Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vivo Avbildning av biologiska vävnader med kombinerad tvåfoto fluorescens och stimulerad Raman spridningsmikroskopi

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi möjliggör etikettfri avbildning av biomolekyler baserat på deras inneboende vibrationer av specifika kemiska bindningar. I detta protokoll beskrivs den instrumentella installationen av en integrerad SRS och två-foton fluorescensmikroskop för att visualisera cellulära strukturer i ryggmärgen hos levande möss.

Abstract

Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi möjliggör etikettfri avbildning av de biologiska vävnaderna i dess naturliga mikromiljö baserad på inneboende molekylär vibration, vilket ger ett perfekt verktyg för in vivo-studier av biologiska processer vid subcellulär upplösning. Genom att integrera TPEF-avbildning (Two-photon excited fluorescence) i SRS-mikroskopet kan dubbelmodal in vivo-avbildning av vävnader förvärva kritisk biokemisk och biofysisk information från flera perspektiv som hjälper till att förstå de dynamiska processerna som är involverade i cellulär metabolism, immunsvar och vävnadsrenovering etc. I detta videoprotokoll introduceras installationen av ett TPEF-SRS-mikroskopsystem samt in vivo-avbildningsmetoden för djurets ryggmärg. Ryggmärgen, som en del av centrala nervsystemet, spelar en avgörande roll i kommunikationen mellan hjärnan och det perifera nervsystemet. Myelin mantel, riklig i fosfolipider, omger och isolerar axon för att tillåta salt ledning av handlingspotentialer. In vivo imaging av myelmantlar i ryggmärgen är viktigt för att studera utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar och ryggmärgsskada. Protokollet beskriver också djurpreparat och in vivo TPEF-SRS-avbildningsmetoder för att förvärva högupplösta biologiska bilder.

Introduction

Raman mikroskopi1,2 växer fram som en kraftfull etikettfri metod för att avbilda biologiska vävnader baserat på de karakteristiska frekvenserna av olika kemiska bindningar i biomolekyler. På grund av sin icke-invasiva och välanpassade avbildningsförmåga har Raman-mikroskopi använts i stor utsträckning för att avbilda lipidberikade komponenter i biologiska vävnader som myelslida3,4,5, adipocyter6,7 och lipiddroppar8,9,10 . Stimulerad Raman spridning (SRS) signal förvärvas som stimulerad Raman vinst (SRG) eller stimulerad Raman förlust (SRL) är bakgrundsfri, visar perfekt spektral likhet med spontan Raman spridning11,12. Dessutom är SRL och SRG linjärt beroende av analytkoncentrationen, vilket möjliggör kvantitativ analys av biokemiska komponenter9,11,13. Två-foton upphetsad fluorescensmikroskopi (TPEF) har använts i stor utsträckning för in vivo biologisk avbildning på grund av dess inneboende optiska sektionsförmåga, djupa penetrationsdjup och låg fototoxicitet14,15,16. Prestandan hos TPEF-avbildning beror dock på egenskaperna hos fluorescerande taggar, och antalet lösta färger är begränsat på grund av bredbandsfluorescensspektra8,17,18,19. Label-free SRS imaging och fluorescence-baserade TPEF imaging är två kompletterande bildframställning modaliteter, och deras kombination kan ge riklig biofysisk och biokemisk information om vävnader. Dessa två bildframställningsmetoder är båda baserade på de icke-linjära optiska (NLO) processerna, vilket möjliggör enkel integration i ett mikroskopsystem. Kombinationen av SRS- och TPEF-avbildning, den så kallade dubbelmodala avbildningen, möjliggör högdimensionell avbildning och profilering av celler och vävnader, vilket underlättar en omfattande förståelse av komplexa biologiska system. Specifikt kan picosekund (ps) SRS-mikroskopi uppnå kemisk bondavbildning med hög spektralupplösning jämfört med femtosekund (fs) SRS-teknik11, vilket gör det möjligt att skilja flera biokemiska komponenter i biologisk vävnad, särskilt i den trånga fingeravtrycksregionen20,21. Jämfört med ett annat vanligt dubbelmodalt NLO-mikroskopsystem med integrering av sammanhängande anti-Stokes-spridningsmikroskop (CARS), visar SRS dessutom överlägsen prestanda för CARS när det gäller spektral- och bildtolkning samt detekteringskänslighet11. SRS-TPEF mikroskopet har använts som ett kraftfullt verktyg för att studera olika biologiska system, såsom Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, mushjärna23,24, ryggmärg25,26, perifer nerv27 och fettvävnad7, etc.

