Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

Abstract

אדמה מארחת כמות מדהימה של חיים מיקרוביאליים, כאשר כל גרם מכיל עד מיליארדי תאים חיידקיים, ארכאיים ופטרייתיים. פטריות רב-תאיות כגון עובשים ופטריות חד-תאיות, המוגדרות באופן רחב כשמרים, ממלאות תפקידים חיוניים במערכות האקולוגיות של הקרקע כמפרקים של חומר אורגני ומקורות מזון עבור שוכני קרקע אחרים. מגוון המינים הפטרייתיים בקרקע תלוי במגוון רחב של גורמים אקלימיים כגון גשמים וטמפרטורה, כמו גם תכונות הקרקע כולל חומר אורגני, pH ולחות. היעדר דגימה סביבתית מספקת, במיוחד באזורים באסיה, אפריקה, דרום אמריקה ומרכז אמריקה, מעכב את אפיון קהילות פטריות הקרקע ואת גילוים של מינים חדשים.

אפיינו קהילות פטרייתיות קרקע בתשע מדינות על פני שש יבשות באמצעות כ-4,000 דגימות קרקע ופרוטוקול שפותח במעבדה לבידוד שמרים ועובשים. פרוטוקול זה מתחיל בהעשרה סלקטיבית נפרדת לשמרים ולעובש הרלוונטי מבחינה רפואית Aspergillus fumigatus, במדיה נוזלית תוך עיכוב צמיחת חיידקים. המושבות המתקבלות מועברות לאחר מכן למדיה מוצקה ומעובדות עוד יותר כדי להשיג תרביות טהורות, ולאחר מכן אפיון גנטי במורד הזרם. זהות מיני השמרים נקבעת באמצעות ריצוף של אזור הספייסר המתועתק הפנימי שלהם (ITS) של צביר הגנים RNA ריבוזומלי גרעיני, בעוד שמבנה האוכלוסייה הגלובלי של A. fumigatus נחקר באמצעות ניתוח סמנים מיקרו-לוויניים.

הפרוטוקול יושם בהצלחה כדי לבודד ולאפיין אוכלוסיות של שמרי קרקע ו-A. fumigatus בקמרון, קנדה, סין, קוסטה ריקה, איסלנד, פרו, ניו זילנד וערב הסעודית. ממצאים אלה חשפו תובנות נחוצות על דפוסים גלובליים במגוון השמרים בקרקע, כמו גם על מבנה האוכלוסייה הגלובלית ופרופילי עמידות אנטי פטרייתיים של A. fumigatus. מאמר זה מציג את השיטה של בידוד הן שמרים והן A. fumigatus מדגימות קרקע בינלאומיות.

Introduction

פטריות במערכות אקולוגיות של הקרקע ממלאות תפקידים חיוניים בפירוק חומר אורגני, מחזור חומרי מזון ודישון קרקע1. הן גישות שאינן תלויות בתרבות (כלומר, ריצוף בתפוקה גבוהה) והן גישות תלויות תרבות נמצאות בשימוש נרחב בחקר פטריות אדמה 2,3. בעוד שכמות הנתונים הגדולה שנוצרת על ידי ריצוף metabarcode בתפוקה גבוהה שימושית להבהרת דפוסים בקנה מידה רחב במבנה הקהילה ובמגוון, הגישה התלויה בתרבות יכולה לספק מידע משלים ביותר על המבנים הטקסונומיים והפונקציונאליים של קהילות פטרייתיות, כמו גם פרופילים ספציפיים יותר של אורגניזמים בודדים באמצעות גיוון במורד הזרם וניתוחים פונקציונליים בשל הזמינות של תרבויות פטרייתיות טהורות.

למרות שלעתים רחוקות הם עולים על אלפי תאים לגרם אדמה, שמרים, המוגדרים באופן רחב כפטריות חד-תאיות, הם מתפרקים חיוניים ומקורות מזון עבור שוכני קרקע אחריםבני 4,5. למעשה, שמרים עשויים להיות פטריות הקרקע השולטות בביוספרות קרות כמויבשת אנטארקטיקה 6,7. אדמה היא גם מאגר ראשוני של שמרים רלוונטיים מבחינה רפואית הגורמים לזיהומים אופורטוניסטיים חמורים בבני אדם וביונקים אחרים8. למרות הדמיון המורפולוגי, מיני השמרים מגוונים מבחינה פילוגנטית ומופיעים בקרב פטריות נימה בשתי פילות עיקריות, Ascomycota ו-Basidiomycota, בתוך ממלכת הפטריות9. לשמרים אין חתימת דנ"א מגדירה בגן הברקוד הפטרייתי, אזור הספייסר המתומלל הפנימי (ITS) של אשכול הגנים RNA ריבוזומלי גרעיני10, מה שהופך אותם לבלתי ניתנים להבחנה מפטריות אחרות בחקירות מטא-גנומיקה ובכך מחייבים שימוש בשיטות תלויות תרבית לבידוד מיני שמרים.

הפרוטוקול שלהלן יושם כדי לאפיין קהילות שמרי קרקע של תשע מדינות ולזהות מגמות ודפוסים עולמיים במגוון שמרי הקרקע 9,11,12. גישות מטא-גנומיקה נמצאות בשימוש מוגבל כאשר חוקרים קבוצות ממוקדות של אורגניזמים כגון שמרים 2,3. בשל המגוון הפילוגנטי שלהם, לא ניתן להבחין בין שמרים לפטריות אחרות על סמך רצף דנ"א בלבד. לפיכך, חקר אוכלוסיות שמרים דורש המשך שימוש בבידוד תלוי תרבית. עם זאת, התרבות היא לעתים קרובות הרבה יותר זמן רב ודורשת יותר כוח אדם כדי לבצע את הניסויים. לכן, הפרוטוקול עבר אופטימיזציה וייעול לעיבוד מהיר יותר עם כוח אדם מוגבל. היתרון העיקרי של התרבות הוא שמיני השמרים שזוהו הם שמרים חיים ולא כאלה מתים, ולכן הם נוטים יותר להיות שוכני קרקע אמיתיים ולא תאים חולפים הנמצאים בקרקעות. ההערכה היא שכ-40% מהדנ"א הפטרייתי בקרקע הם מזהמים מסביבות אחרות, חוץ-תאיות, או מגיעים מתאים שאינם שלמים עוד, מה שגורם לגישות ריצוף בתפוקה גבוהה להערכת יתר של עושר פטריות בשיעור של עד 55%13. בידוד תלוי תרבית יכול לאשר בקלות את זהות מיני השמרים עם היתרון הנוסף של הבטחת תרבית טהורה לשימוש בניתוחים במורד הזרם. ואכן, תרביות טהורות של 44 מיני שמרים חדשים זוהו באמצעות פרוטוקול בידוד קרקע זה שאיפשר שימוש במגוון שיטות כדי לחקור את תכונותיהם הטקסונומיות והתפקודיות בפירוט14.

