Summary
El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.
Abstract
El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9, basado en mecanismos de reparación del genoma, permite la generación de modelos de ratón modificados genéticamente de forma más rápida y sencilla en relación con la recombinación homóloga tradicional. El sistema CRISPR-Cas9 es particularmente atractivo cuando se desea una mutación de un solo punto. La proteína de unión de brecha, Connexin 43 (Cx43), está codificada por el gen Gja1, que tiene un solo exón codificante y no se puede empalmar. Sin embargo, Gja1 produce no solo la proteína Cx43 de longitud completa, sino hasta seis isoformas truncadas N-terminales mediante un proceso conocido como traducción interna, el resultado de la iniciación de la traducción ribosómica en los sitios de inicio internos de AUG (metionina). GJA1-20k es la isoforma truncada más comúnmente generada de Cx43 iniciada en el codón AUG en la posición 213 del ARNm Gja1. Debido a que el residuo 213 ocurre al final del último dominio transmembrana de Cx43, GJA1-20k es efectivamente la cola C-terminal de 20 kDa de Cx43 como una proteína independiente. Investigadores anteriores identificaron, en células, que un papel crítico de GJA1-20k es facilitar el tráfico de hemicanales de unión de brecha Cx43 de longitud completa a la membrana plasmática. Para examinar este fenómeno in vivo, se generó un ratón mutante con una mutación puntual Gja1 que reemplaza el ATG (Metionina) en el residuo 213 por TTA (mutación Leucina, M213L). El resultado de M213L es que el ARNm de Gja1 y el Cx43 de longitud completa todavía se generan, pero la traducción de Gja1-20k se reduce significativamente. Este informe se centra en la elección del sitio de la enzima de restricción para desarrollar un modelo de ratón mutado en un aminoácido (Gja1 M213L / M213L). Este protocolo describe ratones modificados genéticamente por el sistema CRISPR-Cas9 y el genotipado rápido mediante la combinación de PCR y tratamientos con enzimas de restricción.
Introduction
La conexina 43 (Cx43) de longitud completa y la isoforma truncada N-terminal, GJA1-20k, codificadas por el mismo ARNm GJA1, pero utilizan diferentes codones de inicio1 para iniciar la traducción. La traducción de Cx43 se produce en el primer codón de inicio de AUG, mientras que la traducción de GJA1-20k se inicia en el AUG en el residuo 213. Anteriormente se encontró que GJA1-20k tiene funciones esenciales para el tráfico de Cx43 de longitud completa, la estabilización de la actina y la regulación de la morfología mitocondrial in vitro 1,2,3.
Para comprender el papel de GJA1-20k in vivo, se generó un modelo de ratón GJA1-20k "knock-out" que conservó la capacidad de crear Cx43 de longitud completa. El enfoque consistió en utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para sustituir el único residuo en 213 de una metionina (M) a una leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Una mutación interna de M a L disminuye drásticamente la probabilidad de que ocurra la traducción interna, pero conserva la traducción y la función de la proteína4 de longitud completa. Debido a que el tipo salvaje (WT) y el alelo mutado tienen tamaños idénticos y productos de ARNm casi idénticos, existe una dificultad considerable para confirmar el genotipo en los ratones. La secuenciación del ADN puede identificar la mutación, pero es demasiado costosa y requiere demasiado tiempo para el uso rutinario. En general, se han establecido varios métodos de genotipado más rápido, como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), la minisecuenciación-ligadura, el análisis de fusión de alta resolución y el sistema de mutación refractaria de amplificación tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Sin embargo, estos métodos alternativos requieren múltiples pasos, recursos únicos y / o varios conjuntos de cebadores específicos que pueden inducir productos de PCR no específicos.
Este protocolo introduce un enfoque detallado de selección y edición de genes por parte de CRISPR-Cas9 para crear una sola mutación de aminoácidos, y se presenta un genotipado rápido para confirmar la mutación. La identificación del genotipo implica el uso creativo de enzimas de restricción que utilizan solo un conjunto único de cebadores para identificar el gen objetivo. Se remite a los lectores a la Referencia4 para observar el profundo efecto electrofisiológico de la muerte súbita cardíaca causada por una mutación de sustituciónGja1 M213L / M213L de un residuo que aún genera una proteína de longitud completa pero no genera una isoforma de truncamiento traducida internamente más pequeña. Este protocolo ayudará a que otros modelos de ratones utilicen una mutación puntual para disminuir la traducción interna de una isoforma de interés mientras conservan la expresión de la proteína endógena de longitud completa.
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Protocol
"Todos los protocolos de cuidado y estudio de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico Cedars-Sinai y la Universidad de Utah. Para los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6J obtenidos de fuentes comerciales a las 8-9 semanas de edad (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación para la orientación genética
- Seleccione la secuencia diana guía alrededor del sitio de mutación objetivo que codifica M213 utilizando el algoritmo web CRISPOR 4,9,10 (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Se seleccionó una secuencia guía de 20 bases (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), en la hebra opuesta a la secuencia codificante GJA1, con una puntuación MIT11 de 62 en la que el sitio de escisión potencial se encuentra después de 16 bases aguas abajo del codón a mutar (ATG) (Figura 1; toda la secuencia de CRRNA se muestra en la Tabla 1). - Sintetizar el arncr y el arNtra que interactúan con Cas9 como ARNguía 12.
NOTA: Aunque la puntuación del MIT del ARN guía es de 62, solo hay una posible mutación fuera del objetivo con cuatro desajustes a más de 12 bases del PAM. Por lo tanto, esta guía de ARN se considera segura. - Diseñar un oligo donante complementario a la secuencia guía para introducir una única sustitución de aminoácidos (ATG a TTA; M213L) con brazos de homología de 60 y 48 bases en los lados 5' y 3', respectivamente.
NOTA: Este oligo donante incluye una mutación puntual para la interrupción del PAM (AGG a ACG) mediante la introducción de una mutación silenciosa (TCC a TCG; S217S) para evitar la reedición después de la reparación dirigida por homología CRISPR (HDR)13 para la introducción de las mutaciones previstas (Figura 1 y Tabla 1). - Use NaCl (concentración final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar el arrastre de sal al tampón de microinyección pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 mM de EDTA y 100 mM de NaCl sin espermina y espermidina14).
NOTA: No lave el pellet de ADN con etanol al 70%, ya que el pellet se puede disolver en la solución. - Mezclar 50 ng/μL de oligo donante, 60 ng/μL de mezcla de arncr/artracrRNA (relación molar 1:1) (a partir del paso 1.2) y 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabla de Materiales) para hacer mezcla CRISPR en volumen final 20 μL (Tabla 2). Disminuir la concentración del oligo donante si se observa una alta toxicidad (por ejemplo, 25 ng/μL).
2. Inducción de superovulación, recolección de huevos, microinyección pronuclear de mezcla CRISPR y detección de blastocistos
NOTA: Este procedimiento sigue un protocolo general14 publicado anteriormente.
- Inyecte 5 UI de PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) (ver Tabla de materiales) en 100 μL de agua estéril a 5-10 ratones a las 8 semanas de edad mediante un enfoque intraperitoneal aproximadamente a las 3:00 p.m. (día 1).
- Inyectar 5 UI de hCG (gonadotropina coriónica humana) (ver Tabla de Materiales) en 100 μL de agua estéril a las donantes de óvulos mediante un enfoque intraperitoneal 46-48 h después de la inyección de PMSG (día 3). Establezca la cría 1: 1 con machos de sementales.
- Cosechar los huevos fertilizados en medio M2 con hialuronidasa, lavar tres veces en 100 μL de medio M2 alrededor de las 10:00 a.m., luego mantener en medio mWM15 o KSOM16 (día 4) (ver Tabla de Materiales).
- Introducir la mezcla CRISPR (paso 1.3) en embriones en etapa de 1 célula cosechados de los ratones por microinyección pronuclear14 en 100 μL de M2 cubiertos con aceite de parafina en un plato de plástico en un microscopio invertido con una óptica que mejora el contraste a primera hora de la tarde (Video 1).
NOTA: La microinyección pronuclear de la mezcla CRISPR se realizó en embriones en etapa de 1 célula a las 14-16 h postcoitum (p.c.). Los embriones inyectados se cultivaron en una incubadora de CO2 al 5% durante unas horas y se transfirieron quirúrgicamente a las 18-20 h p.c. en ratones ICR receptores que tenían un tapón de cópula en la misma mañana. - Transfiera 20-30 embriones de 2 células a cada receptor para producir animales recombinantes.
NOTA: Siga el protocolo general14 o cultive esos embriones en medio mWM o KSOM durante 4 días para validar la eficiencia y examinar la toxicidad. La toxicidad de la mezcla CRISPR es aceptable cuando al menos un tercio de los embriones inyectados alcanzan temprano la etapa de blastocisto completamente expandido con múltiples recombinantes entre ellos. Al mismo tiempo, más del 90% de los embriones no manipulados alcanzan la misma etapa de blastocisto en un cultivo paralelo. Siga el paso 2.6-2.9 para la detección de blastocitos, que no es esencial, pero se puede hacer si se prefiere cuantificar la tasa de éxito de HDR. - Recoger individualmente blastocistos tempranos a completamente expandidos con 2 μL de medio de cultivo utilizando una punta de pipeta fina tapada con un micropipetador en tubos de PCR individuales (día 8; Vídeo 2).
- Lise blastocistos en 8 μL de mezcla de digestión (igual que el paso 3.2; ver Tabla de Materiales) y procese a 75 °C durante 10 min, 95 °C durante 5 min, luego enfríe hasta 4 °C para su almacenamiento. Utilice 2 μL del lisado como plantilla para pcr en una mezcla total de PCR de 15 μL (paso 3).
- Examinar la eficacia del HDR mediante electroforesis en gel de agarosa17 de las muestras de PCR después de la digestión de restricción con NlaIII (paso 3-5).
- Confirme el estado de la recombinación dirigida secuenciando el amplicón17 de 668 pb en los fundadores y la progenie posterior para confirmar la integridad de la mutación.
3. Extracción de ADN
NOTA: Los ratones en el día postnatal 10 se utilizaron para este experimento debido a la muerte súbita del ratón knock-out GJA1-20k alrededor de 2-4 semanas después del nacimiento4. También se puede aplicar un protocolo más general después del informe18 publicado anteriormente.
- Corte 1-3 mm de la punta del dedo del pie o la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de 0,2 ml y 8 tiras. Para evitar la contaminación entre las muestras del dedo del pie o la cola, use tijeras prelimpiadas o una cuchilla por ratón o limpie antes de cada muestra con etanol al 70% o blanqueador al 10%. Si la cola sangra después del muestreo, aplique una breve presión con una gasa para detener la hemorragia. Guarde las muestras de cola a -20 °C hasta la extracción durante aproximadamente una semana.
- Añadir solución de lisis tisular (ver Tabla de Materiales) en un tubo de 100 μL y mezclar bien, seguido de spin-down con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente). Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución.
- Coloque los tubos en un termociclador establecido por el siguiente programa; 75 °C durante 10 min (lisis tisular), 95 °C durante 5 min (inactivación) y 4 °C (retención). Guarde el lisado tisular a 4 °C durante un máximo de una semana si las PCR no se pueden realizar inmediatamente.
4. Amplificación del ADN por PCR
- Preparar una solución de PCR que contenga 5 μL de H2O libre de nucleasa, 0,75 μL de imprimaciones de 10 μM hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 μL de mezcla maestra de PCR (ver Tabla de Materiales) por muestra en un nuevo tubo de PCR (ver Tabla 1 para secuencias de imprimación). Si hay varias muestras, escalar el contenido a alícuota de 14 μL por tubo.
- Añadir 1 μL de lisado tisular a la solución de PCR preparada en el paso 3.1. Tenga cuidado de no tocar la cola.
- Mezclar bien y girar hacia abajo con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente).
- Coloque los tubos en un termociclador establecido por el programa mencionado a continuación. Guarde los productos de PCR a 4 °C durante 1-2 meses o ~1 año a -20 °C.
NOTA: 95 °C durante 3 min (paso 1, desnaturalización inicial), 95 °C durante 15 s (paso 2, Desnaturalización), 60 °C durante 15 s (paso 2, Recocido), 72 °C durante 45 s (paso 2, Extensión), repita el paso 2 durante 35 ciclos, 72 °C durante 10 min (paso 3, Extensión final) y 4 °C (paso 4, Retención).
5. Incubación con enzima de restricción
- Preparar la solución enzimática que contiene 7 μL de H2O libre de nucleasa, 2 μL de tampón CutSmart 10x y 1 μL de enzima de restricción NlaIII (ver Tabla de Materiales). Si hay varias muestras, multiplique cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 μL por tubo.
- Añadir 10 μL de producto de PCR obtenido en el paso 3 a la solución enzimática por tubo.
- Mezclar bien y girar hacia abajo con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente).
- Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor establecido por el programa mencionado a continuación. Almacene el producto después de la incubación a 4 °C durante 1-2 meses o ~1 año a -20 °C.
NOTA: 37 °C durante 16 h (al menos 2 h; el corto tiempo de incubación puede resultar en una escisión insuficiente) y 4 °C para la explotación.
6. Detección de banda de ADN
- Prepare un gel de agarosa al 1,5% que contenga tinción de gel de ADN para la electroforesis.
- Agregue 0.75 g de agarosa en 50 ml de tampón 1x TAE seguido de mezcla y calor en microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Después de enfriar, agregue 5 μL de tinción de ADN y mezcle suavemente.
- Vierta en el molde de gel (25 ml por molde) y permita que el gel se solidifique. Para obtener una mejor resolución y separación, aumente la concentración de agarosa a 2.5% -4% según sea necesario.
- Cargue 10 μL de producto de PCR digerido en el pozo. Mezcle 6x búfer de carga, si es necesario.
- Pasar el gel con 100 V durante 35 min.
NOTA: Estos parámetros pueden necesitar optimización. - Imagen bajo luz UV (longitud de onda de 302 nm).
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Representative Results
El sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 produce una mutación ATG a TTA y una mutación silenciosa de TCC a TCG en 56.264.279 a 56.264.281 y en 56.264.291 a 56.264.293 en el cromosoma 10 del ratón, o en 869 a 871 y 881 a 883 en el ARNm de Gja1, respectivamente. Esas mutaciones dan como resultado una mutación de metionina 213 a leucina (M213L) en la proteína GJA1 y la mutación TTC a TTG interrumpe una secuencia PAM cercana para evitar la edición no deseada del gen (Figura 1). Los detalles de la mutación se describen en un informe anterior4.
Para analizar los genotipos adecuados, los productos de PCR deben ser digeridos por la enzima de restricción "NlaIII" antes de la electroforesis en gel de agarosa (Figura 2, paso 4). Como se muestra en la Figura 2A, los productos de PCR de alelo de tipo salvaje (WT) se cortarán en dos productos de pares de bases diferentes (227 pb y 441 pb). Por el contrario, los productos de PCR de alelo mutante estarán intactos (668 pb) debido a la falta de sitio de reconocimiento NlaIII por mutación (Figura 2B). La electroforesis general de agarosa se puede realizar utilizando los productos de PCR digeridos (paso 5). Bandas específicas en el gel de agarosa indican cada genotipo (WT, tipo salvaje; Het, heterocigoto; Hm, homocigoto). Debido a la restricción mencionada anteriormente, cada genotipo da como resultado varias bandas de diferentes tamaños (Figura 2C). Las bandas serán dos bandas en WT (227 bp y 441 bp), tres bandas en Het (227 bp, 441 bp y 668 bp) y una banda en Hm (668 bp), respectivamente. De acuerdo con las imágenes en gel utilizando una sola enzima de restricción, se pueden distinguir los genotipos adecuados de los ratones.
En nuestro experimento, se produjeron inicialmente veintiún fundadores, de los cuales nueve eran animales heterocigotos o mosaicos. Dos de los nueve fundadores murieron antes de crecer hasta la edad reproductiva, muy probablemente debido al mosaicismo de alto contenido de células somáticas mutantes bialélicas. Posteriormente se establecieron dos líneas mutantes independientes de los siete fundadores restantes mediante el retrocruce a ratones C57BL / 6J de tipo salvaje durante al menos dos generaciones. Debido a que la mutación dirigida es letal cuando es homocigota, tuvimos que mantener la línea como heterocigota para diluir aún más las posibles mutaciones fuera del objetivo. Los animales de experimentación homocigotos se produjeron entrecruzando las generaciones posteriores.
Vale la pena señalar que se experimentó una toxicidad embrionaria relativamente alta con los oligos donantes a 50 ng / μL para la inyección de los oligos donantes en los embriones. Sin embargo, una concentración del donante de 12,5 ng/μL no indujo la recombinación dirigida en las crías resultantes. Además, se encontró que la precipitación de etanol agregada de los oligos ayudó a eliminar los contaminantes y permitió la inducción de una edición genómica eficiente y dirigida. Tenga en cuenta que lavar el pellet de ADN con etanol al 70% disuelve el pellet en una solución. Por lo tanto, se utilizó NaCl a una concentración final de 200 mM para precipitar 10 μg de oligos para minimizar el arrastre de sal al tampón de microinyección pronuclear. La inyección de prueba con análisis de blastocisto se intentó utilizando 50 o 25 ng/μL de los oligos donantes con precipitación de etanol. La tasa de éxito de cada afección fue del 76,9% (10 de 13 muestras con 50 ng/μL) y del 25,0% (3 de 12 muestras con 25 ng/μL) (Figura 3A-C). Aunque 50 ng / μL de oligo con precipitación de etanol todavía era algo tóxico, muchos huevos necesitaban ser inyectados, y los recombinantes se produjeron a una alta tasa de éxito. Por lo tanto, 50 ng / μL de los oligos donantes finalmente se inyectaron con precipitación de etanol y se obtuvieron animales fundadores con una tasa de éxito del 50,0% (16 de 32 cachorros tuvieron recombinación, incluidos 21 sobrevivientes y 11 muerte después del nacimiento). Dos de los animales fundadores que tenían transmisión en la línea germinal de mutación uniforme o mutación monoallélica o idéntica con transmisión estable confirmada por secuenciación se utilizaron para establecer líneas independientes. El consenso es que el retrocruzamiento de dos generaciones con animales de tipo salvaje y el uso de la proteína Cas9 de fidelidad mejorada elimina los principales eventos fuera del objetivo. El número de tales eventos no es estadísticamente distinguible de la tasa de fondo de mutaciones de novo 19,20.
Los animales con genotipos no deseados (tipo salvaje o recombinantes inadecuados) utilizados para experimentos y al final del estudio fueron sacrificados por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical de acuerdo con el protocolo IACUC.
Figura 1: Representación esquemática para la orientación génica por CRISPR/Cas9. (A) Las secuencias dirigidas para la recombinación de homólogos. Los aminoácidos de una sola letra se muestran entre las secuencias. Los reflejos de color indican brazo de homología (gris), codón de mutación (verde), secuencia PAM (naranja) y secuencia objetivo de ARNg (azul). La flecha azul indica gRNA. El sitio de restricción de NlaIII está subrayado por una línea punteada. (B) Las secuencias esquemáticas de WT y alelo mutante y oligo donante para la mutación puntual dieron lugar a la mutación M213L. TCC a TCG es una mutación silenciosa para la interrupción de PAM no deseada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Productos esquemáticos de PCR y sitio de restricción de WT y el alelo mutante. (A,B) Esquema de la PCR y la digestión por NlaIII. Los cebadores amplifican los 668 pb de ADN Gja1 alrededor del sitio de mutación. Los productos de PCR del alelo WT fueron digeridos a dos tamaños diferentes por NlaIII. Por el contrario, el alelo mutante NO se digiere y mantiene intactos los productos de PCR. (C) La imagen representativa del gel de agarosa indica WT y alelo mutante. Cada genotipo de ratón tenía un tamaño de banda específico; WT (carril 1, 3 y 5), Het (carril 2) y Hm (carril 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La eficiencia de recombinación en dos dosis diferentes de oligos donantes en la mezcla CRISPR. (A) Resultados de genotipado de mórulas o blastocistos inyectados con diferentes dosis (25 o 50 ng/μL) de oligos donantes que muestran el tipo salvaje (WT; carril #10, 12 y 14), heterocigoto/mosaico (het/mosaico; carril # 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, y 13), homocigotos (hom; carril #4 y 5) o no amplificados (carril #7). El control positivo Wild Type y el H2O como control negativo se cargaron entre el carril # 17 y # 18. (B-D) Los gráficos circulares representan la eficiencia de recombinación de las mezclas CRISPR en dos dosis diferentes de oligos donantes (B, C) y la de los animales fundadores inyectados con 50 ng / μL de oligos donantes (D). Tenga en cuenta que 11 de los 32 animales nacidos fueron asesinados por las madres o murieron antes del destete. Las muestras que no lograron amplificarse en PCR se excluyeron en el cálculo de la eficiencia de recombinación. La tasa de genotipo individual de todas las muestras se indica en la Tabla 3 y la Tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencias | Comentarios | |||
| arncr | 5' AUUCAGAGCGAGAGACACCAGU UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' |
Subrayar indica la secuencia de destino CRSPR | |||
| Adn oligo donar | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTTCT TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCTCTCTCTCTCT GAATATCATTGAGCTCTCCTATGTCTTCTTC 3' |
Subrayar indica codones mutados. El puño 60 pb antes de la mutación TTA y 48 pb después de la mutación TCG son el brazo de homología | |||
| Cebador de genotipado hacia adelante | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| Imprimación de genotipado Inversa | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
Tabla 1: Información de secuencia.
| Componente | Solución de stock | Importe | Concentración final |
| Oligo donante | 1μg/μL en H 2 O libre dearnesa | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| GJA1 crRNA | 1μg/μL en H 2 O libre dearnesa | 0,4 μL | 20 ng/μL |
| arndrómetro | 1μg/μL en H 2 O libre dearnesa | 0,8 μL | 40 ng/μL |
| Proteína eSpCas9 | 1μg/μL en H 2 O libre dearnesa | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| Tampón de inyección libre de RNAse | 0.1 mM EDTA pH 8.0 | 16,8 μL | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.5 | |||
| NaCl de 100 mM | |||
| Volumen total | 20,0 μL |
Tabla 2: Receta de la mezcla CRISPR.
| Carril # (Figura 3) | Donante oligo conc. | Estado | No amplificado | Tipo salvaje | Het/mosaico | Hom | Nota |
| 1 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | Deleción | |||
| 2 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 3 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 4 | 50 ng/μl | Mórula | Hom | ||||
| 5 | 50 ng/μl | Mórula | Hom | ||||
| 6 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | Deleción | |||
| 7 | 50 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 8 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 9 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 10 | 50 ng/μl | Mórula | Tipo salvaje | ||||
| 11 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 12 | 50 ng/μl | Mórula | Tipo salvaje | ||||
| 13 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | Inserción | |||
| 14 | 50 ng/μl | Mórula | Tipo salvaje | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 16 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 17 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 18 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 19 | 25 ng/μl | Mórula | Tipo salvaje | ||||
| 20 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 21 | 25 ng/μl | Mórula | Tipo salvaje | ||||
| 22 | 25 ng/μl | Mórula | Tipo salvaje | ||||
| 23 | 25 ng/μl | Blastocisto | N/A | ||||
| 24 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo salvaje | ||||
| 25 | 25 ng/μl | Blastocisto | Het/mosaico | ||||
| 26 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo salvaje | ||||
| 27 | 25 ng/μl | Blastocisto | N/A | ||||
| 28 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo salvaje | ||||
| 29 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo salvaje | ||||
| 30 | 25 ng/μl | Blastocisto | Het/mosaico | Inserción/eliminación | |||
| 31 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo salvaje | ||||
| 32 | 25 ng/μl | Blastocisto | Het/mosaico | Inserción | |||
| 33 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo salvaje | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
Tabla 3: Resultados de genotipado de mórula y blastocisto.
| Animal # | Donante oligo conc. | Estado | No amplificado | Tipo salvaje | Het/mosaico | Hom | Nota |
| d1 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Tipo salvaje | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Het/mosaico | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Het/mosaico | Deleción | |||
| d4 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Tipo salvaje | ||||
| d5 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Het/mosaico | ||||
| d6 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Tipo salvaje | ||||
| d7 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Het/mosaico | ||||
| d8 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Het/mosaico | ||||
| 34 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | ||||
| 35 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 36 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 37 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | utilizado como línea independiente | |||
| 38 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 39 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 40 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 41 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | ||||
| 42 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 43 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 44 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 45 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| d1 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Hom | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Tipo salvaje | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Cachorro muerto | Het/mosaico | ||||
| 46 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | ||||
| 47 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | Inserción | |||
| 48 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | Inserción | |||
| 49 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | ||||
| 50 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 51 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | utilizado como línea independiente | |||
| 52 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 53 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Het/mosaico | Inserción/eliminación | |||
| 54 | 50 ng/μl | Cachorro vivo | Tipo salvaje | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
Tabla 4: Resultados de genotipado de animales fundadores.
Video 1: Inyección crispr a los embriones. La mezcla CRISPR se inyecta en embriones en estadio de 1 célula descritos en el paso 2.4. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Los blastocistos se recogen. El video representativo que muestra los blastocistos se recoge en el paso 2.6. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Un modelo de ratón modificado genéticamente es un enfoque común para comprender la función del gen. Sin embargo, dado que la isoforma traducida internamente GJA1-20k se traduce del mismo ARNm Gja1 que cx43 de longitud completa, se ideó una estrategia creativa para retener la expresión de Cx43 de longitud completa y suprimir la expresión de GJA1-20k. El enfoque se basa en una mutación del codón de inicio interno de GJA1-20k. Con una mutación de un solo punto, M213 se cambió a L en el ARNm de Gja1 , que logró suprimir la expresión de GJA1-20k, pero conservó la expresión de Cx43 de longitud completa4.
Sin embargo, la mutación puntual de un único sitio de inicio de traducción interna presentó otra dificultad: determinar los genotipos de ratón. Una sola sustitución de residuos es demasiado pequeña para hacer cebadores específicos. Además, los alelos WT y mutación tienen pares de bases idénticos. Se agregó un paso más al protocolo de genotipado para resolver estos problemas. Dado que el codón de inicio de GJA1-20k (sitio de mutación dirigido) es reconocido por la enzima de restricción, NlaIII, el sitio no reconocido por NlaIII fue mutado (Figura 1; CATG a CTTA). Además, se diseñaron los cebadores para generar un producto de PCR que no tiene ningún otro sitio apropiado para NlaIII. Se estableció un protocolo de genotipado adecuado para la línea de ratón mutada en puntos agregando el paso de digestión enzimática con la enzima de restricción. Generalmente, la digestión enzimática se realiza mediante incubación a corto plazo (0,5-2,0 h a 37 °C); Se recomienda la incubación durante la noche (~ 16 h) para digerir completamente todo el producto de PCR. La introducción de la mutación en la secuencia diana da lugar al reconocimiento erróneo entre WT y los alelos mutantes. Por lo tanto, se recomienda la incubación durante la noche para una digestión suficiente en este protocolo a menos que la enzima de restricción de elección tenga la actividad estelar21.
El proyecto actual tenía como objetivo interrumpir el segundo sitio de iniciación de la traducción alterando ATG (Metionina) a TTA (Leucina). El NlaIII es una enzima de restricción conveniente para la detección rápida, ya que reconoce catg en el sitio de destino. La citosina (C) a menudo se asocia con la secuencia KOZAK inmediatamente antes del sitio de inicio de la traducción. El NcoI (C/CATGG) y el NdeI (CA/TATG) son otras enzimas de restricción versátiles para el cribado en esta región si es necesario utilizar codones alternativos para la creación/eliminación de esos sitios de restricción. Si la introducción de mutaciones silenciosas no es permisiva para el cribado basado en el sitio de restricción, se necesita la secuenciación de muestras individuales22,23. En este proyecto, la recombinación dirigida fue bastante eficiente.
Esta línea de ratón mutante M213L nos permite analizar la función de GJA1-20k. Recientemente, utilizando esta línea de ratón, se identificó que GJA1-20k es esencial para el tráfico y la formación de uniones de brecha Cx43 de longitud completa en el corazón4. Curiosamente, la mutación homocigota M213L (Gja1M213L/M213L), debido a que no puede generar GJA1-20k, siempre resulta en muerte súbita 2-4 semanas después del nacimiento porque los respectivos corazones no forman uniones de brecha en el disco intercalado cardíaco. En contraste, una mutación heterocigota M213L revela una función cardíaca cercana a la normal, y los ratones tienen una vida útil similar a la de los animales WT4. Estudios in vitro previos también han demostrado que la mutación M213L interrumpe la formación adecuada de la unión de la brecha1. Además, esta interrupción de la unión de la brecha es rescatada por la transfección exógena GJA1-20k. Sobre la base de la formación normal de la unión de brecha en el corazón de ratón heterocigoto mutante M213L bajo condición basal4 y el estudio in vitro 1, se puede concluir que Cx43 de longitud completa con mutación M213L mantiene la función adecuada como una proteína de unión de brecha.
Además del papel esencial de GJA1-20k en el tráfico de Cx43, GJA1-20k enriquece la membrana externa mitocondrial, induciendo la fisión mitocondrial protectora y la biogénesis 3,24,25. En términos de función mitocondrial, los ratones con mutación heterocigota de GJA1-20k (Gja1M213L / WT) tienen una sensibilidad extrema a la lesión por isquemia / reperfusión. Cuando se exponen a isquemia/reperfusión, los ratones adultosGja1 M213L/WT tienen un tamaño de infarto mucho mayor y mitocondrias más alteradas que sus contrapartes WT25.
En resumen, la nueva línea de ratón que contiene la mutación M213L es útil para el análisis de GJA1-20k traducido internamente. Cabe señalar que tanto el Cx43 de longitud completa como el GJA1-20k más pequeño se expresan en todos los sistemas de órganos de mamíferos. Se espera que los estudios futuros también exploren el papel del GJA1-20k extracardíaco.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01HL152691, R01HL138577 y R01HL159983) a RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine.
- Mayer, H.
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
