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Bioengineering

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

Abstract

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite a imagem livre de rótulos dos tecidos biológicos em seu microambiente natural com base na vibração molecular intrínseca, fornecendo assim uma ferramenta perfeita para o estudo in vivo de processos biológicos em resolução subcelular. Ao integrar a fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) no microscópio SRS, a imagem em si de tecidos pode adquirir informações bioquímicas e biofísicas críticas de múltiplas perspectivas que ajudam a entender os processos dinâmicos envolvidos no metabolismo celular, resposta imune e remodelagem tecidual, etc. Neste protocolo de vídeo, é introduzida a configuração de um sistema de microscópio TPEF-SRS, bem como o método de imagem in vivo da medula espinhal animal. A medula espinhal, como parte do sistema nervoso central, desempenha um papel crítico na comunicação entre o cérebro e o sistema nervoso periférico. A baia de mielina, abundante em fosfolipídios, circunda e isola o axônio para permitir a condução saltatória de potenciais de ação. A imagem in vivo de baias de mielina na medula espinhal é importante para estudar a progressão de doenças neurodegenerativas e lesão medular. O protocolo também descreve a preparação animal e métodos de imagem in vivo TPEF-SRS para adquirir imagens biológicas de alta resolução.

Introduction

A microscopia raman1,2 está emergindo como um poderoso método livre de rótulos para imagem de tecidos biológicos com base nas frequências características de várias ligações químicas em biomoléculas. Devido à sua capacidade de imagem não invasiva e bem adaptativa, a microscopia de Raman tem sido amplamente utilizada para imagens de componentes enriquecidos com lipídios em tecidos biológicos como a bainha de mielina3,4,5, adipócitos6,7, e gotículas lipídicas8,9,10 . O sinal de dispersão de Raman estimulado (SRS) adquirido como ganho de Raman estimulado (SRG) ou perda de Raman estimulado (SRL) é livre de fundo, mostrando perfeita semelhança espectral com Raman espontâneo espalhando11,12. Além disso, o SRL e o SRG dependem linearmente da concentração de analitos, permitindo a análise quantitativa dos componentes bioquímicos9,11,13. A microscopia de fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) tem sido amplamente utilizada para imagens biológicas in vivo devido à sua capacidade de seção óptica inerente, profundidade de penetração profunda e baixa fototoxicidade14,15,16. No entanto, o desempenho da imagem TPEF depende das características das tags fluorescentes, e o número de cores solucionáveis é limitado devido ao espectro de fluorescência de banda larga8,17,18,19. A imagem TPEF baseada em imagens TPEF baseadas em ressonância magnética e fluorescência sem rótulos são duas modalidades de imagem complementares, e sua combinação pode fornecer informações biofísicas e bioquímicas abundantes dos tecidos. Essas duas modalidades de imagem são baseadas nos processos ópticos não lineares (NLO), o que permite uma integração simples em um sistema de microscópio. A combinação da imagem SRS e TPEF, a chamada imagem dual-modal, permite imagens de alta dimensão e perfil de células e tecidos, facilitando uma compreensão abrangente de sistemas biológicos complexos. Especificamente, a microscopia SRS picosecond (ps) pode alcançar imagens de ligação química com alta resolução espectral em comparação com a técnica srs femtosegundo (fs)11, permitindo diferenciar múltiplos componentes bioquímicos em tecido biológico, especialmente na região de impressão digital lotada20,21. Além disso, em comparação com outro sistema de microscópio NLO dual-modal comumente usado com integração do microscópio de dispersão anti-Stokes coerente (CARS), o SRS mostra desempenho superior aos CARS em termos de interpretação espectral e de imagem, bem como sensibilidade de detecção11. O microscópio SRS-TPEF tem sido usado como uma poderosa ferramenta para estudar vários sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cérebro de rato23,24, medula espinhal25,26, nervo periférico27, e tecido adiepos7, etc.

A medula espinhal juntamente com o cérebro compõe o sistema nervoso central (SNC). Visualizar atividades celulares no IN VIVO em condições fisiológicas e patológicas é fundamental para a compreensão dos mecanismos dos transtornos do CNS28,29,30 e para o desenvolvimento de terapias correspondentes31,32,33. A baia de mielina, que envolve e isola axônios para condução potencial de ação de alta velocidade, desempenha um papel significativo no desenvolvimento do CNS. A demyelination é considerada uma marca registrada em distúrbios da matéria branca, como a esclerose múltipla34. Além disso, após lesão na medula espinhal35, os detritos de mielina podem modular a ativação do macrófago, contribuindo para inflamação crônica e lesões secundárias36. Portanto, a imagem in vivo da baialina de mielina juntamente com neurônios e células gliais em modelos de camundongos vivos é de grande ajuda para entender os processos dinâmicos nos distúrbios do CNS.

Neste protocolo, são descritos os procedimentos fundamentais de configuração de um microscópio TPEF-SRS construído em casa e introduzidos os métodos de imagem in vivo dual-modal para medula espinhal do rato.

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Protocol

Todos os procedimentos animais realizados neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes do Laboratório de Instalações Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST) e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do HKUST. O treinamento de segurança para manuseio a laser é necessário para configurar e operar o microscópio TPEF-SRS. Use sempre óculos de segurança a laser com alcance de comprimento de onda apropriado ao lidar com laser.

1. Configuração do microscópio TPEF-SRS (para esquema de configuração ver Figura 1)

  1. Use um oscilador óptico integrado (OPO) conectado com um laser de fibra Ytterbium bloqueado no modo como fonte de laser ps para imagem SRS.
    NOTA: OPO produz um feixe de Stokes (1031 nm) e um feixe de bomba (tunable de 780 nm a 960 nm) com duração de pulso de 2 ps e taxa de repetição de 80 MHz. O feixe stokes é modulado a 20 MHz por um modulador eletro-óptico embutido (EOM) para detecção de SRS sensível à fase de alta frequência no nível de MHz.
  2. Use um titânio fs (Ti): laser de safira como fonte de laser para imagens TPEF.
  3. Use um par de lentes (L1 e L2) para cotor e ajustar o tamanho do feixe fs para 3 mm.
  4. Use um par de lentes (L3 e L4) para colidir o feixe laser do PS e expandir seu diâmetro para 3 mm.
  5. Alterar a polarização do raio laser fs da polarização p para a polarização de S usando uma placa de meia onda.
  6. Combine os dois raios laser com um divisor de feixe polarizador (PBS).
  7. Adicione um par de espelhos galvanômetros XY de 3 mm atrás do PBS para varredura de feixe.
  8. Use uma lente de varredura telecêntrica (L5) e uma lente de tubo corrigida pelo infinito (L6) para conjugar o espelho de varredura e a pupila traseira da lente objetiva de 25x. Expanda o raio laser pela lente de varredura e lente do tubo para preencher a abertura traseira do objetivo.
  9. Coloque um PBS ou espelho dicroico (D2) entre a lente do tubo e a lente objetiva para coleta de sinal de SRS ou fluorescência. Use uma nadadeira motorizada para alternar entre PBS e D2.
    NOTA: Parte do sinal SRS espalhado por trás é perdida ao passar pelo PBS como resultado de sua polarização deslocada aleatoriamente.
  10. Use um par de lentes (L7 e L9) para estreitar o feixe de detecção e conjugar a pupila traseira da lente objetiva de 25x com um sensor fotodiode.
  11. Use um par de lentes (L8 e L10) para estreitar o feixe de detecção e conjugar a pupila traseira do objetivo de 25x com a superfície de detecção do fotomultiplier (PMT).
  12. Use um espelho dicroico (D3) para separar o caminho de detecção de sinais de fluorescência e SRS.
  13. Coloque um conjunto de filtro (Fs1) na frente do detector de fotodiodos para bloquear o laser stokes e passe apenas o feixe da bomba.
  14. Coloque um conjunto de filtro (Fs2) em frente ao detector PMT para passar apenas o sinal de fluorescência alvo.
  15. Conecte o PMT a um amplificador de corrente para amplificação de sinal.
  16. Conecte o fotodiodo a um amplificador de travamento.
  17. Conecte o sinal de sincronização da saída EOM incorporada à entrada de referência do amplificador de travamento para desmodulação de sinal SRS.
  18. Conecte as saídas do amplificador PMT e do amplificador de travamento ao módulo de aquisição de dados.

2. Calibração do sistema de microscópio TPEF-SRS

  1. Startup dos lasers
    1. Mude a chave de posição standby para on para ligar o ti: laser de safira e esperar por 30 minutos para o laser aquecer.
    2. Ligue o OPO clicando no botão Iniciar no painel de controle OPO e espere 20 minutos para que o laser aqueça.
    3. Depois que o laser ps se aquecer, use um fotodetetor de alta velocidade para verificar a profundidade de modulação do feixe stokes. Abra o obturador laser para o raio Stokes. Clique na caixa De alimentação OPO e digite 20. Coloque o fotodetector de alta velocidade na saída OPO para detectar o feixe. Conecte a porta de saída do fotodetetor à porta de entrada de um osciloscópio usando um cabo coaxial com o conector Bayonet Neill-Concelman (BNC) para monitorar o pulso laser.
    4. Abra a janela EOM Control no software de controle OPO. Ajuste a potência e a fase do EOM de acordo com o diagrama de intensidade de pulso mostrado no osciloscópio para alcançar a profundidade máxima de modulação a 20 MHz.
      NOTA: O desempenho do EOM é geralmente estável e só precisa ser verificado quando o sinal SRS é encontrado significativamente diminuído.
  2. Alinhamento óptico do microscópio combinado TPEF-SRS
    1. Realize o alinhamento óptico para colocalização dos feixes ps e fs, conforme descrito nas etapas 2.2.2 a 2.2.13.
    2. Abra o obturador a laser da bomba enquanto para a saída de Stokes no software de controle OPO. Use o software de controle OPO para definir o comprimento de onda do feixe da bomba para 796 nm clicando na caixa Definir sinal e digitando o valor do comprimento de onda 796. Clique na caixa De potência OPO e digite 20 para definir sua potência ao mínimo (~20 mW) para alinhamento óptico.
    3. Ligue o computador do microscópio e todos os componentes eletrônicos associados, incluindo scanners, atuadores objetivos, fotodiodos, PMTs, amplificadores atuais, amplificadores de travamento e nadadeiras motorizadas. Inicie o software de controle de microscópio.
      NOTA: O software de controle de microscópio é uma interface caseira.
    4. Coloque duas placas de alinhamento (P1 e P2 na Figura 1) no caminho óptico. Coloque P1 atrás da PBS a uma distância de cerca de 10 cm e coloque P2 atrás de P1 a uma distância de cerca de 30 cm.
      NOTA: Os feixes ps e fs são combinados usando um PBS (Figura 1). As duas placas de alinhamento são usadas para verificar o alinhamento, bem como a colocalização dos dois raios laser.
    5. Abra o obturador do microscópio para o raio laser ps.
    6. Ajuste o espelho M1 para localizar o centro de raios laser ps no buraco de P1. Use um escopo infravermelho (IR) para observar a posição do ponto de feixe em P1 ao ajustar o espelho M1.
    7. Ajuste o espelho M2 para localizar o centro de raios laser ps no buraco de P2. Use o escopo IR para observar a posição do ponto de feixe em P2 ao ajustar o espelho M2.
    8. Repita as etapas 2.2.6 e 2.2.7 até que o centro de feixe ps se localize no buraco de ambas as placas de alinhamento. Feche o obturador do feixe ps no software de controle de microscópio.
    9. Defina o comprimento de onda de fs Ti: laser de safira a 740 nm e abra o obturador a laser. Defina a potência laser para 5 mW (medida na porta de entrada do sistema de microscópio) para alinhamento óptico.
    10. Abra o obturador de microscópio para o raio laser fs.
    11. Ajuste o espelho M3 para localizar o centro de ponto do raio laser fs no buraco de P1.
    12. Ajuste o espelho M4 para localizar o centro de ponto do feixe de laser no buraco do P2.
    13. Repita as etapas 2.2.11 e 2.2.12 até que o centro de raios laser fs se localize nos buracos de duas placas de alinhamento. Feche o obturador de microscópio para o feixe fs.
    14. Realize sobreposição espacial da bomba e dos feixes de Stokes, conforme descrito nas etapas 2.2.15 a 2.2.18.
      NOTA: Embora os feixes de bomba e Stokes estejam aproximadamente sobrepostos dentro do laser ps, é necessário ajuste fino das posições dos dois raios laser para obter o desempenho ótimo do SRS. Uma vez que o feixe da bomba está em primeiro lugar alinhado como descrito anteriormente, o próximo feixe stokes é ajustado para colocarlize com o feixe da bomba.
    15. Coloque uma câmera na posição do objetivo de visualizar a localização de dois pontos de viga. Marque a posição do feixe da bomba na tela da câmera como referência.
    16. Coloque uma placa de alinhamento P0 antes de L3 (Figura 1). Use uma chave hexabil para ajustar o espelho óptico 1 (OM1) para que o centro de feixe stokes passe pelo orifício da placa de alinhamento e coloque com o feixe da bomba na porta de saída do laser. Use o escopo IR para confirmar a posição da mancha de feixe em P0 durante o ajuste.
      NOTA: OM1 e OM2 são dois espelhos na cabeça OPO para ajustar a posição do feixe stokes de 1031 nm.
    17. Remova a placa de alinhamento P0 e use a tecla hexais para ajustar o OM2 de modo que o centro do feixe stokes se colocalize com a marca de referência do feixe da bomba na câmera.
    18. Repita os passos 2.2.16 e 2.2.17 até que o feixe de Stokes se sobreponha estritamente com o feixe da bomba em ambos os planos P0 e câmera.
      NOTA: Ao visualizar as manchas do feixe na câmera, todas as placas de alinhamento devem ser removidas do caminho óptico.
  3. Otimizar as condições de imagem
    1. Realize o ajuste de fase do amplificador de travamento conforme descrito nas etapas 2.3.2. para 2.3.7.
      NOTA: A detecção de SRS é baseada em um esquema sensível a fases de alta frequência. Para detecção de SRL, a intensidade do feixe stokes é modulada a 20 MHz e um amplificador de travamento é usado para desmodular o sinal. A fase e o deslocamento do amplificador de travamento precisam ser ajustados para alcançar o contraste de imagem ideal.
    2. Abra o software de controle do amplificador de travamento.
    3. Defina o comprimento de onda do laser da bomba para 796 nm e a potência da bomba e do feixe de Stokes seja de 15 mW e 25 mW na amostra, respectivamente.
      NOTA: Aqui use azeite para otimização e calibração de imagens SRS. O pico raman de azeite na região carbono-hidrogênio é de 2863,5 cm-1, correspondendo ao comprimento de onda do feixe da bomba a 796 nm.
    4. Sele o azeite em um slide e conecte um papel de tecido dobrado na parte inferior do slide para melhorar a contra-queda do sinal para detecção epi-SRS. Coloque a amostra de azeite no palco e ajuste o foco do objetivo de 25x na amostra.
    5. Use o software de controle de microscópio para definir os parâmetros de imagem da seguinte forma: 512 x 512 pixels para 500 μm x 500 μm de campo de visão (FOV), 6,4 μs de pixel. Use o software de controle do amplificador lock-in para definir o valor constante de tempo para 10 μs, o que é próximo do tempo de moradia do pixel.
    6. Escaneie o raio laser sobre a amostra. Use o software de controle do amplificador de travamento para ajustar a fase (0-180°) com um tamanho de passo de 22,5° até que a intensidade do sinal SRS atinja o máximo.
      NOTA: Neste amplificador de travamento totalmente analógico, a saída do sinal é o componente em fase, que depende da fase do sinal de referência. A fase pode ser ajustada pelo software de controle do amplificador lock-in com resolução de 11°, permitindo maximizar o sinal detectado para dentro de ~2%12. O amplificador de travamento fica fora de fase assim que o sinal de sincronização é interrompido. A fase precisa ser reajustada toda vez que o sinal de sincronização for restabelecido.
    7. Escaneie a amostra com obturador a laser fechado. Use o software de controle do amplificador lock-in para ajustar o valor de deslocamento com um tamanho de passo de 1 mV até que o sinal SRS médio esteja próximo de zero.
      NOTA: O sinal srs médio é estimado como a intensidade média de todos os pixels na imagem SRS, que é calculada automaticamente pelo software de controle de microscópio. Compensações são úteis para cancelar sinais indesejados de formação de fase.
    8. Realizar otimização de sincronização temporal conforme descrito nas etapas 2.3.9 a 2.3.14.
    9. Abra o diálogo Delay Manager (Figura 2) no software de controle OPO.
    10. Escaneie o azeite e ajuste o estágio de atraso até que o sinal SRS de azeite atinja seu máximo.
      NOTA: Pela primeira vez da imagem SRS, quando a fase do amplificador de travamento não foi otimizada, a sincronização temporal é ajustada primeiro aproximadamente para visualizar o sinal SRS da amostra antes de otimizar a fase do amplificador de travamento.
    11. Pare de digitalizar e clique no botão Adicionar dados no diálogo do gerenciador de atraso para registrar os dados de atraso atuais.
    12. Repita os passos 2.3. 10 e 2.3.11 para diferentes amostras químicas em diferentes comprimentos de onda.
      NOTA: Contas de poliestireno, água pesada, 5-Ethynyl-2'-desoxyuridina, glicerol são usados para medir os dados de atraso em diferentes bandas vibracionais.
    13. Selecione o Data Fit e o Order 5 no diálogo do gerenciador de atraso para se adequar aos pontos de dados atuais com a função polinómica de quinta ordem. Aplique os dados instalados clicando no botão Usar como personalizado e verificar a caixa de seleção. A etapa de atraso será ajustada automaticamente em diferentes comprimentos de onda de acordo com a curva de atraso instalada.
    14. Salve todos os dados de atraso em um arquivo de texto, que podem ser carregados para uso futuro.

3. Preparação cirúrgica do rato para fluorescência in vivo e imagem srs

  1. Esterilize todas as ferramentas necessárias, incluindo bisturis, tesouras de mola, fórceps, tampas e almofadas de gaze.
  2. Desinfetar todas as superfícies, que seriam tocadas durante a cirurgia com 70% de etanol. Cubra a área de trabalho do banco com cortinas estéreis. Coloque uma almofada de aquecimento sob a cortina.
  3. Use Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 camundongos transgênicos que expressam proteína de fluorescência amarela aprimorada (EYFP) em neurônios aferentes de gânglio dorsal para imagem da medula espinhal in vivo . Pesar o camundongo e induzir a anestesia por injeção intraperitoneal (i.p.) da mistura cetamina-xilazina (87,5 mg kg-1 e 12,5 mg kg-1).
  4. Aperte o dedo do mouse para garantir anestesia profunda. Suplemente com metade da dose original dos anestésicos, se necessário. Aplique pomada nos olhos do rato para evitar o ressecamento da córnea.
  5. Raspe o cabelo na parte de trás acima da coluna torácica e, em seguida, remova completamente o cabelo usando creme de depilação. Desinfete a área raspada com solução de iodo.
  6. Faça uma pequena incisão midline (~1,5 cm) da pele sobre a vértebra T11-T13 com um bisturi.
  7. Incisar músculos e tendões tanto em cima quanto em lados da vértebra T11-T13 com tesouras de mola e fórceps. Exponha as três vértebras adjacentes. Use gazepads estéreis e soro fisiológico estéril para controlar o sangramento e limpar o local cirúrgico.
  8. Estabilize a coluna vertebral com a ajuda das duas barras laterais de aço inoxidável em um estágio de estabilização personalizado (Figura 2B).
  9. Use um fípnico número 2 para realizar uma laminectomia em T12. Use cuidadosamente o pedacinho para quebrar a peça de lamina por peça até que toda a lâmina da vértebra T12 seja removida.
  10. Lave o sangue sobrevoando a medula espinhal com soro fisiológico estéril e use a almofada de gaze para absorver o excesso de fluido. Aplique pressão no local do sangramento com um pedaço de gaze para controlar o sangramento.
  11. Coloque uma mancha de cobertura (22 x 22 mm) na barra de fixação e encha o interespaço entre a tampa e a medula espinhal com soro fisiológico.

4. In vivo TPEF-SRS imagem de medula espinhal do rato

  1. Monte o estágio de estabilização em um estágio de cinco eixos abaixo do microscópio TPEF-SRS.
    NOTA: O estágio de cinco eixos permite a tradução de três eixos e o movimento de flexão de arremesso e rolo de ±5°.
  2. Fixar a cabeça do mouse com duas barras de cabeça e baixar a placa de retenção para oferecer espaço suficiente para o movimento do peito durante a respiração, aliviando artefatos de movimento.
  3. Insira uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter o mouse aquecido durante a imagem.
  4. Ajuste o estágio translacional z para ajustar o foco até que a imagem de campo brilhante da vasculatura da medula espinhal possa ser observada sob um objetivo de 10x.
  5. Localize a veia dorsal da medula espinhal no centro do FOV afinando o estágio translacional de dois eixos do estágio de cinco eixos.
  6. Sintonize os ângulos de rolo e tom do estágio de cinco eixos para ajustar a superfície dorsal da medula espinhal perpendicular ao eixo objetivo com base na imagem de campo brilhante.
  7. Substitua o 10x por um objetivo de imersão de água de 25x para imagens TPEF-SRS.
  8. Defina o comprimento de onda do feixe fs para 920 nm. Sintonize a potência do feixe fs para ser de 10 mW na amostra.
  9. Coloque o comprimento de onda do feixe da bomba para 796 nm. Sintonize a potência da bomba e do feixe de Stokes a 60 mW e 75 mW na amostra, respectivamente.
    NOTA: A imagem srs da medula espinhal é realizada no número de ondas de 2863,5 cm-1, o que corresponde ao pico raman de baias de mielina na região carbono-hidrogênio com base no espectro SRS medido7,9. A potência do laser é determinada para garantir imagens TPEF-SRS de alta resolução da medula espinhal. Os danos teciduais não são observados nas condições atuais de imagem.
  10. Para imagens SRS, selecione PBS acima do objetivo usando uma nadadeira motorizada pressionando o botão Switch conectado à nadadeira motorizada.
  11. Defina os parâmetros de imagem da seguinte forma: 512 x 512 pixels para 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel de tempo de moradia, 2 μs de tempo constante.
  12. Comece a digitalizar a amostra e coloque o foco na superfície dorsal da medula espinhal.
  13. Ajuste bem o estágio de atraso pelo software de controle OPO até que o sinal máximo de SRS da medula espinhal seja alcançado.
    NOTA: Amostras biológicas podem induzir dispersão cromática extra, o estágio de atraso pode exigir ser ajustado para otimizar a sincronização temporal. No entanto, quando a imagem srs é realizada perto da superfície superior do tecido, a diferença temporal dos dois pulsos de laser introduzidos pelo tecido biológico e a janela de imagem é geralmente pequena (menos de várias centenas de fs).
  14. Para imagens TPEF, selecione o espelho dicroico D2 acima do objetivo usando uma nadadeira motorizada pressionando o botão Switch conectado à nadadeira motorizada.
  15. Defina os parâmetros de imagem e comece a digitalizar a amostra. Para capturar a pilha de imagens TPEF-SRS, adquira as imagens TPEF e SRS sequencialmente com um intervalo de 1 s na mesma profundidade antes de ir para a próxima profundidade. Os parâmetros de imagem para imagens TPEF são 512 x 512 pixels, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs de tempo de moradia.
  16. Remova o animal da fase de estabilização depois que todas as imagens forem coletadas.
  17. Limpe o tecido exposto lavando soro fisiológico e absorva o excesso de fluido usando uma almofada de gaze. Aplique gel de silicone na medula espinhal exposta e espere ~5 minutos até que ele fique curado.
  18. Sutura a pele com sutura cirúrgica nº 6-0 para fechar a ferida. Aplique creme de queimado na pele do local cirúrgico para prevenir a infecção. Administrar tratamento analgésico subcutâneamente (0,1 mg/kg buprenorfina).
  19. Coloque o animal em uma gaiola limpa e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento até que o rato se recupere totalmente da anestesia.
  20. Repita a administração analgésico a cada 12 horas durante 3 dias após a cirurgia.
  21. Feche o obturador de OPO e fs laser. Coloque ao máximo a potência da bomba e o feixe de Stokes.
    NOTA: Definir a potência máxima antes de desligar o laser é benéfico para a manutenção do laser.
  22. Defina o comprimento de onda do feixe da bomba e fs laser para 800 nm.
  23. Defina os dois lasers em prontidão, feche todo o software de controle eletrônico e desligue todos os equipamentos associados.

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Representative Results

A imagem dual-modal in vivo de axônios espinhais, bem como baiatas de mielina é conduzida usando os camundongos transgênicos Thy1-YFPH, que expressam EYFP em neurônios aferentes neurônios aferentes de gânglios de raiz dorsal (Figura 3). Estes neurônios rotulados retransmitem as informações sensoriais do nervo periférico para a medula espinhal, com o ramo central localizado na coluna dorsal da medula espinhal. Com o microscópio TPEF-SRS, a baátima de mielina densamente distribuída pode ser claramente visualizada usando imagens SRS sem rótulo, e axônios YFP pouco rotulados podem ser observados usando imagens TPEF. É revelado pela imagem de modelo duplo que os axônios são intimamente embrulhados por uma espessa camada de baias de mielina (Figura 3C). Os nódulos de Ranvier (NR), onde o axolemma é nu da baia de mielina, desempenham um papel essencial na rápida propagação de potenciais de ação. Como pode ser visto na imagem da medula espinhal TPEF-SRS (Figura 3C), nR mostram diâmetro axonal diminuído e axolemma diretamente exposto à matriz extracelular. É essencial imaginar os axônios junto com as baátos de mielina circundante para confirmar a existência e localização da NR. Portanto, a microscopia TPEF-SRS permite observar as mudanças dinâmicas dos axônios e baias de mielina no desenvolvimento de distúrbios da medula espinhal, o que é significativo para entender os mecanismos da dinâmica celular.

Figure 1
Figura 1: O diagrama esquemático do sistema de microscópio TPEF-SRS. As vigas da bomba e de Stokes são combinadas com um espelho dicroico (D1) no laser picosegundo (ps). O feixe de ps e femtosegud (fs) são colididos e expandidos/estreitos por um par de lentes (L3, L4 e L1, L2, respectivamente) para combinar com os espelhos galvanômetros de 3 mm XY-scan. O feixe fs é girado da polarização horizontal para vertical por uma placa de meia onda (HWP) e, em seguida, combinado com o feixe de ps por um divisor de feixe polarizador (PBS). Os espelhos de varredura e a pupila traseira da lente objetiva são conjugados por uma lente de varredura telecêntrica L5 e uma lente de tubo corrigida pelo infinito L6. O raio laser é expandido pela lente de varredura e tubo para preencher a abertura traseira do objetivo de 25x. Para imagens estimuladas de dispersão de Raman (SRS), o feixe de bomba recuado coletado pelo objetivo é refletido por um PBS e direcionado para uma grande área (10 mm x 10 mm) fotodioda de silício (DP). Para imagens de dois fótons, o sinal de fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) é refletido por um divisor de feixedicróico D2 para a unidade de fotodesetecção. Um módulo fotomultiplier atual (PMT) é usado para detectar o sinal TPEF. Abreviaturas-L1-L10: lentes; OL: lente objetiva; D1-D3: espelhos dicroicos; Fs1, Fs2: conjuntos de filtros; M: espelhos; OM1, OM2: espelhos ópticos; P0-P2: placas de alinhamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A interface do gerenciador de atrasos no software de controle OPO. A seta vermelha indica a caixa de verificação para aplicar os dados de atraso calibrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: In vivo TPEF-SRS imagem da medula espinhal do rato. (A) Diagrama esquemático da preparação cirúrgica da medula espinhal do camundongo e da imagem de campo brilhante da medula espinhal. (B) Esquema de montagem do mouse para imagem in vivo da medula espinhal. (C) Imagens de projeção maximal z de axônios e baias de mielina na medula espinhal do camundongo. Pontas de flecha branca indicam a localização de um nó de Ranvier. As imagens srs da mielina são tiradas no turno raman de 2863,5 cm-1. A Figura A foi criada usando BioRender (https://biorender.com/).  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste protocolo, a configuração básica do microscópio TPEF-SRS é descrita em detalhes. Para a imagem srs, os feixes de bomba e Stokes são temporalmente e espacialmente sobrepostos dentro do OPO. No entanto, essa sobreposição pode ser interrompida após passar pelo sistema de microscópio. Portanto, tanto a otimização espacial quanto temporal da colocalização das vigas da bomba e dos feixes de Stokes é necessária e fundamental para alcançar a imagem ótima do SRS. O atraso temporal entre a bomba e o feixe de Stokes está relacionado com a diferença óptica de caminho dos dois feixes, que é determinada pela dispersão de elementos ópticos no sistema de microscópio38. Quando o comprimento de onda do feixe da bomba é ajustado para imagens SRS em diferentes mudanças raman, o comprimento óptico do caminho do feixe de bomba muda de acordo porque o índice de refração das lentes ópticas depende do comprimento de onda38. Portanto, o atraso temporal entre a bomba e o pulso laser de Stokes muda com o comprimento de onda do feixe da bomba e, portanto, precisa ser calibrado. O OPO é equipado com uma linha de atraso controlada por software para sincronização temporal da bomba e do feixe stokes. Para a mesma configuração óptica, os dados de atraso permanecem estáveis e só precisam ser calibrados uma vez. Como resultado, os dados de atraso em diferentes comprimentos de onda do feixe da bomba podem ser salvos na primeira medição para uso futuro. Os dados de atraso calibrados podem ser aplicados automaticamente pelo software de controle OPO quando o comprimento de onda do feixe da bomba é alterado, o que é conveniente para imagens SRS em diferentes turnos de Raman ou imagens srs hiperespectrais. Para a imagem TPEF-SRS, a sobreposição espacial rigorosa dos feixes ps e fs após a combinação é um passo crítico para evitar qualquer mudança de FOV entre os dois modelos de imagem. Em primeiro lugar, o feixe de bomba ps e o feixe fs estão alinhados para garantir que ambos estejam no eixo óptico do sistema de microscópio, o que é fundamental para evitar qualquer mudança FOV ao alternar os dois modelos de imagem. Em seguida, usando o feixe da bomba como referência, a posição do feixe de Stokes é ajustada de acordo para alcançar uma colocalização espacial rigorosa. Cada procedimento de alinhamento requer vários ensaios para alcançar o ideal.

Se o sinal SRS diminuir significativamente, o valor de fase do amplificador de bloqueio e os dados de atraso de tempo devem ser verificados primeiro. Uma vez que o amplificador de travamento sai da fase uma vez que o sinal de sincronização é interrompido, o valor de fase requer reajuste sempre que sua fonte de alimentação ou sinal de sincronização EOM é interrompido. A sincronização temporal da bomba e do feixe de Stokes pode ser rapidamente verificada ajustando ligeiramente a linha de atraso dentro do OPO. Se os dados calibrados de atraso de tempo estiverem longe do valor ideal, uma varredura zero deve ser realizada para recalibrar o deslocamento de atraso clicando no botão Zero Scan no diálogo do gerenciador de atraso. Todo o procedimento de varredura zero leva cerca de 10 minutos. Se o sinal SRS não se recuperar após a otimização da fase e do valor de atraso de tempo, a modulação EOM do feixe de Stokes deve ser verificada conforme descrito nas etapas 2.1.3-2.1.4. Se a taxa de extinção for muito inferior a 10 dB com a observação de pequenos picos de pulso na posição de fora do trem de pulso Stokes, o EOM deve ser reiniciado, e o poder de modulação e a fase devem ser reajustados para alcançar a profundidade máxima de modulação. Normalmente, o problema de modulação pode ser resolvido redefinindo o EOM. Caso não, deve ser necessário suporte técnico do fabricante.

Para imagens de tecido espesso in vivo, o modo de detecção epi-SRS deve ser usado. Neste protocolo, um PBS é usado para passar o laser de excitação e refletir o sinal SRS espalhado para trás para o detector. O sinal SRL detectado depende do recuo do feixe de bomba para a frente por tecidos. Os lasers de excitação têm polarização linear e podem passar totalmente pelo PBS, enquanto o feixe de costas mudou a polarização e, portanto, só pode ser parcialmente refletido pela PBS. Portanto, o atual esquema de coleta de sinal mostra menor eficiência em relação à estratégia que coloca diretamente um fotodetetor anular na frente do objetivo12. No entanto, devido à forte dispersão dos tecidos ricos em lipídios39, imagens srs de alta relação sinal-ruído (512 x 512 pixels) da medula espinhal podem ser adquiridas com tempo de integração de 1-2 s, tornando este esquema de coleta baseado em PBS uma abordagem apropriada para a imagem da medula espinhal. Por outro lado, porém, a forte dispersão tecidual limita a profundidade de penetração da luz. Tanto para a imagem SRS quanto para TPEF, a profundidade de imagem da medula espinhal é limitada a cerca de 50 μm.

O procedimento de imagem sequencial para imagem SRS e TPEF é a principal limitação do método de imagem dual-modal atual. No protocolo, as imagens TPEF e SRS são realizadas no mesmo local sequencialmente com um intervalo de 1 s, alternando automaticamente a nadadeira motorizada. Artefatos de movimento podem causar uma fusão imperfeita das imagens TPEF e SRS, o que limita a capacidade deste método para imagens de processos ou tecidos altamente dinâmicos em grande parte afetados pela respiração e batimentos cardíacos dos animais. Uma solução possível é coletar a fluorescência de dois fótons excitada a laser do ps simultaneamente durante a imagem srs9. No entanto, este método só é aplicável às estruturas biológicas com fortes sinais de fluorescência, uma vez que o pulso ps tem uma eficiência de excitação de fluorescência muito menor em comparação com o pulso fs14. Alternativamente, o problema pode ser resolvido utilizando um sistema fs-SRS22,40, onde a fonte de laser fs permite a excitação simultânea dos sinais SRS e TPEF efetivamente, em detrimento da baixa resolução espectral da imagem SRS. Outra solução é usar a fluorescência de ressonância magnética do ps a laser obtida durante a imagem srs como referência para registrar as imagens de fs fluorescência. Como mostrado na Figura 3, esta estratégia de registro funciona bem se não ocorrer nenhum movimento significativo durante a srs e a imagem de fluorescência.

A SRS apresenta vantagens únicas em imagens biológicas, uma vez que fornece informações químicas de biomoléculas com base em seu mecanismo específico de contraste sem rótulo41. Em comparação com os CARS que também foram combinados com o TPEF para imagens NLO multimodal, o SRS mostrou melhor capacidade espectral e de interpretação de imagem11. Portanto, tem sido amplamente aplicado para imagem lipid9,11, proteína42,43, DNA44, e componentes bio-ortogonais contendo alkyne (C ≡ C)13,45, carbono-deutério (C−D)9,46 e ligações oxigênio-deutério (O-D)47,48 em tecidos biológicos. Neste protocolo, utilizamos uma fonte de laser ps para imagem SRS e uma fonte de laser fs para imagem TPEF, que combina as vantagens da excitação eficiente da fluorescência e alta resolução espectral de Raman, permitindo uma diferenciação efetiva de diversas biomoléculas42,44. Na medula espinhal, interações complexas de microambiente celular envolvendo células gliais, neurônios e células imunes recrutadas contribuem para a progressão de lesões49 e doenças50. Combinada com várias sondas de fluorescência e ressonância magnética, a microscopia TPEF-SRS pode alcançar imagens simultâneas de várias estruturas celulares, bem como seus distintos componentes biomoléculas, o que pode facilitar significativamente nossa compreensão do início e desenvolvimento de distúrbios da medula espinhal.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar e não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong através de subsídios 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, a Comissão de Inovação e Tecnologia (ITCPD/17-9), a Área de Excelência do Comitê de Subsídios Universitários (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) e a Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong (HKUST) através da concessão RPC10EG33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

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References

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Bioengenharia Edição 178
<em>In vivo</em> Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada
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