הפרוטוקול שלהלן יכול לשמש גם לבידוד תבניות הקיימות בקרקע, כגון A. fumigatus. אספרגילוס פומיגטוס (Aspergillus fumigatus) הוא עובש תרמופילי וספרופיטי בעל תפוצה גלובלית רחבה בקרקע15. הוא בודד מסביבות קליניות ולא קליניות רבות. דגימה לא קלינית כוללת בדרך כלל אוויר, פסולת אורגנית (קומפוסט, אבק מסור, פסולת נורות צבעונים) ואדמה (קרקע חקלאית, גינה וקרקע טבעית)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus הוא פתוגן אופורטוניסטי אנושי הגורם למגוון זיהומים המכונים באופן קולקטיבי אספרגילוזיס, המשפיעים על למעלה מ -8 מיליון אנשים ברחבי העולם16,20. כ -300,000 אנשים ברחבי העולם סובלים מאספרגילוזיס פולשנית, שהיא הצורה החמורה ביותר של אספרגילוזיס16. בהתאם לגורמים כגון אוכלוסיית המטופלים, אתר ההדבקה והיעילות של טיפול אנטי פטרייתי, שיעור התמותה יכול להיות גבוה עד 90%. במהלך העשורים האחרונים, ההתנגדות לטיפולים אנטי פטרייתיים גדלה, ודרשה מאמצי מעקב עולמיים באוכלוסיות קליניות וסביבתיות כאחד כדי לעקוב אחר גנוטיפים של עמידות אלה 21,22,23. בהתחשב ביכולתו לגדול בטמפרטורות כלפי מעלה של 50 מעלות צלזיוס, ניתן לנצל טמפרטורה זו כדי לבחור עבור A. fumigatus מבודד מהאדמה בשיטות התלויות בתרבית. מבודדי אספרגילוס פומיגטוס הם בדרך כלל גנוטיפיים בתשעה לוקוסים פולימורפיים מאוד של טנדם קצר (STR), שהוכחו כבעלי כוח מפלה גבוה בין זנים24. ניתן להשוות את הגנוטיפים האלה של STR לאוכלוסיות אחרות שנסקרו בעבר כדי לעקוב אחר התפשטות הגנוטיפים של A. fumigatus, כולל גנים של עמידות לתרופות, ברחבי העולם.

להלן נתאר פרוטוקול לבידוד מהיר של שמרים ו- A. fumigatus מדגימות קרקע באופן התלוי בתרבית. בהתאם לכמות הקרקע המתקבלת לכל דגימה, ניתן לחלוק את דגימות הקרקע בין שני הפרוטוקולים. בהשוואה לשיטות דומות המבודדות שמרים ו- A. fumigatus מהאדמה, פרוטוקול זה משתמש בפי 10 פחות אדמה לכל מבודד המתקבל. מחקרים המנסים לבודד את A. fumigatus מהקרקע דורשים בין 1 ל-2 גרם אדמה לכל מבודד, בעוד שפרוטוקול זה דורש רק 0.1-0.2 גרם קרקע 18,19,25. פרוטוקול זה משתמש בפלסטיק ובמיכלים קטנים יותר המאפשרים את תכנון התפוקה הגבוהה שלו. לכן, ניתן לעבד מספר גדול יותר של דגימות תוך שימוש בפחות מקום לציוד כגון אינקובטורים ותופי רולר. דגימות קרקע יכולות להיות מעובדות במלואן כדי לקבל מבודדים תוך 7 ימים בלבד. פרוטוקול זה הותאם כדי לאפשר עיבוד של עד 150-200 דגימות ביום לאדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל שלב העושה שימוש בדגימות קרקע בינלאומיות ו/או נבגי A. fumigatus ו- mycelia דורשים עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית עבור אורגניזמים ברמה 2 (BSCII).

1. בידוד שמרים מהאדמה

  1. הכנת תמיסות אנטיבקטריאליות ואנטי פטרייתיות
    1. השוה אבקת כלוראמפניקול ב-70% אתנול כדי להכין תמיסת מלאי של 50 גרם לליטר. לעקר על ידי סינון מזרקים ולאחסן ב 4 °C (64 °F).
      הערה: אנטיביוטיקה זו תמנע את צמיחתם של רוב החיידקים במהלך בידוד שמרי הקרקע. מכיוון שחיידקים עמידים לכלוראמפניקול עדיין עשויים לגדול, יש לקחת בחשבון את המורפולוגיה של המושבה בעת הבחנה בין שמרים לחיידקים. ניתן להוסיף אנטיביוטיקה נוספת למדיה כאשר עובדים עם אדמה החשודה כמכילה זני חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה. זיהום חיידקי במדיה המכילה תוסף כלוראמפניקול לא היה בעיה שנתקלים בה בעת בידוד שמרים מקרקעות סביבתיות.
    2. השהו אבקת בנומיל ב-DMSO כדי להכין תמיסת מלאי של 5 גרם לליטר. לעקר על ידי סינון מזרקים ולאחסן ב 4 °C (64 °F).
      הערה: תרופה אנטי-פטרייתית סלקטיבית זו מונעת את צמיחתן של פטריות החוטים ביותר מבלי להשפיע על צמיחת השמרים במהלך בידוד שמרי הקרקע26,27.
  2. הכנת מדיה תרבותית וציוד סטרילי
    1. להכנת ציר YEPD (תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז), הוסיפו 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון ו-20 גרם דקסטרוז ל-1 ליטר של מים מזוקקים כפול. מערבבים עד לערבוב טוב ואוטוקלבים במשך 40 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
    2. YEPD מדיום אגר מוצק
      1. מערבבים 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון, 20 גרם דקסטרוז ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר מים. מערבבים היטב כדי לערבב autoclave במשך 40 דקות ב 121 °C (64 °F).
      2. לאחר קירור מספיק, יש להוסיף 1 מ"ל של כלורמפניקול ובנומיל מתמיסות מלאי כדי להביא את הריכוזים הסופיים של שני האנטי-מיקרוביאלים ל-50 מ"ג/ל' ו-5 מ"ג/ל', בהתאמה.
      3. מערבבים היטב על ידי ערבוב ויוצקים לתוך כלי פטרי בקוטר 10 ס"מ. עזבו בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי להגדיר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
        הערה: מ 1 L של YEPD, כ 40 צלחות ניתן לשפוך.
    3. עיקרו מקלות אפליקטור מעץ עם קצה רגיל ומפזרי תאים רב-פעמיים על ידי אוטוקלאבינג ואחסנו בטמפרטורת החדר.
  3. דגירה של אדמה בציר נוזלי
    1. הכן קבוצה של צינורות תרבית סטריליים של 13 מ"ל על ידי תיוגם במזהה דגימת אדמה.
    2. באמצעות פיפטה סרולוגית, מוסיפים 5 מ"ל של ציר YEPD בתוספת כלוראמפניקול ובנומיל לכל צינור.
    3. בעבודה ב- BSCII, מעבירים ~ 0.1 גרם אדמה לתוך צינור התרבית המתאים באמצעות אפליקטור סטרילי, בעל קצה פשוט מעץ.
      הערה: השתמש באפליקטור טרי עבור כל דגימת קרקע והשלך מיד עם השימוש כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות.
    4. צמצם את הצינור בצורה מאובטחת לתחנה הראשונה כדי למנוע שפיכה אך עדיין לאפשר חילופי אוויר במהלך הדגירה. דגירה של צינורות התרבית בתוף רולר למשך 24 שעות בטמפרטורה הנחשבת אופטימלית למקסום צמיחת השמרים.
      הערה: יש להחליט על טמפרטורת הדגירה על סמך הטמפרטורה השנתית הממוצעת של ארץ המוצא של דגימות הקרקע. לדוגמה, בעת בידוד שמרי הקרקע מאיסלנד, צינורות התרבית דוגרו בטמפרטורה של 14 מעלות צלזיוס, בעוד שקרקעות מסעודיה דוגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. בשל צמיחה איטית יותר של שמרים בטמפרטורות נמוכות יותר, ייתכן שיהיה צורך להאריך את זמן הדגירה עד 72 שעות.
  4. מעבירים את הסופרנאטנט למדיום המוצק.
    1. באמצעות הסט של לוחות YEPD + כלורמפניקול + בנומיל אגר שהוכנו בשלב 1.2, סמן אותם עם מזהה דגימת הקרקע.
    2. הסר את צינורות התרבות שהוכנו בשלב 1.3 מתוף הרולר. בעבודה ב- BSCII, מערבולת לזמן קצר את הצינור כדי למשוך חלקיקי קרקע ותאים שאולי התיישבו בתחתית בחזרה לתוך התרחיף.
    3. באמצעות מיקרופיפט, מעבירים 100 μL של הסופרנטנט על צלחת. השתמשו במפיץ תאים סטרילי הניתן לשימוש חוזר כדי לפזר את הנוזל ביסודיות ובאופן שווה על פני השטח של האגר.
      הערה: עבודה בקבוצות של 10 דוגמאות יכולה להאיץ באופן משמעותי את התהליך הזה. פיפט את הסופרנטנט על 10 צלחות תחילה ולאחר מכן לבצע התפשטות. השתמש במפיץ טרי עבור כל דגימה כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות.
    4. עורמים את הצלחות בשקיות ניילון, אוטמים ודגירה הפוכה למשך 2-3 ימים באותה טמפרטורה ששימשה בעבר לדגירה של ציר נוזלי עד לנראה לצמיחה מיקרוביאלית.
  5. זיהוי שמרים ופסים למושבות בודדות
    1. לאחר מתן זמן דגירה מספק (בדרך כלל 2-3 ימים, אך עשוי להימשך זמן רב יותר בטמפרטורות נמוכות יותר), בדוק את הצלחות ב- BSCII עבור כל צמיחת שמרים. חפשו שמרים קרמיים, עגולים, דמויי מט, המובחנים בקלות ממושבות חיידקים ועובש.
      הערה: שמרים מסוימים מייצרים פיגמנטים צבעוניים ועשויים להיראות שחורים/חומים, צהובים או אדומים, אך מרקם המושבה וצורתם הכללית יהיו דומים לשמרים ללא פיגמנטים.
    2. בחר מושבה אחת דמוית שמרים מכל צלחת לעיבוד נוסף.
      הערה: אם נצפה יותר מסוג אחד של מורפולוגיה על לוח יחיד, בחר מושבה מייצגת אחת עבור כל סוג מורפולוגי.
    3. באמצעות מקלות אפליקטור סטריליים מעץ בעל קצה רגיל, מעבירים כל מושבה שנבחרה לצלחת טרייה של YEPD + כלורמפניקול + בנומיל ופס למושבות בודדות. בצע שלושה פסים נפרדים.
      1. פסים קדימה ואחורה מעל שליש מהצלחת באמצעות מקל אפליקטור. התחל את הרצף השני והשלישי על ידי פסים של המוליך על פני הפס הקודם פעם אחת. השתמשו במקל אפליקטור חדש לכל פס.
        הערה: השתמש בלוחית אחת לכל מבודד. יש להשליך את המוליך מיד עם השימוש כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות.
    4. עורמים את הצלחות בשקיות ניילון, אוטמים ודוגרים הפוך במשך 2-3 ימים באותה טמפרטורה שהייתה נהוגה בעבר עד שמושבות בודדות הופכות גלויות לעין.
  6. זיהוי מיני שמרים באמצעות ריצוף ITS
    1. בחרו מושבה יחידה ומופרדת היטב לכל אדמה מבודדת ותת-תרבות על גבי צלחת YEPD + כלוראמפניקול + בנומיל חדשה ומופרדת היטב כדי להשיג תאים נוספים. דגירה במשך 2-3 ימים באותה טמפרטורה ששימשה בעבר.
    2. קוצרים את התאים שגודלו זה עתה ותולים אותם בצינורות מקפיא של -80 מעלות צלזיוס המכילים 1 מ"ל של 30% גליצרול מעוקר במים מזוקקים כפולים כדי ליצור תרחיפי תאים. שמור על מתלים אלה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כפתרונות מלאי.
    3. השתמש בתאים טריים כדי לבצע PCR מושבה (תגובת שרשרת פולימראז) עם פריימרים ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') ו- ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') כדי להגביר את גן הברקוד הפטרייתי, ITS9. השתמש בתנאי התרמו-מחזור הבאים: שלב דנטורציה ראשוני ב- 95 ° C למשך 10 דקות ואחריו 35 מחזורים של (i) 95 ° C עבור 30 שניות, (ii) 55 ° C עבור 30 שניות, ו- (iii) 72 ° C למשך דקה אחת.
      הערה: למושבה PCR יש שיעור הצלחה גבוה וזמן אספקה מהיר יותר מאשר מיצוי DNA ואחריו PCR.
    4. אם ה-PCR של המושבה נכשל שוב ושוב עבור זן, חלץ דנ"א באמצעות הפרוטוקול המועדף ובצע את ה-PCR של ITS באמצעות דנ"א גנומי שחולץ כתבנית (השתמש באותם תנאים תרמו-מחזוריים כמו לעיל).
      הערה: מיצוי דנ"א זול יחסית על בסיס כלורופורם מומלץ28.
    5. בצע ריצוף סנגר כדי לקבוע את רצף הדנ"א של אזור ITS מוגבר עבור כל זן.
    6. השווה את רצף ITS המתקבל של זני השמרים לרצפים שהופקדו במאגרי מידע ציבוריים כגון NCBI GenBank ו- UNITE כדי לקבוע את זהות המינים.

