Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение культурных дрожжей и плесени из почв для исследования структуры грибковой популяции

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Этот протокол является эффективным, быстрым методом культивирования дрожжей и плесени Aspergillus fumigatus из больших наборов образцов почвы всего за 7 дней. Методы могут быть легко модифицированы для размещения диапазона инкубационных сред и температур по мере необходимости для экспериментов.

Abstract

Почва является домом для невероятного количества микробной жизни, причем каждый грамм содержит до миллиардов бактериальных, архейных и грибковых клеток. Многоклеточные грибы, такие как плесень и одноклеточные грибы, широко определяемые как дрожжи, выполняют важную роль в почвенных экосистемах в качестве разлагателей органического материала и в качестве источников пищи для других почвенных жителей. Грибковое разнообразие в почве зависит от множества климатических факторов, таких как количество осадков и температура, а также свойства почвы, включая органическое вещество, рН и влагу. Отсутствие адекватного отбора проб окружающей среды, особенно в регионах Азии, Африки, Южной Америки и Центральной Америки, препятствует характеристике почвенных грибковых сообществ и открытию новых видов.

Мы охарактеризовали сообщества почвенных грибов в девяти странах на шести континентах, используя ~ 4000 образцов почвы и протокол, разработанный в лаборатории для выделения дрожжей и плесени. Этот протокол начинается с раздельного селективного обогащения дрожжей и значимой с медицинской точки зрения плесени Aspergillus fumigatus в жидких средах при ингибировании роста бактерий. Полученные колонии затем переносятся в твердые среды и далее обрабатываются для получения чистых культур с последующей генетической характеристикой. Идентичность видов дрожжей устанавливается путем секвенирования их внутренней транскрибированной спейсерной области (ITS) кластера генов ядерной рибосомальной РНК, в то время как глобальная популяционная структура A. fumigatus исследуется с помощью анализа микросателлитных маркеров.

Протокол был успешно применен для изоляции и характеристики популяций почвенных дрожжей и A. fumigatus в Камеруне, Канаде, Китае, Коста-Рике, Исландии, Перу, Новой Зеландии и Саудовской Аравии. Эти результаты выявили столь необходимую информацию о глобальных моделях разнообразия почвенных дрожжей, а также о глобальной структуре населения и профилях устойчивости к противогрибковым препаратам A. fumigatus. В данной работе представлен метод выделения как дрожжей, так и A. fumigatus из международных образцов почвы.

Introduction

Грибы в почвенных экосистемах играют важную роль в разложении органического вещества, круговороте питательных веществ и удобрениипочвы 1. При изучении почвенных грибов 2,3 широко используются как культурозависимые (т.е. высокопроизводительное секвенирование), так и культурозависимые подходы. В то время как большой объем данных, генерируемых высокопроизводительным секвенированием метабаркода, полезен для выяснения широкомасштабных закономерностей в структуре и разнообразии сообществ, зависящий от культуры подход может обеспечить весьма взаимодополняющую информацию о таксономических и функциональных структурах грибковых сообществ, а также более конкретные профили отдельных организмов посредством последующего разнообразия и функционального анализа из-за наличия чистых грибковых культур.

Несмотря на то, что дрожжи, широко определяемые как одноклеточные грибы, редко превышают тысячи клеток на грамм почвы, являются важными разлагателями и источниками пищи для других жителей почвы 4,5. Фактически, дрожжи могут быть преобладающими почвенными грибами в холодных биосферах, таких как континентальная Антарктида 6,7. Почва также является основным резервуаром медицински значимых дрожжей, которые вызывают серьезные оппортунистические инфекции у людей и других млекопитающих8. Несмотря на морфологическое сходство, виды дрожжей филогенетически разнообразны и встречаются среди нитевидных грибов в двух основных типах, Ascomycota и Basidiomycota, в грибковом царстве9. Дрожжи не имеют определяющей днк-сигнатуры в гене штрихкодирования грибов, области внутреннего транскрибированного спейсера (ITS) кластера генов ядерной рибосомальной РНК10, что делает их неотличимыми от других грибов в исследованиях метагеномики и, таким образом, требует использования культурозависимых методов для выделения видов дрожжей.

Приведенный ниже протокол был реализован для характеристики почвенных дрожжевых сообществ девяти стран и выявления глобальных тенденций и закономерностей в разнообразии почвенных дрожжей 9,11,12. Подходы метагеномики имеют ограниченное применение при изучении целевых групп организмов, таких как дрожжи 2,3. Из-за их филогенетического разнообразия дрожжи не могут быть отличимы от других грибов только по последовательности ДНК. Таким образом, изучение популяций дрожжей требует постоянного использования культурозависимой изоляции. Тем не менее, культивирование часто значительно более трудоемко и требует большего количества персонала для выполнения экспериментов. Поэтому протокол был оптимизирован и оптимизирован для более быстрой обработки с ограниченным персоналом. Основным преимуществом культивирования является то, что идентифицированные виды дрожжей являются живыми дрожжами, а не мертвыми, и, таким образом, с большей вероятностью будут истинными обитателями почвы, а не переходными клетками, присутствующими в почвах. Было подсчитано, что примерно 40% грибковой ДНК в почве являются либо загрязняющими веществами из других сред, внеклеточных, либо поступают из клеток, которые больше не являются неповрежденными, что приводит к высокопроизводительному секвенированию подходов к переоценке грибкового богатства на целых 55% 13. Культурозависимая изоляция может легко подтвердить идентичность видов дрожжей с дополнительным преимуществом обеспечения чистой культуры для использования в последующих анализах. Действительно, чистые культуры 44 предполагаемых новых видов дрожжей были идентифицированы с использованием этого протокола изоляции почвы, что позволило использовать ряд методов для детального изучения их таксономических и функциональных свойств14.

