Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av odlingsbara jästar och mögel från jordar för att undersöka svamppopulationsstruktur

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Detta protokoll är en effektiv, snabb metod för odling av jäst och mögel Aspergillus fumigatus från stora uppsättningar jordprover på så lite som 7 dagar. Metoderna kan enkelt modifieras för att rymma en rad inkubationsmedier och temperaturer efter behov för experiment.

Abstract

Jord är värd för en otrolig mängd mikrobiellt liv, där varje gram innehåller upp till miljarder bakterie-, arkeala och svampceller. Flercelliga svampar som mögel och encelliga svampar, brett definierade som jäst, fyller viktiga roller i markens ekosystem som sönderdelare av organiskt material och som matkällor för andra jordbor. Svamparternas mångfald i marken är beroende av en mängd klimatfaktorer som nederbörd och temperatur, liksom markegenskaper inklusive organiskt material, pH och fukt. Brist på adekvat miljöprovtagning, särskilt i regioner i Asien, Afrika, Sydamerika och Centralamerika, hindrar karakteriseringen av marksvampsamhällen och upptäckten av nya arter.

Vi karakteriserade jordsvampsamhällen i nio länder på sex kontinenter med hjälp av ~ 4 000 jordprover och ett protokoll som utvecklats i laboratoriet för isolering av jäst och mögel. Detta protokoll börjar med separat selektiv anrikning för jäst och den medicinskt relevanta formen Aspergillus fumigatus, i flytande media samtidigt som bakterietillväxt hämmas. Resulterande kolonier överförs sedan till fasta medier och bearbetas vidare för att erhålla rena kulturer, följt av nedströms genetisk karakterisering. Jästartsidentiteten fastställs genom sekvensering av deras inre transkriberade distansregion (ITS) i det nukleära ribosomala RNA-genklustret, medan den globala populationsstrukturen för A. fumigatus utforskas via mikrosatellitmarköranalys.

Protokollet tillämpades framgångsrikt för att isolera och karakterisera jordjäst och A. fumigatuspopulationer i Kamerun, Kanada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, Nya Zeeland och Saudiarabien. Dessa fynd avslöjade välbehövliga insikter om globala mönster i markjästdiversitet, liksom global befolkningsstruktur och svampdödande resistensprofiler för A. fumigatus. Detta dokument presenterar metoden för att isolera både jäst och A. fumigatus från internationella jordprover.

Introduction

Svampar i markens ekosystem spelar viktiga roller i nedbrytning av organiskt material, näringscykel och markgödsling1. Både kulturoberoende (dvs. sekvensering med hög genomströmning) och kulturberoende metoder används ofta i studien av marksvampar 2,3. Medan den stora mängden data som genereras av metabarkodsekvensering med hög genomströmning är användbar för att belysa storskaliga mönster i samhällsstruktur och mångfald, kan det kulturberoende tillvägagångssättet ge mycket kompletterande information om de taxonomiska och funktionella strukturerna i svampsamhällen, liksom mer specifika profiler av enskilda organismer genom nedströms mångfald och funktionella analyser på grund av tillgången på rena svampkulturer.

Trots att de sällan överstiger tusentals celler per gram jord, är jäst, brett definierad som encelliga svampar, viktiga sönderdelare och matkällor för andra jordbor 4,5. Faktum är att jäst kan vara de dominerande marksvamparna i kalla biosfärer som kontinentala Antarktis 6,7. Jord är också en primär reservoar av medicinskt relevanta jästsvampar som orsakar allvarliga opportunistiska infektioner hos människor och andra däggdjur8. Trots morfologiska likheter är jästarter fylogenetiskt olika och förekommer bland trådformiga svampar i två stora phyla, Ascomycota och Basidiomycota, inom svampriket9. Jäst saknar en definierande DNA-signatur vid svampbarkodningsgenen, den interna transkriberade distansregionen (ITS) i det nukleära ribosomala RNA-genklustret10, vilket gör dem oskiljbara från andra svampar i metagenomiska undersökningar och därmed kräver användning av kulturberoende metoder för att isolera jästarter.

Protokollet nedan implementerades för att karakterisera jordjästsamhällen i nio länder och identifiera globala trender och mönster i markjästdiversitet 9,11,12. Metagenomiska metoder är av begränsad nytta när man studerar riktade grupper av organismer såsom jäst 2,3. På grund av deras fylogenetiska mångfald kan jäst inte särskiljas från andra svampar baserat på DNA-sekvens ensam. Att studera jästpopulationer kräver således fortsatt användning av kulturberoende isolering. Odling är dock ofta betydligt mer tidskrävande och kräver mer personal för att utföra experimenten. Därför har protokollet optimerats och effektiviserats för snabbare bearbetning med begränsad personal. Den största fördelen med odling är att de identifierade jästarterna är levande jäst och inte döda, och därmed är mer benägna att vara sanna jordbor snarare än övergående celler som finns i jordarna. Det har uppskattats att cirka 40% av svamp-DNA i jord antingen är föroreningar från andra miljöer, extracellulära eller kommer från celler som inte längre är intakta, vilket orsakar sekvenseringsmetoder med hög genomströmning för att överskatta svamprikedomen med så mycket som 55%13. Kulturberoende isolering kan lätt bekräfta jästartsidentitet med den extra fördelen att säkerställa ren kultur som kan användas i nedströmsanalyser. Faktum är att rena kulturer av 44 förmodade nya jästarter identifierades med hjälp av detta jordisoleringsprotokoll som möjliggjorde användningen av en rad metoder för att studera deras taxonomiska och funktionella egenskaper i detalj14.