2. בידודו של אספרגילוס פומיגטוס מהאדמה

  1. מכינים 1 מ"ל של מרק דקסטרוז סטרילי של Sabouraud (SDB) בתוספת האנטיביוטיקה כלוראמפניקול לכל דגימת אדמה.
    1. הוסיפו 10 גרם של פפטון ו-20 גרם דקסטרוז ל-1 ליטר מים מזוקקים. Autoclave ב 121 °C (74 °F) למשך 40 דקות.
    2. אפשרו ל-SDB להתקרר לכ-50 מעלות צלזיוס, הוסיפו 1 מ"ל של כלוראמפניקול 1 מ"ל כדי להביא את הריכוז ל-50 מ"ג/ל'.
      הערה: כלוראמפניקול מוכן זהה לזה שתואר לעיל לבידוד שמרים. מלבד עיכוב צמיחת החיידקים, כלורמפניקול גם מונע ייצור של גז מחיידקים שיגרמו לצינורות להיפתח במהלך שלב הדגירה המפורט בשלב 2.2.
    3. באופן אספטי 1 מ"ל של SDB לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל לכל דגימת קרקע באמצעות פיפטה מכנית.
  2. הוסיפו אדמה לצינורות מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל.
    1. הניחו ציפוי ספסל או ריפוד סופג בתוך BSCII כדי לסייע בסילוק אדמה שנשפכה.
    2. באמצעות מקלות אפליקטורים אוטוקלאבים, מעבירים כ-0.1 גרם אדמה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של SBD. סגרו את הצינור והמערבולת. דגירה של האדמה התלויה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
      הערה: אין צורך ברעידות במהלך הדגירה.
  3. קציר תפטיר של מרק מחוסן באדמה
    1. מכינים צלחות אגר תמצית מאלט (MEA).
      1. לליטר של MEA: להוסיף 20 גרם של תמצית מאלט, 20 גרם של דקסטרוז, 6 גרם של פפטון, ו 15 גרם של אגר עד 1 L של מים מזוקקים. Autoclave ב 121 °C (74 °F) למשך 40 דקות.
      2. אפשרו ל-MEA להתקרר ל-50 מעלות צלזיוס, ואז הוסיפו 1 מ"ל של 50 גרם/ל' כלוראמפניקול כדי להגיע לריכוז סופי של 50 מ"ג/ל'.
    2. מעבירים את המיציליה מהמרק המחוסן באדמה לצלחות MEA.
      1. זהה אינוקולומים של קרקע שיש להם צמיחה תפטירית נראית לעין ב-SDB לגבול האוויר.
      2. השתמשו במקלות אפליקטור מעץ מעוקרים בעלי קצה רגיל כדי להעביר את המיציליה למרכז צלחת MEA. דגירה של צלחות MEA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
  4. בחירת תפטירים עם תכונות מורפולוגיות של A. fumigatus .
    1. זהה מושבות עובש בעלות תכונות מורפולוגיות אופייניות של A. fumigatus (זמש ירוק כמו צמיחה).
    2. בעבודה ב-BSCII, השתמשו במקלות אפליקטורים מעוקרים מעץ עם קצה רגיל או בלולאת חיסון כדי לקצור קונידיה/תמיסליה על ידי גירוד המשטח פעם אחת. מעבירים את הנבגים/תמיסליה למרכז צלחת MEA על ידי פסים על האגר למושבות בודדות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
      הערה: מכיוון שזני A. fumigatus מרובים ו/או פטריות אחרות עשויים להיות נוכחים בצלחת, חשוב לפסים למושבות בודדות. ניתן להשתמש בפרוטוקול פסים של מושבה אחת בשלב 1.5.3 בפרוטוקול בידוד השמרים.
    3. באמצעות מקל אפליקטור סטרילי או לולאת חיסון, תת-תרבות מושבה בודדת שנוצרה בשלב 2.4.1.2 על MEA על ידי פסים של המושבה פעם אחת. מפזרים את הנבגים שנקטפו למרכז הצלחת. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
  5. קצירת נבגי A. fumigatus /mycelia לאחסון תרבית
    1. הכינו תמיסת גליצרול סטרילית של 30% (לתמיסה של 100 מ"ל, הוסיפו 30 מ"ל של 100% גליצרול מעורבב עם 70 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, מעוקרים ב-121 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות).
    2. בעבודה ב- BSCII, השתמש בפיפטה p1000 כדי לשאוף 1 מ"ל של תמיסת הגליצרול 30%. מחלקים את תמיסת הגליצרול בגודל 1 מ"ל למושבה A. fumigatus כדי לקצור נבגים/תמיסות.
      1. בשל ההידרופוביות של נבגי A. fumigatus /mycelia, השתמש בקצה הפיפטה כדי לגרד אזור צפוף של הצלחת.
        הערה: כאשר גליצרול מחולק בשריטה, הגליצרול היה נדבק לאזור השריטה במקום להתגלגל על האגר.
      2. לאט לאט מחלקים את הגליצרול על אזור השריטות כדי לנתק את הנבגים ולהשעות אותם בתמיסת הגליצרול.
      3. לאחר חלוקתם המלאה, היטו קלות את הצלחת ושאפו את תרחיף נבגי הגליצרול/מיתיסיה.
        הערה: כ-750 עד 800 μL ישאפו.
      4. מעבירים את השואף לצינור הקפאה סטרילי ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. במידת הצורך, צור מלאי עבודה על-ידי חזרה על שלבים 2.5.2.1 עד 2.5.2.4.
  6. זיהוי פנוטיפי של זני A. fumigatus
    1. באמצעות מלאי הנבגים שנוצר משלב 2.5.2, צור דילול של פי 100 במים.
      1. לשאוף 10 μL של מלאי התפטיר והנבגים ולחלק 990 μL של מים. מערבולת את המתלים.
    2. מחלקים 10 μL של מתלה הנבג המדולל על שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית.
    3. אופציונלי: הכתימו את תרחיף התפטיר והנבגים בכחול מתילן.
      1. כדי להכתים במתילן כחול, יש לקבע את הקונידיה והקונידיופורים למגלשה על ידי העברת המגלשה מעל מבער בונזן עד לייבוש.
      2. יש למרוח מתילן כחול למשך 1-2 דקות ולשטוף במים.
      3. מייבשים את המגלשה בנייר מכתים.
    4. באמצעות מיקרוסקופ מורכב בהגדלה של פי 400, צפו במתלים ואתרו קונידיופורים. השווה את המורפולוגיה של קונידיופור שנצפתה עם מורפולוגיה של A. fumigatus conidiophore.
  7. זיהוי מולקולרי של זני A. fumigatus
    1. חלצו דנ"א מכל מבודד בהתאם לפרוטוקולים נפוצים של מיצוי דנ"א פטרייתי.
    2. באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים אספרגילוס β-טובולין (β-tub1 ו-β-tub4), מריצים PCR ומקבלים את הרצף עבור המוצרים המוגברים, בהתאם לפרוטוקולים שתוארו על ידי Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. השווה את הרצפים שהתקבלו לרצפים שהופקדו במאגרי מידע ציבוריים כגון NCBI GenBank באמצעות BLAST.
      2. ודא שרצפי המתחים הם התאמה עליונה לרצפי A. fumigatus במסד הנתונים.
    3. חלופה לשלב 2.7.2, הפעל תגובת PCR מרובבת המכוונת לסוגי ההזדווגות A. fumigatus MAT1-1 ו- MAT1-229.
      1. השתמש בשלושת רצפי הפריימר הבאים בתגובת המולטיפלקס PCR: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. השתמש בפרמטרים הבאים של thermocycler: 5 דקות ב- 95 ° C, 35 מחזורים של 30 שניות ב - 95 ° C, 30 שניות ב - 60 ° C, ו 1 דקה ב 72 ° C לפני 5 דקות אחרונות ב 72 ° C.
      3. הפעל אלקטרופורזה של ג'ל כדי לזהות את המוצרים; חפש 834 bp MAT-1 או 438 bp MAT1-2. השתמש בזני A. fumigatus שאישרו הגברה מסוג הזדווגות כבקרות חיוביות ושליליות.
  8. גנוטיפ מיקרו-לווייני של זני A. fumigatus באמצעות ניתוח שברים
    הערה: למרות שהשלבים המפורטים להלן מכסים באופן נרחב את הגנוטיפ A. fumigatus בתשעה מוקדי מיקרו-לוויינים (STR), רק כמה שיקולים חשובים הודגשו. לפרטים על A. fumigatus STR genotyping, עיין ב- De Valk et al.24,30.
    1. הכן שלושה תערובות מאסטר של מולטיפלקס PCR באמצעות פריימרים של STRAf שתוארו בעבר על ידי De Valk et al.24.
      1. סימון פלואורסצנטי של פריימרים קדמיים כדי לקבוע את גודל השבר באמצעות אלקטרופורזה נימית. ודא שהריכוז של הפריימרים הקדמיים הוא חצי (0.5 μM) מזה של הפריימרים ההפוכים (1 μM) בתוך התערובת הראשית.
        הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בתוויות פלואורסצנטיות בעלות אורכי גל סופגים התואמים את אלה של תקן הצבע שנבחר המשמש במהלך אלקטרופורזה נימית
      2. השתמש בפולימראז התחלה חם לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
      3. השתמש בריכוז דנ"א של 0.1 ננוגרם לכל תגובה.
    2. הפעל את המולטיפלקס PCR עבור כל זן באמצעות תוכנית ה- PCR הבאה: 95 ° C למשך 10 דקות, 40 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, 60 ° C עבור 30 שניות, ו- 72 ° C עבור 60 שניות, ואחריו 72 ° C למשך 10 דקות והחזקה ב - 4 ° C.
    3. בדוק אם יש מוצרים מוגברים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
    4. דיללו את המוצרים לרמה הרצויה (בדרך כלל ~ 50x) כפי שהומלץ על ידי מומחים לניתוח שברים והפעל אלקטרופורזה נימית. בצע שלוש ריצות עבור כל זן, כאשר כל ריצה מכסה שלוש תגובות מרובות עם שלוש בדיקות פלואורסצנטיות שונות.
    5. כדי לקבוע את גודל השבר הנכון עבור כל אחד מתשעת מוקדי ה-STR, השתמש בתוכנה המסוגלת לנתח שברים.
      1. אחזור הנתונים הגולמיים המתקבלים מאלקטרופורזה נימית. דרג את גדלי השברים בהתבסס על הפסגה הגדולה ביותר באמצעות תוכנת ניתוח השברים (למשל, אוזיריס).
      2. המר את גדלי השברים למספרים חוזרים עבור כל אחד מתשעת המוקדים. השתמש בגדלי השברים של המספרים החוזרים של זן הייחוס Af293 כפי שתואר קודם לכן על ידי De Valk et al.24.
        הערה: ייתכנו שינויים קלים בגדלים של שברים בין פלטפורמות אלקטרופורזה נימיות שונות. לפיכך, חשוב לכלול זן ייחוס נפוץ (וסולם פנימי) עם גודל שבר ידוע עבור כל אחד מתשעת הלוקוסים עבור זני גנוטיפ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד שמרים מהאדמה
פרוטוקול בידוד השמרים הנ"ל יושם כדי לתרבת שמרים מדגימות קרקע שמקורן ב-53 מקומות בתשע מדינות 9,12. בסך הכל בודדו 1,473 זני שמרים מ-3,826 דגימות קרקע. בהתחשב בתנאי האקלים השונים של תשע המדינות המקוריות, טמפרטורת הדגירה הטובה ביותר עבור כל מדינה נקבעה על סמך הטמפרטורה השנתית הממוצעת שלה (טבלה 1). בהתחשב בצמיחת השמרים האיטית יותר ב-14 מעלות צלזיוס, דגימות קרקע מאיסלנד הודגמו על תוף רולר למשך 48 שעות נוספות (96-120 שעות בסך הכל). לאחר 2-3 ימים של דגירה על מדיום מוצק, ניתן היה לראות את הצמיחה המיקרוביאלית על הצלחות של כל הדגימות (איור 1A). מושבה שנבחרה באקראי עבור כל מורפולוגיה של שמרים שנמצאת על צלחת הוטבעה עבור מושבות בודדות על צלחות טריות (איור 1B).

קצב בידוד השמרים המוצלח היה שונה בין המדינות (טבלה 1). לדוגמה, 97 זני שמרים הוסבו מ-562 דגימות קרקע סעודיות (17.3%), בעוד ש-261 שמרים עברו תרבית מ-300 דגימות קרקע קנדיות (87%). יש לבצע ניתוח נדיר כדי לקבוע אם נערכה דגימת קרקע מספקת כדי לקבל הערכות מדויקות של מגוון השמרים האמיתי במקומות שנדגמו. דוגמה לניתוח נדיר של כל מדינה נעשתה מראש כאשר מדד המגוון של שאנון שימש כמדד למגוון שמרי הקרקע (איור 2). עקומות הנדירות שנוצרו כתוצאה מכך התקרבו לאסימפטוטת הרוויה, מה שמצביע על כך שדגימה נוספת לא הניבה ככל הנראה מגוון שמרים גדול יותר.

ריצוף של אזור ITS גילה כי ניתן לסווג את 1,473 מבודדי השמרים ל-134 מינים נפרדים. זה כלל 90 מינים ידועים ו-44 מינים שעשויים להיות חדשניים. יישמנו מודל של אפקטים מעורבים כדי לזהות מנבאים של מגוון שמרי הקרקע התרבותיים העולמי, כפי שמכומת על ידי מדד המגוון של שאנון31. במודל זה, משקעים שנתיים ממוצעים, טמפרטורה שנתית ממוצעת, גובה ומרחק לקו המשווה של מיקומי הדגימה הותקנו כאפקטים קבועים, בעוד שארץ הדגימה נקבעה כאפקט אקראי9. מודל זה זיהה משקעים שנתיים ממוצעים כמתואמים באופן משמעותי עם מדד המגוון של שאנון (p = 0.012), בעוד שלא נמצאו קורלציות משמעותיות בין משתנים מנבאים אחרים לבין מדד המגוון של שאנון9.

כדי להשוות את הפרוטוקול מבוסס התרבות הזה לשיטות שאינן תלויות בתרבות, השווינו את הממצאים האלה למחקר קודם של טדרסו ועמיתיו שחקר את המגוון הגלובלי של פטריות קרקע באמצעות מטא-גנומיקה2. טדרסו ועמיתיו ביצעו ריצוף בתפוקה גבוהה של אזור ITS על דנ"א שחולץ ישירות מדגימות קרקע של 39 מדינות, שארבע מהן, כלומר קמרון, קנדה, סין וניו זילנד, נדגמו גם הן במחקר זה. ביצענו חיפושי BLAST כדי לזהות את רצפי ITS שנמצאים בשני מערכי הנתונים32, ומצאנו של-26% מרצפי ה-ITS הייתה התאמה משמעותית (>98.41% זהות נוקלאוטידים) במערך הנתונים של המטא-גנומיקה. עם זאת, <3% התאימו לרצף פטרייתי מאותה מדינה, בעוד ש-23% הנותרים התאימו לרצף פטרייתי שנמצא במדינה אחרת9. הצלחנו יותר ממחקר המטא-גנומיקה בהערת רצפי ה-ITS עם זהות מיני השמרים. טדרסו ועמיתיו דיווחו על סך של 50,589 יחידות טקסונומיות תפעוליות פטרייתיות (OTUs), כאשר מספר ה-OTUs של שמרים אינו ידוע. מתוך ה-OTUs הפטרייתיים הללו, 33% הוזכרו רק כ-environmental_sequence (724, 1.4%), uncultured_soil_fungus (2,405, 4.8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1,407, 2.8%) או uncultured_fungus (11,898, 23.5%).

בידוד אספרגילוס פומיגטוס מהאדמה
לאחר 3 ימים של דגירה בקרקע בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס ב-1 מ"ל של SDB בצינור מיקרו-צנטריפוגה, ניתן למצוא תפטירים גדלים בתוך ה-SDB, על ה-SDB לגבול האוויר ו/או על הקירות הפנימיים. תפטיריה של אספרגילוס פומיגטוס מצויה בדרך כלל על ה-SDB עד לגבול האוויר, אך ניתן גם לקצור אותה ממש מתחת לפני השטח של ה-SDB. לאחר שלב זה, התמיסליות מועברות ל- MEA וגדלות במשך 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צמיחת תפטיר על לוחות עשויה ליצור רק את המורפולוגיה של זמש ירוק האופיינית ל-A. fumigatus (איור 3A). באופן נפוץ יותר, תבניות תרמוטולרנטיות אחרות עשויות להיות נוכחות בתוך אותה אדמה ולצמוח עם A. fumigatus על אותה צלחת או על אותה צלחת או על עצמה (איור3B-D). שיעורי הבידוד של Aspergillus fumigatus עשויים להשתנות בין מיקומים גיאוגרפיים, בדומה למה שנמצא עבור שמרי קרקע. לדוגמה, בתוך ונקובר, קנדה, 251 מבודדים התקבלו בשיטה זו מתוך 540 דגימות קרקע (46.5%) (תוצאות שלא פורסמו). לעומת זאת, בתוך קמרון, 51 מבודדי A. fumigatus נקטפו מתוך 495 דגימות קרקע (10.3%)33.

A. fumigatus conidiophore מבנה ניתן לראות ולזהות באמצעות מיקרוסקופ אור. לקונידיופורים יש מורפולוגיה של כדור על מקל (איור 4). בנוסף, A. fumigatus conidiophores הם יוניסריאטים, כאשר הפילידים, המחוברים לשרשראות הקונידיה, מחוברים ישירות לשלפוחית הכדורית. במינים אחרים של אספרגילוס, קונידיופורים הם ביסריאטים, שם הפילידים מחוברים למטולות המחוברות לשלפוחית.

מספר תוכנות זמינות לביצוע ניתוח שברים של הנתונים הגולמיים מאלקטרופורזה נימית, תוך המרת ספקטרום האלקטרופורזה הנימית לגדולי שברים. איור 5 הוא כרומטוגרמה שנוצרת על ידי התוכנית אוזיריס. שלושת הערוצים המדמיינים את אורכי השברים של A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B ו- 2C), trinucleotide (3A, 3B ו- 3C) ו- tetranucleotide (4A, 4B ו- 4C) STR לוקוסים מוצגים. בנוסף, מוצגים גם ממצאי PCR המתרחשים אם ריכוז הדנ"א של הדגימה במהלך PCR גבוה מדי. הפסגות הגבוהות ביותר של כל צבע מייצגות את גדלי השברים של שלושת מוקדי ה-STR בעלילה זו.

ניתן לדמיין את השונות הגנטית הקיימת בין הגנוטיפים של A. fumigatus STR באמצעות פופר חבילת R. סקריפט R bruvo.msn יוצר מטריצת מרחקים גנטיים של Bruvo בין כל זוג של גנוטיפים. מטריצה זו משמשת לאחר מכן ליצירת רשת מורחבת מינימלית (MSN). לאחר מכן ניתן ליצור MSN באיכות גבוהה באמצעות סקריפט R plot_poppr_msn או imsn (איור 6). ניתוח מפלה של מרכיבים עיקריים (DAPC) הוא שיטה נוספת להמחשת הקשרים הגנטיים בין זנים (איור 7). dapc סקריפט R בחבילת R adegenet משמש לביצוע DAPC וניתן להשתמש בו עם קודמי קבוצה ידועים או לא ידועים. עם קידומי קבוצות לא ידועים, הוא משתמש באשכולות K-means כדי לזהות את המספר הסביר של קבוצות של פרטים.

Figure 1
איור 1: בידוד שמרים מדגימות קרקע. (A) צמיחה מיקרוביאלית נראית על אגר מוצק לאחר 2-3 ימי דגירה. ניתן לראות מושבות שמרים שזורות זו בזו בין מושבות פטרייתיות/חיידקיות אחרות. מושבת שמרים מייצגת אחת לכל סוג מורפולוגי על צלחת נבחרת כדי לפס עבור מושבות בודדות. (B) שלושה פסים מבוצעים כדי להשיג מושבות בודדות של שמרים מבודדים. צלחת אחת שימשה להשגת כל קרקע מבודדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח נדיר של דגימת קרקע. בכל אחת מתשע המדינות שנדגמו, מגוון שמרי הקרקע, כפי שמכומת על ידי מדד המגוון של שאנון, מתקרב לרוויה ככל שמספר דגימות הקרקע גדל. נתון זה הותאם מ-9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מורפולוגיה של אספרגילוס פומיגטוס על מורפולוגיה של סאבוראוד דקסטרוסאגר. (A) מורפולוגיה ירוקה דמוית זמש A. fumigatus growth. (ב-ד) A. fumigatus growth עם תבניות תרמופיליות אחרות הקיימות בתוך דגימת הקרקע. A. fumigatus conidiation מופחת באופן ניכר ב- B ו- D. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תצלום של אספרגילוס פומיגטוס קונידיופור מתחת למיקרוסקופ אור. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תפוקת אוזיריס של תשעה לוקוסים מיקרו-לוויינים מזן אספרגילוס פומיגטוס . הפלטים תואמים את (A) דינוקלאוטיד (2A, 2B ו-2C), (B) טרינוקלאוטיד (3A, 3B ו-3C) ו-(C) טטרה-נוקלאוטיד (4A, 4B ו-4C) STR loci. תוויות פלואורסצנטיות של פריימר קדמי 5' הן: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. תוצרי תגובת המולטיפלקס דוללו פי 30 לפני אלקטרופורזה נימית. תקן הצבע LIZ600 שימש במהלך אלקטרופורזה נימית. הנתונים הגולמיים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח השיא אוזיריס המזהה שיאים פוטנציאליים בין 60 ל-400 bp. מספר ממצאי PCR הם פסגות מחוץ לקנה המידה שגורמות לדימום פלואורסצנטי, לשיאי גמגום ולפסגות N-1 (C). קיצורים: 6-FAM = 6-carboxyfluorescein; HEX = הקסכלורופלואורסצין; STR = טנדם קצר חוזר; RFU = יחידות פלואורסצנטיות יחסיות; BPS = זוגות בסיסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: רשת מינימלית המציגה את הקשר הגנטי בין MLGs של A. fumigatus מאיסלנד לבין הטריטוריות הצפון-מערביות בקנדה. כל צומת מייצג MLG אחד, כאשר גודל הצומת מתאים למספר הזנים עבור כל MLG. לצמתים הדומים יותר מבחינה גנטית יש קצוות כהים ועבים יותר, בעוד שלצמתים מרוחקים גנטית יש קצוות בהירים ודקים יותר. נתון זה הותאם מ-34. קיצורים: ISL = איסלנד; NWT = הטריטוריות הצפון-מערביות בקנדה; MLG = גנוטיפ מולטילוקוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: אשכולות גנטיים באמצעות ניתוח מפלה של מרכיבים עיקריים (DAPC) של אוכלוסיות איסלנד, NWT, אירו-אסיה, צפון אמריקה ואוקיאנית A. fumigatus . המבודדים עברו גנוטיפ בתשעה מוקדי מיקרו-לוויינים ותוקנו על-ידי שיבוטים, ובסך הכל 1,703 גנוטיפים מולטי-לוקוס ייחודיים. הגנוטיפים נצבעו על פי מקורות גיאוגרפיים. נתון זה הותאם מ-34. קיצורים: DAPC = ניתוח דיסקרימיננטי של רכיבים עיקריים; NWT = הטריטוריות הצפון-מערביות; ISL = איסלנד; CMR = קמרון; CAN = המילטון, אונטריו, קנדה; BEL = בלגיה; FRA = צרפת; DEU = גרמניה; IND = הודו; NLD = הולנד; NOR = נורבגיה; NZL = ניו זילנד; ESP = ספרד; CHE = שוויץ; ארה"ב = ארצות הברית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מדינה טמפרטורת הדגירה (°C) דגימות קרקע שמרים מבודדים מינים ידועים/ מינים חדשים
קמרון 30 493 110 10/9
קנדה 23 300 261 34/12
סין 23 340 230 23/5
קוסטה ריקה 30 388 95 20/2
צרפת 23 327 175 12/2
איסלנד 14 316 211 11/0
ניו זילנד 23 610 155 14/4
פרו 23 490 139 30/9
ערב הסעודית 30 562 97 8/1
סך 3826 1473 90/44

טבלה 1: בידוד שמרי קרקע מתשע מדינות בשש יבשות. טמפרטורת הדגירה לדגימות קרקע מכל מדינה נקבעה על סמך הטמפרטורה השנתית הממוצעת שלה. התוצאות המוצגות כאן מותאמות מ-9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שפותח לבידוד שמרים ו- A. fumigatus מהאדמה הוא שיטה מהירה ויעילה לעיבוד קרקע בתפוקה גבוהה ובידוד פטרייתי. הפרוטוקול דורש רק כמות קטנה של אדמה (0.1-0.2 גרם) לכל דגימה, מה שמאפשר לדגום יותר אתרים במאמץ דומה. זמן ההסבה המהיר מבטיח שניתן יהיה להשיג תוצאות תוך פרק זמן קצר ומאפשר זמן לפתרון בעיות ולניסויים חוזרים במידת הצורך. ניתן לשכפל פרוטוקול זה בקלות על פני הגדרות מעבדה רבות באמצעות מיקרוביולוגיה סטנדרטית וציוד לחקלאות תאים. עם זאת, כאשר מבודדים שמרים או עובשים מהאדמה הבינלאומית, נדרשים אמצעי זהירות נוספים. כל ציוד הפלסטיק שאינו חד פעמי, כגון מגשי פלסטיק ומפזרי תאים, צריך להיות מעוקר על ידי טבילה ב 10% אקונומיקה, ולאחר מכן autoclaving. יש לאטום את ציפוי הספסל המשומש בשקית ניילון ולעקר אותה באוטוקלב לפני השלכתו.

כדי לציין, המספר והזהות של שמרים שבודדו באמצעות הפרוטוקול לעיל יכולים להיות מוגבלים על ידי תנאי הדגירה והמדיה המשמשים. לדוגמה, דגירה של 24 שעות בתוף הרולר יכולה להעדיף בידוד של שמרים אירוביים הגדלים במהירות על פני מינים הגדלים לאט. בנוסף, ייתכן שהשימוש במדיום YEPD עשיר בחומרים מזינים לבידוד שמרים החריג מיני שמרים עם דרישות והעדפות שונות של חומרים מזינים. יתר על כן, רוב המקומות שנדגמו כאן חווים שינויים עונתיים בטמפרטורה ובתנאי אקלים אחרים במהלך השנה. אם הזמן והמשאבים מאפשרים זאת, ניתן לעבד את אותן דגימות קרקע תחת טווח של טמפרטורות שונות כדי לאפשר בידוד של מגוון רחב יותר של שמרים המאכלסים קרקעות אלה.