Приведенный ниже протокол также может быть использован для выделения плесени, присутствующей в почве, такой как A. fumigatus. Aspergillus fumigatus представляет собой термофильную и сапрофитную плесень с широким глобальным распространением в почве15. Он был выделен из многочисленных клинических и неклинических сред. Доклинический отбор проб обычно включает воздух, органический мусор (компост, опилки, отходы луковиц тюльпанов) и почву (сельскохозяйственные, садовые и естественные почвы)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus является оппортунистическим патогеном человека, вызывающим ряд инфекций, в совокупности называемых аспергиллезом, затрагивая более 8 миллионов человек во всем мире16,20. Приблизительно 300 000 человек во всем мире страдают от инвазивного аспергиллеза, который является наиболее тяжелой формой аспергиллеза16. В зависимости от таких факторов, как популяция пациентов, место инфекции и эффективность противогрибковой терапии, смертность может достигать 90%. За последние несколько десятилетий устойчивость к противогрибковой терапии возросла, что потребовало глобальных усилий по эпиднадзору как в клинических, так и в экологических популяциях для отслеживания этих генотипов резистентности 21,22,23. Учитывая его способность расти при температурах выше 50 ° C, эта температура может быть использована для отбора изолятов A. fumigatus из почвы с использованием методов, зависящих от культуры. Изоляты Aspergillus fumigatus обычно генотипируются в девяти высокополиморфных локусах короткого тандемного повтора (STR), которые, как показано, обладают высокой дискриминирующей силой между штаммами24. Эти генотипы STR можно сравнить с другими ранее обследованными популяциями для отслеживания распространения генотипов A. fumigatus, включая гены лекарственной устойчивости, по всему миру.

Ниже мы опишем протокол для быстрого выделения дрожжей и A. fumigatus из образцов почвы в зависимости от культуры. В зависимости от количества почвы, полученной на образец, образцы почвы могут быть разделены между двумя протоколами. По сравнению с аналогичными методами, которые изолируют дрожжи и A. fumigatus из почвы, этот протокол использует в 10 раз меньше почвы на полученный изолят. Исследования, направленные на изоляцию A. fumigatus от почвы, требуют от 1 до 2 г почвы на изолят, тогда как этот протокол требует только 0,1-0,2 г почвы 18,19,25. Этот протокол использует меньшие пластмассы и контейнеры, которые облегчают его высокопроизводительную конструкцию. Поэтому большее количество образцов может быть обработано с использованием меньшего пространства для оборудования, такого как инкубаторы и роликовые барабаны. Образцы почвы могут быть полностью обработаны для получения изолятов всего за 7 дней. Этот протокол был оптимизирован, чтобы позволить обрабатывать до 150-200 образцов в день на человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Любые этапы с использованием международных образцов почвы и/или спор и мицелия A. fumigatus требуют работы в шкафу биобезопасности для организмов уровня 2 (BSCII).

1. Выделение дрожжей из почвы

  1. Приготовление антибактериальных и противогрибковых растворов
    1. Суспендировать порошок хлорамфеникола в 70% этаноле для приготовления спиртового раствора 50 г/л. Стерилизуют шприцевой фильтрацией и хранят при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот антибиотик предотвратит рост большинства бактерий во время выделения почвенных дрожжей. Поскольку устойчивые к хлорамфениколу бактерии все еще могут расти, морфология колонии должна тщательно учитываться при различении дрожжей от бактерий. Дополнительные антибиотики могут быть добавлены в среду при работе с почвой, подозреваемой в содержании устойчивых к антибиотикам бактериальных штаммов. Бактериальное загрязнение в средах, дополненных хлорамфениколом, не было проблемой, возникающей при выделении дрожжей из экологических почв.
    2. Суспендировать беномиловый порошок в ДМСО для приготовления 5 г/л бульонного раствора. Стерилизуют шприцевой фильтрацией и хранят при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот селективный противогрибковый препарат предотвращает рост большинства нитевидных грибов, не влияя на рост дрожжей во время выделения почвенных дрожжей26,27.
  2. Подготовка питательных сред и стерильного оборудования
    1. Для приготовления отвара YEPD (дрожжевого экстракта-пептона-декстрозы) добавьте 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона и 20 г декстрозы в 1 л двойной дистиллированной воды. Перемешивать до полного перемешивания и автоклава в течение 40 мин при 121 °C. Хранить при комнатной температуре до использования.
    2. YEPD твердый агар среды
      1. Смешайте 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы и 20 г агара в 1 л воды. Хорошо перемешать и автоклав в течение 40 мин при 121 °C.
      2. После достаточного охлаждения добавляют 1 мл хлорамфеникола и беномила из исходных растворов, чтобы довести конечные концентрации двух противомикробных препаратов до 50 мг/л и 5 мг/л соответственно.
      3. Хорошо перемешать, помешивая, и вылить в чашки Петри диаметром 10 см. Оставьте при комнатной температуре на ночь, чтобы установить и хранить при 4 °C до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Из 1 л YEPD можно налить около 40 пластин.
    3. Стерилизуйте деревянные аппликаторные палочки с простым наконечником и многоразовые разбрасыватели ячеек путем автоклавирования и храните при комнатной температуре.
  3. Инкубация почвы в жидком бульоне
    1. Подготовьте набор стерильных 13 мл культуральных пробирок, пометив их идентификатором образца почвы.
    2. Используя серологическую пипетку, добавьте в каждую пробирку 5 мл отвара YEPD, дополненного хлорамфениколом и беномилом.
    3. Работая в BSCII, переложите ~ 0,1 г почвы в соответствующую культуральную трубку с помощью стерильного, деревянного аппликатора с простым наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий аппликатор для каждого образца почвы и выбрасывайте сразу после использования, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
    4. Надежно закройте трубку до первой остановки, чтобы предотвратить разлив, но при этом обеспечить воздухообмен во время инкубации. Инкубируйте культуральные трубки в барабане в течение 24 ч при температуре, которая считается оптимальной для максимизации роста дрожжей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура инкубации должна определяться на основе среднегодовой температуры страны происхождения проб почвы. Например, при выделении почвенных дрожжей из Исландии культуральные трубки инкубировали при 14 °C, тогда как почвы из Саудовской Аравии инкубировали при 30 °C. Из-за более медленного роста дрожжей при более низких температурах время инкубации, возможно, придется продлить до 72 ч.
  4. Перенесите супернатант в твердую среду.
    1. Используя набор пластин YEPD + хлорамфеникол + беномилагар, приготовленных на этапе 1.2, маркируйте их идентификатором образца почвы.
    2. Извлеките пробирки для культивирования, приготовленные на этапе 1.3, из барабана ролика. Работая в BSCII, кратковременно вихрьте трубку, чтобы втянуть частицы почвы и клетки, которые, возможно, осели на дне, обратно в суспензию.
    3. Используя микропипетку, перенесите 100 мкл супернатанта на пластину. Используйте стерильный, многоразовый разбрасыватель клеток, чтобы тщательно и равномерно распределить жидкость по поверхности агара.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в наборах по 10 образцов может значительно ускорить этот процесс. Сначала пипетка супернатанта на 10 пластин, а затем выполните разбрасывание. Используйте свежий разбрасыватель для каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
    4. Сложите пластины в полиэтиленовые пакеты, запечатайте и инкубируйте вверх ногами в течение 2-3 дней при той же температуре, которая использовалась ранее для инкубации жидкого бульона до тех пор, пока не будет виден рост микробов.
  5. Обнаружение дрожжей и растяжение для одиночных колоний
    1. После обеспечения достаточного времени инкубации (обычно 2-3 дня, но может занять больше времени при более низких температурах), осмотрите пластины в BSCII на предмет роста дрожжей. Ищите кремовые, круглые, матовые дрожжи, которые легко отличить от бактериальных и плесневых колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые дрожжи производят цветные пигменты и могут казаться черными / коричневыми, желтыми или красными, но их общая текстура и форма колонии будут похожи на непигментированные дрожжи.
    2. Выберите одну дрожжеподобную колонию из каждой пластины для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на одной пластине наблюдается более одного типа морфологии, выберите одну репрезентативную колонию для каждого морфологического типа.
    3. Используя стерильные, деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником, перенесите каждую выбранную колонию на свежую YEPD + хлорамфеникол + беномильную пластину и полосу для отдельных колоний. Выполните три отдельные полосы.
      1. Проведите взад и вперед более трети пластины с помощью аппликаторной палочки. Начните вторую и третью полосы, проведя аппликатор по предыдущей полосе один раз. Используйте новый аппликатор для каждой полосы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну пластину на изолят. Откажитесь от аппликаторов сразу после использования, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
    4. Сложите пластины в полиэтиленовые пакеты, запечатайте и высиживайте вверх ногами в течение 2-3 дней при той же температуре, которая использовалась ранее, пока не станут видны отдельные колонии.
  6. Идентификация видов дрожжей с помощью секвенирования ITS
    1. Выберите хорошо разделенную, единую колонию на почвенный изолят и субкультуру на свежей YEPD + хлорамфеникол + беномильная пластина, чтобы получить больше клеток. Инкубировать в течение 2-3 дней при той же температуре, которая использовалась ранее.
    2. Соберите свежевыращенные клетки и суспендируйте их в морозильных пробирках с температурой -80 °C, содержащих 1 мл стерилизованного 30% глицерина в двойной дистиллированной воде для создания клеточных суспензий. Поддерживайте эти суспензии при -80 °C в качестве запасных растворов.
    3. Используйте свежие клетки для выполнения колониальной ПЦР (полимеразной цепной реакции) с праймерами ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') и ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') для усиления гена грибкового штрихкодирования ITS9. Используйте следующие условия термоциклирования: начальная стадия денатурации при 95 °C в течение 10 мин, затем 35 циклов (i) 95 °C в течение 30 с, (ii) 55 °C в течение 30 с и (iii) 72 °C в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колониальная ПЦР имеет высокий уровень успеха и более быстрое время обработки, чем экстракция ДНК с последующей ПЦР.
    4. Если колониальная ПЦР неоднократно терпит неудачу для штамма, извлеките ДНК с использованием протокола выбора и выполните ИТС-ПЦР, используя извлеченную геномную ДНК в качестве шаблона (используйте те же условия термоциклирования, что и выше).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется относительно недорогая экстракция ДНК на основе хлороформа28.
    5. Выполните секвенирование Сэнгера для определения последовательности ДНК амплифицированной области ITS для каждого штамма.
    6. Сравните полученную последовательность ITS штаммов дрожжей с последовательностями, депонированными в общедоступных базах данных, таких как NCBI GenBank и UNITE, чтобы установить видовую идентичность.

2. Выделение Aspergillus fumigatus из почвы

  1. Приготовьте 1 мл стерильного бульона декстрозы Сабуро (SDB), дополненного антибиотиком хлорамфениколом на образец почвы.
    1. Добавьте 10 г пептона и 20 г декстрозы в 1 л дистиллированной воды. Автоклав при 121 °C в течение 40 мин.
    2. Дайте SDB остыть до ~50 °C, добавьте 1 мл 50 г / л хлорамфеникола, чтобы довести концентрацию до 50 мг / л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорамфеникол получают таким же образом, как описано выше, для выделения дрожжей. Помимо ингибирования роста бактерий, хлорамфеникол также предотвращает образование газа из бактерий, которые приведут к открытию трубок на этапе инкубации, описанном в шаге 2.2.
    3. Асептически аликвотирует 1 мл SDB в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на образец почвы с использованием механической пипетки.
  2. Добавьте почву в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл.
    1. Положите скамью или абсорбирующую прокладку внутри BSCII, чтобы помочь в утилизации пролитого грунта.
    2. Используя палочки-аппликаторы автоклава, переложите примерно 0,1 г почвы в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл SBD. Закройте трубку и вихрь. Насиживайте взвешенную почву при 50 °C в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание во время инкубации не требуется.
  3. Мицелиальный урожай почвенно-инокулированного бульона
    1. Приготовьте пластины с солодовым экстрактом агара (MEA).
      1. На литр МЭА: добавить 20 г солодового экстракта, 20 г декстрозы, 6 г пептона и 15 г агара в 1 л дистиллированной воды. Автоклав при 121 °C в течение 40 мин.
      2. Дайте МЭА остыть до ~50 °C, затем добавьте 1 мл 50 г / л хлорамфеникола, чтобы довести до конечной концентрации 50 мг / л.
    2. Переложите мицелий из привитого почвой бульона на пластины MEA.
      1. Определите почвенные прививки, которые имеют видимый рост мицелиальной кости на границе SDB с воздухом.
      2. Используйте стерилизованные деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником для переноса мицелия в центр meA-пластины. Инкубируйте пластины MEA при 37 °C в течение 3 дней.
  4. Выделение мицелия с морфологическими свойствами A. fumigatus .
    1. Выявляют колонии плесени, обладающие характерными морфологическими свойствами A. fumigatus (зеленая замша похожа на рост).
    2. Работая в BSCII, используйте стерилизованные деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником или петлю прививки для сбора конидий / мицелия, соскребая поверхность один раз. Перенесите споры / мицелий в центр пластины MEA, нанеся на агар для отдельных колоний. Инкубировать при 37 °C в течение 2 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку на пластине может присутствовать несколько штаммов A. fumigatus и / или других грибов, важно прорезать для отдельных колоний. Можно использовать протокол одноколонийного стрейкинга в шаге 1.5.3 протокола выделения дрожжей.
    3. Используя стерильную палочку аппликатора или петлю прививки, субкультуру одной колонии, полученной на этапе 2.4.1.2, на MEA путем однократного удаления колонии. Выложите собранные споры в центр пластины. Инкубировать при 37 °C в течение 2 дней.
  5. Сбор спор/мицелия A. fumigatus для хранения культур
    1. Готовят стерильный 30% раствор глицерина (для раствора 100 мл добавляют 30 мл 100% глицерина, смешанного с 70 мл дистиллированной воды, стерилизуемой при 121 °С в течение 40 мин).
    2. Работая в BSCII, используйте пипетку p1000 для аспирации 1 мл 30% раствора глицерина. Распределите 1 мл раствора глицерина на колонию A. fumigatus для сбора спор / мицелия.
      1. Из-за гидрофобности спор / мицелия A. fumigatus используйте кончик пипетки, чтобы поцарапать плотно спорулированную область пластины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Когда глицерин дозируется в царапине, глицерин будет прилипать к области царапины, а не переворачиваться над агаром.
      2. Медленно распределите глицерин на область царапины, чтобы выбить споры и приостановить их в растворе глицерина.
      3. После полного дозирования слегка опрокините пластину и аспирируйте суспензию спор / мицелия глицерина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно от 750 до 800 мкл будет аспирировано.
      4. Переложите аспират в стерильную морозильную камеру и храните при -80 °C. При необходимости создайте рабочий фонд, повторив шаги 2.5.2.1-2.5.2.4.
  6. Фенотипическая идентификация штаммов A. fumigatus
    1. Используя запас спор, созданный на шаге 2.5.2, создайте 100-кратное разбавление в воде.
      1. Аспират 10 мкл мицелиального и спорового запасов и дозируют в 990 мкл воды. Вихрь подвески.
    2. Нанесите 10 мкл разбавленной споровой суспензии на стандартный предмет микроскопа.
    3. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Окрасить мицелиальную и споровую суспензию метиленовым синим.
      1. Чтобы окрасить метиленовым синим, зафиксируйте конидии и конидиофоры на слайде, переместив горку над горелкой Бунзена до высыхания.
      2. Нанесите метиленовый синий на 1-2 мин и смойте водой.
      3. Высушите слайд промокательной бумагой.
    4. Используя составной микроскоп с 400-кратным увеличением, просмотрите суспензию и найдите конидиофоры. Сравните наблюдаемую морфологию конидиофора с морфологией конидиофора A. fumigatus .
  7. Молекулярная идентификация штаммов A. fumigatus
    1. Извлекайте ДНК из каждого изолята в соответствии с общими протоколами экстракции грибковой ДНК.
    2. Используя праймеры, специфичные для генов Aspergillus β-тубулина (β-tub1 и β-tub4), запустите ПЦР и получите последовательность для амплифицированных продуктов в соответствии с протоколами, описанными Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Сравните полученные последовательности с последовательностями, депонированными в общедоступных базах данных, таких как NCBI GenBank, с помощью BLAST.
      2. Убедитесь, что последовательности деформаций соответствуют последовательностям A. fumigatus в базе данных.
    3. Альтернативой шагу 2.7.2 является запуск мультиплексной реакции ПЦР, нацеленной на спаривание A. fumigatus типов MAT1-1 и MAT1-229.
      1. Используйте следующие три последовательности праймеров в мультиплексной реакции ПЦР: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Используйте следующие параметры термоциклера: 5 мин при 95 °C, 35 циклов по 30 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 1 мин при 72 °C до последних 5 минут при 72 °C.
      3. Проводят гель-электрофорез для идентификации продуктов; ищите 834 bp MAT-1 или 438 bp MAT1-2. Используйте штаммы A. fumigatus , которые подтвердили усиление типа спаривания в качестве положительного и отрицательного контроля.
  8. Микроспутниковое генотипирование штаммов A. fumigatus путем фрагментного анализа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя перечисленные ниже шаги широко охватывают генотипирование A. fumigatus в девяти микроспутниковых (STR) локусах, было выделено лишь несколько важных соображений. Подробную информацию о генотипировании A. fumigatus STR см. в De Valk et al.24,30.
    1. Подготовьте три мультиплексных мастер-микса ПЦР, используя праймеры STRAf, ранее описанные De Valk et al.24.
      1. Флуоресцентно метят передние грунтовки для определения размера фрагмента с помощью капиллярного электрофореза. Убедитесь, что концентрация прямых грунтовок вдвое меньше (0,5 мкМ) по сравнению с концентрацией обратных праймеров (1 мкМ) в основной смеси.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте флуоресцентные метки, которые имеют длины волн поглощения, соответствующие выбранному стандарту красителя, используемому во время капиллярного электрофореза.
      2. Используйте термостартовую полимеразу для достижения наилучших результатов.
      3. Используйте концентрацию ДНК 0,1 нг на реакцию.
    2. Запустите мультиплексную ПЦР для каждого штамма, используя следующую программу ПЦР: 95 °C в течение 10 мин, 40 циклов 95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 60 с, затем 72 °C в течение 10 мин и удержание при 4 °C.
    3. Проверьте наличие усиленных продуктов с помощью гелевого электрофореза.
    4. Разбавьте продукты до желаемого уровня (обычно ~50x), как рекомендовано специалистами по анализу фрагментов, и запустите капиллярный электрофорез. Выполните три прогона для каждого штамма, причем каждый прогон охватывает три мультиплексированные реакции с тремя различными флуоресцентными зондами.
    5. Чтобы определить правильный размер фрагмента для каждого из девяти локусов STR, используйте программное обеспечение, способное анализировать фрагменты.
      1. Извлеките необработанные данные, полученные в результате капиллярного электрофореза. Оцените размеры фрагментов на основе наибольшего пика с помощью программного обеспечения для анализа фрагментов (например, Osiris).
      2. Преобразуйте размеры фрагментов в повторяющиеся числа для каждого из девяти локусов. Используйте размеры фрагментов повторяющихся чисел эталонного штамма Af293, как описано ранее De Valk et al.24.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные различия в размерах фрагментов могут возникать между различными платформами капиллярного электрофореза. Таким образом, важно включить общий эталонный штамм (и внутреннюю лестницу) с известным размером фрагмента для каждого из девяти локусов для штаммов генотипирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выделение дрожжей из почвы
Вышеупомянутый протокол выделения дрожжей был внедрен для культивирования дрожжей из образцов почвы, происходящих из 53 мест в девяти странах 9,12. В общей сложности 1 473 штамма дрожжей были выделены из 3 826 образцов почвы. Учитывая различные климатические условия девяти стран происхождения, наилучшая температура инкубации для каждой страны определялась на основе ее среднегодовой температуры (таблица 1). Учитывая более медленный рост дрожжей при 14 °C, образцы почвы из Исландии инкубировали на роликовом барабане в течение дополнительных 48 ч (всего 96-120 ч). После 2-3 дней инкубации на твердой среде рост микробов был виден на пластинах для всех образцов (рисунок 1А). Случайно выбранная колония для каждой морфологии дрожжей, присутствующей на тарелке, была растянута для отдельных колоний на свежих пластинах (рисунок 1B).

Скорость успешной выделения дрожжей различалась между странами (таблица 1). Например, 97 штаммов дрожжей были культивированы из 562 образцов почвы Саудовской Аравии (17,3%), тогда как 261 дрожж был культивирован из 300 канадских образцов почвы (87%). Следует провести анализ разрежения, чтобы определить, был ли проведен достаточный отбор проб почвы для получения точных оценок истинного разнообразия дрожжей в отобранных местах. Был подготовлен пример анализа разрежения для каждой страны, в котором индекс разнообразия Шеннона использовался в качестве меры разнообразия почвенных дрожжей (рисунок 2). Полученные кривые разрежения приблизились к асимптоте насыщения, что указывает на то, что дополнительный отбор проб вряд ли дал бы больше разнообразия дрожжей.

Секвенирование региона ITS показало, что 1 473 дрожжевых изолята могут быть классифицированы на 134 различных вида. Это включало 90 известных видов и 44 потенциально новых вида. Мы применили модель смешанных эффектов для выявления предикторов глобального культурируемого разнообразия почвенных дрожжей, количественно определяемого индексом разнообразия Шеннона31. В этой модели среднегодовое количество осадков, среднегодовая температура, высота и расстояние до экватора мест отбора проб были определены в качестве фиксированных эффектов, в то время как страна отбора проб была установлена как случайный эффект9. Эта модель определила, что среднегодовое количество осадков значительно коррелирует с индексом разнообразия Шеннона (p = 0,012), в то время как между другими предикторными переменными и индексом разнообразия Шеннона9 не было обнаружено существенных корреляций.

Чтобы сравнить этот протокол, основанный на культуре, с независимыми от культуры методами, мы сравнили эти результаты с предыдущим исследованием Тедерсу и его коллег, в котором изучалось глобальное разнообразие почвенных грибов с использованием метагеномики2. Тедерсу и его коллеги выполнили высокопроизводительное секвенирование региона ITS на ДНК, непосредственно извлеченной из образцов почвы 39 стран, четыре из которых, а именно Камерун, Канада, Китай и Новая Зеландия, также были отобраны в этом исследовании. Мы выполнили поиск BLAST для идентификации последовательностей ITS, присутствующих в обоих наборах данных32, и обнаружили, что 26% последовательностей ITS имели значительное совпадение (>98,41% нуклеотидной идентичности) в наборе данных метагеномики. Тем не менее, <3% соответствовали грибковой последовательности из той же страны, в то время как остальные 23% соответствовали грибковой последовательности, обнаруженной в другой стране9. Мы были более успешными, чем метагеномное исследование, в аннотировании последовательностей ITS с идентичностью видов дрожжей. Тедерсоо и его коллеги сообщили в общей сложности о 50 589 грибковых операционных таксономических единицах (ОТУ), при этом количество дрожжевых ОТУ неизвестно. Из этих грибковых ОТУ 33% были просто аннотированы как environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2 405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1 407, 2,8%) или uncultured_fungus (11 898, 23,5%).

Изоляция Aspergillus fumigatus от почвы
После 3 дней инкубации почвы при 50 °C в 1 мл SDB в микроцентрифужной трубке мицелий может быть найден растущим внутри SDB, на границе SDB с воздухом и / или на внутренних стенках. Aspergillus fumigatus mycelia обычно растут на границе SDB с воздухом, но также могут быть собраны чуть ниже поверхности SDB. После этого этапа мицелий переносится в МЭА и выращивается в течение 3 дней при 37 °C. Мицелиальный рост на пластинах может образовывать только морфологию зеленой замши, типичную для A. fumigatus (рисунок 3A). Чаще всего другие термотолерантные плесени могут присутствовать в той же почве и расти с A. fumigatus на той же пластине или сами по себе (рисунок3B-D). Показатели изоляции Aspergillus fumigatus могут варьироваться в зависимости от географического положения, аналогично тому, что было обнаружено для почвенных дрожжей. Например, в пределах Ванкувера, Канада, с помощью этого метода был получен 251 изолят из 540 образцов почвы (46,5%) (неопубликованные результаты). Напротив, в Камеруне из 495 образцов почвы (10,3%)33 был собран 51 изолят A. fumigatus.

Структура конидиофора A. fumigatus может быть просмотрена и идентифицирована с помощью световой микроскопии. Конидиофоры имеют шар по морфологии палки (рисунок 4). Кроме того, A. fumigatus conidiophores являются унисериатными, где фиалиды, прикрепленные к цепочкам конидий, прикреплены непосредственно к сферическому пузырьку. У других видов Aspergillus конидиофоры являются бисериатными, где фиалиды соединены с метулами, прикрепленными к везикуле.

Доступно несколько программ для выполнения фрагментного анализа исходных данных капиллярного электрофореза, преобразуя спектр капиллярного электрофореза в размеры фрагментов. На рисунке 5 показана хроматограмма, сгенерированная программой Osiris. Показаны три канала, визуализирующие длины фрагментов A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B и 2C), тринуклеотида (3A, 3B и 3C) и тетрануклеотида (4A, 4B и 4C) STR локусов. Кроме того, показаны артефакты ПЦР, которые возникают, если концентрация ДНК образца во время ПЦР слишком высока. Самые высокие вершины каждого цвета представляют размеры фрагментов трех локусов STR на этом участке.

Генетическая вариация, присутствующая между генотипами A. fumigatus STR, может быть визуализирована с помощью поппера пакета R. Скрипт R bruvo.msn создает попарную матрицу генетических расстояний Бруво между каждой парой генотипов. Эта матрица затем используется для создания минимальной связующей сети (MSN). Затем можно сгенерировать высококачественный MSN с помощью скрипта R plot_poppr_msn или imsn (рисунок 6). Дискриминационный анализ основных компонентов (DAPC) является еще одним методом визуализации генетических связей между штаммами (рисунок 7). Сценарий R dapc в адегенете пакета R используется для выполнения DAPC и может использоваться с известными или неизвестными априорами групп. С неизвестными групповыми априорами он использует кластеризацию K-средних для определения вероятного числа групп лиц.

Figure 1
Рисунок 1: Выделение дрожжей из образцов почвы. (А) Рост микробов виден на твердом агаре после 2-3 дней инкубации. Колонии дрожжей можно увидеть перемежающимися среди других грибковых / бактериальных колоний. Одна репрезентативная дрожжевая колония для каждого морфологического типа на пластине выбирается для полос для одиночных колоний. (B) Три полосы выполняются для получения одиночных колоний дрожжевых изолятов. Для получения каждого почвенного изолята использовалась одна пластина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ редкости отбора проб почвы. В каждой из девяти отобранных стран разнообразие почвенных дрожжей, количественно определяемое индексом разнообразия Шеннона, приближается к насыщению по мере увеличения количества образцов почвы. Эта цифра была адаптирована из 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Морфология Aspergillus fumigatus на dextroseagar Sabouraud. (A) Морфология роста зеленого замшевого A. fumigatus. (Б-Д) A. fumigatus растет с другими термофильными плесенями, присутствующими в образце почвы. Конидиация A. fumigatus заметно снижается в B и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фотография конидиофора Aspergillus fumigatus под световым микроскопом. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Вывод Осирисом девяти микросателлитных локусов из штамма Aspergillus fumigatus . Выходы соответствуют (A) динуклеотиду (2A, 2B и 2C), (B) тринуклеотиду (3A, 3B и 3C) и (C) тетрануклеотиду (4A, 4B и 4C) STR локусам. Передняя грунтовка 5' флуоресцентные этикетки: A = 6-FAM; B = ШЕСТНАДЦАТЕРИЧНЫЙ; C = ATTO550. Продукты мультиплексной реакции разбавляли в 30 раз перед капиллярным электрофорезом. Стандарт красителя LIZ600 использовался во время капиллярного электрофореза. Необработанные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения для анализа пиков Osiris, определяющего потенциальные пики между 60 и 400 bp. Некоторые артефакты ПЦР являются зашкаливающими пиками, которые вызывают кровотечение флуоресценции, пики заикания и пики N-1 (C). Сокращения: 6-FAM = 6-карбоксифлуоресцеин; HEX = гексахлорфлуоресцеин; STR = короткие тандемные повторы; РФС = относительные единицы флуоресценции; BPS = пары оснований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Минимальная сеть, показывающая генетическое родство между MLG A. fumigatus из Исландии и Северо-Западных территорий в Канаде. Каждый узел представляет один MLG, где размер узла соответствует количеству штаммов для каждого MLG. Узлы, которые более генетически похожи, имеют более темные и толстые края, тогда как узлы генетически отдаленные имеют более светлые и тонкие края. Эта цифра была адаптирована из 34. Сокращения: ISL = Исландия; СЗТ = Северо-Западные территории в Канаде; MLG = мультилокусный генотип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Генетическая кластеризация с использованием дискриминантного анализа основных компонентов (DAPC) популяций Исландии, СЗТ, Евразии, Северной Америки и Океании A. fumigatus . Изоляты были генотипированы в девяти микросателлитных локусах и клон-скорректированы, в общей сложности 1 703 уникальных мультилокусных генотипа. Генотипы были окрашены в соответствии с географическим происхождением. Эта цифра была адаптирована из 34. Сокращения: DAPC = дискриминантный анализ основных компонентов; СЗТ = Северо-Западные территории; ISL = Исландия; КДПГ = Камерун; CAN = Гамильтон, Онтарио, Канада; BEL = Бельгия; ОЛР = Франция; DEU = Германия; IND = Индия; НЛД = Нидерланды; NOR = Норвегия; NZL = Новая Зеландия; ESP = Испания; CHE = Швейцария; США = США. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Страна Температура инкубации (°C) Образцы почвы Дрожжевые изоляты Известные виды/ Новые виды
Камерун 30 493 110 10/9
Канада 23 300 261 34/12
Китай 23 340 230 23/5
Коста-Рика 30 388 95 20/2
Франция 23 327 175 12/2
Исландия 14 316 211 11/0
Новая Зеландия 23 610 155 14/4
Перу 23 490 139 30/9
Саудовская Аравия 30 562 97 8/1
Итог 3826 1473 90/44

Таблица 1: Выделение почвенных дрожжей из девяти стран на шести континентах. Температура инкубации образцов почвы из каждой страны определялась на основе ее среднегодовой температуры. Результаты, представленные здесь, адаптированы из 9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, разработанный для выделения дрожжей и A. fumigatus из почвы, является быстрым и эффективным методом высокопроизводительной обработки почвы и грибковой изоляции. Протокол требует только небольшого количества почвы (0,1-0,2 г) на образец, что позволяет отбирать больше участков с аналогичными усилиями. Быстрое время выполнения работ гарантирует, что результаты могут быть получены в течение короткого периода времени и дает время для устранения неполадок и повторения экспериментов, если это необходимо. Этот протокол может быть легко воспроизведен во многих лабораторных условиях с использованием стандартного оборудования для микробиологии и культивирования клеток. Однако при выделении дрожжей или плесени из международной почвы требуются дополнительные меры предосторожности. Все неодноразовое пластиковое оборудование, такое как пластиковые лотки и разбрасыватели ячеек, должно быть стерилизовано погружением в 10% отбеливатель с последующим автоклавированием. Использованное скамье должно быть запечатано в полиэтиленовый пакет и стерилизовано в автоклаве перед выбрасыванием.

Следует отметить, что количество и идентичность дрожжей, выделенных с использованием протокола выше, могут быть ограничены условиями инкубации и используемыми средами. Например, 24-часовая инкубация в роликовом барабане может способствовать выделению быстрорастущих аэробных дрожжей по сравнению с медленно растущими видами. Кроме того, использование богатой питательными веществами среды YEPD для выделения дрожжей, возможно, исключило виды дрожжей с различными потребностями в питательных веществах и предпочтениями. Кроме того, большинство мест, отобранных здесь, испытывают сезонные колебания температуры и других климатических условий в течение года. Если позволяют время и ресурсы, одни и те же образцы почвы могут быть обработаны при диапазоне различных температур, чтобы обеспечить изоляцию более широкого спектра дрожжей, которые населяют эти почвы.

Хотя независимые от культуры методы имеют решающее значение для выяснения крупномасштабных закономерностей в разнообразии экологических грибов, они не могут быть достаточно информативными для целевых групп грибов, таких как дрожжи. Использование культурозависимой изоляции позволило провести всестороннее исследование глобального разнообразия почвенных дрожжей и его предикторов9. В то время как метагеномное исследование, проведенное Тедерсу и его коллегами, выявило глобальные предикторы и закономерности в разнообразии грибов почвы, степень, в которой эти результаты применимы конкретно к разнообразию дрожжей, не может быть выяснена2. Тедерсу и его коллеги определили среднегодовое количество осадков в качестве основного климатического фактора разнообразия почвенных грибов во всем мире2. Это исследование обнаружило аналогичную корреляцию между среднегодовым количеством осадков и культурным разнообразием дрожжей в глобальных почвах, подчеркнув, что зависящие от культуры методы могут дополнять и расширять результаты высокопроизводительных подходов к секвенированию9.

Добавление хлорамфеникола является важным шагом в приготовлении как твердых, так и жидких сред для предотвращения вмешательства бактерий в рост грибков. Добавление хлорамфеникола в жидкие среды имеет решающее значение, поскольку отсутствие антибиотиков позволит бактериям, присутствующим в почве, ферментироваться. Это приведет к образованию газов, которые будут принудительно открывать микроцентрифужные трубки или 13 мл культуральных трубок, используемых во время инкубации почвы в протоколе. Если бактериальное загрязнение в хлорамфениколе, содержащем агар / бульон, является проблемой, хлорамфеникол может быть заменен или дополнен более сильными антибиотиками. При выделении A. fumigatus из почвы отвар SD может быть заменен раствором Tween 20 (0,2 M NaCl с 1% Tween 20), чтобы помочь приостановить гидрофобный A. fumigatus conidia35,36. После суспензии 100 мкл можно наносить на SD-агар и инкубировать при 50 °C.

Aspergillus fumigatus быстро растет и обильно спорулирует при инкубации в одиночку как на SD-агаре, так и на MEA-среде между 22 ° C и 50 ° C. Однако, в зависимости от того, какие другие термотолерантные виды присутствуют в образце почвы, рост и спорообразование A. fumigatus могут быть затруднены (рисунок 3A, D). В такой ситуации может потребоваться от одного до нескольких этапов субкультурирования для получения чистой колонии для последующего сбора и определения характеристики.

Фрагментарный анализ штаммов A. fumigatus на рисунке 5 проводился с помощью программы Osiris. Несколько артефактов ПЦР были выделены на рисунке 5C и подробно обсуждаются De Valk et al.30. Пики заикания B-1, которые имеют более короткие значения повтора, вызваны проскальзыванием нити во время синтеза антисмысловой нити ДНК-полимеразой. Пики N-1 возникают, если концентрация ДНК слишком высока во время ПЦР. Рекомендуемая концентрация ДНК составляет 0,1 нг, как указано в протоколе выше. Другим артефактом является кровотечение красителя, которое может быть исправлено с помощью флуоресцентных меток с неперекрывающимися длинами волн поглощения. Например, флуоресцентные этикетки 6-FAM, HEX и ATTO550, а также стандарт красителя LIZ600 генерируют отчетливые пики фрагментов (рисунок 5). Наконец, чтобы предотвратить зашкаливающие пики, разбавьте каждую реакцию ПЦР (в данном случае это было ~ 50-кратное разведение) перед капиллярным электрофорезом. Для дальнейшего снижения флуоресценции неиспользуемых передних грунтовок в реакционной смеси при создании мастер-микса вдвое разрежьте концентрации форвардной грунтовки относительно обратных грунтовок.

Высокая пропускная способность и консервативный характер этого протокола позволяет относительно быстро и легко усваивать многие дрожжи и плесень из почв. Однако методология выборки сопряжена с двумя основными ограничениями. Во-первых, для отбора уникальных видов использовались морфологические характеристики дрожжевых колоний, выращенных из почвы. Затем они были субкультурированы и использовались для идентификации видов с помощью секвенирования ITS. Это было сделано, чтобы максимизировать представление присутствующих видов дрожжей. Тем не менее, виды дрожжей, которые имеют сходную или идентичную морфологию с выбранными колониями, могут не быть субкультурированы. Во-вторых, во время изоляции A. fumigatus , поскольку на образец почвы отбирается только одна отдельная колония, присутствие нескольких особей в образце почвы будет пропущено. Это может привести к недопредставленности истинного генетического разнообразия, присутствующего в выборочной популяции, поскольку уникальные генотипы, присутствующие в одном и том же образце почвы, собираться не будут. Чтобы смягчить эту проблему, во время полосы для одной колонии после первого культивирования на твердых средах может быть собрано несколько одиночных колоний для получения дополнительных генотипов. Небольшой объем почвы, используемый на образец, помогает свести к минимуму это ограничение отбора проб по сравнению с методами, в которых используется большее количество почвы на образец.

Использование этого высокопроизводительного и трудоэффективного протокола для выделения дрожжей и плесени увеличит количество особей в почвенной популяции, используя при этом меньше усилий на образец. Увеличение статистической мощности обеспечит лучшую картину культивируемых дрожжевых сообществ в почве и поможет охарактеризовать почвенные популяции A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (Грант No. ALLRP 570780-2021) и Университета Макмастера.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

Биология Выпуск 183 Разнообразие дрожжей Aspergillus fumigatus чистая культура морфотипирование штрих-кодирование ДНК генотипирование микросателлитов
Выделение культурных дрожжей и плесени из почв для исследования структуры грибковой популяции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter