Summary
O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.
Abstract
O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9, baseado em mecanismos de reparação de genomas, permite a geração de modelos de camundongos modificados por genes de forma mais rápida e fácil em relação à recombinação homologous tradicional. O sistema CRISPR-Cas9 é particularmente atraente quando uma mutação de um ponto é desejada. A proteína de junção de lacunas, Connexin 43 (Cx43), é codificada pelo gene Gja1, que tem um único exon de codificação e não pode ser emendado. No entanto, Gja1 produz não apenas proteína Cx43 de comprimento completo, mas até seis isoformas truncados N-terminus por um processo conhecido como tradução interna, o resultado da iniciação da tradução ribossômica em locais de partida internos de AUG (Methionine). GJA1-20k é o isóforme truncado mais comumente gerado do Cx43 iniciado no codon AUG na posição 213 de Gja1 mRNA. Como o resíduo 213 ocorre no final do último domínio transmembrano de Cx43, GJA1-20k é efetivamente a cauda C-terminus de 20 kDa C de Cx43 como uma proteína independente. Investigadores anteriores identificaram, em células, que um papel crítico do GJA1-20k é facilitar o tráfico de hemicanais de junção de lacunas Cx43 de comprimento completo à membrana plasmática. Para examinar esse fenômeno in vivo, foi gerado um rato mutante com mutação de ponto Gja1 que substitui o ATG (Methionine) no resíduo 213 por TTA (leucemia, mutação M213L). O resultado do M213L é que Gja1 mRNA e Cx43 de comprimento completo ainda são gerados, mas a tradução de Gja1-20k é significativamente reduzida. Este relatório se concentra na escolha do local da enzima de restrição para desenvolver um modelo de mouse de um aminoácido mutado (Gja1M213L/M213L). Este protocolo descreve camundongos geneticamente modificados pelo sistema CRISPR-Cas9 e genotipagem rápida combinando tratamentos de PCR e enzimas de restrição.
Introduction
O Connexin 43 (Cx43) e o isoforme truncado N-terminus, GJA1-20k, codificados pelo mesmo GJA1 mRNA, mas utilizam códons de início diferentes1 para iniciar a tradução. A tradução Cx43 ocorre no primeiro códon de início de AUG, enquanto a tradução GJA1-20k inicia-se no AUG no resíduo 213. Foi previamente constatado que o GJA1-20k tem funções essenciais para o tráfico de Cx43 em comprimento total, estabilização de actin e regulação da morfologia mitocondrial in vitro 1,2,3.
Para entender o papel do GJA1-20k in vivo, foi gerado um modelo de mouse "knock-out" GJA1-20k que manteve a capacidade de criar Cx43 de comprimento completo. A abordagem foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para substituir o resíduo único em 213 de uma methionina (M) a uma leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Uma mutação interna de M a L diminui drasticamente a probabilidade de a tradução interna ocorrer, mas mantém a tradução e a função da proteína de comprimento total4. Como o tipo selvagem (WT) e o alelo mutado têm tamanhos idênticos e produtos mRNA quase idênticos, há uma dificuldade considerável em confirmar genótipo nos camundongos. O sequenciamento de DNA pode identificar a mutação, mas é muito caro e demorado para uso rotineiro. Em geral, vários métodos de genotipagem mais rápido foram estabelecidos, como reação de cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR), minisequenciamento-ligation, análise de fusão de alta resolução e sistema de mutação refratário tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. No entanto, esses métodos alternativos requerem múltiplas etapas, recursos exclusivos e/ou vários conjuntos de primer específicos que podem induzir produtos PCR não específicos.
Este protocolo introduz uma abordagem detalhada de segmentação e edição de genes pelo CRISPR-Cas9 para criar uma única mutação de aminoácidos, e genotipagem rápida é apresentada para confirmar a mutação. A identificação do genótipo envolve o uso criativo de enzimas de restrição utilizando apenas um único conjunto de primers para identificar o gene alvo. Os leitores são encaminhados à Referência4 para observar o profundo efeito eletrofisiológico da morte cardíaca súbita causada por uma mutação de substituição Gja1M213L/M213L que ainda gera proteína de comprimento total e não consegue gerar uma isoforma de truncação ingenuamente traduzida internamente menor. Este protocolo ajudará a fazer com que outros modelos de camundongos usem uma mutação pontual para diminuir a tradução interna de uma isoforme de interesse, mantendo a expressão da proteína endógena de comprimento total.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os protocolos de cuidados e estudos para animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Cedars-Sinai Medical Center e da Universidade de Utah. Camundongos fêmeas C57BL/6J obtidos de fontes comerciais com 8-9 semanas de idade (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para os experimentos.
1. Preparação para direcionamento genético
- Selecione a sequência de destino guia em torno do site de mutação alvo codificando M213 usando o algoritmo web CRISPOR 4,9,10 (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Uma sequência de guia de 20 bases (ATTCAGAGCGAGACACCA), no fio oposto da sequência de codificação GJA1, com uma pontuação do MIT11 de 62 foi selecionada na qual o potencial local de decote está localizado após 16 bases a jusante do códon a ser mutado (ATG) (Figura 1; toda a sequência de crRNA é mostrada na Tabela 1). - Sintetizar o crRNA e tracrRNA que interagem com o Cas9 como guia RNA12.
NOTA: Embora a pontuação do MIT do RNA guia seja de 62, há apenas uma mutação potencial fora do alvo com quatro incompatibilidades a mais de 12 bases do PAM. Portanto, este guia RNA é considerado seguro. - Projetar um oligo doador complementar à sequência guia para introduzir uma única substituição de aminoácido (ATG para TTA; M213L) com 60 e 48 bases de armas de ílogo nos lados de 5'e 3', respectivamente.
NOTA: Este oligo doador inclui uma mutação pontual para interrupção do PAM (AGG to ACG) introduzindo uma mutação silenciosa (TCC to TCG; S217S) para evitar a reeditação após o reparo direcionado à bralogia crispr (HDR)13 para a introdução das mutações pretendidas (Figura 1 e Tabela 1). - Use NaCl (concentração final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar o transporte de sal em tampão de microinjeção pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM de EDTA, e 100 mM de NaCl sem espermatozoide e espermidina14).
NOTA: Não lave a pelota de DNA com 70% de etanol, pois a pelota pode ser dissolvida na solução. - Misture 50 ng/μL de oligo doador, 60 ng/μL de mistura de crRNA/tracrRNA (razão molar 1:1) (a partir da etapa 1,2) e 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabela de Materiais) para fazer mistura CRISPR no volume final 20 μL (Tabela 2). Diminua a concentração do oligo doador se for observada alta toxicidade (por exemplo, 25 ng/μL).
2. Indução de superovulação, colheita de ovos, microinjeção pronuclear de mistura CRISPR e triagem de blastocisto
NOTA: Este procedimento segue um protocolo geral publicado anteriormente14.
- Injete 5 UI de PMSG (gonadotropina soro da égua grávida) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril a 5-10 camundongos com 8 semanas de idade por uma abordagem intraperitoneal por volta das 3:00 p.m. (dia 1).
- Injete 5 UI de hCG (gonadotropina coriônica humana) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril aos doadores de óvulos por uma abordagem intraperitoneal 46-48 h após a injeção de PMSG (dia 3). Configurar 1:1 reprodução com machos garanhão.
- Colher ovos fertilizados em m2 médio com hialuronidase, lavar três vezes em 100 μL de m2 médio por volta das 10:00 a.m., em seguida, manter em mWM15 ou KSOM16 médio (dia 4) (ver Tabela de Materiais).
- Introduza a mistura CRISPR (passo 1.3) em embriões de estágio 1 colhidos dos camundongos pela microinjeção pronuclear14 em 100 μL de M2 coberto com óleo de parafina em um prato plástico em um microscópio invertido com uma óptica que melhora o contraste no início da tarde (Vídeo 1).
NOTA: A microinjeção pronuclear da mistura CRISPR foi realizada em embriões de estágio de 1 células em 14-16 h póscoitum (p.c.). Os embriões injetados foram cultivados em uma incubadora de CO2 de 5% por algumas horas e transferidos cirurgicamente a 18-20 h p.c. para camundongos receptores ICR que tinham um plugue de copulação na mesma manhã. - Transfira 20-30 embriões de 2 células para cada receptor para produzir animais recombinantes.
NOTA: Siga o protocolo geral14 ou cultue os embriões no mWM ou no meio KSOM por 4 dias para validar a eficiência e examinar a toxicidade. A toxicidade da mistura CRISPR é aceitável quando pelo menos um terço dos embriões injetados chegam cedo ao estágio blastocisto totalmente expandido com múltiplos recombinantes entre eles. Ao mesmo tempo, mais de 90% dos embriões não domesticados atingem o mesmo estágio blastocisto em uma cultura paralela. Siga o passo 2.6-2.9 para a triagem do blastcyst que não é essencial, mas pode ser feito se preferir quantificar a taxa de sucesso do HDR. - Captar individualmente blastocistos totalmente expandidos com 2 μL de meio de cultura usando uma ponta de pipeta fina plugada com uma micropipetter em tubos PCR únicos (dia 8; Vídeo 2).
- Blastocistos de lyse em 8 μL de mistura de digestão (mesmo que passo 3.2; ver Tabela de Materiais) e processo a 75 °C por 10 min, 95 °C por 5 min, depois esfrie até 4 °C para armazenamento. Use 2 μL do lysate como modelo para PCR em uma mistura total de 15 μL PCR (passo 3).
- Examine a eficácia do HDR por eletroforese de gel agarose17 das amostras pcr após a digestão de restrição com NlaIII (passo 3-5).
- Confirme o estado da recombinação direcionada sequenciando o amplicon17 de 668 bp nos fundadores e prole subsequente para confirmar a integridade da mutação.
3. Extração de DNA
NOTA: Camundongos no pós-natal dia 10 foram usados para este experimento devido à morte súbita do rato nocaute GJA1-20k cerca de 2-4 semanas após o nascimento4. Um protocolo mais geral também pode ser aplicado após o relatório publicado anteriormente18.
- Corte 1-3 mm do dedo do dedo ou da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de 0,2 mL de 8 Tiras. Para evitar contaminação entre as amostras do dedo do pé ou da cauda, use uma tesoura pré-limpa ou uma lâmina por mouse ou limpe antes de cada amostra usando 70% de etanol ou 10% de alvejante. Se a cauda sangrar após a amostragem, aplique uma breve pressão com gaze para parar o sangramento. Armazene as amostras da cauda a -20 °C até a extração por até cerca de uma semana.
- Adicione a solução de lise tecidual (ver Tabela de Materiais) em um tubo de 100 μL/e misture bem, seguido de spin-down com uma minicentrífuda de mesa (2.200 x g para 10 s à temperatura ambiente). Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução.
- Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa a seguir; 75 °C para 10 min (lise tecidual), 95 °C para 5 min (inativação) e 4 °C (segurando). Armazene o tecido a 4 °C por até uma semana se os PCRs não puderem ser realizados imediatamente.
4. Amplificação de DNA por PCR
- Prepare uma solução PCR contendo 5 μL de H2O sem nuclease, 0,75 μL de 10 μM para frente e primers invertidos e 7,5 μL de mix mestre PCR (ver Tabela de Materiais) por amostra em novo tubo PCR (ver Tabela 1 para sequências de primer). Se houver várias amostras, dimensione o conteúdo para alíquota de 14 μL por tubo.
- Adicione 1 μL do tecido à solução PCR preparada na etapa 3.1. Tenha cuidado para não tocar na cauda.
- Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).
- Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene os produtos PCR a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C.
NOTA: 95 °C por 3 min (etapa 1, Denaturação inicial), 95 °C para 15 s (etapa 2, Denaturação), 60 °C para 15 s (etapa 2, Annealing), 72 °C para 45 s (etapa 2, Extensão), repetição do passo 2 para 35 ciclos, 72 °C para 10 min (etapa 3, Extensão Final) e 4 °C (etapa 4, Holding).
5. Incubação com enzima de restrição
- Prepare a solução enzimápica contendo 7 μL de H2O sem nuclease, 2 μL de tampão CutSmart de 10x e 1 μL de enzima de restrição NlaIII (ver Tabela de Materiais). Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 μL por tubo.
- Adicione 10 μL de produto PCR obtido na etapa 3 à solução enzimápica por tubo.
- Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).
- Coloque os tubos em um cicloviário térmico ou bloco de calor definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene o produto após a incubação a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C.
NOTA: 37 °C para 16 h (pelo menos 2 h; tempo curto de incubação pode resultar em decote insuficiente) e 4 °C para realização.
6. Detecção de banda de DNA
- Prepare um gel de 1,5% de agarose contendo mancha de gel de DNA para eletroforese.
- Adicione 0,75 g de agarose em 50 mL de tampão TAE 1x seguido de mistura e calor no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente. Depois de esfriar, adicione 5 μL de mancha de DNA e misture suavemente.
- Despeje no molde de gel (25 mL por molde) e deixe o gel solidificar. Para obter melhor resolução e separação, aumente a concentração de ágarose para 2,5%-4% conforme necessário.
- Carregue 10 μL do produto PCR digerido até o poço. Misture 6x tampão de carregamento, se necessário.
- Execute o gel com 100 V por 35 min.
NOTA: Esses parâmetros podem precisar de otimização. - Imagem sob luz UV (comprimento de onda de 302 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 produz uma mutação ATG para TTA e uma mutação silenciosa de TCC para TCG entre 56.264.279 a 56.264.281 e de 56.264.291 a 56.264.293 no cromossomo do rato 10, ou em 869 a 871 e 881 a 883 em Gja1 mRNA, respectivamente. Essa mutação resulta em uma mutação de Methionina 213 a Leucina (M213L) na proteína GJA1 e a mutação TTC para TTG interrompe uma sequência PAM próxima para evitar edição genética indesejada (Figura 1). Os detalhes da mutação estão descritos em um relatório anterior4.
Para analisar genótipos adequados, os produtos PCR precisam ser digeridos por restrição da enzima "NlaIII" antes da eletroforese de gel agarose (Figura 2, passo 4). Como mostrado na Figura 2A, os produtos PCR de alelo tipo selvagem (WT) serão cortados em dois produtos diferentes de par de base (227 bp e 441 bp). Em contrapartida, os produtos PCR de alelos mutantes estarão intactos (668 bp) devido à falta de local de reconhecimento NlaIII por mutação (Figura 2B). A eletroforese geral agarose pode ser realizada utilizando os produtos PCR digeridos (etapa 5). Bandas específicas no gel de agarose indicam cada genótipo (WT, tipo selvagem; Het, heterozigos; Hm, homozigos). Devido à restrição mencionada acima, cada genótipo resulta em várias faixas de tamanhos diferentes (Figura 2C). As bandas serão duas bandas em WT (227 bp e 441 bp), três bandas em Het (227 bp, 441 bp e 668 bp), e uma banda em Hm (668 bp), respectivamente. De acordo com a imagem em gel usando uma única enzima de restrição, genótipos adequados dos camundongos podem ser distinguidos.
Em nosso experimento, foram inicialmente produzidos 21 fundadores, dos quais nove eram animais heterozigosos ou mosaicos. Dois dos nove fundadores morreram antes de crescer em idade de reprodução, provavelmente devido ao mosaico de alto teor de células somáticas mutantes bi-alólicas. Duas linhas mutantes independentes foram posteriormente estabelecidas a partir dos sete fundadores restantes, cruzando para ratos C57BL/6J do tipo selvagem por pelo menos duas gerações. Como a mutação alvo é letal quando homozigosa, tivemos que manter a linha como heterozigous para diluir ainda mais possíveis mutações fora do alvo. Animais experimentais homozigos foram produzidos intercrossing gerações subsequentes.
Vale ressaltar que a toxicidade embrionária relativamente alta com os oligos doadores a 50 ng/μL foi experimentada para injeção dos oligos doadores nos embriões. No entanto, uma concentração de doadores de 12,5 ng/μL não induziu a recombinação direcionada nos filhotes resultantes. Além disso, verificou-se que a precipitação adicional de etanol dos oligos ajudou a remover contaminantes e permitiu a indução de edição eficiente e direcionada do genoma. Note que lavar a pelota de DNA com 70% de etanol dissolve a pelota em uma solução. Portanto, a NaCl foi usada na concentração final de 200 mM para precipitar 10 μg de oligos para minimizar a transporte de sal no tampão de microinjeção pronuclear. A injeção de teste com análise de blastocisto foi tentada utilizando-se 50 ou 25 ng/μL dos oligos doadores com precipitação de etanol. A taxa de sucesso de cada condição foi de 76,9% (10 de 13 amostras com 50 ng/μL) e 25,0% (3 de 12 amostras com 25 ng/μL) (Figura 3A-C). Embora 50 ng/μL de oligo com precipitação de etanol ainda fosse um pouco tóxico, muitos ovos precisavam ser injetados, e recombinantes eram produzidos a uma alta taxa de sucesso. Portanto, 50 ng/μL dos oligos doadores foram finalmente injetados com precipitação de etanol e obtiveram animais fundadores com uma taxa de sucesso de 50,0% (16 dos 32 filhotes tiveram recombinação, incluindo 21 sobreviventes e 11 mortes após o nascimento). Dois dos animais fundadores que tiveram transmissão germinal de mutação uniforme ou mutação monoallélica ou idêntica com transmissão estável confirmada por sequenciamento foram utilizados para estabelecer linhas independentes. O consenso é que cruzar duas gerações com animais do tipo selvagem e usar proteína Cas9 de maior fidelidade elimina grandes eventos fora de segmentação. O número desses eventos não é estatisticamente distinguível da taxa de fundo de mutações de novo 19,20.
Animais com genótipos indesejados (tipo selvagem ou recombinantes inadequados) utilizados para experimentos e, na conclusão do estudo, foram eutanizados por inalação de CO2 seguida de deslocamento cervical de acordo com o protocolo iACUC.
Figura 1: Representação esquemática para o direcionamento genético por CRISPR/Cas9. (A) As sequências direcionadas para recombinação de homólogos. Aminoácidos de letra única são mostrados entre as sequências. Os destaques coloridos indicam braço de ecologia (Cinza), codon de mutação (Verde), sequência PAM (Laranja) e sequência de alvo gRNA (Azul). A seta azul indica gRNA. O local de restrição NlaIII é sublinhado por linha pontilhada. (B) As sequências esquemáticas de WT e alelo mutante e oligo doador para a mutação de ponto resultou em mutação M213L. TCC para TCG é uma mutação silenciosa para interrupção de PAM indesejado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Produtos pcr esquemáticos e local de restrição de WT e o alelo mutante. (A,B) Esquema do PCR e digestão por NlaIII. Os primers amplificam a 668 bp de DNA Gja1 em torno do local da mutação. Os produtos WT allele PCR foram digeridos em dois tamanhos diferentes pela NlaIII. Em contraste, o alelo mutante NÃO é digerido e mantém produtos PCR intactos. (C) A imagem representativa do gel de agarose indica WT e alelo mutante. Cada genótipo de rato tinha um tamanho de banda específico; WT (pista 1, 3 e 5), Het (pista 2) e Hm (pista 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A eficiência de recombinação em duas doses diferentes de oligos doadores na mistura CRISPR. (A) Resultados genotipados de morulas ou blastocistos injetados com doses diferentes (25 ou 50 ng/μL) de oligos doadores mostrando o tipo selvagem (WT; pista #10, 12 e 14), heterozigous/mosaico (het/mosaico; pista nº 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, e 13), homozigos (hom; faixa #4 e 5) ou não amplificado (pista #7). Controle positivo wild type e H2O como controle negativo foram carregados entre a faixa #17 e #18. (B-D) Os gráficos de tortas representam a eficiência de recombinação das misturas CRISPR em duas doses diferentes de oligos doadores (B,C) e os animais fundadores injetados com 50 ng/μL de oligos doadores (D). Note que 11 dos 32 animais nascidos foram mortos pelas mães ou morreram antes do desmamar. Amostras que não conseguiram amplificar em PCR foram excluídas no cálculo da eficiência de recombinação. A taxa de genótipo individual de todas as amostras está indicada na Tabela 3 e Tabela 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Seqüências | Comentários | |||
| crRNA | 5' AUUCAGAGAGAGACACCAGU UUUAGAGCUAUGCUUUUG 3' |
Sublinhado indica sequência de alvos do CRSPR | |||
| Oligo donar DNA | CCCCACCAGGTGGTGGCTCTCCTCTCACG DE 5' TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCTTCTTCTCTCTTCTCT TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT GAATATCATTGAGCTCTTCTATGTCTTCTTC 3' |
Sublinhar indica códons mutantes. Punho 60 bp antes mutação TTA e 48 bp após mutação TCG são braço de ecologia | |||
| Primer genotipagem para a frente | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| Primer genotipado reverso | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
Tabela 1: Informações de sequência.
| Componente | Solução de estoque | Quantidade | Concentração Final |
| Oligo doador | 1μg/μL em H2O sem Rnase | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| CRRNA GJA1 | 1μg/μL em H2O sem Rnase | 0,4 μL | 20 ng/μL |
| tracrRNA | 1μg/μL em H2O sem Rnase | 0,8 μL | 40 ng/μL |
| proteína eSpCas9 | 1μg/μL em H2O sem Rnase | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| Tampão de injeção sem RNAse | 0,1 mM EDTA pH 8.0 | 16,8 μL | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.5 | |||
| 100 mM NaCl | |||
| Volume total | 20,0 μL |
Tabela 2: Receita da mistura CRISPR.
| Pista # (Figura 3) | Doador oligo conc. | Estado | Não amplificado | Tipo selvagem | Het/mosaico | Hom | Nota |
| 1 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | Deleção | |||
| 2 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 3 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 4 | 50 ng/μl | Mórula | Hom | ||||
| 5 | 50 ng/μl | Mórula | Hom | ||||
| 6 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | Deleção | |||
| 7 | 50 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 8 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 9 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 10 | 50 ng/μl | Mórula | Tipo selvagem | ||||
| 11 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | ||||
| 12 | 50 ng/μl | Mórula | Tipo selvagem | ||||
| 13 | 50 ng/μl | Mórula | Het/mosaico | Inserção | |||
| 14 | 50 ng/μl | Mórula | Tipo selvagem | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 16 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 17 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 18 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 19 | 25 ng/μl | Mórula | Tipo selvagem | ||||
| 20 | 25 ng/μl | Mórula | N/A | ||||
| 21 | 25 ng/μl | Mórula | Tipo selvagem | ||||
| 22 | 25 ng/μl | Mórula | Tipo selvagem | ||||
| 23 | 25 ng/μl | Blastocisto | N/A | ||||
| 24 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo selvagem | ||||
| 25 | 25 ng/μl | Blastocisto | Het/mosaico | ||||
| 26 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo selvagem | ||||
| 27 | 25 ng/μl | Blastocisto | N/A | ||||
| 28 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo selvagem | ||||
| 29 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo selvagem | ||||
| 30 | 25 ng/μl | Blastocisto | Het/mosaico | Inserção/exclusão | |||
| 31 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo selvagem | ||||
| 32 | 25 ng/μl | Blastocisto | Het/mosaico | Inserção | |||
| 33 | 25 ng/μl | Blastocisto | Tipo selvagem | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
Tabela 3: Resultados genotipagem de Morula e Blastocyst.
| Animal # | Doador oligo conc. | Estado | Não amplificado | Tipo selvagem | Het/mosaico | Hom | Nota |
| d1 | 50 ng/μl | Filhote morto | Tipo selvagem | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Filhote morto | Het/mosaico | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Filhote morto | Het/mosaico | Deleção | |||
| d4 | 50 ng/μl | Filhote morto | Tipo selvagem | ||||
| d5 | 50 ng/μl | Filhote morto | Het/mosaico | ||||
| d6 | 50 ng/μl | Filhote morto | Tipo selvagem | ||||
| d7 | 50 ng/μl | Filhote morto | Het/mosaico | ||||
| d8 | 50 ng/μl | Filhote morto | Het/mosaico | ||||
| 34 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | ||||
| 35 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 36 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 37 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | usado como linha independente | |||
| 38 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 39 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 40 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 41 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | ||||
| 42 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 43 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 44 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 45 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| d1 | 50 ng/μl | Filhote morto | Hom | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Filhote morto | Tipo selvagem | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Filhote morto | Het/mosaico | ||||
| 46 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | ||||
| 47 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | Inserção | |||
| 48 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | Inserção | |||
| 49 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | ||||
| 50 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 51 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | usado como linha independente | |||
| 52 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 53 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Het/mosaico | Inserção/exclusão | |||
| 54 | 50 ng/μl | Filhote vivo | Tipo selvagem | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
Tabela 4: Resultados genotipagem de animais fundadores.
Vídeo 1: Injeção CRISPR nos embriões. A mistura CRISPR é injetada em embriões de estágio de 1 célula descritos na etapa 2.4. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Blastocistos captam. O vídeo representativo mostrando blastocistos pega na etapa 2.6. Clique aqui para baixar este vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um modelo de rato modificado por genes é uma abordagem comum para entender a função genética. No entanto, uma vez que o isoform traduzido internamente GJA1-20k é traduzido do mesmo Gja1 mRNA como Cx43 de comprimento completo, uma estratégia criativa foi concebida para manter a expressão Cx43 de comprimento completo, mas suprimir a expressão GJA1-20k. A abordagem é baseada em uma mutação do códon inicial interno de GJA1-20k. Com uma mutação de um único ponto, M213 foi trocado para L em Gja1 mRNA, que conseguiu suprimir a expressão GJA1-20k, mas manteve a expressão Cx43 de comprimento completo4.
No entanto, a mutação pontual de um único site inicial de tradução interna apresentou outra dificuldade: determinar os genótipos do mouse. Uma única substituição de resíduo é muito pequena para fazer primers específicos. Além disso, os alelos de WT e mutação têm pares de base idênticos. Mais um passo foi adicionado ao protocolo de genotipagem para resolver esses problemas. Uma vez que o codon inicial do GJA1-20k (local de mutação direcionado) é reconhecido pela enzima de restrição, NlaIII, o local a não ser reconhecido pelo NlaII foi mutado (Figura 1; CATG para CTTA). Além disso, foram projetados os primers para gerar um produto PCR que não tenha nenhum outro local apropriado para o NlaIII. Um protocolo adequado de genotipagem foi estabelecido para a linha do rato com mutação pontual adicionando a etapa de digestão da enzima com a enzima de restrição. Geralmente, a digestão enzimápica é feita por incubação de curto prazo (0,5-2,0 h a 37 °C); a incubação noturna (~16 h) é recomendada para digerir completamente todo o produto PCR. A introdução da mutação na sequência de alvo resulta no erro de reconhecimento entre os alelos mutantes e WT. Portanto, a incubação noturna para digestão suficiente neste protocolo é recomendada a menos que a enzima de restrição de escolha tenha a atividade estelar21.
O projeto atual visava interromper o segundo local de iniciação da tradução alterando o ATG (Methionine) para TTA (Leucine). O NlaIII é uma enzima de restrição conveniente para triagem rápida, pois reconhece o CATG no local de segmentação. A citosina (C) é frequentemente associada à sequência KOZAK imediatamente antes do local de iniciação da tradução. O NCOI (C/CATGG) e o NdeI (CA/TATG) são outras enzimas de restrição versátils para triagem nesta região se forem necessários códons alternativos para a criação/exclusão desses locais de restrição. Se a introdução de mutações silenciosas não for permissiva para a triagem baseada no local de restrição, é necessário sequenciamento de amostras individuais22,23. Neste projeto, a recombinação direcionada foi bastante eficiente.
Esta linha de mouse mutante M213L nos permite analisar a função de GJA1-20k. Recentemente, usando esta linha de mouse, identificou-se que a GJA1-20k é essencial para o tráfico e formação de junções de abertura Cx43 de comprimento completo no coração4. Curiosamente, a mutação homozigosa M213L (Gja1M213L/M213L), porque não pode gerar GJA1-20k, sempre resulta em morte súbita 2-4 semanas após o nascimento porque os respectivos corações não formam junções de lacunas no disco intercalado cardíaco. Em contraste, uma mutação heterozygous M213L revela uma função cardíaca próxima à normal, e os camundongos têm uma vida útil semelhante à dos animais WT4. Estudo in vitro anterior também mostrou que a mutação M213L interrompe a formação adequada de junção de lacunas1. Além disso, essa interrupção da junção é resgatada pela exógena transfecção GJA1-20k. Com base na formação normal de junção de lacunas no coração de camundongo mutante M213L heterozigos sob condição basal4 e no estudo in vitro 1, pode-se concluir que cx43 de comprimento completo com mutação M213L mantém a função adequada como uma proteína de junção de lacunas.
Além do papel essencial do GJA1-20k no tráfico de Cx43, o GJA1-20k enriquece a membrana externa mitocondrial, induzindo fissão mitocondrial protetora e biogênese 3,24,25. Em termos de função mitocondrial, camundongos com mutação heterozigous de GJA1-20k (Gja1M213L/WT) têm extrema sensibilidade à lesão de isquemia/reperfusão. Quando expostos à isquemia/reperfusão, os camundongos Gja1M213L/WT adultos têm um tamanho infarto muito maior e mitocôndrias mais interrompidas do que seus homólogosWT 25.
Em resumo, a nova linha de mouse contendo a mutação M213L é útil para a análise de GJA1-20k traduzido internamente. Deve-se notar que tanto o Cx43 de comprimento completo quanto o menor GJA1-20k são expressos em todos os sistemas de órgãos de mamíferos. Espera-se que estudos futuros explorem o papel do extracardiac GJA1-20k também.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL152691, R01HL138577 e R01HL159983) à RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine. Keep off-target effects in focus. Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).
- Mayer, H. Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease. FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