בעוד ששיטות שאינן תלויות בתרבות חיוניות להבהרת דפוסים בקנה מידה גדול במגוון פטרייתי סביבתי, הן אינן מצליחות להיות אינפורמטיביות מספיק עבור קבוצות ממוקדות של פטריות כגון שמרים. השימוש בבידוד תלוי תרבית איפשר חקירה מקיפה של מגוון שמרי הקרקע העולמי ומנבאיו9. בעוד שמחקר המטא-גנומיקה שנערך על ידי טדרסו ועמיתיו זיהה מנבאים ודפוסים גלובליים במגוון פטרייתי בקרקע, לא ניתן היה להבהיר את המידה שבה ממצאים אלה חלים באופן ספציפי על מגוון השמרים2. טדרסו ועמיתיו זיהו משקעים שנתיים ממוצעים כגורם אקלימי עיקרי למגוון פטריות הקרקע ברחבי העולם2. מחקר זה מצא מתאם דומה בין משקעים שנתיים ממוצעים לבין מגוון שמרים תרבותי בקרקעות גלובליות, והדגיש כי שיטות תלויות תרבית יכולות להשלים ולהרחיב את הממצאים של גישות ריצוף בתפוקה גבוהה9.

תוספת של chloramphenicol הוא צעד חשוב בהכנת מדיה מוצקה ונוזלית כדי למנוע הפרעה לצמיחה פטרייתית על ידי חיידקים. התוספת של כלוראמפניקול לתקשורת נוזלית היא חיונית מכיוון שהיעדר אנטיביוטיקה יאפשר לחיידקים הנמצאים בקרקע להתסיס. זה יוביל לייצור גזים שיפתחו בכוח צינורות מיקרוצנטריפוגה או צינורות תרבית של 13 מ"ל המשמשים במהלך דגירה של הקרקע בפרוטוקול. אם זיהום חיידקי בכלוראמפניקול המכיל אגר/מרק הוא בעיה, ניתן להחליף את הכלוראמפניקול או להשלים אותו באנטיביוטיקה חזקה יותר. בעת בידוד A. fumigatus מהאדמה, ניתן להחליף את ציר SD בתמיסת Tween 20 (0.2 M NaCl עם 1% Tween 20) כדי לעזור להשעות את ההידרופובי A. fumigatus conidia35,36. לאחר ההשעיה, ניתן לצפות 100 μL על אגר SD ולדגר בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.

Aspergillus fumigatus גדל במהירות ומתפזר בשפע כאשר הוא דגירה לבדה הן על אגר SD והן על מדיה MEA בין 22 °C (76 °F) ל -50 °C (84 °F). עם זאת, בהתאם למינים תרמוטולרנטיים אחרים שנמצאים בדגימת הקרקע, A. fumigatus צמיחה וספורולציה עשויים להיות מעוכבים (איור 3A,D). במצב כזה, ייתכן שיידרשו צעדים אחד עד כמה מתת-תרבות כדי להשיג מושבה טהורה לקציר ולאפיון הבאים.

ניתוח השברים של זני A. fumigatus באיור 5 נערך באמצעות התוכנה אוזיריס. מספר ממצאי PCR הודגשו באיור 5C ונדונו בפירוט על ידי De Valk et al.30. פסגות גמגום B-1 בעלות ערכים חוזרים קצרים יותר נגרמות על ידי החלקת גדיל במהלך הסינתזה של גדיל האנטיסנס על ידי ה- DNA פולימראז. שיאי N-1 מתרחשים אם ריכוז הדנ"א גבוה מדי במהלך PCR. ריכוז הדנ"א המומלץ הוא 0.1 ננוגרם כאמור בפרוטוקול לעיל. ממצא נוסף הוא דימום צבע שניתן לתקן באמצעות תוויות פלואורסצנטיות עם אורכי גל בליעה שאינם חופפים. לדוגמה, התוויות הפלורסנטיות 6-FAM, HEX ו-ATTO550, כמו גם תקן הצבע LIZ600, יוצרות פסגות שברים נפרדות (איור 5). לבסוף, כדי למנוע פסגות מחוץ לקנה המידה, דיללו כל תגובת PCR (במקרה זה, זה היה דילול של פי 50 בקירוב) לפני אלקטרופורזה נימית. כדי להפחית עוד יותר את הפלואורסצנציה של הפריימרים הקדמיים שאינם בשימוש בתערובת התגובה, יש לקצר בחצי את ריכוזי הפריימרים הקדמיים ביחס לפריימרים ההפוכים בעת יצירת התמהיל הראשי.

התפוקה הגבוהה והאופי השמרני של פרוטוקול זה מאפשרים רכישה מהירה וקלה יחסית של שמרים ועובשים רבים מהקרקעות. עם זאת, ישנן שתי מגבלות עיקריות הקיימות במתודולוגיית הדגימה. ראשית, המאפיינים המורפולוגיים של מושבות שמרים שגדלו מהאדמה שימשו לבחירה עבור מינים ייחודיים. אלה היו אז תת-תרבויות ושימשו לזיהוי מינים באמצעות ריצוף ITS. זה נעשה כדי למקסם את הייצוג של מיני שמרים נוכחים. עם זאת, מיני שמרים שחולקים מורפולוגיות דומות או זהות למושבות הנבחרות עלולים להיכשל בתת-תרבות. שנית, במהלך הבידוד של A. fumigatus , מכיוון שרק מושבה בודדת אחת נבחרת לכל דגימת קרקע, נוכחותם של פרטים מרובים בתוך דגימת הקרקע תחסר. זה עלול להוביל לייצוג חסר של המגוון הגנטי האמיתי הקיים באוכלוסיית הדגימה, שכן גנוטיפים ייחודיים הנמצאים באותה דגימת קרקע לא ייאספו. כדי למתן בעיה זו, במהלך הרצף של צעד המושבה הבודדת בעקבות התרבות הראשונה על מדיה מוצקה, ניתן לאסוף מספר מושבות בודדות כדי להשיג גנוטיפים נוספים. נפח הקרקע הקטן המשמש לכל דגימה מסייע למזער את מגבלת הדגימה הזו בהשוואה לשיטות שהשתמשו בכמויות גדולות יותר של קרקע לכל דגימה.

השימוש בפרוטוקול זה בעל התפוקה הגבוהה והיעילות בעבודה לבידוד שמרים ועובש יגדיל את מספר הפרטים באוכלוסיית הקרקע תוך שימוש בפחות מאמץ לכל דגימה. העלייה בכוח הסטטיסטי תספק תמונה טובה יותר של קהילות שמרים תרבותיות בתוך האדמה ותסייע לאפיין את אוכלוסיות הקרקע של A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק מס' ALLRP 570780-2021) ואוניברסיטת מקמאסטר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 183 מגוון שמרים אספרגילוס פומיגטוס תרבית טהורה מורפוטיפ ברקוד DNA גנוטיפ מיקרו-לווייני
בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter