Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vivo Avbildning av biologisk vev med kombinert to-foton fluorescens og stimulert ramanspredningsmikroskopi

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi tillater etikettfri avbildning av biomolekyler basert på deres iboende vibrasjon av spesifikke kjemiske bindinger. I denne protokollen er det instrumentelle oppsettet av et integrert SRS og to-foton fluorescensmikroskop beskrevet for å visualisere cellulære strukturer i ryggmargen til levende mus.

Abstract

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi muliggjør etikettfri avbildning av det biologiske vevet i sitt naturlige mikromiljø basert på iboende molekylær vibrasjon, og gir dermed et perfekt verktøy for in vivo-studie av biologiske prosesser ved subcellulær oppløsning. Ved å integrere to-foton spent fluorescens (TPEF) bildebehandling i SRS mikroskop, dual-modal in vivo avbildning av vev kan skaffe kritisk biokjemisk og biofysisk informasjon fra flere perspektiver som bidrar til å forstå de dynamiske prosessene involvert i cellulær metabolisme, immunrespons og vev ombygging, etc. I denne videoprotokollen introduseres oppsettet av et TPEF-SRS-mikroskopsystem samt in vivo-avbildningsmetoden til dyrets ryggmarg. Ryggmargen, som en del av sentralnervesystemet, spiller en kritisk rolle i kommunikasjonen mellom hjernen og perifert nervesystem. Myelinhylse, rikelig i fosfolipider, omgir og isolerer axonen for å tillate saltatorisk ledning av virkningspotensialer. In vivo avbildning av myelinhylser i ryggmargen er viktig for å studere utviklingen av nevrodegenerative sykdommer og ryggmargsskade. Protokollen beskriver også dyreforberedelse og in vivo TPEF-SRS avbildningsmetoder for å skaffe seg biologiske bilder med høy oppløsning.

Introduction

Raman mikroskopi1,2 fremstår som en kraftig etikettfri metode for å avbilde biologisk vev basert på de karakteristiske frekvensene av ulike kjemiske bindinger i biomolekyler. På grunn av sin ikke-invasive og godt adaptive bildebehandlingsevne har Raman-mikroskopi blitt mye brukt til å avbilde lipidberikede komponenter i biologisk vev som myelinhylse3,4,5, adipocytter6,7 og lipiddråper8,9,10 . Stimulert Raman spredning (SRS) signal ervervet som stimulert Raman gain (SRG) eller stimulert Raman tap (SRL) er bakgrunnsfri, viser perfekt spektral likhet med spontan Raman spredning11,12. I tillegg er SRL og SRG lineært avhengige av analyttkonsentrasjonen, noe som muliggjør kvantitativ analyse av biokjemiske komponenter9,11,13. To-foton spent fluorescensmikroskopi (TPEF) har blitt mye brukt til in vivo biologisk avbildning på grunn av sin iboende optiske seksjoneringsevne, dyp penetrasjonsdybde og lav fototoksisitet14,15,16. Ytelsen til TPEF-avbildning avhenger imidlertid av egenskapene til fluorescerende koder, og antall løselige farger er begrenset på grunn av bredbåndsfluorescensspektraet8,17,18,19. Etikettfri SRS-avbildning og fluorescensbasert TPEF-avbildning er to komplementære bildemodaliteter, og deres kombinasjon kan gi rikelig biofysisk og biokjemisk informasjon om vev. Disse to bildemodalitetene er begge basert på de ikke-lineære optiske (NLO) prosessene, noe som muliggjør enkel integrasjon i ett mikroskopsystem. Kombinasjonen av SRS- og TPEF-avbildningen, den såkalte dual-modale avbildningen, muliggjør høydimensjonal avbildning og profilering av celler og vev, noe som letter en omfattende forståelse av komplekse biologiske systemer. Nærmere bestemt kan picosecond (ps) SRS-mikroskopi oppnå kjemisk bindingsavbildning med høy spektral oppløsning sammenlignet med femtosecond (fs) SRS-teknikk11, noe som gjør det mulig å skille mellom flere biokjemiske komponenter i biologisk vev, spesielt i det overfylte fingeravtrykkområdet20,21. I tillegg, sammenlignet med et annet ofte brukt dobbeltmodalt NLO-mikroskopsystem med integrasjon av sammenhengende anti-Stokes spredningsmikroskop (CARS), viser SRS overlegen ytelse til CARS når det gjelder spektral- og bildetolkning samt deteksjonsfølsomhet11. SRS-TPEF mikroskopet har blitt brukt som et kraftig verktøy for å studere ulike biologiske systemer, for eksempel Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, mus hjerne23,24, ryggmargen25,26, perifer nerve27, og fettvev7, etc.