Protokollet nedan kan också användas för att isolera mögel som finns i jord, såsom A. fumigatus. Aspergillus fumigatus är en termofil och saprofytisk form med en bred, global fördelning i jord15. Det har isolerats från många kliniska och icke-kliniska miljöer. Icke-klinisk provtagning inkluderar vanligtvis luft, organiskt skräp (kompost, sågdamm, tulpanlökavfall) och jord (jordbruks-, trädgårds- och naturjord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus är en mänsklig opportunistisk patogen som orsakar en rad infektioner som kollektivt kallas aspergillos, som påverkar över 8 miljoner människor världen över16,20. Cirka 300 000 människor runt om i världen lider av invasiv aspergillos, vilket är den allvarligaste formen av aspergillos16. Beroende på faktorer som patientpopulationen, infektionsstället och effekten av svampdödande behandling kan dödligheten vara så hög som 90%. Under de senaste decennierna har resistensen mot svampdödande terapier ökat, vilket kräver globala övervakningsinsatser i både kliniska och miljömässiga populationer för att spåra dessa resistensgenotyper 21,22,23. Med tanke på dess förmåga att växa vid temperaturer upp till 50 ° C kan denna temperatur utnyttjas för att välja för A. fumigatusisolat från jord med hjälp av kulturberoende metoder. Aspergillus fumigatus-isolat är vanligtvis genotypade vid nio mycket polymorfa korta tandemupprepning (STR) loci, som visat sig ha hög diskriminerande effekt mellan stammar24. Dessa STR-genotyper kan jämföras med andra tidigare undersökta populationer för att spåra spridningen av A. fumigatus-genotyper, inklusive läkemedelsresistensgener, runt om i världen.

Nedan beskriver vi ett protokoll för snabb isolering av jäst och A. fumigatus från jordprover på ett kulturberoende sätt. Beroende på mängden jord som erhålls per prov kan jordproverna delas mellan de två protokollen. I jämförelse med liknande metoder som isolerar jäst och A. fumigatus från jord, använder detta protokoll 10 gånger mindre jord per erhållet isolat. Studier som försöker isolera A. fumigatus från jord kräver mellan 1 och 2 g jord per isolat, medan detta protokoll endast kräver 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Detta protokoll använder mindre plast och behållare som underlättar dess design med hög genomströmning. Därför kan ett större antal prover bearbetas med mindre utrymme för utrustning som inkubatorer och rulltrummor. Jordprover kan bearbetas fullständigt för att få isolat på så lite som 7 dagar. Detta protokoll har optimerats för att möjliggöra bearbetning av upp till 150-200 prover per dag och person.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla steg som använder internationella jordprover och / eller A. fumigatussporer och mycelia kräver att man arbetar i ett biosäkerhetsskåp för nivå 2-organismer (BSCII).

