Summary
Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.
Abstract
Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ermöglicht eine markierungsfreie Abbildung des biologischen Gewebes in seiner natürlichen Mikroumgebung auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungen und ist somit ein perfektes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung biologischer Prozesse bei subzellulärer Auflösung. Durch die Integration der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzbildgebung (TPEF) in das SRS-Mikroskop kann die dual-modale In-vivo-Bildgebung von Geweben kritische biochemische und biophysikalische Informationen aus mehreren Perspektiven erfassen, die helfen, die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau usw. beteiligt sind. In diesem Videoprotokoll wird der Aufbau eines TPEF-SRS-Mikroskopsystems sowie das in vivo bildgebende Verfahren des tierischen Rückenmarks vorgestellt. Das Rückenmark spielt als Teil des zentralen Nervensystems eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem peripheren Nervensystem. Myelinscheide, die reich an Phospholipiden ist, umgibt und isoliert das Axon, um eine salzige Leitung von Aktionspotentialen zu ermöglichen. Die In-vivo-Bildgebung von Myelinscheiden im Rückenmark ist wichtig, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt auch die Tierpräparation und in vivo TPEF-SRS-Bildgebungsverfahren zur Aufnahme hochauflösender biologischer Bilder.
Introduction
Die Raman-Mikroskopie1,2 entwickelt sich zu einer leistungsstarken markierungsfreien Methode, um biologisches Gewebe basierend auf den charakteristischen Frequenzen verschiedener chemischer Bindungen in Biomolekülen abzubilden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven und gut adaptiven Bildgebungsfähigkeit wurde die Raman-Mikroskopie häufig für die Bildgebung von lipidangereicherten Komponenten in biologischen Geweben wie Myelinscheide3,4,5, Adipozyten6,7 und Lipidtröpfchen eingesetzt8,9,10 . Das Signal der stimulierten Raman-Streuung (SRS), das als stimulierter Raman-Gewinn (SRG) oder stimulierter Raman-Verlust (SRL) erfasst wird, ist hintergrundfrei und zeigt eine perfekte spektrale Ähnlichkeit mit spontaner Raman-Streuung11,12. Darüber hinaus sind SRL und SRG linear von der Analytkonzentration abhängig, was eine quantitative Analyse der biochemischen Komponenten ermöglicht9,11,13. Die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (TPEF) wurde aufgrund ihrer inhärenten optischen Schnittfähigkeit, tiefen Eindringtiefe und geringen Phototoxizität häufig für die biologische In-vivo-Bildgebung eingesetzt14,15,16. Die Leistung der TPEF-Bildgebung hängt jedoch von den Eigenschaften fluoreszierender Tags ab, und die Anzahl der auflösbaren Farben ist aufgrund der breitbandigen Fluoreszenzspektren begrenzt8,17,18,19. Markierungsfreie SRS-Bildgebung und fluoreszenzbasierte TPEF-Bildgebung sind zwei komplementäre Bildgebungsmodalitäten, und ihre Kombination kann reichlich biophysikalische und biochemische Informationen über Gewebe liefern. Diese beiden Bildgebungsmodalitäten basieren beide auf den nichtlinearen optischen (NLO) Prozessen, die eine einfache Integration in ein Mikroskopsystem ermöglichen. Die Kombination der SRS- und TPEF-Bildgebung, die sogenannte dual-modale Bildgebung, ermöglicht eine hochdimensionale Bildgebung und Profilierung von Zellen und Geweben und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis komplexer biologischer Systeme. Insbesondere kann die Pikosekunden-SRS-Mikroskopie eine chemische Bindungsbildgebung mit hoher spektraler Auflösung im Vergleich zur Femtosekunden-SRS-Technik (fs)11 erreichen, die es ermöglicht, mehrere biochemische Komponenten in biologischem Gewebe zu unterscheiden, insbesondere in der überfüllten Fingerabdruckregion20,21. Darüber hinaus zeigt SRS im Vergleich zu einem anderen häufig verwendeten dual-modalen NLO-Mikroskopsystem mit Integration eines kohärenten Anti-Stokes-Streumikroskops (CARS) eine überlegene Leistung gegenüber CARS in Bezug auf Spektral- und Bildinterpretation sowie Detektionsempfindlichkeit11. Das SRS-TPEF-Mikroskop wurde als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung verschiedener biologischer Systeme verwendet, wie Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis Kaulquappengehirn5, Mausgehirn23,24, Rückenmark25,26, peripherer Nerv27 und Fettgewebe7 usw.
Das Rückenmark bildet zusammen mit dem Gehirn das zentrale Nervensystem (ZNS). Die Visualisierung zellulärer Aktivitäten im ZNS in vivo unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von ZNS-Erkrankungen28,29,30 und für die Entwicklung entsprechender Therapien31,32,33. Die Myelinscheide, die Axone für eine Hochgeschwindigkeits-Wirkungspotentialleitung umhüllt und isoliert, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Die Demyelinisierung gilt als Kennzeichen bei Erkrankungen der weißen Substanz wie der Multiplen Sklerose34. Darüber hinaus können Myelinreste nach einer Rückenmarksverletzung35 die Makrophagenaktivierung modulieren, was zu chronischen Entzündungen und Sekundärverletzungen beiträgt36. Daher ist die In-vivo-Bildgebung von Myelinhüllen zusammen mit Neuronen und Gliazellen in lebenden Mausmodellen eine große Hilfe, um die dynamischen Prozesse bei ZNS-Erkrankungen zu verstehen.
In diesem Protokoll werden die grundlegenden Setup-Verfahren eines selbst gebauten TPEF-SRS-Mikroskops beschrieben und die dual-modalen In-vivo-Bildgebungsverfahren für das Rückenmark der Maus vorgestellt.
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Protocol
Alle Tierverfahren, die bei dieser Arbeit durchgeführt werden, werden gemäß den Richtlinien der Laboratory Animal Facility der Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) durchgeführt und von der Tierethikkommission der HKUST genehmigt. Für die Einrichtung und Bedienung des TPEF-SRS-Mikroskops ist eine Sicherheitsschulung für die Laserhandhabung erforderlich. Tragen Sie immer eine Laserschutzbrille mit entsprechendem Wellenlängenbereich, wenn es um Laser geht.
1. Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops (Setup-Schema siehe Abbildung 1)
- Verwenden Sie einen integrierten optischen parametrischen Oszillator (OPO), der mit einem modegebundenen Ytterbium-Faserlaser verbunden ist, als ps-Laserquelle für die SRS-Bildgebung.
HINWEIS: OPO gibt einen Stokes-Strahl (1031 nm) und einen Pumpstrahl (abstimmbar von 780 nm bis 960 nm) mit 2 ps Pulsdauer und 80 MHz Wiederholrate aus. Der Stokes-Strahl wird bei 20 MHz durch einen eingebauten elektro-optischen Modulator (EOM) für die hochfrequente phasensensitive SRS-Detektion auf MHz-Ebene moduliert. - Verwenden Sie einen fs Titan (Ti): Saphirlaser als Laserquelle für die TPEF-Bildgebung.
- Verwenden Sie ein Paar Objektive (L1 und L2), um zu kollimieren und die Größe des fs-Strahls auf 3 mm einzustellen.
- Verwenden Sie ein Paar Linsen (L3 und L4), um den ps-Laserstrahl zu kollimieren und seinen Durchmesser auf 3 mm zu erweitern.
- Ändern Sie die Polarisation des fs-Laserstrahls von p-Polarisation auf s-Polarisation mit einer Halbwellenplatte.
- Kombinieren Sie die beiden Laserstrahlen mit einem polarisierenden Strahlteiler (PBS).
- Fügen Sie ein Paar 3-mm-XY-Scan-Galvanometerspiegel hinter dem PBS für das Strahlscannen hinzu.
- Verwenden Sie ein telezentrisches Scanobjektiv (L5) und ein unendlich korrigiertes Röhrenobjektiv (L6), um den Scanspiegel und die hintere Pupille des 25-fachen Objektivs zu konjugieren. Erweitern Sie den Laserstrahl um die Scanlinse und die Tubuslinse, um die hintere Blende des Objektivs auszufüllen.
- Platzieren Sie einen PBS- oder dichroitischen Spiegel (D2) zwischen der Röhrenlinse und der Objektivlinse für die SRS- oder Fluoreszenzsignalsammlung. Verwenden Sie einen motorisierten Flipper, um zwischen PBS und D2 zu wechseln.
HINWEIS: Ein Teil des rückgestreuten SRS-Signals geht beim Passieren des PBS aufgrund seiner zufällig verschobenen Polarisation verloren. - Verwenden Sie ein Paar Linsen (L7 und L9), um den Erfassungsstrahl zu verengen und die hintere Pupille der 25-fachen Objektivlinse mit einem Fotodiodensensor zu konjugieren.
- Verwenden Sie ein Paar Linsen (L8 und L10), um den Detektionsstrahl zu verengen und die hintere Pupille des 25-fachen Objektivs mit der Detektionsoberfläche des Photomultipliers (PMT) zu konjugieren.
- Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel (D3), um den Detektionspfad von Fluoreszenz- und SRS-Signalen zu trennen.
- Platzieren Sie ein Filterset (Fs1) vor dem Photodiodendetektor, um den Stokes-Laser zu blockieren und nur den Pumpstrahl zu passieren.
- Platzieren Sie ein Filterset (Fs2) vor dem PMT-Detektor, um nur das Zielfluoreszenzsignal zu leiten.
- Schließen Sie den PMT zur Signalverstärkung an einen Stromverstärker an.
- Schließen Sie die Fotodiode an einen Lock-in-Verstärker an.
- Schließen Sie das Sync-Signal vom eingebauten EOM-Ausgang an den Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers zur SRS-Signaldemodulation an.
- Schließen Sie den PMT-Verstärker und die Lock-in-Verstärkerausgänge an das Datenerfassungsmodul an.
2. Kalibrierung des TPEF-SRS-Mikroskopsystems
- Inbetriebnahme der Laser
- Schalten Sie den Schlüsselschalter von der Standby- in die Ein-Position, um den Ti: Saphirlaser einzuschalten, und warten Sie 30 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat.
- Schalten Sie den OPO ein, indem Sie auf die Schaltfläche Start auf dem OPO Control Panel klicken und warten Sie 20 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat.
- Nachdem sich der PS-Laser erwärmt hat, verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Photodetektor, um die Modulationstiefe des Stokes-Strahls zu überprüfen. Öffnen Sie den Laserverschluss für den Stokes-Strahl. Klicken Sie auf die Set OPO Power Box und geben Sie 20 ein. Platzieren Sie den Hochgeschwindigkeits-Photodetektor am OPO-Ausgang, um den Strahl zu detektieren. Verbinden Sie den Ausgangsanschluss des Photodetektors mit dem Eingangsanschluss eines Oszilloskops über ein Koaxialkabel mit Bajonett-Neill-Concelman (BNC)-Anschluss, um den Laserpuls zu überwachen.
- Öffnen Sie das EOM-Steuerungsfenster in der OPO-Steuerungssoftware . Stellen Sie die EOM-Leistung und -Phase entsprechend dem auf dem Oszilloskop gezeigten Pulsintensitätsdiagramm ein, um eine maximale Modulationstiefe bei 20 MHz zu erreichen.
HINWEIS: Die EOM-Leistung ist in der Regel stabil und muss nur überprüft werden, wenn das SRS-Signal deutlich verringert ist.
- Optische Ausrichtung des kombinierten TPEF-SRS-Mikroskops
- Führen Sie eine optische Ausrichtung zur Kolokalisierung der ps- und fs-Strahlen durch, wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.13 beschrieben.
- Öffnen Sie den Laserverschluss der Pumpe, während Sie die Stokes-Ausgabe in der OPO-Steuerungssoftware stoppen. Verwenden Sie die OPO-Steuerungssoftware, um die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 796 nm einzustellen, indem Sie auf die Set Signal Box klicken und den Wellenlängenwert 796 eingeben. Klicken Sie auf die Box Set OPO Power und geben Sie 20 ein, um die Leistung auf das Minimum (~ 20 mW) für die optische Ausrichtung einzustellen.
- Schalten Sie den Mikroskopcomputer und alle zugehörigen elektronischen Komponenten ein, einschließlich Scanner, Objektivaktuatoren, Photodioden, PMTs, Stromverstärker, Lock-in-Verstärker und motorisierte Flossen. Starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware.
HINWEIS: Die Mikroskopsteuerungssoftware ist eine hausgemachte Schnittstelle. - Platzieren Sie zwei Ausrichtungsplatten (P1 und P2 in Abbildung 1) auf dem optischen Weg. Platzieren Sie P1 hinter PBS in einem Abstand von ca. 10 cm und platzieren Sie P2 hinter P1 in einem Abstand von ca. 30 cm.
HINWEIS: Die ps- und fs-Strahlen werden mithilfe eines PBS kombiniert (Abbildung 1). Die beiden Ausrichtungsplatten dienen zur Überprüfung der Ausrichtung sowie der Kolokalisation der beiden Laserstrahlen. - Öffnen Sie den Mikroskopverschluss für den ps-Laserstrahl.
- Stellen Sie den Spiegel M1 so ein, dass er die ps-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P1 lokalisiert. Verwenden Sie ein Infrarot (IR) Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P1 zu beobachten, wenn Sie den Spiegel M1 einstellen.
- Stellen Sie den Spiegel M2 ein, um die ps-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren. Verwenden Sie das IR-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P2 beim Einstellen des Spiegels M2 zu beobachten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6 und 2.2.7, bis sich die ps-Strahlmitte am Durchgangsloch beider Ausrichtungsplatten befindet. Schließen Sie den Verschluss des PS-Strahls in der Mikroskopsteuerungssoftware.
- Stellen Sie die Wellenlänge von fs Ti: Saphirlaser auf 740 nm ein und öffnen Sie den Laserverschluss. Stellen Sie die Laserleistung auf 5 mW (gemessen am Eingangsanschluss des Mikroskopsystems) für die optische Ausrichtung ein.
- Öffnen Sie den Mikroskopverschluss für den fs-Laserstrahl.
- Stellen Sie den Spiegel M3 ein, um das fs-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P1 zu lokalisieren.
- Stellen Sie den Spiegel M4 ein, um das Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.11 und 2.2.12, bis sich das fs-Laserstrahlzentrum an den Durchgangslöchern zweier Ausrichtungsplatten befindet. Schließen Sie den Mikroskopverschluss für den fs-Strahl.
- Führen Sie eine räumliche Überlappung der Pumpe und der Stokes-Träger durch, wie in den Schritten 2.2.15 bis 2.2.18 beschrieben.
HINWEIS: Obwohl sich die Pumpe und die Stokes-Strahlen im ps-Laser grob überlappen, ist eine Feinabstimmung der Positionen der beiden Laserstrahlen erforderlich, um eine optimale SRS-Leistung zu erzielen. Da der Pumpenstrahl zunächst wie zuvor beschrieben ausgerichtet wird, wird als nächstes der Stokes-Strahl so eingestellt, dass er mit dem Pumpenstrahl kolokalisiert. - Platzieren Sie eine Kamera an der Position des Objektivs, um die Position von zwei Strahlpunkten zu visualisieren. Markieren Sie die Position des Pumpenstrahls auf dem Kamerabildschirm als Referenz.
- Setzen Sie eine Ausrichtungsplatte P0 vor L3 (Abbildung 1). Verwenden Sie eine Hex-Taste, um den optischen Spiegel 1 (OM1) so einzustellen, dass das Stokes-Strahlzentrum das Durchgangsloch der Ausrichtungsplatte passiert und mit dem Pumpstrahl am Laserausgangsanschluss kolokalisiert. Verwenden Sie das IR-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P0 während der Einstellung zu bestätigen.
HINWEIS: OM1 und OM2 sind zwei Spiegel im OPO-Kopf, um die Position des 1031 nm Stokes-Strahls einzustellen. - Entfernen Sie die Ausrichtungsplatte P0 und verwenden Sie die Hex-Taste, um den OM2 so einzustellen, dass die Mitte des Stokes-Strahls mit dem Referenzzeichen des Pumpenstrahls auf der Kamera kolokalisiert wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.16 und 2.2.17, bis sich der Stokes-Strahl sowohl auf P0- als auch auf Kameraebene strikt mit dem Pumpenstrahl überlappt.
HINWEIS: Bei der Visualisierung der Strahlpunkte auf der Kamera sollten alle Ausrichtungsplatten aus dem optischen Pfad entfernt werden.
- Optimierung der Bildgebungsbedingungen
- Führen Sie die Phaseneinstellung des Lock-in-Verstärkers wie in Schritt 2.3.2 beschrieben durch. bis 2.3.7.
HINWEIS: Die SRS-Erkennung basiert auf einem hochfrequenten phasensensitiven Schema. Für die SRL-Detektion wird die Intensität des Stokes-Strahls mit 20 MHz moduliert und ein Lock-in-Verstärker wird verwendet, um das Signal zu demodulieren. Phase und Offset des Lock-in-Verstärkers müssen angepasst werden, um den optimalen Bildkontrast zu erreichen. - Öffnen Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware.
- Stellen Sie die Wellenlänge des Pumplasers auf 796 nm und die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 15 mW bzw. 25 mW auf der Probe ein.
HINWEIS: Verwenden Sie hier Olivenöl für die Optimierung und Kalibrierung der SRS-Bildgebung. Der Raman-Gipfel des Olivenöls in der Kohlenstoff-Wasserstoff-Region liegt bei 2863,5 cm-1, was der Wellenlänge des Pumpstrahls bei 796 nm entspricht. - Verschließen Sie das Olivenöl in einem Objektträger und befestigen Sie ein gefaltetes Seidenpapier am Boden des Objektträgers, um die Signalrückstreuung für die Epi-SRS-Erkennung zu verbessern. Legen Sie die Olivenölprobe auf die Bühne und stellen Sie den Fokus des 25-fachen Objektivs auf die Probe ein.
- Verwenden Sie die Mikroskopsteuerungssoftware, um die Bildgebungsparameter wie folgt einzustellen: 512 x 512 Pixel für 500 μm x 500 μm Sichtfeld (FOV), 6,4 μs Pixelverweildauer. Verwenden Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware, um den Zeitkonstantenwert auf 10 μs einzustellen, was nahe an der Pixelverweilzeit liegt.
- Scannen Sie den Laserstrahl über die Probe. Verwenden Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware, um die Phase (0-180°) mit einer Schrittweite von 22,5° so lange abzustimmen, bis die SRS-Signalintensität das Maximum erreicht.
HINWEIS: Bei diesem rein analogen Lock-in-Verstärker ist der Signalausgang die phasenabhängige Komponente, die von der Phase des Referenzsignals abhängig ist. Die Phase kann durch die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware mit einer Auflösung von 11 ° eingestellt werden, wodurch das erkannte Signal auf ~ 2% 12 maximiert werden kann. Der Lock-in-Verstärker gerät aus der Phase, sobald das Synchronisationssignal unterbrochen wird. Die Phase muss jedes Mal neu eingestellt werden, wenn das Synchronisationssignal wiederhergestellt wird. - Scannen Sie die Probe mit geschlossenem Laserverschluss. Verwenden Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware, um den Offset-Wert mit einer Schrittweite von 1 mV so lange abzustimmen, bis das durchschnittliche SRS-Signal nahe Null liegt.
HINWEIS: Das durchschnittliche SRS-Signal wird als die durchschnittliche Intensität aller Pixel im SRS-Bild geschätzt, die automatisch von der Mikroskopsteuerungssoftware berechnet wird. Offsets sind nützlich, um unerwünschte phasenkohärente Signale zu unterdrücken. - Führen Sie die Optimierung der zeitlichen Synchronisierung wie in den Schritten 2.3.9 bis 2.3.14 beschrieben durch.
- Öffnen Sie den Dialog Delay Manager (Abbildung 2) in der OPO-Steuerungssoftware.
- Scannen Sie das Olivenöl und stimmen Sie die Verzögerungsstufe ab, bis das SRS-Signal des Olivenöls sein Maximum erreicht.
HINWEIS: Zum ersten Mal der SRS-Bildgebung, wenn die Phase des Lock-in-Verstärkers nicht optimiert wurde, wird die zeitliche Synchronisation zunächst grob angepasst, um das SRS-Signal der Probe zu visualisieren, bevor die Phase des Lock-in-Verstärkers optimiert wird. - Stoppen Sie das Scannen und klicken Sie im Dialogfeld des Verzögerungsmanagers auf die Schaltfläche Daten hinzufügen , um die aktuellen Verzögerungsdaten aufzuzeichnen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3. 10 und 2.3.11 für verschiedene chemische Proben bei unterschiedlichen Wellenlängen.
HINWEIS: Polystyrolkügelchen, schweres Wasser, 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin, Glycerin werden verwendet, um die Verzögerungsdaten an verschiedenen Schwingungsbändern zu messen. - Wählen Sie im Dialogfeld "Verzögerungsmanager" die Option "Datenanpassung und -reihenfolge" 5 aus, um die aktuellen Datenpunkte mit der polynomischen Funktion fünfter Ordnung abzugleichen. Wenden Sie die angepassten Daten an, indem Sie auf die Schaltfläche Als benutzerdefiniert verwenden klicken und das Kontrollkästchen aktivieren. Die Verzögerungsstufe wird bei verschiedenen Wellenlängen entsprechend der angepassten Verzögerungskurve automatisch angepasst.
- Speichern Sie alle Verzögerungsdaten in einer Textdatei, die für die zukünftige Verwendung geladen werden kann.
- Führen Sie die Phaseneinstellung des Lock-in-Verstärkers wie in Schritt 2.3.2 beschrieben durch. bis 2.3.7.
3. Chirurgische Vorbereitung der Maus für in vivo Fluoreszenz und SRS-Bildgebung
- Sterilisieren Sie alle erforderlichen Werkzeuge, einschließlich Skalpelle, Federschere, Pinzette, Deckgläser und Mullpads.
- Desinfizieren Sie alle Oberflächen, die während der Operation berührt würden, mit 70% Ethanol. Decken Sie den Arbeitsbereich der Tischplatte mit sterilen Vorhängen ab. Legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang.
- Verwenden Sie Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgene Mäuse, die Enhanced Yellow Fluorescence Protein (EYFP) in afferenten Neuronen der dorsalen Wurzelganglion für die In-vivo-Rückenmarksbildgebung exprimieren. Wiegen Sie die Maus und induzieren Sie eine Anästhesie durch intraperitoneale (i.p.) Injektion des Ketamin-Xylazin-Gemisches (87,5 mg kg-1 und 12,5 mg kg-1).
- Kneifen Sie den Zeh der Maus zusammen, um eine tiefe Anästhesie zu gewährleisten. Ergänzen Sie bei Bedarf mit der Hälfte der ursprünglichen Dosis der Anästhetika. Tragen Sie Salbe auf die Mausaugen auf, um Hornhauttrockenheit zu verhindern.
- Rasieren Sie die Haare auf dem Rücken über der Brustwirbelsäule und entfernen Sie dann die Haare vollständig mit Enthaarungscreme. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit Jodlösung.
- Machen Sie einen kleinen Mittellinienschnitt (~ 1,5 cm) der Haut über dem T11-T13-Wirbel mit einem Skalpell.
- Schneiden Sie Muskeln und Sehnen sowohl oben als auch an den Seiten des T11-T13-Wirbels mit Federschere und Pinzette ein. Belichten Sie die drei benachbarten Wirbel. Verwenden Sie sterile Mullbinden und sterile Kochsalzlösung, um Blutungen zu kontrollieren und die Operationsstelle zu reinigen.
- Stabilisieren Sie die Wirbelsäule mit Hilfe der beiden Edelstahl-Seitenstangen auf einer speziell entwickelten Stabilisierungsstufe (Abbildung 2B).
- Verwenden Sie eine # 2-Pinzette, um eine Laminektomie bei T12 durchzuführen. Verwenden Sie vorsichtig die Pinzette, um die Lamina Stück für Stück zu brechen, bis die gesamte Lamina des T12-Wirbels entfernt ist.
- Waschen Sie das Blut über dem Rückenmark mit steriler Kochsalzlösung ab und verwenden Sie das Mullkissen, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen. Üben Sie mit einem Stück Mullkissen Druck auf die Blutungsstelle aus, um die Blutung zu kontrollieren.
- Legen Sie ein Deckglas (22 x 22 mm) auf die Klemmstange und füllen Sie den Zwischenraum zwischen dem Deckglas und dem Rückenmark mit Kochsalzlösung.
4. In vivo TPEF-SRS-Bildgebung des Rückenmarks der Maus
- Montieren Sie die Stabilisierungsstufe auf einer fünfachsigen Stufe unter dem TPEF-SRS-Mikroskop.
HINWEIS: Der Fünf-Achsen-Tisch ermöglicht eine dreiachsige Verschiebung und ±5°-Nick- und Rollbiegebewegung. - Sichern Sie den Mauskopf mit zwei Kopfstangen und senken Sie die Halteplatte ab, um genügend Platz für Brustbewegungen während der Atmung zu bieten und Bewegungsartefakte zu lindern.
- Setzen Sie ein Heizkissen unter die Maus ein, um die Maus während der Bildgebung warm zu halten.
- Stellen Sie das z-Translationsstadium ein, um den Fokus so einzustellen, bis das Hellfeldbild der Rückenmarksvaskulatur unter einem 10-fachen Objektiv beobachtet werden kann.
- Lokalisieren Sie die Rückenmarksvene in der Mitte des FOV, indem Sie die zweiachsige Translationsstufe der fünfachsigen Stufe abstimmen.
- Stimmen Sie die Roll- und Nickwinkel der Fünf-Achsen-Stufe ab, um die Rückenmarksoberfläche senkrecht zur Objektivachse basierend auf dem Hellfeldbild anzupassen.
- Ersetzen Sie das 10x durch ein 25-faches Wassertauchobjektiv für die TPEF-SRS-Bildgebung.
- Stellen Sie die Wellenlänge des fs-Strahls auf 920 nm ein. Stellen Sie die fs-Strahlleistung auf 10 mW auf dem Sample ein.
- Stellen Sie die Wellenlänge des Pumpstrahls auf 796 nm ein. Passen Sie die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 60 mW bzw. 75 mW an der Probe an.
HINWEIS: Die Rückenmarks-SRS-Bildgebung wird bei der Wellenzahl von 2863,5 cm-1 durchgeführt, was dem Raman-Peak von Myelinscheiden im Kohlenstoff-Wasserstoff-Bereich entspricht, basierend auf den gemessenen SRS-Spektren7,9. Die Laserleistung wird bestimmt, um eine hochauflösende TPEF-SRS-Bildgebung des Rückenmarks zu gewährleisten. Gewebeschäden werden unter den derzeitigen bildgebenden Bedingungen nicht beobachtet. - Wählen Sie für die SRS-Bildgebung PBS über dem Objektiv mit einem motorisierten Flipper aus, indem Sie die Switch-Taste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist.
- Stellen Sie die Bildgebungsparameter wie folgt ein: 512 x 512 Pixel für 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs Pixelverweilzeit, 2 μs Zeitkonstante.
- Beginnen Sie mit dem Scannen der Probe und legen Sie den Fokus auf die dorsale Oberfläche des Rückenmarks fest.
- Feinabstimmung der Verzögerungsstufe durch die OPO-Steuerungssoftware, bis das maximale SRS-Signal des Rückenmarks erreicht ist.
HINWEIS: Biologische Proben können eine zusätzliche chromatische Dispersion induzieren, die Verzögerungsstufe muss möglicherweise angepasst werden, um die zeitliche Synchronisation zu optimieren. Wenn die SRS-Bildgebung jedoch in der Nähe der oberen Oberfläche des Gewebes durchgeführt wird, ist der zeitliche Unterschied zwischen den beiden Laserpulsen, die durch das biologische Gewebe und das Bildgebungsfenster eingeführt werden, in der Regel gering (weniger als mehrere hundert fs). - Für die TPEF-Bildgebung wählen Sie den dichroitischen Spiegel D2 über dem Objektiv mit einem motorisierten Flipper , indem Sie die Switch-Taste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist.
- Legen Sie die Bildgebungsparameter fest und starten Sie das Scannen der Probe. Um den TPEF-SRS-Bildstapel zu erfassen, erfassen Sie die TPEF- und SRS-Bilder nacheinander mit einem Intervall von 1 s in der gleichen Tiefe, bevor Sie in die nächste Tiefe gehen. Die Bildgebungsparameter für die TPEF-Bildgebung sind 512 x 512 Pixel, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs Pixelverweildauer.
- Entfernen Sie das Tier aus der Stabilisierungsphase, nachdem alle Bilder gesammelt wurden.
- Reinigen Sie das freiliegende Gewebe, indem Sie Kochsalzlösung spülen und die überschüssige Flüssigkeit mit einem Mullkissen aufnehmen. Tragen Sie Silikongel auf das freiliegende Rückenmark auf und warten Sie ~ 5 Minuten, bis es geheilt ist.
- Nähen Sie die Haut mit #6-0 chirurgischer Naht, um die Wunde zu schließen. Tragen Sie Verbrennungscreme auf die Haut der Operationsstelle auf, um eine Infektion zu verhindern. Verabreichen Sie die analgetische Behandlung subkutan (0,1 mg/kg Buprenorphin).
- Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig und legen Sie den Käfig auf ein Heizkissen, bis sich die Maus vollständig von der Narkose erholt hat.
- Wiederholen Sie die analgetische Verabreichung alle 12 Stunden für 3 Tage nach der Operation.
- Schließen Sie den Verschluss von OPO und fs Laser. Stellen Sie die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf das Maximum ein.
HINWEIS: Das Einstellen der maximalen Leistung vor dem Ausschalten des Lasers ist für die Laserwartung von Vorteil. - Stellen Sie die Wellenlänge des Pumpstrahls und des fs-Lasers auf 800 nm ein.
- Stellen Sie die beiden Laser in den Standby-Modus, schließen Sie die gesamte Steuerungssoftware der Elektronik und schalten Sie alle zugehörigen Geräte aus.
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Representative Results
Die in vivo dual-modale Bildgebung von spinalen Axonen sowie Myelinscheiden wird mit den transgenen Thy1-YFPH-Mäusen durchgeführt, die EYFP in afferenten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions exprimieren (Abbildung 3). Diese gekennzeichneten afferenten Neuronen leiten die sensorischen Informationen vom peripheren Nerv an das Rückenmark weiter, wobei sich der zentrale Ast in der Rückenmarksdorsalsäule befindet. Mit dem TPEF-SRS-Mikroskop können dicht verteilte Myelinhüllen mittels markierungsfreier SRS-Bildgebung und spärlich markierte YFP-Axone mittels TPEF-Bildgebung beobachtet werden. Die Dual-Modell-Bildgebung zeigt, dass Axone eng von einer dicken Schicht von Myelinscheiden umhüllt sind (Abbildung 3C). Knoten von Ranvier (NR), bei denen das Axolemma der Myelinscheide entblößt ist, spielen eine wesentliche Rolle bei der schnellen saltatorischen Ausbreitung von Aktionspotentialen. Wie im TPEF-SRS-Rückenmarksbild zu sehen ist (Abbildung 3C), zeigen NR einen verringerten axonalen Durchmesser und Axolemma, das direkt der extrazellulären Matrix ausgesetzt ist. Es ist wichtig, die Axone zusammen mit den umgebenden Myelinscheiden abzubilden, um die Existenz und den Standort von NR zu bestätigen. Daher ermöglicht uns die TPEF-SRS-Mikroskopie, die dynamischen Veränderungen von Axonen und Myelinscheiden bei der Entwicklung von Rückenmarkserkrankungen zu beobachten, was für das Verständnis der Mechanismen der Zelldynamik von Bedeutung ist.
Abbildung 1: Das schematische Diagramm des TPEF-SRS-Mikroskopsystems. Die Pump- und Stokes-Strahlen werden mit einem dichroitischen Spiegel (D1) im Pikosekundenlaser (ps) kombiniert. Der ps-Strahl und der Femtosekundenstrahl (fs) werden durch ein Paar Linsen (L3, L4 bzw. L1, L2) kollimiert und erweitert/verengt, um den 3-mm-XY-Scan-Galvanometerspiegeln zu entsprechen. Der fs-Strahl wird durch eine Halbwellenplatte (HWP) von horizontaler nach vertikaler Polarisation gedreht und dann durch einen polarisierenden Strahlteiler (PBS) mit dem ps-Strahl kombiniert. Die Scanspiegel und die hintere Pupille der Objektivlinse werden durch ein telezentrisches Scanobjektiv L5 und ein unendlich korrigiertes Röhrenobjektiv L6 konjugiert. Der Laserstrahl wird durch die Scan- und Tubuslinse erweitert, um die hintere Blende des 25-fachen Objektivs auszufüllen. Für die stimulierte Raman-Streuung (SRS) wird der vom Objektiv gesammelte rückgestreute Pumpstrahl von einem PBS reflektiert und auf eine großflächige (10 mm x 10 mm) Silizium-Photodiode (PD) gerichtet. Für die Zwei-Photonen-Bildgebung wird das Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzsignal (TPEF) von einem dichroitischen Strahlteiler D2 an die Photodetektionseinheit reflektiert. Ein aktuelles Photomultiplier-Modul (PMT) wird verwendet, um das TPEF-Signal zu detektieren. Abkürzungen-L1-L10: Linsen; OL: Objektiv; D1-D3: dichroitische Spiegel; Fs1, Fs2: Filtersets; M: Spiegel; OM1, OM2: optische Spiegel; P0-P2: Ausrichtungsplatten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Schnittstelle des Verzögerungsmanagers auf der OPO-Steuerungssoftware. Der rote Pfeil zeigt das Kontrollkästchen zum Anwenden der kalibrierten Verzögerungsdaten an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: In vivo TPEF-SRS-Bildgebung des Rückenmarks der Maus. (A) Schematische Darstellung der chirurgischen Vorbereitung des Rückenmarks der Maus und des Hellfeldbildes des Rückenmarks. (B) Mausmontageschema für die In-vivo-Bildgebung des Rückenmarks. (C) Maximale z-Projektionsbilder von Axonen und Myelinscheiden im Rückenmark der Maus. Weiße Pfeilspitzen zeigen die Position eines Knotens von Ranvier an. SRS-Bilder von Myelin wurden in der Raman-Verschiebung von 2863,5 cm-1 aufgenommen. Abbildung A wurde mit BioRender (https://biorender.com/) erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Protokoll wird der grundlegende Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops ausführlich beschrieben. Für die SRS-Bildgebung sind die Pumpe und die Stokes-Strahlen innerhalb des OPO zeitlich und räumlich überlappt. Diese Überlappung kann jedoch nach dem Durchlaufen des Mikroskopsystems unterbrochen werden. Daher ist sowohl die räumliche als auch die zeitliche Optimierung der Kolokalisation der Pumpe und der Stokes-Träger notwendig und entscheidend, um eine optimale SRS-Bildgebung zu erreichen. Die zeitliche Verzögerung zwischen Pumpe und Stokes-Strahl hängt mit der optischen Wegdifferenz der beiden Strahlen zusammen, die durch die Dispersion optischer Elemente im Mikroskopsystem38 bestimmt wird. Wenn die Wellenlänge des Pumpstrahls für die SRS-Bildgebung bei verschiedenen Raman-Verschiebungen abgestimmt ist, ändert sich die optische Weglänge des Pumpstrahls entsprechend, da der Brechungsindex der optischen Linsen von der Wellenlänge abhängig ist38. Daher ändert sich die zeitliche Verzögerung zwischen der Pumpe und dem Stokes-Laserpuls mit der Wellenlänge des Pumpstrahls und muss daher kalibriert werden. Der OPO ist mit einer softwaregesteuerten Verzögerungsleitung zur zeitlichen Synchronisation von Pumpe und Stokes-Strahl ausgestattet. Für den gleichen optischen Aufbau bleiben die Verzögerungsdaten stabil und müssen nur einmal kalibriert werden. Dadurch können die Verzögerungsdaten bei unterschiedlichen Wellenlängen des Pumpstrahls bei der ersten Messung für die zukünftige Verwendung gespeichert werden. Die kalibrierten Verzögerungsdaten können automatisch von der OPO-Steuerungssoftware angewendet werden, wenn die Wellenlänge des Pumpstrahls geändert wird, was für die SRS-Bildgebung bei verschiedenen Raman-Verschiebungen oder die hyperspektrale SRS-Bildgebung geeignet ist. Für die TPEF-SRS-Bildgebung ist die strikte räumliche Überlappung der ps- und fs-Strahlen nach der Kombination ein kritischer Schritt, um eine FOV-Verschiebung zwischen den beiden Bildgebungsmodellen zu vermeiden. Erstens sind der ps-Pumpstrahl und der fs-Strahl ausgerichtet, um sicherzustellen, dass sie sich beide auf der optischen Achse des Mikroskopsystems befinden, was entscheidend ist, um eine FOV-Verschiebung beim Wechsel der beiden Bildgebungsmodelle zu vermeiden. Dann, mit dem Pumpenstrahl als Referenz, wird die Stokes-Strahlposition entsprechend angepasst, um eine strikte räumliche Kolokalisierung zu erreichen. Jedes Ausrichtungsverfahren erfordert mehrere Versuche, um das Optimum zu erreichen.
Wenn das SRS-Signal deutlich abnimmt, sollten zuerst der Phasenwert des Lock-in-Verstärkers und die Zeitverzögerungsdaten überprüft werden. Da der Lock-in-Verstärker aus der Phase gerät, sobald das Synchronisationssignal unterbrochen wird, muss der Phasenwert jedes Mal neu eingestellt werden, nachdem die Stromversorgung oder das EOM-Synchronisationssignal unterbrochen wurde. Die zeitliche Synchronisation von Pumpe und Stokes-Strahl kann schnell überprüft werden, indem die Verzögerungsleitung innerhalb des OPO leicht angepasst wird. Wenn die kalibrierten Zeitverzögerungsdaten weit vom optimalen Wert entfernt sind, sollte ein Null-Scan durchgeführt werden, um den Verzögerungs-Offset neu zu kalibrieren, indem Sie im Dialogfeld des Verzögerungsmanagers auf die Schaltfläche Zero Scan klicken. Der gesamte Zero-Scan-Vorgang dauert ca. 10 min. Wenn sich das SRS-Signal nach der Optimierung des Phasen- und Zeitverzögerungswerts nicht erholt, sollte die EOM-Modulation des Stokes-Strahls wie in den Schritten 2.1.3-2.1.4 beschrieben überprüft werden. Wenn das Extinktionsverhältnis weit weniger als 10 dB beträgt, wobei kleine Pulsspitzen in der Aus-Position des Stokes-Pulszuges beobachtet werden, sollte der EOM neu gestartet und die Modulationsleistung und -phase neu eingestellt werden, um eine maximale Modulationstiefe zu erreichen. Normalerweise kann das Modulationsproblem durch Zurücksetzen der EOM gelöst werden. Wenn nicht, sollte technische Unterstützung vom Hersteller erforderlich sein.
Für die In-vivo-Dickgewebebildgebung muss der Epi-SRS-Detektionsmodus verwendet werden. In diesem Protokoll wird ein PBS verwendet, um den Anregungslaser zu leiten und das rückgestreute SRS-Signal an den Detektor zu reflektieren. Das detektierte SRL-Signal ist abhängig von der Rückstreuung des vorwärts gerichteten Pumpstrahls durch Gewebe. Die Anregungslaser haben eine lineare Polarisation und können das PBS vollständig passieren, während der rückgestreute Strahl eine verschobene Polarisation aufweist und daher nur teilweise vom PBS reflektiert werden kann. Daher zeigt das aktuelle Signalsammelschema einen geringeren Wirkungsgrad im Vergleich zu der Strategie, bei der ein ringförmiger Photodetektor direkt vor dem Objektiv platziert wird12. Aufgrund der starken Streuung der lipidreichen Gewebe39 können jedoch SRS-Bilder (512 x 512 Pixel) des Rückenmarks mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (512 x 512 Pixel) des Rückenmarks mit einer Integrationszeit von 1-2 s aufgenommen werden, was dieses PBS-basierte Sammelschema zu einem geeigneten Ansatz für die Rückenmarksbildgebung macht. Auf der anderen Seite begrenzt jedoch die starke Gewebestreuung die Lichteindringtiefe. Sowohl für die SRS- als auch für die TPEF-Bildgebung ist die Abbildungstiefe für das Rückenmark auf etwa 50 μm begrenzt.
Das sequentielle Bildgebungsverfahren für die SRS- und TPEF-Bildgebung ist die Haupteinschränkung des derzeitigen dual-modalen Bildgebungsverfahrens. Im Protokoll werden TPEF- und SRS-Bildgebung sequenziell an derselben Stelle mit einem Intervall von 1 s durchgeführt, indem der motorisierte Flipper automatisch geschaltet wird. Bewegungsartefakte können zu einer unvollkommenen Zusammenführung der TPEF- und SRS-Bilder führen, was die Fähigkeit dieser Methode zur Abbildung hochdynamischer Prozesse oder Gewebe, die weitgehend vom Atem und Herzschlag von Tieren betroffen sind, einschränkt. Eine mögliche Lösung besteht darin, die ps-laserangeregte Zwei-Photonen-Fluoreszenz gleichzeitig während der SRS-Bildgebung zu erfassen9. Diese Methode ist jedoch nur auf die biologischen Strukturen mit starken Fluoreszenzsignalen anwendbar, da der ps-Puls im Vergleich zum fs-Puls eine viel geringere Fluoreszenzanregungseffizienz aufweist14. Alternativ kann das Problem durch die Verwendung eines fs-SRS-Systems22,40 gelöst werden, bei dem die fs-Laserquelle eine gleichzeitige Anregung der SRS- und TPEF-Signale effektiv auf Kosten der niedrigen spektralen Auflösung der SRS-Bildgebung ermöglicht. Eine andere Lösung besteht darin, die ps-laserangeregte Fluoreszenz, die während der SRS-Bildgebung erhalten wird, als Referenz zu verwenden, um die fs-Fluoreszenzbilder zu registrieren. Wie in Abbildung 3 gezeigt, funktioniert diese Registrierungsstrategie gut, wenn während der SRS- und Fluoreszenzbildgebung keine signifikante Bewegung auftritt.
SRS weist einzigartige Vorteile in der biologischen Bildgebung auf, da es chemische Informationen von Biomolekülen auf der Grundlage seines spezifischen markierungsfreien Kontrastmechanismus liefert41. Im Vergleich zu CARS, das auch mit TPEF für die multimodale NLO-Bildgebung kombiniert wurde, zeigte SRS eine bessere Spektral- und Bildinterpretationsfähigkeit11. Daher wurde es häufig für die Bildgebung von Lipid9,11, Protein42,43, DNA44 und bioorthogonalen Komponenten angewendet, die Alkin (C ≡ C) 13,45, Kohlenstoff-Deuterium (C−D)9,46 und Sauerstoff-Deuterium (O-D)-Bindungen enthalten47,48 in biologischen Geweben. In diesem Protokoll verwendeten wir eine ps-Laserquelle für die SRS-Bildgebung und eine fs-Laserquelle für die TPEF-Bildgebung, die die Vorteile einer effizienten Fluoreszenzanregung und einer hohen Raman-Spektralauflösung kombiniert und eine effektive Differenzierung verschiedener Biomoleküle ermöglicht42,44. Im Rückenmark tragen komplexe Zell-Mikroumgebungs-Interaktionen zwischen Gliazellen, Neuronen und rekrutierten Immunzellen zum Fortschreiten von Verletzungen bei49 und Krankheiten50. In Kombination mit verschiedenen Fluoreszenz- und SRS-Bildgebungssonden kann die TPEF-SRS-Mikroskopie eine gleichzeitige Abbildung verschiedener zellulärer Strukturen sowie ihrer unterschiedlichen Biomolekülkomponenten erreichen, was unser Verständnis des Auftretens und der Entwicklung von Rückenmarkserkrankungen erheblich erleichtern kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen und haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Hong Kong Research Grants Council durch Zuschüsse 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, der Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), dem Area of Excellence Scheme des University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) und der Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) durch den Zuschuss RPC10EG33 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25x36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
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