Ryggmargen sammen med hjernen utgjør sentralnervesystemet (CNS). Visualisering av cellulære aktiviteter i CNS in vivo under fysiologiske og patologiske forhold er avgjørende for å forstå mekanismene for CNS-lidelser28,29,30 og for å utvikle tilsvarende terapier31,32,33. Myelinhylse, som vikler og isolerer aksoner for høyhastighets handling potensiell ledning, spiller en betydelig rolle i utviklingen av CNS. Demyelinasjon er tenkt som et kjennetegn i hvite materieforstyrrelser, for eksempel multippel sklerose34. I tillegg, etter ryggmargsskade35, kan myelinrester modulere makrofagaktivering, noe som bidrar til kronisk betennelse og sekundær skade36. Derfor er in vivo-avbildning av myelinhylse sammen med nevroner og glialceller i levende musemodeller til stor hjelp for å forstå de dynamiske prosessene i CNS-lidelser.

I denne protokollen beskrives de grunnleggende oppsettsprosedyrene for et hjemmebygd TPEF-SRS-mikroskop, og de doble modale in vivo-avbildningsmetodene for musens ryggmarg introduseres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer som utføres i dette arbeidet utføres i henhold til retningslinjene fra Laboratory Animal Facility ved Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) og er godkjent av Animal Ethics Committee of HKUST. Sikkerhetsopplæring for laserhåndtering er nødvendig for å sette opp og betjene TPEF-SRS mikroskopet. Bruk alltid lasersikkerhetsbriller med passende bølgelengdeområde når du arbeider med laser.

1. Oppsett av TPEF-SRS mikroskopet (for oppsett skjematisk se figur 1)

  1. Bruk en integrert optisk parametrisk oscillator (OPO) koblet til en moduslåst Ytterbium fiberlaser som ps laserkilde for SRS-avbildning.
    MERK: OPO sender ut en Stokes-stråle (1031 nm) og en pumpestråle (justerbar fra 780 nm til 960 nm) med 2 ps pulsvarighet og 80 MHz repetisjonshastighet. Stokes-strålen er modulert på 20 MHz av en innebygd elektrooptisk modulator (EOM) for høyfrekvent fasesensitiv SRS-deteksjon på MHz-nivå.
  2. Bruk en fs titan (Ti): safirlaser som laserkilde for TPEF-avbildning.
  3. Bruk et par linser (L1 og L2) til å kollatere og justere størrelsen på fs-strålen til 3 mm.
  4. Bruk et par linser (L3 og L4) for å kollatere PS-laserstrålen og utvide diameteren til 3 mm.
  5. Endre polariseringen av fs laserstrålen fra p polarisering til polarisering ved hjelp av en halvbølgeplate.
  6. Kombiner de to laserstrålene med en polariserende strålesplitter (PBS).
  7. Legg til et par 3 mm XY-scan galvanometerspeil bak PBS for stråleskanning.
  8. Bruk en telesentrisk skannelinse (L5) og en uendelig korrigert rørlinse (L6) for å konjugere skannespeilet og den bakre eleven på den 25x objektive linsen. Utvid laserstrålen med skannelinsen og rørlinsen for å fylle bakåpningen til målet.
  9. Plasser et PBS- eller dikroisk speil (D2) mellom rørlinsen og objektivlinsen for SRS- eller fluorescenssignalsamling. Bruk en motorisert flipper for å bytte mellom PBS og D2.
    MERK: En del av det bakoverspredningsbaserte SRS-signalet går tapt når det passerer gjennom PBS som følge av den tilfeldig forskjøvet polariseringen.
  10. Bruk et par linser (L7 og L9) for å begrense deteksjonsstrålen og konjugere den bakre pupillen på den 25x objektive linsen med en fotodiodesensor.
  11. Bruk et par linser (L8 og L10) for å begrense deteksjonsstrålen og konjugere den bakre eleven av 25x-målet med deteksjonsoverflaten til fotomultiplieret (PMT).
  12. Bruk et dikroisk speil (D3) for å skille deteksjonsbanen til fluorescens- og SRS-signaler.
  13. Plasser et filtersett (Fs1) foran fotodiodedetektoren for å blokkere Stokes-laseren og bare passere pumpestrålen.
  14. Plasser et filtersett (Fs2) foran PMT-detektoren for å bare sende målfluorescenssignalet.
  15. Koble PMT til en strømforsterker for signalforsterkning.
  16. Koble fotodioden til en innlåsingsforsterker.
  17. Koble synkroniseringssignalet fra den innebygde EOM-utgangen til referanseinngangen til låseforsterkeren for SRS-signaldemodulering.
  18. Koble PMT-forsterkeren og låseforsterkerutgangene til datainnsamlingsmodulen.

2. Kalibrering av TPEF-SRS-mikroskopsystem

  1. Oppstart av lasere
    1. Sett nøkkelbryteren fra standby til på-posisjon for å slå på ti: safirlaseren og vent i 30 minutter til laseren varmes opp.
    2. Slå på OPO ved å klikke på Start-knappen på OPO-kontrollpanelet og vent i 20 minutter til laseren varmes opp.
    3. Når ps-laseren er varmet opp, bruk en høyhastighets fotodetektor for å sjekke modulasjonsdybden til Stokes-strålen. Åpne laserlukkeren for Stokes-strålen. Klikk på Set OPO Power-boksen og skriv inn 20. Plasser høyhastighets fotodetektoren ved OPO-utgangen for å oppdage strålen. Koble utgangsporten til fotodetektoren til inngangsporten til et oscilloskop ved hjelp av en koaksialkabel med Bayonet Neill-Concelman (BNC)-kontakt for å overvåke laserpulsen.
    4. Åpne EOM Control-vinduet i OPO-kontrollprogramvaren. Juster EOM-kraften og -fasen i henhold til pulsintensitetsdiagrammet som vises på oscilloskopet for å oppnå maksimal modulasjonsdybde ved 20 MHz.
      MERK: EOM-ytelsen er vanligvis stabil og trenger bare å kontrolleres når SRS-signalet blir funnet betydelig redusert.
  2. Optisk justering av det kombinerte TPEF-SRS-mikroskopet
    1. Utfør optisk justering for colokalisering av ps- og fs-bjelkene som beskrevet i trinn 2.2.2 til 2.2.13.
    2. Åpne pumpelaserlukkeren mens du stopper Stokes-utgangen i OPO-kontrollprogramvaren. Bruk OPO-kontrollprogramvare til å sette bølgelengden til pumpestrålen til 796 nm ved å klikke på Set Signal-boksen og angi bølgelengdeverdien 796. Klikk på Set OPO Power-boksen og skriv inn 20 for å stille inn strømmen til minimum (~ 20 mW) for optisk justering.
    3. Slå på mikroskopdatamaskinen og alle tilknyttede elektroniske komponenter, inkludert skannere, objektive aktuatorer, fotodioder, PMTer, nåværende forsterkere, låseforsterkere og motoriserte flippere. Start programvaren for mikroskopkontroll.
      MERK: Mikroskopkontrollprogramvaren er et hjemmelaget grensesnitt.
    4. Plasser to justeringsplater (P1 og P2 i figur 1) på den optiske banen. Plasser P1 bak PBS i en avstand på ca. 10 cm og plasser P2 bak P1 i en avstand på ca. 30 cm.
      MERK: Ps- og fs-bjelkene kombineres ved hjelp av en PBS (figur 1). De to justeringsplatene brukes til å kontrollere justeringen samt colokaliseringen av de to laserstrålene.
    5. Åpne mikroskopets lukker for PS-laserstrålen.
    6. Juster speilet M1 for å finne ps laserstrålesenteret ved gjennomhullet av P1. Bruk et infrarødt (IR) omfang for å observere posisjonen til strålepunktet ved P1 når du justerer speilet M1.
    7. Juster speilet M2 for å finne ps laserstrålesenteret ved gjennomhullet av P2. Bruk IR-området til å observere posisjonen til strålepunktet ved P2 når du justerer speilet M2.
    8. Gjenta trinn 2.2.6 og 2.2.7 til PS-strålesenteret befinner seg ved gjennomhullet på begge justeringsplatene. Lukk lukkeren til PS-strålen i mikroskopkontrollprogramvaren.
    9. Still inn bølgelengden til fs Ti: safirlaser på 740 nm og åpne laserlukkeren. Sett laserstrømmen til 5 mW (målt ved inngangsporten til mikroskopsystemet) for optisk justering.
    10. Åpne mikroskopets lukker for fs-laserstrålen.
    11. Juster speilet M3 for å finne fs laserstrålepunktsenter ved gjennomhullet til P1.
    12. Juster speilet M4 for å finne laserstrålen i gjennomhullet på P2.
    13. Gjenta trinn 2.2.11 og 2.2.12 til fs laserstrålesenter befinner seg ved hullene på to justeringsplater. Lukk mikroskopets lukker for fs-strålen.
    14. Utfør romlig overlapping av pumpen og Stokes bjelker som beskrevet i trinn 2.2.15 til 2.2.18.
      MERK: Selv om pumpen og Stokes-bjelkene er grovt overlappet inne i PS-laseren, er det nødvendig med finjustering av posisjonene til de to laserstrålene for å oppnå optimal SRS-ytelse. Siden pumpestrålen først er justert som tidligere beskrevet, justeres Stokes-strålen deretter for å colokalisere med pumpestrålen.
    15. Plasser et kamera i posisjonen til målet for å visualisere plasseringen av to strålepunkter. Merk posisjonen til pumpestrålen på kameraskjermen som referanse.
    16. Plasser en justeringsplate P0 før L3 (figur 1). Bruk en sekskantnøkkel til å justere det optiske speilet 1 (OM1) slik at Stokes strålesenter passerer gjennomhullet på justeringsplaten og colokaliserer med pumpestrålen ved laserutgangsporten. Bruk IR-området til å bekrefte posisjonen til strålepunktet ved P0 under justering.
      MERK: OM1 og OM2 er to speil i OPO-hodet for å justere posisjonen til 1031 nm Stokes-bjelken.
    17. Fjern justeringsplaten P0 og bruk sekskantnøkkelen til å justere OM2 slik at midten av Stokes-strålen samlokaliseres med referansemerket til pumpestrålen på kameraet.
    18. Gjenta trinn 2.2.16 og 2.2.17 til Stokes-strålen overlapper med pumpestrålen ved både P0- og kameraplan.
      MERK: Når du visualiserer stråleflekkene på kameraet, skal alle justeringsplatene fjernes fra den optiske banen.
  3. Optimalisere bildeforholdene
    1. Utfør fasejustering av låseforsterkeren som beskrevet i trinn 2.3.2. til 2.3.7.
      MERK: SRS-deteksjon er basert på et høyfrekvent fasesensitivt skjema. For SRL-deteksjon moduleres intensiteten til Stokes-strålen ved 20 MHz, og en innlåsingsforsterker brukes til å demodulere signalet. Fasen og forskyvningen til låseforsterkeren må justeres for å oppnå den optimale bildekontrasten.
    2. Åpne programvaren for innlåsingsforsterkerkontroll.
    3. Sett bølgelengden på pumpelaseren til henholdsvis 796 nm og pumpens og Stokes-strålens effekt til henholdsvis 15 mW og 25 mW på prøven.
      MERK: Her bruker du olivenolje for SRS-avbildningsoptimalisering og kalibrering. Raman-toppen av olivenolje i karbon-hydrogenområdet er på 2863,5 cm-1, tilsvarende pumpestrålebølgelengden ved 796 nm.
    4. Forsegle olivenoljen i et lysbilde og fest et brettet silkepapir til bunnen av lysbildet for å forbedre signalets backscattering for epi-SRS-deteksjon. Plasser olivenoljeprøven på scenen og juster fokuset på 25x-målet på prøven.
    5. Bruk programvaren for mikroskopkontroll til å angi bildeparameterne på følgende måte: 512 x 512 piksler for 500 μm x 500 μm synsfelt (FOV), 6,4 μs pikselbotid. Bruk programvaren for innlåsingsforsterkerkontroll til å angi tidskonstantverdien til 10 μs, som er nær pikselens oppholdstid.
    6. Skann laserstrålen over prøven. Bruk programvaren for innlåsingsforsterkerkontroll til å justere fasen (0-180°) med en trinnstørrelse på 22,5° til SRS-signalintensiteten når maksimum.
      MERK: I denne analoge innlåsingsforsterkeren er signalutgangen fasekomponenten, som er avhengig av referansesignalets fase. Fasen kan justeres av programvaren for innlåsingsforsterkerkontroll med 11° oppløsning, slik at detekterte signalet kan maksimeres til innenfor ~2%12. Innlåsingsforsterkeren kommer ut av fasen når synkroniseringssignalet er forstyrret. Fasen må justeres på nytt hver gang synkroniseringssignalet gjenopprettes.
    7. Skann prøven med laserlukker lukket. Bruk programvaren for innlåsingsforsterkerkontroll til å justere forskyvningsverdien med en trinnstørrelse på 1 mV til det gjennomsnittlige SRS-signalet er nær null.
      MERK: Det gjennomsnittlige SRS-signalet er estimert som gjennomsnittlig intensitet for alle piksler i SRS-bildet, som beregnes automatisk av mikroskopkontrollprogramvaren. Forskyvninger er nyttige for å avbryte uønskede fasesammenhengende signaler.
    8. Utfør optimalisering av tidssynkronisering som beskrevet i trinn 2.3.9 til 2.3.14.
    9. Åpne dialogboksen Forsinkelsesbehandling (figur 2) i OPO-kontrollprogramvaren.
    10. Skann olivenoljen og still inn forsinkelsesstadiet til olivenoljens SRS-signal når sitt maksimum.
      MERK: For første gangs SRS-avbildning, når fasen av låseforsterkeren ikke er optimalisert, justeres tidssynkroniseringen først grovt for å visualisere SRS-signalet til prøven før du optimaliserer fasen av låseforsterkeren.
    11. Stopp skanningen og klikk på Legg til data-knappen i forsinkelsesbehandlingsdialog for å registrere gjeldende forsinkelsesdata.
    12. Gjenta trinn 2.3. 10 og 2.3.11 for ulike kjemiske prøver ved forskjellige bølgelengder.
      MERK: Polystyrenperler, tungtvann, 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine, glyserol brukes til å måle forsinkelsesdataene ved forskjellige vibrasjonsbånd.
    13. Velg Datatilpassing og Ordre 5 i dialogboksen for forsinkelsesbehandling for å få plass til gjeldende datapunkter med den polynomiske funksjonen i femte rekkefølge. Bruk de monterte dataene ved å klikke på Bruk som egendefinert-knappen og merke av i avmerkingsboksen. Forsinkelsestrinnet justeres automatisk ved forskjellige bølgelengder i henhold til den monterte forsinkelseskurven.
    14. Lagre alle forsinkelsesdataene i en tekstfil, som kan lastes inn for fremtidig bruk.

3. Kirurgisk tilberedning av mus for in vivo fluorescens og SRS-avbildning

  1. Steriliser alle nødvendige verktøy, inkludert skalpeller, vårsaks, tang, deksler og gasbindputer.
  2. Desinfiser alle overflatene, som vil bli berørt under operasjonen med 70% etanol. Dekk arbeidsområdet på benken med sterile gardiner. Sett en varmepute under gardinen.
  3. Bruk Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgene mus som uttrykker forbedret gult fluorescensprotein (EYFP) i dorsalrot ganglion afferent nevroner for in vivo ryggmargsavbildning. Vei musen og induser bedøvelse ved intraperitoneal (dvs.) injeksjon av ketamin-xylazinblandingen (87,5 mg kg-1 og 12,5 mg kg-1).
  4. Klem tåen på musen for å sikre dyp anestesi. Supplement med halvparten av den opprinnelige dosen av bedøvelsen om nødvendig. Påfør salve på museøyne for å forhindre hornhinnen tørrhet.
  5. Barber håret på baksiden over thoracic ryggraden, og fjern deretter håret helt ved hjelp av depilerende krem. Desinfiser det barberte området med jodoppløsning.
  6. Lag et lite midtlinje snitt (~ 1,5 cm) av huden over T11-T13 vertebra med en skalpell.
  7. Øk muskler og sener både på toppen og på sidene av T11-T13 vertebra med vårsaks og tang. Utsett de tre tilstøtende ryggvirvlene. Bruk sterile gasbindputer og steril saltvann for å kontrollere blødning og rengjøre operasjonsstedet.
  8. Stabiliser ryggraden ved hjelp av de to sidestolpene i rustfritt stål på et spesialdesignet stabiliseringsstadium (figur 2B).
  9. Bruk en #2 forcep for å utføre en laminektomi på T12. Bruk forsiktig tangen til å bryte laminastykket etter stykke til hele lamina av T12 vertebra er fjernet.
  10. Vask bort blodet som overbeskyter ryggmargen med steril saltvann og bruk gasbindputen til å absorbere overdreven væske. Påfør trykk på blødningsstedet med et stykke gasbindpute for å kontrollere blødning.
  11. Plasser en deksle (22 x 22 mm) på klemmestangen og fyll mellomrommet mellom dekslene og ryggmargen med saltvann.

4. In vivo TPEF-SRS avbildning av musens ryggmarg

  1. Monter stabiliseringstrinnet på et femaksetrinn under TPEF-SRS-mikroskopet.
    MERK: Femaksetrinnet tillater treakseoversettelse og ±5° pitch og roll flexure bevegelse.
  2. Fest musehodet med to hodestenger og senk holdeplaten for å gi nok plass til brystbevegelser under pusten, noe som lindrer bevegelsesartefakter.
  3. Sett inn en varmepute under musen for å holde musen varm under bildebehandling.
  4. Juster z-translasjonsstadiet for å justere fokuset til lysfeltbildet av ryggmargens vaskulatur kan observeres under et 10x-mål.
  5. Finn ryggmargen dorsal vene i midten av FOV ved å stille inn to-aksen translasjonsstadiet av fem-akse scenen.
  6. Juster rulle- og tonehøydevinklene på femaksetrinnet for å justere ryggmargens dorsale overflate vinkelrett på målaksen basert på bildet med lyse felt.
  7. Bytt ut 10x med et 25x vanninnlevelsesmål for TPEF-SRS-avbildning.
  8. Sett bølgelengden på fs-strålen til 920 nm. Juster fs strålekraften til å være 10 mW på prøven.
  9. Sett bølgelengden på pumpestrålen til 796 nm. Juster pumpens og Stokes bjelkens kraft til henholdsvis 60 mW og 75 mW på prøven.
    MERK: Ryggmargen SRS-avbildning utføres ved bølgenummeret på 2863,5 cm-1, som tilsvarer Raman-toppen av myelinhylser i karbon-hydrogenområdet basert på den målte SRS-spektra7,9. Lasereffekten bestemmes for å sikre høyoppløselig TPEF-SRS-avbildning av ryggmargen. Vevsskade observeres ikke under gjeldende avbildningsforhold.
  10. For SRS-bildebehandling velger du PBS over målet ved hjelp av en motorisert flipper ved å trykke på Bryter-knappen som er koblet til den motoriserte flipperen.
  11. Angi bildeparameterne på følgende måte: 512 x 512 piksler for 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pikselbotid, 2 μs tid konstant.
  12. Begynn å skanne prøven og sett fokus på ryggmargens dorsale overflate.
  13. Finjuster forsinkelsesfasen av OPO-kontrollprogramvaren til maksimalt SRS-signal for ryggmargen er oppnådd.
    MERK: Biologiske prøver kan indusere ekstra kromatisk dispersjon, forsinkelsesstadiet kan kreve å bli justert for å optimalisere den tidsmessige synkroniseringen. Men når SRS-avbildning utføres nær vevets toppoverflate, er den tidsmessige forskjellen mellom de to laserpulsene introdusert av det biologiske vevet og bildevinduet vanligvis liten (mindre enn flere hundre fs).
  14. For TPEF-bildebehandling velger du dikroisk speil D2 over målet ved hjelp av en motorisert flipper ved å trykke på Bryter-knappen som er koblet til den motoriserte flipperen.
  15. Angi bildeparameterne, og begynn å skanne eksemplet. Hvis du vil ta bildestakken TPEF-SRS, må du hente TPEF- og SRS-bildene sekvensielt med et intervall på 1 s på samme dybde før du går til neste dybde. Bildeparameterne for TPEF-avbildning er 512 x 512 piksler, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pikselbotid.
  16. Fjern dyret fra stabiliseringsstadiet etter at alle bildene er samlet inn.
  17. Rengjør det eksponerte vevet ved å skylle saltvann og absorbere overflødig væske ved hjelp av en gasbindpute. Påfør silikongel på den eksponerte ryggmargen og vent i ~ 5 min til den blir herdet.
  18. Suturer huden med #6-0 kirurgisk sutur for å lukke såret. Påfør brennkrem på huden på det kirurgiske stedet for å forhindre infeksjon. Administrer smertestillende behandling subkutant (0,1 mg/kg buprenorfin).
  19. Plasser dyret i et rent bur og legg buret på en varmepute til musen helt gjenoppretter fra anestesi.
  20. Gjenta smertestillende administrasjon hver 12 timer i 3 dager etter operasjonen.
  21. Lukk lukkeren til OPO- og fs-laseren. Sett pumpens og Stokes-strålens kraft maksimalt.
    MERK: Å stille inn maksimal effekt før du slår av laseren er gunstig for laservedlikehold.
  22. Sett bølgelengden på pumpestrålen og fs laseren til 800 nm.
  23. Sett de to laserne i ventemodus, lukk all programvaren for elektronikkkontroll og slå av alt tilknyttet utstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vivo dual-modal avbildning av spinal axoner samt myelinhylser utføres ved hjelp av Thy1-YFPH transgene mus, som uttrykker EYFP i dorsal rot ganglion afferent neuroner (Figur 3). Disse merkede afferent nevronene videresender sensorisk informasjon fra perifer nerve til ryggmargen, med den sentrale grenen plassert i ryggmargens dorsalkolonne. Med TPEF-SRS-mikroskopet kan tett distribuert myelinhylse tydelig visualiseres ved hjelp av etikettfri SRS-avbildning, og tynt merkede YFP-aksoner kan observeres ved hjelp av TPEF-avbildning. Det avsløres av tomodellavbildningen at axoner er tett innpakket av et tykt lag med myelinhylser (figur 3C). Noder av Ranvier (NR), hvor axolemma er bar av myelinhylsen, spiller en viktig rolle i den raske saltatoriske forplantningen av handlingspotensialer. Som det fremgår av TPEF-SRS ryggmargsbilde (figur 3C), viser NR redusert axonal diameter og axolemma direkte utsatt for den ekstracellulære matrisen. Det er viktig å se for seg axonene sammen med de omkringliggende myelinhylsene for å bekrefte eksistensen og plasseringen av NR. Derfor tillater TPEF-SRS mikroskopi oss å observere de dynamiske endringene av aksoner og myelinhylser i utviklingen av ryggmargsforstyrrelser, noe som er viktig for å forstå mekanismene for cellulær dynamikk.

Figure 1
Figur 1: Det skjematiske diagrammet for TPEF-SRS-mikroskopsystemet. Pumpen og Stokes bjelker er kombinert med et dikroisk speil (D1) i picosecond (ps) laser. PS-strålen og femtosecond-strålen (fs) er kollatert og utvidet/innsnevret av et par linser (henholdsvis L3, L4 og L1, L2) for å matche de 3 mm XY-skannede galvanometerspeilene. FS-strålen roteres fra horisontal til vertikal polarisering med en halvbølgeplate (HWP), og kombineres deretter med ps-strålen med en polariserende strålesplitter (PBS). Skannespeilene og den bakre eleven på objektivet konjugeres av en telesentrisk skannelinse L5 og en uendelig korrigert rørlinse L6. Laserstrålen utvides av skanne- og rørlinsen for å fylle bakåpningen til 25x-målet. For stimulert Raman-spredning (SRS) bildebehandling reflekteres den bakskultede pumpestrålen som samles inn av målet av en PBS og rettes mot et stort område (10 mm x 10 mm) silisiumfotodiode (PD). For to-foton bildebehandling reflekteres det to-foton begeistrede fluorescenssignalet (TPEF) av en dikroisk strålesplitter D2 til fotodeteksjonsenheten. En gjeldende PMT-modul (photomultiplier) brukes til å oppdage TPEF-signalet. Forkortelser-L1-L10: linser; OL: objektiv linse; D1-D3: dikroiske speil; Fs1, Fs2: filtersett; M: speil; OM1, OM2: optiske speil; P0-P2: justeringsplater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Grensesnittet til forsinkelsesbehandleren på OPO-kontrollprogramvaren. Den røde pilen angir om det er merket av for å bruke de kalibrerte forsinkelsesdataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: In vivo TPEF-SRS-avbildning av ryggmargen til musen. (A) Skjematisk diagram over kirurgisk forberedelse av musens ryggmarg og det lyse feltbildet av ryggmargen. (B) Musmonteringsskjema for in vivo-avbildning av ryggmargen. (C) Maximal z projeksjon bilder av axoner og myelin skjede i musen ryggmargen. Hvite pilspisser angir plasseringen av en node i Ranvier. SRS-bilder av myelin er tatt ved Raman-skiftet på 2863,5 cm-1. Figur A ble opprettet ved hjelp av BioRender (https://biorender.com/).  Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen er det grunnleggende oppsettet av TPEF-SRS-mikroskopet beskrevet i detalj. For SRS-avbildning er pumpen og Stokes-bjelkene timelig og romlig overlappet inne i OPO. Denne overlappingen kan imidlertid avbrytes etter å ha passert gjennom mikroskopsystemet. Derfor er både romlig og tidsmessig optimalisering av colokaliseringen av pumpen og Stokes bjelker nødvendig og kritisk for å oppnå optimal SRS-avbildning. Den tidsmessige forsinkelsen mellom pumpen og Stokes-strålen er relatert til den optiske baneforskjellen mellom de to bjelkene, som bestemmes av spredning av optiske elementer i mikroskopsystemet38. Når pumpestrålens bølgelengde er innstilt for SRS-avbildning ved forskjellige Raman-skift, endres pumpestrålens optiske banelengde tilsvarende fordi brytningsindeksen til de optiske linsene er avhengig av bølgelengden38. Derfor endres den tidsmessige forsinkelsen mellom pumpen og Stokes laserpuls med bølgelengden til pumpestrålen og må derfor kalibreres. OPO er utstyrt med en programvarestyrt forsinkelseslinje for tidsmessig synkronisering av pumpen og Stokes-strålen. For det samme optiske oppsettet forblir forsinkelsesdataene stabile og trenger bare å kalibreres én gang. Som et resultat kan forsinkelsesdataene ved forskjellige bølgelengder av pumpestrålen lagres ved første måling for fremtidig bruk. De kalibrerte forsinkelsesdataene kan brukes automatisk av OPO-kontrollprogramvaren når bølgelengden til pumpestrålen endres, noe som er praktisk for SRS-avbildning ved forskjellige Raman-skift eller hyperspektral SRS-avbildning. For TPEF-SRS-avbildning er streng romlig overlapping av ps- og fs-strålene etter kombinasjonen et kritisk skritt for å unngå FOV-skift mellom de to bildemodellene. For det første er PS-pumpestrålen og fs-strålen justert for å sikre at de begge er på mikroskopsystemets optiske akse, noe som er avgjørende for å unngå FOV-skift når du bytter de to bildemodellene. Deretter justeres Stokes bjelkeposisjon tilsvarende for å oppnå streng romlig colokalisering ved hjelp av pumpestrålen som referanse. Hver justeringsprosedyre krever flere forsøk for å oppnå det optimale.

Hvis SRS-signalet reduseres betydelig, bør faseverdien til låseforsterkeren og tidsforsinkelsesdataene kontrolleres først. Siden låseforsterkeren kommer ut av fasen når synkroniseringssignalet er forstyrret, krever faseverdien justering hver gang etter at strømforsyningen eller EOM-synkroniseringssignalet er avbrutt. Den tidsmessige synkroniseringen av pumpen og Stokes-strålen kan raskt kontrolleres ved å justere forsinkelseslinjen litt inne i OPO. Hvis de kalibrerte tidsforsinkelsesdataene er langt borte fra den optimale verdien, bør det utføres en nullskanning for å kalibrere forsinkelsesforskyvningen på nytt ved å klikke nullskanningsknappen i dialogboksen for forsinkelsesbehandling. Hele null skanneprosedyren tar omtrent 10 minutter. Hvis SRS-signalet ikke gjenoppretter etter optimalisering av fase- og tidsforsinkelsesverdien, bør EOM-moduleringen av Stokes-strålen kontrolleres som beskrevet i trinn 2.1.3-2.1.4. Hvis utryddelsesforholdet er langt mindre enn 10 dB med observasjon av små pulstopper i off position av Stokes pulstog, bør EOM startes på nytt, og modulasjonskraften og fasen bør justeres for å oppnå maksimal modulasjonsdybde. Vanligvis kan modulasjonsproblemet løses ved å tilbakestille EOM. Hvis ikke, bør det være nødvendig med teknisk støtte fra produsenten.

For in vivo tykk vevsavbildning må epi-SRS-deteksjonsmodus brukes. I denne protokollen brukes en PBS til å sende eksitasjonslaseren og reflektere det bakspredningsbaserte SRS-signalet til detektoren. Det oppdagede SRL-signalet er avhengig av baksiden av den fremovergående pumpestrålen av vev. Eksitasjonslaserne har lineær polarisering og kan passere helt gjennom PBS, mens den bakscattered strålen har skiftet polarisering og kan dermed bare delvis reflekteres av PBS. Derfor viser dagens signalinnsamlingsordning lavere effektivitet sammenlignet med strategien som direkte plasserer en ringformet fotodetektor foran målet12. Likevel, på grunn av den sterke spredningen av lipidrike vev39, kan høy signal-til-støy-forhold SRS-bilder (512 x 512 piksler) av ryggmargen oppnås med 1-2 s integrasjonstid, noe som gjør denne PBS-baserte samlingsordningen til en passende tilnærming for spinalmargsavbildning. På den annen side begrenser imidlertid den sterke vevspredningen lysinntrengningsdybde. For både SRS- og TPEF-avbildning er bildedybden for ryggmargen begrenset til ca. 50 μm.

Den sekvensielle avbildningsprosedyren for SRS- og TPEF-avbildning er hovedbegrensningen for den nåværende dobbeltmodale bildemetoden. I protokollen utføres TPEF- og SRS-avbildning på samme sted sekvensielt med et intervall på 1 s ved å bytte den motoriserte flipperen automatisk. Bevegelsesartefakter kan forårsake en ufullkommen sammenslåing av TPEF- og SRS-bildene, noe som begrenser evnen til denne metoden for avbildning av svært dynamiske prosesser eller vev som i stor grad påvirkes av dyrs pust og hjerteslag. En mulig løsning er å samle ps laser-spent to-foton fluorescens samtidig under SRS bildebehandling9. Denne metoden gjelder imidlertid bare for de biologiske strukturene med sterke fluorescenssignaler, siden ps-pulsen har en mye lavere fluorescenseksitasjonseffektivitet sammenlignet med fs pulse14. Alternativt kan problemet løses ved å bruke et fs-SRS-system22,40, der fs laserkilden tillater samtidig eksitasjon av SRS- og TPEF-signalene effektivt, på bekostning av lav spektral oppløsning av SRS-avbildningen. En annen løsning er å bruke ps laser-spent fluorescens oppnådd under SRS-avbildning som referanse for å registrere fs fluorescens bilder. Som vist i figur 3 fungerer denne registreringsstrategien bra hvis det ikke oppstår noen signifikant bevegelse under SRS- og fluorescensavbildningen.

SRS har unike fordeler ved biologisk avbildning siden det gir kjemisk informasjon om biomolekyler basert på den spesifikke etikettfrie kontrastmekanismen41. Sammenlignet med CARS som også er kombinert med TPEF for multimodal NLO-avbildning, viste SRS bedre spektral- og bildetolkningskapasitet11. Derfor har det blitt mye brukt til avbildning av lipid9,11, protein42,43, DNA44 og bio-ortogonale komponenter som inneholder alkyne (C ≡ C)13,45, karbon-deuterium (C-D)9,46 og oksygen-deuterium (O-D) bindinger47,48 biologisk vev. I denne protokollen brukte vi en ps laserkilde for SRS-avbildning og en fs laserkilde for TPEF-avbildning, som kombinerer fordelene med effektiv fluorescenseksitasjon og høy Raman spektraloppløsning, noe som muliggjør effektiv differensiering av forskjellige biomolekyler42,44. I ryggmargen bidrar komplekse cellemikromiljøetinteraksjoner som involverer glialceller, nevroner og rekrutterte immunceller til progresjonen av skade49 og sykdommer50. Kombinert med ulike fluorescens- og SRS-avbildningssonder, kan TPEF-SRS-mikroskopi oppnå samtidig avbildning av ulike cellulære strukturer samt deres distinkte biomolekylkomponenter, noe som kan lette vår forståelse av utbruddet og utviklingen av ryggmargsforstyrrelser betydelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre og har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Hong Kong Research Grants Council gjennom tilskudd 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), Area of Excellence Scheme of the University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) og Hong Kong University of Science &Technology (HKUST) gjennom tilskudd RPC10EG33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

Tags

Bioingeniør utgave 178
<em>In vivo</em> Avbildning av biologisk vev med kombinert to-foton fluorescens og stimulert ramanspredningsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S.… More

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter