 810014 | blocking |
| Branson 1210 Sonicator | SONITEK | sample cleaning | |
| Copper Etchant | Sigma Aldrich | 667528-500ML | removing copper film to release graphene |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | VWR | 97063-136 | functionalization |
| Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 21909-144 | create well in PDMS |
| Gold etchant | Gold Etch, TFA, Transene | 658148 | enchant |
| Graphene | Graphene supermarket | 2" x 2" sheet | biosensing element of the device |
| IgG aptamer | Base Pair Biotechnologies | customized | bioreceptor |
| Keithley 4200A-SCS Parameter Analyzer | Tektronix | measurement and detection | |
| KMG CR-6 | KMG chemicals | 64216 | Chromium etchant |
| Kurt J. Lesker E-beam Evaporator | Kurt J. Lesker | metal deposition | |
| Laurell Technologies 400 Spinners | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | thin film coating |
| March PX-250 Plasma Asher | March Instruments | sample cleaning | |
| Nickel etchant | Nickel Etchant, TFB, Transene | 600016000 | etchant |
| OAI Flood Exposure | OAI | photolithography | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552-500ML | buffer |
| PMMA 495K A4 | MicroChemicals | PMMA 495K A4 | Photoresist for assisting graphene transferring |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Sigma Aldrich | Sylgard 184 | sample delivery well |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | graphene characterization | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-25G | functionalization |
| Suss Microtech MA6 Mask Aligner | Suss MicroTec | photolithography | |
| Thermo Scientific Cimarec Hotplate | Thermo Scientific | SP131635 | sample and device Baking |
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