1. Isolering av jäst från jord

  1. Framställning av antibakteriella och antifungala lösningar
    1. Suspendera kloramfenikolpulver i 70 % etanol för att bereda en stamlösning på 50 g/l. Sterilisera genom sprutfiltrering och förvara vid 4 °C.
      OBS: Detta antibiotikum kommer att förhindra tillväxt av de flesta bakterier under jordjästisolering. Eftersom kloramfenikolresistenta bakterier fortfarande kan växa måste kolonimorfologin noggrant beaktas när man skiljer jäst från bakterier. Ytterligare antibiotika kan tillsättas till media vid arbete med jord som misstänks innehålla antibiotikaresistenta bakteriestammar. Bakteriell kontaminering i kloramfenikolkompletterade medier var inte ett problem som uppstod vid isolering av jäst från miljöjordar.
    2. Suspendera benomylpulver i DMSO för att bereda en 5 g/l stamlösning. Sterilisera genom sprutfiltrering och förvara vid 4 °C.
      OBS: Detta selektiva svampdödande läkemedel förhindrar tillväxt av de flesta trådformiga svampar utan att påverka jästtillväxten under jordjästisolering26,27.
  2. Beredning av odlingsmedier och steril utrustning
    1. För att förbereda YEPD (Jästextrakt-Peptone-Dextrose) buljong, tillsätt 10 g jästextrakt, 20 g pepton och 20 g dextros till 1 liter dubbeldestillerat vatten. Rör om tills det är väl blandat och autoklavera i 40 minuter vid 121 °C. Förvaras i rumstemperatur tills den används.
    2. YEPD fast agarmedium
      1. Blanda 10 g jästextrakt, 20 g pepton, 20 g dextros och 20 g agar i 1 liter vatten. Rör om väl för att blanda och autoklavera i 40 min vid 121 °C.
      2. När den har kylts tillräckligt, tillsätt 1 ml kloramfenikol och benomyl från stamlösningar för att få de slutliga koncentrationerna av de två antimikrobiella medlen till 50 mg/l respektive 5 mg/l.
      3. Blanda väl under omrörning och häll i petriskålar med en diameter på 10 cm. Låt stå i rumstemperatur över natten för att ställa in och förvara vid 4 °C tills den används.
        OBS: Från 1 liter YEPD kan cirka 40 plattor hällas.
    3. Sterilisera träapplikatorpinnar med slättspets och återanvändbara cellspridare genom autoklavering och förvaring vid rumstemperatur.
  3. Inkubation av jord i flytande buljong
    1. Förbered en uppsättning sterila 13 ml odlingsrör genom att märka dem med jordprov-ID.
    2. Använd en serologisk pipett, tillsätt 5 ml YEPD-buljong kompletterad med kloramfenikol och benomyl i varje rör.
    3. Arbeta i en BSCII, överför ~ 0,1 g jord till lämpligt odlingsrör med hjälp av en steril applikator av trä med slättspets.
      OBS: Använd en ny applikator för varje jordprov och kassera omedelbart efter användning för att undvika korskontaminering mellan proverna.
    4. Täck röret ordentligt till det första stoppet för att förhindra spill men ändå tillåta luftutbyte under inkubation. Inkubera odlingsrören i en rulltrumma i 24 timmar vid en temperatur som anses optimal för att maximera jästtillväxten.
      ANMÄRKNING: Inkubationstemperaturen bör bestämmas på grundval av årsmedeltemperaturen i jordprovernas ursprungsland. Till exempel, när man isolerade jordjäst från Island, inkuberades odlingsrören vid 14 ° C, medan jordar från Saudiarabien inkuberades vid 30 ° C. På grund av långsammare jästtillväxt vid lägre temperaturer kan inkubationstiden behöva förlängas med upp till 72 timmar.
  4. Överför supernatanten till det fasta mediet.
    1. Använd uppsättningen YEPD + kloramfenikol + benomylagarplattor som framställts i steg 1.2 och märk dem med jordprov-ID.
    2. Ta bort odlingsrören som förberetts i steg 1.3 från rulltrumman. Arbeta i en BSCII, kort virvla röret för att dra jordpartiklar och celler som kan ha lagt sig längst ner tillbaka till suspension.
    3. Överför 100 μl av supernatanten till en platta med en mikropipett. Använd en steril, återanvändbar cellspridare för att sprida vätskan noggrant och jämnt över agarytan.
      OBS: Att arbeta i uppsättningar med 10 prover kan påskynda denna process avsevärt. Pipettera supernatanten på 10 plattor först och utför sedan spridning. Använd en ny spridare för varje prov för att undvika korskontaminering mellan proverna.
    4. Stapla plattorna i plastpåsar, försegla och inkubera upp och ner i 2-3 dagar vid samma temperatur som tidigare användes för inkubation av flytande buljong tills mikrobiell tillväxt är synlig.
  5. Detektion av jäst och ränder för enstaka kolonier
    1. Efter att ha tillåtit tillräcklig inkubationstid (vanligtvis 2-3 dagar, men kan ta längre tid vid lägre temperaturer), inspektera plattorna i en BSCII för eventuell jästtillväxt. Leta efter krämiga, runda, mattliknande jästar som lätt kan skiljas från bakterie- och mögelkolonier.
      OBS: Vissa jästar producerar färgade pigment och kan verka svart / brun, gul eller röd, men deras övergripande kolonistruktur och form skulle likna icke-pigmenterade jästar.
    2. Välj en jästliknande koloni från varje platta för vidare bearbetning.
      OBS: Om mer än en typ av morfologi observeras på en enda platta, välj en representativ koloni för varje morfologisk typ.
    3. Använd sterila, vanliga applikatorpinnar av trä, överför varje vald koloni till en ny YEPD + kloramfenikol + benomylplatta och strimma för enstaka kolonier. Utför tre separata streck.
      1. Stryk fram och tillbaka över en tredjedel av plattan med en applikatorpinne. Börja den andra och tredje raden genom att stryka applikatorn över föregående streck en gång. Använd en ny applikatorpinne för varje strimma.
        OBS: Använd en platta per isolat. Kassera applikatorer omedelbart efter användning för att undvika korskontaminering mellan prover.
    4. Stapla plattorna i plastpåsar, försegla och inkubera upp och ner i 2-3 dagar vid samma temperatur som tidigare använts tills enstaka kolonier blir synliga.
  6. Identifiering av jästarter via ITS-sekvensering
    1. Välj en väl separerad, enda koloni per jordisolat och subkultur på en ny YEPD + kloramfenikol + benomylplatta för att få fler celler. Inkubera i 2-3 dagar vid samma temperatur som tidigare använts.
    2. Skörda de nyodlade cellerna och suspendera dem i frysrör på -80 °C som innehåller 1 ml steriliserad 30 % glycerol i dubbeldestillerat vatten för att skapa cellsuspensioner. Behåll dessa suspensioner vid -80 °C som lagerlösningar.
    3. Använd färska celler för att utföra koloni-PCR (polymeraskedjereaktion) med primers ITS1 (5 'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') och ITS4 (5 'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') för att förstärka svampbarkodningsgenen, ITS9. Använd följande termocklingsförhållanden: ett inledande denatureringssteg vid 95 °C i 10 minuter följt av 35 cykler med (i) 95 °C i 30 s, (ii) 55 °C i 30 s och (iii) 72 °C i 1 min.
      OBS: Colony PCR har en hög framgångsgrad och en snabbare handläggningstid än DNA-extraktion följt av PCR.
    4. Om koloni-PCR upprepade gånger misslyckas för en stam, extrahera DNA med hjälp av det valda protokollet och utför ITS PCR med extraherat genomiskt DNA som mall (använd samma termocyklingsförhållanden som ovan).
      OBS: En relativt billig kloroformbaserad DNA-extraktion rekommenderas28.
    5. Utför Sanger-sekvensering för att bestämma DNA-sekvensen för den förstärkta ITS-regionen för varje stam.
    6. Jämför den erhållna ITS-sekvensen av jäststammarna med sekvenser som deponerats i offentliga databaser som NCBI GenBank och UNITE för att fastställa artidentitet.

2. Isolering av Aspergillus fumigatus från jord

  1. Bered 1 ml steril Sabouraud dextrosbuljong (SDB) kompletterad med antibiotikumet kloramfenikol per jordprov.
    1. Tillsätt 10 g pepton och 20 g dextros till 1 liter destillerat vatten. Autoklav vid 121 °C i 40 minuter.
    2. Låt SDB svalna till ~50 °C, tillsätt 1 ml 50 g/l kloramfenikol för att få koncentrationen till 50 mg/l.
      OBS: Kloramfenikol framställs på samma sätt som beskrivits ovan för jästisolering. Förutom att hämma bakterietillväxt förhindrar kloramfenikol också produktion av gas från bakterier som får rören att öppnas under inkubationssteget som beskrivs i steg 2.2.
    3. Aseptiskt alikvotera 1 ml SDB i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör per jordprov med hjälp av en mekanisk pipett.
  2. Tillsätt jord till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    1. Lägg bänkbeläggning eller absorberande vaddering inuti en BSCII för att hjälpa till med bortskaffande av spilld jord.
    2. Använd autoklaverade applikatorpinnar, överför cirka 0,1 g jord till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml SBD. Stäng röret och virveln. Inkubera den suspenderade jorden vid 50 °C i 3 dagar.
      OBS: Skakning under inkubation krävs inte.
  3. Mycelskörd av jordinokulerad buljong
    1. Förbered maltextraktagar (MEA) plattor.
      1. Per liter MEA: tillsätt 20 g maltextrakt, 20 g dextros, 6 g pepton och 15 g agar till 1 liter destillerat vatten. Autoklav vid 121 °C i 40 minuter.
      2. Låt MONOLERA svalna till ~50 °C och tillsätt sedan 1 ml 50 g/l kloramfenikol för att få till en slutlig koncentration på 50 mg/l.
    2. Överför mycelia från den jordinokulerade buljongen till MEA-plattor.
      1. Identifiera jordinokulum som har synlig myceltillväxt vid SDB till luftgränsen.
      2. Använd steriliserade applikatorpinnar i trä för att överföra mycelia till mitten av en MEA-platta. Inkubera MEA-plattorna vid 37 °C i 3 dagar.
  4. Urval av mycelia med A. fumigatus morfologiska egenskaper.
    1. Identifiera mögelkolonier som har karakteristiska A. fumigatus morfologiska egenskaper (grön mocka som tillväxt).
    2. Arbeta i en BSCII, använd steriliserade träapplikatorpinnar med slättspets eller en ympningsslinga för att skörda konidier / mycelia genom att skrapa ytan en gång. Överför sporerna/mycelia till mitten av en MEA-platta genom att stryka på agar för enstaka kolonier. Inkubera vid 37 °C i 2 dagar.
      OBS: Eftersom flera A. fumigatus-stammar och / eller andra svampar kan finnas på plattan är det viktigt att stryka för enstaka kolonier. Enkolonisstrimlingsprotokollet i steg 1.5.3 i jästisoleringsprotokollet kan användas.
    3. Med hjälp av en steril applikatorpinne eller inokuleringsslinga, subkulturerar en enda koloni som genereras i steg 2.4.1.2 på MEA genom att stryka kolonin en gång. Sprid de skördade sporerna i mitten av plattan. Inkubera vid 37 °C i 2 dagar.
  5. Skörd av A. fumigatussporer /mycelia för odling
    1. Bered en steril 30% glycerollösning (för en 100 ml lösning, tillsätt 30 ml 100% glycerol blandat med 70 ml dubbeldestillerat vatten, steriliserat vid 121 °C i 40 min).
    2. Arbeta i en BSCII, använd en p1000-pipett för att aspirera 1 ml av 30% glycerollösningen. Fördela 1 ml glycerollösning på A. fumigatus-kolonin för att skörda sporer / mycelia.
      1. På grund av hydrofobiciteten hos A. fumigatussporer /mycelia, använd pipettspetsen för att repa ett tätt sporulerat område på plattan.
        OBS: När glycerol dispenseras i repan skulle glycerolen fästa vid repområdet snarare än att rulla över agar.
      2. Släpp långsamt ut glycerolen på repområdet för att lossa sporerna och suspendera dem i glycerollösningen.
      3. När den är helt dispenserad, tippa lätt på plattan och aspirera glycerolspor / mycelia suspension.
        OBS: Cirka 750 till 800 μL kommer att aspireras.
      4. Överför aspiranten till ett sterilt frysrör och förvara vid -80 °C. Om det behövs skapar du arbetslager genom att upprepa stegen 2.5.2.1 till 2.5.2.4.
  6. Fenotypisk identifiering av A. fumigatus-stammar
    1. Använd sporstocken som skapats från steg 2.5.2 och skapa en 100x utspädning i vatten.
      1. Aspirera 10 μL av mycel- och sporbestånden och dosera i 990 μL vatten. Virvla upphängningen.
    2. Fördela 10 μL av den utspädda sporsuspensionen på ett vanligt mikroskopglas.
    3. VALFRITT: Färga mycel- och sporsuspensionen med metylenblått.
      1. För att färga med metylenblått, fixera konidierna och konidioforerna på bilden genom att föra bilden över en Bunsen-brännare tills den är torr.
      2. Applicera metylenblått i 1-2 min och tvätta av med vatten.
      3. Torka bilden med blottingpapper.
    4. Använd ett sammansatt mikroskop med 400x förstoring, se suspensionen och lokalisera konidioforer. Jämför den observerade konidioformorfologin med A. fumigatus conidiophore morfologi.
  7. Molekylär identifiering av A. fumigatus-stammar
    1. Extrahera DNA från varje isolat enligt vanliga svamp-DNA-extraktionsprotokoll.
    2. Med hjälp av primers som är specifika för Aspergillus-β-tubulin-generna (β-tub1 och β-tub4), kör PCR och erhålla sekvensen för de förstärkta produkterna, enligt protokoll som beskrivs av Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Jämför de erhållna sekvenserna med sekvenser som deponerats i offentliga databaser som NCBI GenBank med BLAST.
      2. Bekräfta att stamsekvenserna är en toppmatchning till A. fumigatus-sekvenser i databasen.
    3. Alternativ till steg 2.7.2, kör en multiplex PCR-reaktion riktad mot A. fumigatus-parningstyperna MAT1-1 och MAT1-229.
      1. Använd följande tre primersekvenser i multiplex PCR-reaktionen: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Använd följande termocyklerparametrar: 5 min vid 95 °C, 35 cykler om 30 s vid 95 °C, 30 s vid 60 °C och 1 min vid 72 °C före en sista 5 min vid 72 °C.
      3. Kör gelelektrofores för att identifiera produkterna; leta efter 834 bp MAT-1 eller 438 bp MAT1-2. Använd A. fumigatus-stammar som har bekräftat förstärkning av parningstyp som positiva och negativa kontroller.
  8. Mikrosatellitgenotypning av A. fumigatus-stammar genom fragmentanalys
    OBS: Även om stegen nedan i stort sett täcker genotypning A. fumigatus vid nio mikrosatellit (STR) loci, har endast några viktiga överväganden lyfts fram. För detaljer om A. fumigatus STR genotypning, se De Valk et al.24,30.
    1. Förbered tre PCR-multiplexmasterblandningar med hjälp av STRAf-primers som tidigare beskrivits av De Valk et al.24.
      1. Märk fluorescerande framåtriktade primers för att bestämma fragmentstorlek genom kapillärelektrofores. Se till att koncentrationen av de främre primrarna är hälften (0,5 μM) av de omvända primers (1 μM) i mastermixen.
        OBS: För bästa resultat, använd fluorescerande etiketter som har absorbansvåglängder som matchar de för den valda färgstandarden som används under kapillärelektrofores
      2. Använd varmstartspolymeras för bästa resultat.
      3. Använd en DNA-koncentration på 0,1 ng per reaktion.
    2. Kör multiplex PCR för varje stam med följande PCR-program: 95 °C i 10 min, 40 cykler med 95 °C i 30 s, 60 °C i 30 s och 72 °C i 60 s, följt av 72 °C i 10 min och ett grepp vid 4 °C.
    3. Kontrollera om det finns förstärkta produkter genom gelelektrofores.
    4. Späd produkterna till önskad nivå (vanligtvis ~ 50x) som rekommenderas av fragmentanalysspecialister och kör kapillärelektrofores. Utför tre körningar för varje stam, där varje körning täcker tre multiplexerade reaktioner med tre olika fluorescerande sonder.
    5. För att bestämma rätt fragmentstorlek för var och en av de nio STR-loci, använd programvara som kan fragmentanalys.
      1. Hämta rådata som erhållits från kapillärelektrofores. Poängsätt fragmentstorlekarna baserat på den största toppen med hjälp av fragmentanalysprogramvaran (t.ex. Osiris).
      2. Konvertera fragmentstorlekarna till upprepade tal för var och en av de nio loci. Använd fragmentstorlekarna för de upprepade numren för referensstammen Af293 som tidigare beskrivits av De Valk et al.24.
        OBS: Små variationer i fragmentstorlekar kan förekomma mellan olika kapillärelektroforesplattformar. Det är därför viktigt att inkludera en gemensam referensstam (och en inre stege) med känd fragmentstorlek för var och en av de nio loci för genotypning av stammar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Jästisolering från jord
Ovanstående jästisoleringsprotokoll implementerades för att odla jäst från jordprover med ursprung från 53 platser i nio länder 9,12. Totalt isolerades 1 473 jäststammar från 3 826 jordprover. Med tanke på de olika klimatförhållandena i de nio ursprungsländerna fastställdes den bästa inkubationstemperaturen för varje land på grundval av dess årsmedeltemperatur (tabell 1). Med tanke på den långsammare jästtillväxten vid 14 °C inkuberades jordprover från Island på en rulltrumma i ytterligare 48 timmar (totalt 96–120 timmar). Efter 2-3 dagars inkubation på fast medium var mikrobiell tillväxt synlig på plattorna för alla prover (figur 1A). En slumpmässigt utvald koloni för varje jästmorfologi som finns på en platta ströks för enstaka kolonier på färska plattor (figur 1B).

Graden av framgångsrik jästisolering skilde sig åt mellan länderna (tabell 1). Till exempel odlades 97 jäststammar från 562 saudiarabiska jordprover (17,3%), medan 261 jäst odlades från 300 kanadensiska jordprover (87%). En sällsynthetsanalys bör utföras för att avgöra om tillräcklig jordprovtagning har utförts för att få exakta uppskattningar av den verkliga jästdiversiteten på de platser där provet tagits. Ett exempel på sällsynta fallanalys för varje land förformades där Shannons mångfaldsindex användes som ett mått på jordjästdiversitet (figur 2). De resulterande rarefaction-kurvorna närmade sig mättnadsasymptoten, vilket indikerar att ytterligare provtagning sannolikt inte skulle ha gett mer jästdiversitet.

Sekvensering av ITS-regionen avslöjade att de 1 473 jästisolaten kan kategoriseras i 134 olika arter. Detta inkluderade 90 kända arter och 44 potentiellt nya arter. Vi tillämpade en modell med blandade effekter för att identifiera prediktorer för global odlingsbar jordjästdiversitet, kvantifierad av Shannon diversity index31. I denna modell monterades genomsnittlig årlig nederbörd, årsmedeltemperatur, höjd och avstånd till ekvatorn för provtagningsplatserna som fasta effekter, medan provtagningslandet sattes som en slumpmässig effekt9. Denna modell identifierade genomsnittlig årlig nederbörd som signifikant korrelerad med Shannon-mångfaldsindexet (p = 0,012), medan inga signifikanta korrelationer hittades mellan andra prediktorvariabler och Shannon-mångfaldsindexet9.

För att jämföra detta kulturbaserade protokoll med kulturoberoende metoder jämförde vi dessa resultat med en tidigare studie av Tedersoo och kollegor som undersökte global mångfald av marksvampar med hjälp av metagenomik2. Tedersoo och kollegor utförde sekvensering med hög genomströmning av ITS-regionen på DNA direkt extraherat från jordprover från 39 länder, varav fyra, nämligen Kamerun, Kanada, Kina och Nya Zeeland, också samplades i denna studie. Vi utförde BLAST-sökningar för att identifiera ITS-sekvenser som finns i båda datamängderna32 och fann att 26% av ITS-sekvenserna hade en signifikant matchning (>98,41% nukleotididentitet) i metagenomikdatasetet. <3% matchade dock en svampsekvens från samma land, medan de återstående 23% matchade en svampsekvens som hittades i ett annat land9. Vi var mer framgångsrika än metagenomikstudien med att kommentera ITS-sekvenserna med jästartsidentitet. Tedersoo och kollegor rapporterade totalt 50 589 svampoperativa taxonomiska enheter (OTUs), med antalet jäst-OTUs inte känt. Av dessa svamp-OTU: er kommenterades 33% bara som environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2 405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1 407, 2,8%) eller uncultured_fungus (11 898, 23,5%).

Aspergillus fumigatus isolering från jord
Efter 3 dagars jordinkubation vid 50 °C i 1 ml SDB i ett mikrocentrifugrör kan mycelia påträffas växa inom SDB, på SDB till luftgränsen och/eller på innerväggarna. Aspergillus fumigatus mycelia finns vanligtvis växande på SDB till luftgränsen men kan också skördas från strax under SDB-ytan. Efter detta steg överförs mycelia till MEA och odlas i 3 dagar vid 37 °C. Myceltillväxt på plattor kan endast bilda den gröna mockamorfologin som är typisk för A. fumigatus (figur 3A). Vanligare kan andra termotoleranta formar finnas i samma jord och växa med A. fumigatus på samma platta eller av sig själva (figur3B-D). Aspergillus fumigatus isoleringshastigheter kan variera mellan geografiska platser, liknande vad som har hittats för jordjäst. Till exempel, inom Vancouver, Kanada, erhölls 251 isolat genom denna metod från 540 jordprover (46,5%) (opublicerade resultat). I Kamerun skördades däremot 51 A. fumigatus-isolat från 495 jordprover (10,3 %)33.

A. fumigatus conidiophore struktur kan ses och identifieras med hjälp av ljusmikroskopi. Conidiophores har en boll på stickmorfologi (Figur 4). Dessutom är A. fumigatus conidiophores uniseriate, där phialiderna, fästa vid konidiakedjorna, är fästa direkt på den sfäriska vesikeln. I andra Aspergillus-arter är konidioforer biseriate, där phialiderna är kopplade till metulae fästa vid vesikeln.

Flera program finns tillgängliga för att utföra fragmentanalys av rådata från kapillärelektrofores, vilket omvandlar kapillärelektroforesspektrumet till fragmentstorlekar. Figur 5 är ett kromatogram som genereras av programmet Osiris. De tre kanalerna som visualiserar fragmentlängderna av A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B och 2C), trinukleotid (3A, 3B och 3C) och tetranukleotid (4A, 4B och 4C) STR-loci visas. Dessutom visas PCR-artefakter som uppstår om provets DNA-koncentration under PCR är för hög. De högsta topparna i varje färg representerar fragmentstorlekarna för de tre STR-loci i denna plot.

Den genetiska variationen som finns mellan A. fumigatus STR-genotyper kan visualiseras med hjälp av R-paketet poppr. R-skriptet bruvo.msn skapar en parvis Bruvos genetiska avståndsmatris mellan varje par genotyper. Den här matrisen används sedan för att generera ett MSN (Minimum Spanning Network). Ett MSN av hög kvalitet kan sedan genereras med hjälp av R-skriptet plot_poppr_msn eller imsn (bild 6). En diskriminerande analys av huvudkomponenter (DAPC) är en annan metod för att visualisera de genetiska förhållandena mellan stammar (figur 7). R-skriptet dapc i R-paketet adegenet används för att utföra DAPC och kan användas med kända eller okända gruppföreträdare. Med okända gruppföreträdare använder den K-medelkluster för att identifiera det troliga antalet grupper av individer.

Figure 1
Figur 1: Jästisolering från jordprover. Jästkolonier kan ses insprängda bland andra svamp/ bakteriekolonier. En representativ jästkoloni för varje morfologisk typ på en platta väljs för att stryka för enstaka kolonier. (B) Tre streck utförs för att erhålla enstaka kolonier av jästisolat. En platta användes för att erhålla varje jordisolat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Sällsynthetsanalys av jordprovtagning. I vart och ett av de nio provtagna länderna närmar sig jordjästdiversiteten, som kvantifieras av Shannons mångfaldsindex, mättnad när antalet jordprov ökar. Denna siffra anpassades från 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Aspergillus fumigatus morfologi på Sabouraud dextroseagar. (B-D) A. fumigatus tillväxt med andra termofila formar som finns i jordprovet. A. fumigatus konidiation reduceras synligt i B och D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Foto av en Aspergillus fumigatus conidiophore under ett ljusmikroskop. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Osiris-utdata från nio mikrosatellit-loci från en Aspergillus fumigatus-stam . Utgångarna motsvarar (A) dinucleotid (2A, 2B och 2C), (B) trinukleotid (3A, 3B och 3C) och (C) tetranukleotid (4A, 4B och 4C) STR loci. Framåt primer 5 'fluorescerande etiketter är: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Multiplexreaktionsprodukter späddes 30x före kapillärelektrofores. LIZ600-färgämnesstandarden användes under kapillärelektrofores. Rådata analyserades med hjälp av toppanalysprogramvaran Osiris som identifierade potentiella toppar mellan 60 och 400 bp. Flera PCR-artefakter är off-scale toppar som orsakar fluorescensblödning, stamningstoppar och N-1-toppar (C). Förkortningar: 6-FAM = 6-karboxifluorescein; HEX = hexaklorfluorescein; STR = korta tandemupprepningar; RFU = relativa fluorescensenheter; BPS = baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Nätverk med minsta spännvidd som visar det genetiska förhållandet mellan MLG av A. fumigatus från Island och Northwest Territories i Kanada. Varje nod representerar en MLG, där nodstorleken motsvarar antalet stammar för varje MLG. Noder som är mer genetiskt lika har mörkare och tjockare kanter, medan noder som är genetiskt avlägsna har ljusare och tunnare kanter. Denna siffra anpassades från 34. Förkortningar: ISL = Island; NWT = Northwest Territories i Kanada; MLG = multilocus genotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Genetisk klustring med hjälp av diskriminant analys av huvudkomponenter (DAPC) i Island, NWT, eurasiska, nordamerikanska och oceaniska A. fumigatuspopulationer . Isolat genotypades vid nio mikrosatellit-loci och klonkorrigerades, totalt 1 703 unika multilocus-genotyper. Genotyper färgades enligt geografiskt ursprung. Denna siffra anpassades från 34. Förkortningar: DAPC = diskriminerande analys av huvudkomponenter; NWT = Nordvästra territorierna; ISL = Island; CMR = Kamerun; CAN = Hamilton, Ontario, Kanada; BEL = Belgien; FRA = Frankrike; DEU = Tyskland; IND = Indien; NLD = Nederländerna; NOR = Norge; NZL = Nya Zeeland; ESP = Spanien; CHE = Schweiz; USA = Förenta staterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Land Inkubationstemperatur (°C) Jordprover Jästisolat Kända arter/ Nya arter
Kamerun 30 493 110 10/9
Kanada 23 300 261 34/12
Kina 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Frankrike 23 327 175 12/2
Island 14 316 211 11/0
Nya Zeeland 23 610 155 14/4
Peru 23 490 139 30/9
Saudiarabien 30 562 97 8/1
Total 3826 1473 90/44

Tabell 1: Isolering av jordjäst från nio länder på sex kontinenter. Inkubationstemperaturen för jordprover från varje land bestämdes utifrån dess årsmedeltemperatur. Resultaten som presenteras här är anpassade från 9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som utvecklats för att isolera jäst och A. fumigatus från jord är en snabb och effektiv metod för jordbearbetning med hög kapacitet och svampisolering. Protokollet kräver endast en liten mängd jord (0,1-0,2 g) per prov, vilket gör att fler platser kan provtas med liknande ansträngning. Den snabba handläggningstiden säkerställer att resultat kan erhållas inom en kort tidsram och ger tid för felsökning och upprepning av experiment vid behov. Detta protokoll kan enkelt replikeras över många laboratorieinställningar med hjälp av standard mikrobiologi och cellodlingsutrustning. Men när man isolerar jäst eller mögel från internationell jord krävs extra försiktighetsåtgärder. All icke-engångsplastutrustning, såsom plastbrickor och cellspridare, bör steriliseras genom nedsänkning i 10% blekmedel, följt av autoklavering. Den använda bänkbeläggningen ska förseglas i en plastpåse och steriliseras i en autoklav innan den kasseras.

Att notera kan antalet och identiteten hos jäst som isolerats med hjälp av protokollet ovan begränsas av de inkuberingsförhållanden och medier som används. Till exempel kan 24 timmars inkubation i rulltrumman gynna isoleringen av snabbväxande aeroba jästar framför långsamt växande arter. Dessutom kan användningen av näringsrikt YEPD-medium för jästisolering ha uteslutit jästarter med olika näringsbehov och preferenser. Dessutom upplever de flesta platser som provas här säsongsvariationer i temperatur och andra klimatförhållanden under hela året. Om tid och resurser tillåter kan samma jordprover bearbetas under en rad olika temperaturer för att möjliggöra isolering av ett bredare spektrum av jäst som bor i dessa jordar.

Även om kulturoberoende metoder är avgörande för att belysa storskaliga mönster i miljösvampdiversitet, är de inte tillräckligt informativa för riktade grupper av svampar som jäst. Användningen av kulturberoende isolering möjliggjorde en omfattande undersökning av den globala jordjästdiversiteten och dess prediktorer9. Medan metagenomikstudien utförd av Tedersoo och kollegor identifierade globala prediktorer och mönster i marksvampdiversitet, kunde i vilken utsträckning dessa fynd gäller specifikt för jästdiversitet inte belysas2. Tedersoo och kollegor identifierade genomsnittlig årlig nederbörd som en viktig klimatdrivare för marksvampdiversitet över hela världen2. Denna studie fann en liknande korrelation mellan genomsnittlig årlig nederbörd och odlingsbar jästdiversitet i globala jordar, vilket belyser att kulturberoende metoder kan komplettera och utöka resultaten av sekvenseringsmetoder med hög genomströmning9.

Tillsatsen av kloramfenikol är ett viktigt steg i beredningen av både fasta och flytande medier för att förhindra svamptillväxtstörningar av bakterier. Tillsatsen av kloramfenikol till flytande media är avgörande eftersom bristen på antibiotika gör att bakterierna som finns i jorden kan jäsas. Detta kommer att leda till produktion av gaser som med våld öppnar mikrocentrifugrör eller 13 ml odlingsrör som används under markinkubation i protokollet. Om bakteriell kontaminering i kloramfenikol som innehåller agar/buljong är ett problem kan kloramfenikol ersättas eller kompletteras med starkare antibiotika. Vid isolering av A. fumigatus från jord kan SD-buljong ersättas med en Tween 20-lösning (0,2 M NaCl med 1% Tween 20) för att hjälpa till att suspendera den hydrofoba A. fumigatus conidia35,36. Efter suspension kan 100 μl pläteras på SD-agar och inkuberas vid 50 °C.

Aspergillus fumigatus växer snabbt och sporulerar rikligt när den inkuberas ensam på både SD-agar och MEA-media mellan 22 ° C och 50 ° C. Beroende på vilka andra termotoleranta arter som finns i jordprovet kan emellertid A. fumigatus tillväxt och sporulering hindras (figur 3A,D). Under en sådan situation kan ett till flera subkultureringssteg krävas för att erhålla en ren koloni för efterföljande skörd och karakterisering.

Fragmentanalysen av A. fumigatus-stammar i figur 5 utfördes med hjälp av programmet Osiris. Flera PCR-artefakter har markerats i figur 5C och diskuteras i detalj av De Valk et al.30. B-1 stamningstoppar som har kortare upprepningsvärden orsakas av strängglidning under syntesen av antisensesträngen av DNA-polymeraset. N-1-toppar uppstår om DNA-koncentrationen är för hög under PCR. Den rekommenderade DNA-koncentrationen är 0,1 ng som anges i protokollet ovan. En annan artefakt är färgblödning som kan åtgärdas med hjälp av fluorescerande etiketter med icke-överlappande absorbansvåglängder. Till exempel genererar de fluorescerande etiketterna 6-FAM, HEX och ATTO550, liksom FÄRGÄMNESSTANDARDEN LIZ600, distinkta fragmenttoppar (Figur 5). Slutligen, för att förhindra toppar utanför skalan, späd varje PCR-reaktion (i detta fall var det ~ 50x utspädning) före kapillärelektrofores. För att ytterligare minska fluorescensen hos de oanvända främre primersna i reaktionsblandningen, halvera de främre primerkoncentrationerna i förhållande till de omvända primersna när du skapar mastermixen.

Protokollets höga genomströmning och konservativa karaktär möjliggör ett relativt snabbt och enkelt förvärv av många jästar och mögel från jordar. Det finns dock två huvudsakliga begränsningar med urvalsmetoden. Först användes de morfologiska egenskaperna hos jästkolonier odlade från jord för att välja unika arter. Dessa subkulturerades sedan och användes för artbestämning via ITS-sekvensering. Detta gjordes för att maximera representationen av jästarter närvarande. Jästarter som delade liknande eller identiska morfologier till de utvalda kolonierna kan dock misslyckas med att subkultureras. För det andra, under A. fumigatus-isolering , eftersom endast en enskild koloni väljs per jordprov, kommer närvaron av flera individer i jordprovet att missas. Detta kan leda till en underrepresentation av den verkliga genetiska mångfalden som finns inom provpopulationen, eftersom unika genotyper som finns i samma jordprov inte kommer att samlas in. För att mildra detta problem, under strecket för enstaka kolonisteg efter den första odlingen på fasta medier, kan flera enskilda kolonier samlas in för att erhålla ytterligare genotyper. Den lilla volym jord som används per prov hjälper till att minimera denna provtagningsbegränsning jämfört med metoder som använde större mängder jord per prov.

Användningen av detta högkapacitets- och arbetseffektiva protokoll för isolering av jäst och mögel kommer att öka antalet individer inom markpopulationen samtidigt som man använder mindre ansträngning per prov. Ökningen av statistisk kraft kommer att ge en bättre bild av odlingsbara jästsamhällen i jorden och hjälpa till att karakterisera markpopulationer av A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) och McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

Biologi Utgåva 183 Jästdiversitet Aspergillus fumigatus ren kultur morfotypning DNA-streckkodning mikrosatellitgenotypning
Isolering av odlingsbara jästar och mögel från jordar för att undersöka svamppopulationsstruktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter