Summary
Настоящий протокол описывает одну мутацию M213L в Gja1, которая сохраняет полноразмерную генерацию Connexin43, но предотвращает трансляцию меньшей изоформы GJA1-20k с внутренней трансляцией.
Abstract
Система редактирования генов CRISPR-Cas9, основанная на механизмах восстановления генома, позволяет быстрее и проще генерировать генно-модифицированные мышиные модели по сравнению с традиционной гомологичной рекомбинацией. Система CRISPR-Cas9 особенно привлекательна, когда требуется одноточечная мутация. Белок щелевого перехода, Connexin 43 (Cx43), кодируется геном Gja1, который имеет один кодирующий экзон и не может быть сращен. Тем не менее, Gja1 производит не только полноразмерный белок Cx43, но и до шести усеченных изоформ N-конца с помощью процесса, известного как внутренняя трансляция, в результате инициации рибосомной трансляции на внутренних начальных участках AUG (метионин). GJA1-20k является наиболее часто генерируемой усеченной изоформой Cx43, инициируемой в кодоне AUG в позиции 213 мРНК Gja1. Поскольку остаток 213 встречается в конце последнего трансмембранного домена Cx43, GJA1-20k фактически является 20 кДа C-концевым хвостом Cx43 в качестве независимого белка. Предыдущие исследователи определили в клетках, что критическая роль GJA1-20k заключается в облегчении транспортировки полноразмерных гемиханнелей Cx43 с плазматической мембраной. Чтобы исследовать это явление in vivo, была сгенерирована мышь-мутант с точечной мутацией Gja1, которая заменяет ATG (метионин) в остатке 213 TTA (мутация Leucine, M213L). Результатом M213L является то, что мРНК Gja1 и полноразмерная Cx43 все еще генерируются, но трансляция Gja1-20k значительно снижается. В этом отчете основное внимание уделяется выбору сайта фермента рестрикции для разработки мышиной модели с одной аминокислотой мутированной (Gja1M213L / M213L). Этот протокол описывает генетически модифицированных мышей с помощью системы CRISPR-Cas9 и быстрого генотипирования путем комбинирования ПЦР и рестрикционных ферментов.
Introduction
Полноразмерный коннексин 43 (Cx43) и N-конечная усеченная изоформа GJA1-20k, кодируемые одной и той же мРНК GJA1, но использующие разные стартовые кодоны1 для инициирования трансляции. Трансляция Cx43 происходит при первом кодоне запуска AUG, тогда как трансляция GJA1-20k инициируется в AUG при остатке 213. Ранее было обнаружено, что GJA1-20k играет важную роль в полноразмерном трафике Cx43, стабилизации актина и регуляции митохондриальной морфологии in vitro 1,2,3.
Чтобы понять роль GJA1-20k in vivo, была сгенерирована «нокаутирующая» модель мыши GJA1-20k, которая сохранила способность создавать полноразмерный Cx43. Подход заключался в использовании системы CRISPR-Cas9 для замены одиночного остатка при 213 с метионина (M) на лейцин (L) (Gja1M213L / M213L) 4. Внутренняя мутация от M до L резко снижает вероятность внутренней трансляции, но сохраняет трансляцию и функцию полноразмерного белка4. Поскольку дикий тип (WT) и мутировавший аллель имеют одинаковые размеры и почти идентичные продукты мРНК, существует значительная трудность в подтверждении генотипа у мышей. Секвенирование ДНК может идентифицировать мутацию, но слишком дорого и отнимает много времени для рутинного использования. В целом, было установлено несколько методов быстрого генотипирования, таких как полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-ПЦР), минисеквенирование-лигирование, анализ плавления с высоким разрешением и тетра-праймерная амплификационная тугобачная мутационная система ПЦР (ARMS-PCR)5,6,7,8. Тем не менее, эти альтернативные методы требуют нескольких шагов, уникальных ресурсов и / или нескольких конкретных наборов праймеров, которые могут индуцировать неспецифические продукты ПЦР.
Этот протокол вводит подробный подход к нацеливанию и редактированию генов CRISPR-Cas9 для создания одной аминокислотной мутации, и для подтверждения мутации представлено быстрое генотипирование. Идентификация генотипа включает в себя творческое использование ферментов рестрикции, использующих только один набор праймеров для идентификации гена-мишени. Читатели ссылаются на Ссылку4 , чтобы наблюдать глубокий электрофизиологический эффект внезапной сердечной смерти, вызванной мутацией замещения одного остатка Gja1M213L / M213L , которая все еще генерирует полноразмерный белок, но не может генерировать меньшую внутренне переведенную изоформу усечения. Этот протокол поможет другим моделям мышей использовать точечную мутацию для уменьшения внутренней трансляции интересующей изоформы при сохранении экспрессии эндогенного полноразмерного белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
«Все протоколы ухода за животными и их изучения были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Cedars-Sinai и Университета штата Юта. Для экспериментов использовали самок мышей C57BL/6J, полученных из коммерческих источников в возрасте 8-9 недель (см. Таблицу материалов).
1. Подготовка к генному таргетированию
- Выберите направляющую целевую последовательность вокруг целевого сайта мутации, кодирующего M213, с помощью веб-алгоритма CRISPOR 4,9,10 (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Была выбрана 20-базовая направляющая последовательность (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), в противоположной цепи от кодирующей последовательности GJA1, с оценкой MIT11 из 62, в которой потенциальный участок расщепления расположен после 16 оснований ниже по течению кодона, подлежащего мутации (ATG) (рисунок 1; вся последовательность crRNA показана в таблице 1). - Синтезируют крРНК и тракрРНК, которые взаимодействуют с Cas9 в качестве направляющей РНК12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя оценка MIT направляющей РНК составляет 62, существует только одна потенциальная нецелевая мутация с четырьмя несоответствиями более чем в 12 основаниях от PAM. Поэтому данная направляющая РНК считается безопасной. - Разработать донорское олиго, комплементарное к направляющей последовательности, для введения одной аминокислотной замены (ATG в TTA; M213L) с 60 и 48 основаниями гомологических рычагов в 5'- и 3'-х сторонах соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это донорское олиго включает точечную мутацию для нарушения PAM (от AGG до ACG) путем введения тихой мутации (TCC к TCG; S217S), чтобы избежать повторного редактирования после восстановления, направленного на гомологию CRISPR (HDR)13 для введения предполагаемых мутаций (рисунок 1 и таблица 1). - Используйте NaCl (конечная концентрация 200 мМ) для осаждения 10 мкг олиго, чтобы свести к минимуму перенос соли в пронуклеарный буфер микроинъекции (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 0,1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCl без спермина и спермидина14).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не промывайте гранулу ДНК 70% этанолом, так как гранула может быть растворена в растворе. - Смешайте 50 нг/мкл донорского олиго, 60 нг/мкл смеси крРНК/тракрРНК (молярное соотношение 1:1) (со стадии 1.2) и 50 нг/мкл белка eSpCas9 (см. Таблицу материалов), чтобы получить смесь CRISPR в конечном объеме 20 мкл (Таблица 2). Снижают концентрацию донорского олиго, если наблюдается высокая токсичность (например, 25 нг/мкл).
2. Индукция суперовуляции, сбор яйцеклеток, пронуклеарная микроинъекция смеси CRISPR и скрининг бластоцисты
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура следует ранее опубликованному общемупротоколу 14.
- Вводят 5 МЕ PMSG (сывороточного гонадотропина беременной кобылы) (см. Таблицу материалов) в 100 мкл стерильной воды 5-10 мышам в возрасте 8 недель путем внутрибрюшинного подхода примерно в 3:00 п.m. (день 1).
- Вводят 5 МЕ ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) (см. Таблицу материалов) в 100 мкл стерильной воды донорам яйцеклеток внутрибрюшинным подходом через 46-48 ч после инъекции ПМСГ (3 день). Наладите разведение 1:1 с племенными самцами.
- Соберите оплодотворенные яйцеклетки в среде М2 с гиалуронидазой, промыть три раза в 100 мкл среды М2 около 10:00 а.m., затем держать в среде мВтМ15 или KSOM16 (день 4) (см. Таблицу материалов).
- Вводят смесь CRISPR (стадия 1.3) в эмбрионы 1-клеточной стадии, собранные у мышей пронуклеарной микроинъекцией14 в 100 мкл М2, покрытые парафиновым маслом, в пластиковой посуде на перевернутом микроскопе с контрастной оптикой в начале и конце дня (Видео 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пронуклеарную микроинъекцию смеси CRISPR проводили на эмбрионах 1-клеточной стадии через 14-16 ч после койта (стр.c.). Введенные эмбрионы культивировали в инкубаторе 5% CO2 в течение нескольких часов и хирургически переносили через 18-20 ч p.c. мышам-реципиентам ICR, у которых в то же утро была совокупляющая пробка. - Перенесите 20-30 2-клеточных эмбрионов в каждого реципиента для получения рекомбинантных животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте общему протоколу14 или культивируйте эти эмбрионы в среде mWM или KSOM в течение 4 дней для проверки эффективности и изучения токсичности. Токсичность смеси CRISPR приемлема, когда по меньшей мере одна треть введенных эмбрионов рано достигает полностью расширенной стадии бластоцисты с несколькими рекомбинантами среди них. При этом более 90% необработанных эмбрионов достигают той же стадии бластоцисты в параллельной культуре. Следуйте шагам 2.6-2.9 для скрининга бластцисты, который не является необходимым, но может быть выполнен, если это предпочтительно, для количественной оценки успешности HDR. - Индивидуально подбирать ранние и полностью расширенные бластоцисты с 2 мкл питательной среды с помощью закупоренного тонкого наконечника пипетки с микропипеттером в одиночные пробирки ПЦР (день 8; Видео 2).
- Лизовые бластоцисты в 8 мкл смеси для сбраживания (то же, что и стадия 3.2; см. Таблицу материалов) и обрабатывают при 75 °C в течение 10 мин, 95 °C в течение 5 мин, затем охлаждают до 4 °C для хранения. Используйте 2 мкл лизата в качестве шаблона для ПЦР в общей сложности 15 мкл ПЦР-смеси (этап 3).
- Изучить эффективность HDR с помощью электрофореза агарозного геля17 образцов ПЦР после рестрикционного пищеварения с помощью NlaIII (стадия 3-5).
- Подтвердить состояние целевой рекомбинации путем секвенирования ампликона17 668 bp у основателей и последующего потомства для подтверждения целостности мутации.
3. Извлечение ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши на 10-й послеродовой день были использованы для этого эксперимента из-за внезапной смерти нокаутирующей мыши GJA1-20k примерно через 2-4 недели после рождения4. Более общий протокол также может быть применен после ранее опубликованного отчета18.
- Отрежьте 1-3 мм кончика пальца ноги или хвоста чистыми ножницами и переложите его в 8-полосную ПЦР-трубку объемом 0,2 мл. Чтобы избежать загрязнения среди образцов пальцев ног или хвоста, используйте предварительно очищенные ножницы или одно лезвие на мышь или очистите перед каждым образцом, используя 70% этанола или 10% отбеливателя. Если хвост кровоточит после отбора проб, примените кратковременное давление марлей, чтобы остановить кровотечение. Храните образцы хвоста при -20 °C до экстракции в течение примерно недели.
- Добавьте раствор лизиса тканей (см. Таблицу материалов) в пробирке объемом 100 мкл/пробирку и хорошо перемешайте, а затем открутите с помощью настольной мини-центрифуги (2 200 х г в течение 10 с при комнатной температуре). Убедитесь, что образцы хвоста погружены в раствор.
- Установите трубки на термоциклер, установленный по следующей программе; 75 °C в течение 10 мин (лизис тканей), 95 °C в течение 5 мин (инактивация) и 4 °C (выдержка). Храните тканевый лизат при 4 °C в течение недели, если ПЦР не может быть выполнена немедленно.
4. Амплификация ДНК методом ПЦР
- В новую ПЦР-пробирку готовят раствор ПЦР, содержащий 5 мкл без нуклеазH2O, 0,75 мкл прямых и обратных праймеров 10 мкМ и 7,5 мкл мастер-смеси ПЦР (см. Таблицу материалов) на образец (см. Таблицу 1 для последовательностей праймеров). Если образцов несколько, масштабируйте содержимое до аликвоты 14 мкл на пробирку.
- Добавьте 1 мкл тканевого лизата к раствору ПЦР, приготовленному на стадии 3.1. Будьте осторожны, чтобы не коснуться хвоста.
- Хорошо перемешайте и открутите с помощью настольной мини-центрифуги (2 200 х г в течение 10 с при комнатной температуре).
- Установите трубки на термоциклер, установленный по нижеуказанной программе. Хранить продукты ПЦР при 4 °C в течение 1-2 месяцев или ~1 года при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: 95 °C в течение 3 мин (стадия 1, начальная денатурация), 95 °C в течение 15 с (стадия 2, денатурация), 60 °C в течение 15 с (стадия 2, отжиг), 72 °C в течение 45 с (стадия 2, удлинение), повторите стадию 2 в течение 35 циклов, 72 °C в течение 10 мин (стадия 3, окончательное расширение) и 4 °C (стадия 4, выдержка).
5. Инкубация с ферментом рестрикции
- Готовят ферментный раствор, содержащий 7 мкл не содержащего нуклеазыH2O, 2 мкл 10x буфера CutSmart и 1 мкл фермента рестрикции NlaIII (см. Таблицу материалов). Если образцов несколько, умножьте каждое содержимое, чтобы получить смесь и аликвоту 10 мкл на пробирку.
- Добавляют 10 мкл продукта ПЦР, полученного на стадии 3, в раствор фермента на пробирку.
- Хорошо перемешайте и открутите с помощью настольной мини-центрифуги (2 200 х г в течение 10 с при комнатной температуре).
- Установите трубки на термоциклер или тепловой блок, установленный по нижеуказанной программе. Хранить продукт после инкубации при 4 °C в течение 1-2 месяцев или ~1 года при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: 37°С в течение 16 ч (не менее 2 ч; короткое время инкубации может привести к недостаточному расщеплению) и 4°С для выдержки.
6. Обнаружение полосы ДНК
- Для электрофореза приготовьте 1,5% агарозный гель, содержащий пятно ДНК-геля.
- Добавьте 0,75 г агарозы в 50 мл 1x TAE буфера, затем перемешайте и нагрейте в микроволновой печи до полного растворения агарозы. После остывания добавьте 5 мкл пятна ДНК и аккуратно перемешайте.
- Вылейте в гелевую форму (25 мл на форму) и дайте гелю затвердеть. Для получения лучшего разрешения и разделения увеличивают концентрацию агарозы до 2,5%-4% по мере необходимости.
- Загрузите в скважину 10 мкл переваренного продукта ПЦР. При необходимости смешайте 6-кратный буфер загрузки.
- Запустите гель со 100 В в течение 35 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут нуждаться в оптимизации. - Изображение под ультрафиолетовым светом (длина волны 302 нм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Система редактирования генов CRISPR/Cas9 производит мутацию ATG to TTA и тихую мутацию TCC to TCG при 56 264 279 до 56 264 281 и от 56 264 291 до 56 264 293 на хромосоме мыши 10 или при 869 до 871 и 881 до 883 на мРНК Gja1 соответственно. Эта мутация приводит к мутации метионина 213 к лейцину (M213L) на белке GJA1, а мутация TTC к TTG нарушает близлежащую последовательность PAM, чтобы избежать нежелательного издания гена (рисунок 1). Подробности мутации описаны в предыдущем отчете4.
Чтобы проанализировать правильные генотипы, продукты ПЦР необходимо переварить ферментом рестрикции «NlaIII» перед электрофорезом агарозного геля (рисунок 2, этап 4). Как показано на рисунке 2A, продукты ПЦР для аллелей дикого типа (WT) будут разрезаны на два разных продукта пары оснований (227 bp и 441 bp). Напротив, мутантные аллельные продукты ПЦР будут неповрежденными (668 bp) из-за отсутствия сайта распознавания NlaIII по мутации (рисунок 2B). Общий электрофорез агарозы может быть выполнен с использованием переваренных продуктов ПЦР (этап 5). Специфические полосы в агарозном геле указывают на каждый генотип (WT, дикий тип; Het, гетерозиготный; Хм, гомозиготный). Из-за ограничения, упомянутого выше, каждый генотип приводит к нескольким полосам разных размеров (рисунок 2C). Полосы будут состоять из двух полос в WT (227 bp и 441 bp), трех полос в Het (227 bp, 441 bp и 668 bp) и одной полосы в Hm (668 bp) соответственно. Согласно гелевой визуализации с использованием одного фермента рестрикции, можно различить правильные генотипы мышей.
В нашем эксперименте изначально был произведен двадцать один основатель, из которых девять были гетерозиготными или мозаичными животными. Двое из девяти основателей умерли, не дожив до возраста размножения, скорее всего, из-за высокосодержательного мозаицизма биаллельных мутантных соматических клеток. Две независимые мутантные линии были впоследствии установлены от оставшихся семи основателей путем обратного скрещивания с мышами дикого типа C57BL / 6J в течение по крайней мере двух поколений. Поскольку целевая мутация смертельна при гомозиготности, нам пришлось поддерживать линию как гетерозиготную для дальнейшего разбавления возможных нецелевых мутаций. Гомозиготные экспериментальные животные были получены путем скрещивания последующих поколений.
Стоит отметить, что относительно высокая эмбриональная токсичность с донорскими олиго при 50 нг/мкл наблюдалась при введении донорских олиго в эмбрионы. Однако концентрация донора 12,5 нг/мкл не вызывала целенаправленной рекомбинации у полученных детенышей. Кроме того, было обнаружено, что добавление этанолового осаждения олиго помогло удалить загрязняющие вещества и позволило индукционировать эффективное, целенаправленное редактирование генома. Обратите внимание, что промывка гранул ДНК 70% этанолом растворяет гранулу в растворе. Поэтому NaCl использовали при конечной концентрации 200 мМ для осаждения 10 мкг олиго, чтобы свести к минимуму перенос соли в пронуклеарный буфер микроинъекции. Тестовая инъекция с анализом бластоцисты была предпринята с использованием 50 или 25 нг/мкл донорских олиго с осаждением этанола. Успешность каждого состояния составила 76,9% (10 из 13 образцов с 50 нг/мкл) и 25,0% (3 из 12 образцов с 25 нг/мкл) (рисунок 3А-С). Хотя 50 нг/мкл олиго с осаждением этанола все еще были несколько токсичными, многие яйца необходимо было вводить, и рекомбинанты производились с высокой успешностью. Таким образом, 50 нг/мкл донорских олиго были, наконец, введены с осаждением этанола и получены животные-основатели с показателем успеха 50,0% (16 из 32 щенков имели рекомбинацию, включая 21 выжившего и 11 смертей после рождения). Два из животных-основателей, имеющих передачу зародышевой линии однородной мутации или моноаллельной или идентичной мутации со стабильной передачей, подтвержденной секвенированием, использовались для установления независимых линий. Консенсус заключается в том, что обратное скрещивание двух поколений с дикими животными и использование белка Cas9 с повышенной точностью устраняет основные нецелевые события. Количество таких событий статистически не отличается от фоновой частоты мутаций de novo 19,20.
Животные с нежелательными генотипами (дикий тип или неправильные рекомбинанты), используемые для экспериментов и по завершении исследования, были усыплены ингаляцией CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с протоколом IACUC.
Рисунок 1: Схематическое представление для гена, нацеленного с помощью CRISPR/Cas9. (A) Целевые последовательности для рекомбинации гомологов. Между последовательностями показаны однобуквенные аминокислоты. Цветные блики указывают на гомологию руки (серый), кодон мутации (зеленый), последовательность PAM (оранжевый) и целевую последовательность гРНК (синий). Синяя стрелка указывает на гРНК. Сайт ограничения NlaIII подчеркнут пунктирной линией. (B) Схематические последовательности WT и мутантного аллеля и донорского олиго для точечной мутации привели к мутации M213L. TCC to TCG - это тихая мутация для нарушения нежелательных PAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема ПЦР продуктов и рестрикционный сайт WT и мутантный аллель. (A,B) Схема ПЦР и пищеварения по NlaIII. Праймеры усиливают 668 bp ДНК Gja1 вокруг места мутации. Продукты WT allele PCR были переварены до двух различных размеров NlaIII. Напротив, мутантный аллель НЕ переваривается и сохраняет неповрежденные продукты ПЦР. (C) Репрезентативное изображение агарозного геля указывает на WT и мутантный аллель. Каждый генотип мыши имел определенный размер полосы; WT (полосы 1, 3 и 5), Het (полоса 2) и Hm (полоса 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Эффективность рекомбинации в двух различных дозах донорских олиго в смеси CRISPR. (A) Результаты генотипирования морул или бластоцист, вводимых различными дозами (25 или 50 нг/мкл) донорских олиго, показывающих дикий тип (WT; полоса No 10, 12 и 14), гетерозиготные/мозаичные (het/mosaic; полосы No 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11 и 13), гомозиготные (hom; полосы #4 и 5) или не усиленные (полоса #7). Положительный контроль Wild Type и H2O в качестве отрицательного контроля были загружены между полосами #17 и #18. (Б-Д) Круговые диаграммы представляют эффективность рекомбинации смесей CRISPR в двух различных дозах донорских олиго (B, C) и животных-основателей, которым вводили 50 нг /мкл донорских олиго (D). Обратите внимание, что 11 из 32 родившихся животных были либо убиты матерями, либо умерли перед отъемом. Образцы, которые не смогли амплироваться при ПЦР, были исключены при расчете эффективности рекомбинации. Индивидуальная частота генотипа из всех образцов указана в таблицах 3 и 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя | Последовательности | Комментарии | |||
| крРНК | 5' АУУКАГАГГГАГАГАКАКАГУ УУУАГАГКУАУГУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУ |
Подчеркивание указывает целевую последовательность CRSPR | |||
| ДНК олигодонара | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCTCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTCTCTCTCTCT ТАКТГГТГТТГТГГТТГТТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТ ГААТАТГАТГКТКТТТТТТТТТТТТЦЦТТКТКТКТТК 3' |
Подчеркивание указывает на мутировавшие кодоны. Кулак 60 bp до мутации TTA и 48 bp после мутации TCG являются гомологической рукой | |||
| Генотипирование грунтовки вперед | 5' ТГГАТТГААГАААКГГКА 3' | ||||
| Генотипирующая грунтовка Реверс | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
Таблица 1: Информация о последовательности.
| Компонент | Складское решение | Количество | Конечная концентрация |
| Донорское олиго | 1 мкг/мкл вН2O без Рназы | 1.0 мкл | 50 нг/мкл |
| GJA1 crRNA | 1 мкг/мкл вН2O без Рназы | 0.4 мкл | 20 нг/мкл |
| тракрРНК | 1 мкг/мкл вН2O без Рназы | 0.8 мкл | 40 нг/мкл |
| Белок eSpCas9 | 1 мкг/мкл вН2O без Рназы | 1.0 мкл | 50 нг/мкл |
| Буфер впрыска без РНКазы | 0,1 мМ ЭДТА рН 8,0 | 16.8 мкл | |
| 10 мМ Tris-HCl pH 7.5 | |||
| 100 мМ NaCl | |||
| Общий объем | 20.0 мкл |
Таблица 2: Рецепт смеси CRISPR.
| Номер полосы движения (рисунок 3) | Донор олиго конк. | Статус | Не усилено | Дикий тип | Хет/мозаика | Хом | Заметка |
| 1 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | Стирание | |||
| 2 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | ||||
| 3 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | ||||
| 4 | 50 нг/мкл | Морула | Хом | ||||
| 5 | 50 нг/мкл | Морула | Хом | ||||
| 6 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | Стирание | |||
| 7 | 50 нг/мкл | Морула | Н/Д | ||||
| 8 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | ||||
| 9 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | ||||
| 10 | 50 нг/мкл | Морула | Дикий тип | ||||
| 11 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | ||||
| 12 | 50 нг/мкл | Морула | Дикий тип | ||||
| 13 | 50 нг/мкл | Морула | Хет/мозаика | Вставка | |||
| 14 | 50 нг/мкл | Морула | Дикий тип | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 нг/мкл | Морула | Н/Д | ||||
| 16 | 25 нг/мкл | Морула | Н/Д | ||||
| 17 | 25 нг/мкл | Морула | Н/Д | ||||
| 18 | 25 нг/мкл | Морула | Н/Д | ||||
| 19 | 25 нг/мкл | Морула | Дикий тип | ||||
| 20 | 25 нг/мкл | Морула | Н/Д | ||||
| 21 | 25 нг/мкл | Морула | Дикий тип | ||||
| 22 | 25 нг/мкл | Морула | Дикий тип | ||||
| 23 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Н/Д | ||||
| 24 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Дикий тип | ||||
| 25 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Хет/мозаика | ||||
| 26 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Дикий тип | ||||
| 27 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Н/Д | ||||
| 28 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Дикий тип | ||||
| 29 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Дикий тип | ||||
| 30 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Хет/мозаика | Вставка/удаление | |||
| 31 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Дикий тип | ||||
| 32 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Хет/мозаика | Вставка | |||
| 33 | 25 нг/мкл | Бластоциста | Дикий тип | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
Таблица 3: Результаты генотипирования морулы и бластоцисты.
| Животное # | Донор олиго конк. | Статус | Не усилено | Дикий тип | Хет/мозаика | Хом | Заметка |
| д1 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Дикий тип | ||||
| д2 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хет/мозаика | ||||
| д3 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хет/мозаика | Стирание | |||
| д4 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Дикий тип | ||||
| д5 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хет/мозаика | ||||
| д6 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Дикий тип | ||||
| д7 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хет/мозаика | ||||
| д8 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хет/мозаика | ||||
| 34 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | ||||
| 35 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 36 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 37 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | используется как независимая линия | |||
| 38 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 39 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 40 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 41 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | ||||
| 42 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 43 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 44 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 45 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| д1 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хом | ||||
| д2 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Дикий тип | ||||
| д3 | 50 нг/мкл | Мертвый щенок | Хет/мозаика | ||||
| 46 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | ||||
| 47 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | Вставка | |||
| 48 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | Вставка | |||
| 49 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | ||||
| 50 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 51 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | используется как независимая линия | |||
| 52 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 53 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Хет/мозаика | Вставка/удаление | |||
| 54 | 50 нг/мкл | Живой щенок | Дикий тип | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
Таблица 4: Результаты генотипирования животных-основателей.
Видео 1: Инъекция CRISPR эмбрионам. Смесь CRISPR вводят в эмбрионы 1-клеточной стадии, описанные на этапе 2.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Бластоцисты поднимаются. Репрезентативное видео, показывающее, как бластоцисты поднимаются на шаге 2.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генно-модифицированная модель мыши является распространенным подходом к пониманию функции генов. Однако, поскольку внутренне транслируемая изоформа GJA1-20k транслируется из той же мРНК Gja1 , что и полноразмерная Cx43, была разработана творческая стратегия для сохранения полноразмерного выражения Cx43, но подавления выражения GJA1-20k. Подход основан на мутации внутреннего стартового кодона GJA1-20k. С одноточечной мутацией M213 был переключен на L на мРНК Gja1 , которая преуспела в подавлении экспрессии GJA1-20k, но сохранила полноразмерную экспрессию Cx434.
Однако точечная мутация одного внутреннего сайта начала трансляции представляла другую трудность: определение генотипов мыши. Замена одного остатка слишком мала, чтобы сделать конкретные грунтовки. Кроме того, WT и мутационные аллели имеют идентичные пары оснований. Еще один шаг был добавлен в протокол генотипирования для решения этих проблем. Поскольку стартовый кодон GJA1-20k (целевой участок мутации) распознается ферментом рестрикции NlaIII, сайт, не подлежащий распознаванию NlaIII, мутировал (рисунок 1; CATG к CTTA). Кроме того, были разработаны праймеры для генерации продукта ПЦР, который не имеет никакого другого подходящего сайта NlaIII. Правильный протокол генотипирования был установлен для точечно-мутированной мышиной линии путем добавления стадии переваривания фермента с ферментом рестрикции. Как правило, переваривание ферментов осуществляется путем кратковременной инкубации (0,5-2,0 ч при 37 °C); ночная инкубация (~16 ч) рекомендуется для полного переваривания всего продукта ПЦР. Введение мутации в целевую последовательность приводит к неправильному распознаванию между WT и мутантными аллелями. Поэтому рекомендуется ночная инкубация для достаточного пищеварения в этом протоколе, если только рестрикционный фермент выбора не обладает звездной активностью21.
Текущий проект направлен на то, чтобы нарушить работу второго сайта инициации трансляции путем изменения ATG (метионин) на TTA (лейцин). NlaIII является удобным ферментом рестрикции для быстрого скрининга, поскольку он распознает CATG в месте таргетинга. Цитозин (C) часто ассоциируется с последовательностью KOZAK непосредственно перед местом инициации трансляции. NcoI (C/CATGG) и NdeI (CA/TATG) являются другими универсальными ферментами рестрикции для скрининга в этой области, если для создания/удаления этих участков ограничения необходимо использовать альтернативные кодоны. Если введение тихих мутаций не является разрешительным для ограничения скрининга на месте, необходимо секвенирование отдельных образцов22,23. В этом проекте целенаправленная рекомбинация была достаточно эффективной.
Эта линия мутантных мышей M213L позволяет нам анализировать функцию GJA1-20k. Недавно, используя эту линию мыши, было выявлено, что GJA1-20k имеет важное значение для трафика и образования полноразмерных разрывных соединений Cx43 в сердце4. Интересно, что гомозиготная мутация M213L (Gja1M213L/M213L), поскольку она не может генерировать GJA1-20k, всегда приводит к внезапной смерти через 2-4 недели после рождения, потому что соответствующие сердца не образуют разрывных соединений в сердечном интеркалированном диске. Напротив, гетерозиготная мутация M213L показывает близкую к нормальной сердечную функцию, и мыши имеют продолжительность жизни, аналогичную продолжительности жизни животных WT4. Предыдущее исследование in vitro также показало, что мутация M213L нарушает правильное образование щелевого соединения1. Более того, это нарушение разрыва соединения спасается экзогенной трансфекцией GJA1-20k. Основываясь на нормальном образовании щелевых переходов в гетерозиготном мутантном сердце мыши M213L в базальном состоянии4 и исследовании in vitro 1, можно сделать вывод, что полноразмерный Cx43 с мутацией M213L сохраняет правильную функцию в качестве белка щелевого перехода.
В дополнение к существенной роли GJA1-20k в незаконном обороте Cx43, GJA1-20k обогащает митохондриальную внешнюю мембрану, вызывая защитное митохондриальное деление и биогенез 3,24,25. С точки зрения митохондриальной функции, мыши с гетерозиготной мутацией GJA1-20k (Gja1M213L / WT) имеют чрезвычайную чувствительность к ишемии / реперфузионному повреждению. При воздействии ишемии/реперфузии взрослые мыши Gja1M213L/WT имеют гораздо больший размер инфаркта и больше нарушенных митохондрий, чем их коллеги WT25.
Таким образом, новая линия мыши, содержащая мутацию M213L, полезна для анализа внутренне переведенного GJA1-20k. Следует отметить, что как полноразмерный Cx43, так и меньший GJA1-20k экспрессируются во всех системах органов млекопитающих. Ожидается, что будущие исследования также изучат роль экстракардиального GJA1-20k.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Проект был поддержан грантами Национальных институтов здравоохранения (R01HL152691, R01HL138577 и R01HL159983) для RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine.
- Mayer, H.
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