Ryggmärgen tillsammans med hjärnan utgör centrala nervsystemet (CNS). Visualisering av cellulära aktiviteter i CNS in vivo under fysiologiska och patologiska förhållanden är avgörande för att förstå mekanismerna för CNS störningar28,29,30 och för att utveckla motsvarande terapier31,32,33. Myelin-mantel, som lindar in och isolerar axoner för höghastighetsverkanspotentialledning, spelar en viktig roll i utvecklingen av CNS. Demyelination anses vara ett kännetecken i vit fråga störningar, såsom multipel skleros34. Dessutom, efter ryggmärgsskada35, myelin skräp kan modulera makrofag aktivering, bidra till kronisk inflammation och sekundär skada36. Därför är in vivo imaging av myelisk mantel tillsammans med nervceller och gliaceller i levande musmodeller till stor hjälp för att förstå de dynamiska processerna i CNS störningar.

I detta protokoll beskrivs de grundläggande installationsförfarandena för ett hembyggt TPEF-SRS-mikroskop och de dubbla modala in vivo-avbildningsmetoderna för mus ryggmärg introduceras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök som utförs i detta arbete utförs i enlighet med riktlinjerna från Laboratory Animal Facility vid Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) och har godkänts av HKUST:s djuriska kommitté. Säkerhetsutbildning för laserhantering krävs för att installera och driva TPEF-SRS-mikroskopet. Använd alltid laserglasögon med lämplig våglängdsintervall när du hanterar laser.

1. Installation av TPEF-SRS-mikroskopet (för installationsschema se bild 1)

  1. Använd en integrerad optisk parametrisk oscillator (OPO) ansluten till en lägeslåst Ytterbium fiberlaser som ps-laserkälla för SRS-avbildning.
    OBS: OPO utstrålar en Stokes-balk (1031 nm) och en pumpstråle (tunable från 780 nm till 960 nm) med 2 ps puls varaktighet och 80 MHz repetitionshastighet. Stokes-strålen moduleras vid 20 MHz av en inbyggd elektrooptisk modulator (EOM) för högfrekvent faskänslig SRS-detektering på MHz-nivå.
  2. Använd en fs titanium (Ti): safirlaser som laserkälla för TPEF-avbildning.
  3. Använd ett par linser (L1 och L2) för att kollidera och justera storleken på fs-balken till 3 mm.
  4. Använd ett par linser (L3 och L4) för att kollidera ps-laserstrålen och utöka dess diameter till 3 mm.
  5. Ändra polariseringen av fs-laserstrålen från p polarisering till polarisering med hjälp av en halvvågsplatta.
  6. Kombinera de två laserstrålarna med en polariserande stråldelare (PBS).
  7. Lägg till ett par 3 mm XY-skannings galvanometerspeglar bakom PBS för strålskanning.
  8. Använd en telecentrisk skanningslins (L5) och en infinitykorrigerad rörlins (L6) för att konjugera skanningsspegeln och den bakre pupillen i 25x objektiv. Expandera laserstrålen med skanningslinsen och rörlinsen för att fylla målets bakre bländare.
  9. Placera en PBS- eller dichroisk spegel (D2) mellan rörlinsen och objektivet för SRS- eller fluorescenssignalinsamling. Använd en motoriserad flipper för att växla mellan PBS och D2.
    OBS: En del av den bakåtsprängda SRS-signalen går förlorad när den passerar genom PBS som ett resultat av dess slumpmässigt skiftade polarisering.
  10. Använd ett par linser (L7 och L9) för att begränsa detektionsstrålen och konjugera den bakre pupillen på 25x objektivet med en fotodiodsensor.
  11. Använd ett par linser (L8 och L10) för att begränsa detektionsstrålen och konjugera den bakre pupillen i 25x-målet med fotomultiplikplierns detekteringsyta (PMT).
  12. Använd en dichroisk spegel (D3) för att separera detektionsvägen för fluorescens- och SRS-signaler.
  13. Placera ett filterset (Fs1) framför fotodioddetektorn för att blockera Stokes laser och endast passera pumpstrålen.
  14. Placera en filteruppsättning (Fs2) framför PMT-detektorn för att endast skicka målfluorescenssignalen.
  15. Anslut PMT till en strömförstärkare för signalförstärkning.
  16. Anslut fotodioden till en inlåsningsförstärkare.
  17. Anslut synkroniseringssignalen från den inbyggda EOM-utgången till referensingången för inlåsningsförstärkaren för SRS-signalmodulering.
  18. Anslut PMT-förstärkaren och inlåsningsförstärkarens utgångar till datainsamlingsmodulen.

2. TPEF-SRS mikroskopsystemkalibrering

  1. Start av lasrarna
    1. Byt nyckelbrytaren från standby till påläge för att slå på Ti: safirlaser och vänta i 30 minuter på att lasern ska värmas upp.
    2. Slå på OPO genom att klicka på Start-knappen på OPO-kontrollpanelen och vänta i 20 minuter på att lasern ska värmas upp.
    3. När ps-lasern har värmts upp, använd en höghastighetsfotodetektor för att kontrollera stokesstrålens moduleringsdjup. Öppna laserluckan för Stokes-strålen. Klicka på rutan Ange OPO Power och ange 20. Placera höghastighetsfotodetektorn vid OPO-utgången för att detektera strålen. Anslut utgångsporten för fotodetektorn till ingångsporten för ett oscilloskop med hjälp av en koaxialkabel med Bayonet Neill-Concelman (BNC) kontakt för att övervaka laserpulsen.
    4. Öppna fönstret EOM Control i OPO-kontrollprogramvaran. Justera EOM-effekten och fasen enligt pulsintensitetsdiagrammet som visas på oscilloskopet för att uppnå maximalt moduleringsdjup vid 20 MHz.
      OBS: EOM-prestanda är vanligtvis stabil och behöver bara kontrolleras när SRS-signalen hittas avsevärt minskad.
  2. Optisk inriktning av det kombinerade TPEF-SRS-mikroskopet
    1. Utför optisk inriktning för colocalization av ps- och fs-strålarna enligt beskrivningen i steg 2.2.2 till 2.2.13.
    2. Öppna pumplaserluckan samtidigt som du stoppar Stokes-utgången i OPO-styrprogramvaran. Använd OPO-styrprogramvaran för att ställa in våglängden på pumpstrålen till 796 nm genom att klicka på rutan Ställ in signal och ange våglängdsvärdet 796. Klicka på rutan Ställ in OPO Power och ange 20 för att ställa in dess effekt till minimum (~ 20 mW) för optisk justering.
    3. Slå på mikroskopdatorn och alla tillhörande elektroniska komponenter, inklusive skannrar, objektiva ställdon, fotodioder, PMT, strömförstärkare, inlåsningsförstärkare och motoriserade flippers. Starta mikroskopstyrningsprogramvaran.
      OBS: Mikroskopkontrollprogramvaran är ett hemmagjort gränssnitt.
    4. Placera två justeringsplattor (P1 och P2 i figur 1) på den optiska banan. Placera P1 bakom PBS på ett avstånd av ca 10 cm och placera P2 bakom P1 på ett avstånd av ca 30 cm.
      OBS: Ps- och fs-balkarna kombineras med hjälp av en PBS (bild 1). De två justeringsplattorna används för att kontrollera inriktningen samt colocalization av de två laserstrålarna.
    5. Öppna mikroskopluckan för ps-laserstrålen.
    6. Justera spegeln M1 för att lokalisera ps laserstrålens mitt vid genomgående hål på P1. Använd ett IR-scope (IR) för att observera strålplatsens position vid P1 när du justerar spegeln M1.
    7. Justera spegeln M2 för att lokalisera ps laserstrålens centrum vid genomgående hål på P2. Använd IR-scopet för att observera strålplatsens position vid P2 när du justerar spegeln M2.
    8. Upprepa steg 2.2.6 och 2.2.7 tills ps-balkens mittpunkt lokaliseras vid genomgående hål på båda inriktningsplattorna. Stäng slutaren på ps-strålen i mikroskopkontrollprogramvaran.
    9. Ställ in våglängden för fs Ti: safirlaser på 740 nm och öppna laserluckan. Ställ in lasereffekten på 5 mW (mätt vid mikroskopsystemets ingångsport) för optisk inriktning.
    10. Öppna mikroskopluckan för fs-laserstrålen.
    11. Justera spegeln M3 för att lokalisera fs laserstrålens spotcenter vid genomgående hål på P1.
    12. Justera spegeln M4 för att lokalisera laserstrålens spotcenter vid genomgående hål på P2.
    13. Upprepa steg 2.2.11 och 2.2.12 tills fs laserstrålecentrum lokaliserar vid genomgående hål på två inriktningsplattor. Stäng mikroskopluckan för fs-strålen.
    14. Utför rumslig överlappning av pumpen och Stokes strålar enligt beskrivningen i steg 2.2.15 till 2.2.18.
      OBS: Även om pump- och Stokes-strålarna är grovt överlappade inuti ps-lasern, krävs finjustering av positionerna för de två laserstrålarna för att uppnå optimal SRS-prestanda. Eftersom pumpstrålen först är i linje som tidigare beskrivits, justeras stokesstrålen nästa gång för att colocalize med pumpstrålen.
    15. Placera en kamera i målets position för att visualisera placeringen av två strålpunkter. Markera pumpstrålens position på kameraskärmen som referens.
    16. Placera en justeringsplatta P0 före L3 (bild 1). Använd en hexnyckel för att justera den optiska spegeln 1 (OM1) så att Stokes strålcentrum passerar genomgående hål på justeringsplattan och colocalizes med pumpstrålen vid laserutgångsporten. Använd IR-scopet för att bekräfta strålfläckens position vid P0 under justeringen.
      OBS: OM1 och OM2 är två speglar i OPO-huvudet för att justera positionen för 1031 nm Stokes-balken.
    17. Ta bort justeringsplattan P0 och använd hex-tangenten för att justera OM2 så att mitten av Stokes-balken colocalizes med referensmärket för pumpstrålen på kameran.
    18. Upprepa steg 2.2.16 och 2.2.17 tills Stokes-strålen strikt överlappar pumpstrålen på både P0- och kameraplan.
      OBS: När du visualiserar strålfläckarna på kameran ska alla justeringsplattor tas bort från den optiska banan.
  3. Optimera bildförhållandena
    1. Utför fasjustering av inlåsningsförstärkaren enligt beskrivningen i steg 2.3.2. till 2.3.7.
      SRS-identifiering baseras på ett högfrekvent faskänsligt schema. För SRL-detektering moduleras Stokes-strålens intensitet vid 20 MHz och en inlåsningsförstärkare används för att demodulera signalen. Inlåsningsförstärkarens fas och förskjutning måste justeras för att uppnå optimal bildkontrast.
    2. Öppna inlåsningsförstärkarens kontrollprogramvara.
    3. Ställ in pumplaserns våglängd på 796 nm och pumpens och Stokes-strålens effekt till 15 mW respektive 25 mW på provet.
      OBS: Här använder olivolja för SRS imaging optimering och kalibrering. Raman-toppen av olivolja vid kol-väteregionen är på 2863,5 cm-1, vilket motsvarar pumpstrålens våglängd vid 796 nm.
    4. Försegla olivoljan i en rutschkana och fäst ett vikt vävnadspapper på botten av bilden för att förbättra signalens backscattering för epi-SRS-detektion. Placera olivoljeprovet på scenen och justera fokus för 25x-målet på provet.
    5. Använd mikroskopkontrollprogrammet för att ställa in bildparametrarna enligt följande: 512 x 512 pixlar för 500 μm x 500 μm synfält (FOV), 6,4 μs pixel uppehållstid. Använd inlåsningsförstärkarens styrprogramvara för att ställa in tidskonstvärdet till 10 μs, vilket är nära pixelns uppehållstid.
    6. Skanna laserstrålen över provet. Använd inlåsningsförstärkarens styrprogramvara för att justera fasen (0-180°) med en stegstorlek på 22,5° tills SRS-signalintensiteten når maximalt.
      OBS: I denna analoga inlåsningsförstärkare är signalutgången infaskomponenten, som är beroende av referenssignalens fas. Fasen kan justeras med inlåsningsförstärkarens styrprogramvara med 11° upplösning, vilket gör det möjligt att maximera den detekterade signalen till inom ~ 2%12. Inlåsningsförstärkaren tas ur fas när synkroniseringssignalen har störts. Fasen måste justeras varje gång synkroniseringssignalen återupprättas.
    7. Skanna provet med laserlucka stängd. Använd inlåsningsförstärkarens styrprogramvara för att justera offsetvärdet med en stegstorlek på 1 mV tills den genomsnittliga SRS-signalen är nära noll.
      OBS: Den genomsnittliga SRS-signalen uppskattas som den genomsnittliga intensiteten för alla pixlar i SRS-bilden, som beräknas automatiskt av mikroskopkontrollprogramvaran. Förskjutningar är användbara för att avbryta oönskade fas sammanhängande signaler.
    8. Utför tidssynkroniseringsoptimering enligt beskrivningen i steg 2.3.9 till 2.3.14.
    9. Öppna fördröjningshanterarens dialog (bild 2) i OPO-kontrollprogramvaran.
    10. Skanna olivoljan och justera fördröjningssteget tills SRS-signalen för olivolja når sitt maximum.
      OBS: För första gången av SRS-avbildning, när inlåsningsförstärkarens fas inte har optimerats, justeras temporal synkroniseringen först grovt för att visualisera provets SRS-signal innan inlåsningsförstärkarens fas optimeras.
    11. Sluta skanna och klicka på knappen Lägg till data i dialogen för fördröjningshanteraren för att registrera aktuella fördröjningsdata.
    12. Upprepa steg 2.3. 10 och 2.3.11 för olika kemiska prover vid olika våglängder.
      OBS: Polystyrenpärlor, tungt vatten, 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin, glycerol används för att mäta fördröjningsdata vid olika vibrationsband.
    13. Välj datapassning och order 5 i fördröjningshanterarens dialog för att passa de aktuella datapunkterna med den femte ordningens polynomiska funktion. Använd de monterade uppgifterna genom att klicka på knappen Använd som anpassad och markera kryssrutan. Fördröjningssteget justeras automatiskt vid olika våglängder beroende på den monterade fördröjningskurvan.
    14. Spara alla fördröjningsdata i en textfil som kan läsas in för framtida användning.

3. Kirurgisk förberedelse av musen för in vivo fluorescens och SRS-avbildning

  1. Sterilisera alla nödvändiga verktyg, inklusive skalpeller, vårsax, tång, täckslipar och gasvävskuddar.
  2. Desinficera alla ytor, som skulle röras under operationen med 70% etanol. Täck bänkskivans arbetsområde med sterila draperier. Lägg en värmedyna under draperi.
  3. Använd Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgena möss som uttrycker förstärkt gult fluorescensprotein (EYFP) i dorsala rot ganglion afferenta nervceller för in vivo ryggmärg imaging. Väg musen och framkalla bedövning genom intraperitoneal (dvs.p.) injektion av ketamin-xylazinblandningen (87,5 mg kg-1 och 12,5 mg kg-1).
  4. Nyp musens toe för att säkerställa djup anestesi. Komplettera med hälften av den ursprungliga dosen av bedövningsmedel om det behövs. Applicera salva på musögonen för att förhindra hornhinnans torrhet.
  5. Raka håret på baksidan ovanför bröstryggen och ta sedan bort håret helt med utpilerande kräm. Desinficera det rakade området med jodlösning.
  6. Gör ett litet mittlinjesnitt (~ 1,5 cm) av huden över T11-T13-ryggkotan med en skalpell.
  7. Incise muskler och senor både på toppen och på sidorna av T11-T13 ryggkotan med vårsax och tång. Exponera de tre intilliggande kotorna. Använd sterila gasbindor och steril saltlösning för att kontrollera blödning och rengöra operationsstället.
  8. Stabilisera ryggraden med hjälp av de två sidofälten i rostfritt stål på ett specialdesignat stabiliseringssteg (figur 2B).
  9. Använd en #2 forcep för att utföra en laminectomy vid T12. Använd försiktigt tången för att bryta lamina bit för bit tills hela lamina på T12-ryggkotan har tagits bort.
  10. Tvätta bort blodet som överbelyser ryggmärgen med steril saltlösning och använd gasvävsplattan för att absorbera överdriven vätska. Tryck på blödningsstället med en bit gasväv för att kontrollera blödningen.
  11. Placera ett täckskydd (22 x 22 mm) på spännstången och fyll utrymmet mellan täcket och ryggmärgen med saltlösning.

4. In vivo TPEF-SRS avbildning av mus ryggmärg

  1. Montera stabiliseringssteget på ett femaxligt steg under TPEF-SRS-mikroskopet.
    OBS: Femaxlade steget möjliggör treaxlig översättning och ±5° tonhöjd och rulle flexure rörelse.
  2. Säkra mushuvudet med två huvudstänger och sänk hållplattan för att ge tillräckligt med utrymme för bröströrelser under andningen, vilket minskar rörelseartefakter.
  3. Sätt in en värmeplatta under musen för att hålla musen varm under avbildningen.
  4. Justera z translationellt stadium för att justera fokus tills den ljusa fältbilden av ryggmärgsvaskulatur kan observeras under ett 10x-mål.
  5. Lokalisera ryggmärgens dorsala ven i mitten av FOV genom att justera tvåaxliga translationella stadiet i femaxliga scenen.
  6. Justera rullnings- och tonhöjdsvinklarna i femaxlade scenen för att justera ryggmärgens dorsala yta vinkelrätt mot målaxeln baserat på ljusfältsbilden.
  7. Ersätt 10x med ett 25x vattensänkningsmål för TPEF-SRS-avbildning.
  8. Ställ in fs-strålens våglängd på 920 nm. Ställ in fs-stråleffekten så att den är 10 mW på provet.
  9. Ställ in pumpstrålens våglängd på 796 nm. Justera pumpens och Stokes-balkens effekt till 60 mW respektive 75 mW på provet.
    OBS: RyggmärgS-SRS-avbildning utförs vid vågnumer på 2863,5 cm-1, vilket motsvarar Raman-toppen av myelslidor vid kol-väteregionen baserat på det uppmätta SRS-spektrat7,9. Lasereffekten är fast besluten att säkerställa högupplöst TPEF-SRS-avbildning av ryggmärgen. Vävnadsskador observeras inte under de aktuella bildförhållandena.
  10. För SRS-avbildning väljer du PBS över målet med hjälp av en motoriserad flipper genom att trycka på knappen Växla ansluten till den motoriserade flippern.
  11. Ställ in bildparametrarna enligt följande: 512 x 512 pixlar för 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel uppehållstid, 2 μs tidskonstant.
  12. Börja skanna provet och ställ in fokus på ryggmärgens dorsala yta.
  13. Finjustera fördröjningssteget med OPO-kontrollprogramvaran tills maximal ryggmärgs-SRS-signal uppnås.
    OBS: Biologiska prover kan inducera extra kromatisk dispersion, fördröjningssteget kan behöva justeras för att optimera den tidsmässiga synkroniseringen. Men när SRS-avbildning utförs nära vävnadens övre yta är den tidsmässiga skillnaden mellan de två laserpulserna som introduceras av den biologiska vävnaden och bildfönstret vanligtvis liten (mindre än flera hundra fs).
  14. För TPEF-avbildning väljer du dichroisk spegel D2 ovanför målet med hjälp av en motoriserad flipper genom att trycka på knappen Switch som är ansluten till den motoriserade flippern.
  15. Ställ in bildparametrarna och börja skanna exemplet. Om du vill ta TPEF-SRS-bildstacken skaffar du TPEF- och SRS-avbildningarna sekventiellt med ett intervall på 1 s med samma djup innan du går till nästa djup. Bildparametrarna för TPEF-avbildning är 512 x 512 pixlar, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel uppehållstid.
  16. Ta bort djuret från stabiliseringsstadiet efter att alla bilder har samlats in.
  17. Rengör den exponerade vävnaden genom att spola saltlösning och absorbera överskottsvätskan med en gasvävskudde. Applicera silikongel på den exponerade ryggmärgen och vänta i ~5 min tills den blir härdad.
  18. Suturera huden med #6-0 kirurgisk sutur för att stänga såret. Applicera brännkräm på operationsställets hud för att förhindra infektion. Administrera smärtstillande behandling subkutant (0, 1 mg/kg buprenorfin).
  19. Placera djuret i en ren bur och placera buret på en värmeplatta tills musen helt återhämtar sig från anestesi.
  20. Upprepa smärtstillande administrering var 12: e timme i 3 dagar efter operationen.
  21. Stäng slutaren på OPO och fs laser. Ställ in pumpens och Stokes stråles effekt maximalt.
    OBS: Att ställa in maximal effekt innan lasern stängs av är fördelaktigt för laserunderhåll.
  22. Ställ in våglängden för pumpstrålen och fs-lasern på 800 nm.
  23. Ställ de två lasrarna i vänteläge, stäng all elektronikkontrollprogramvara och stäng av all tillhörande utrustning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vivo dual-modal imaging av spinal axons samt myelin mantlar utförs med hjälp av Thy1-YFPH transgena möss, som uttrycker EYFP i dorsala rot ganglion afferent nervceller (figur 3). Dessa märkta afferenta nervceller vidarebefordrar den sensoriska informationen från perifera nerv till ryggmärgen, med den centrala grenen ligger i ryggmärgen dorsala kolonnen. Med TPEF-SRS mikroskopet kan tätt fördelade myelhylsa tydligt visualiseras med hjälp av etikettfri SRS-avbildning, och glest märkta YFP axons kan observeras med hjälp av TPEF imaging. Det framgår av den dubbla modellen imaging att axoner är nära lindade av ett tjockt lager av myelyler (figur 3C). Noder av Ranvier (NR), där axolemma är bar av myelslidan, spelar en viktig roll i den snabba salta spridningen av aktionspotentialer. Som framgår av bilden av ryggmärgen TPEF-SRS (figur 3C) visar NR minskad axonaldiameter och axolemma som direkt exponeras för den extracellulära matrisen. Det är viktigt att avbilda axonerna tillsammans med de omgivande myelslidorna för att bekräfta NR: s existens och plats. Därför tillåter TPEF-SRS mikroskopi oss att observera de dynamiska förändringarna av axoner och myelhylsor i utvecklingen av ryggmärgssjukdomar, vilket är viktigt för att förstå mekanismerna för cellulär dynamik.

Figure 1
Bild 1: Det schematiska diagrammet för TPEF-SRS mikroskopsystem. Pumpens och Stokes strålar kombineras med en dichroisk spegel (D1) i picosekunden (ps) lasern. Ps-strålen och femtosekundsbalken (fs) kollimeras och expanderas/smalgas av ett par linser (L3, L4 respektive L1, L2) för att matcha 3 mm XY-skannings galvanometerspeglar. FS-balken roteras från horisontell till vertikal polarisering med en halvvågsplatta (HWP) och kombineras sedan med ps-strålen med en polariserande balkdelare (PBS). Skanningsspeglarna och den bakre pupillen av objektivet konjugeras av en telecentrisk skanningslins L5 och en infinitykorrigerad rörlins L6. Laserstrålen utökas av skannings- och rörlinsen för att fylla baköppningen på 25x-målet. För stimulerad Raman-spridning (SRS) avbildning reflekteras den ryggskartade pumpstrålen som samlas in av målet av en PBS och riktas till ett stort område (10 mm x 10 mm) kiselfotodiod (PD). För två-foton imaging reflekteras två-foton upphetsad fluorescens (TPEF) signalen av en dichroic beam splitter D2 till fotodetection enheten. En aktuell pmt-modul (photomultiplier) används för att identifiera TPEF-signalen. Förkortningar-L1-L10: linser; OL: objektiv lins; D1-D3: dichroiska speglar; Fs1, Fs2: filteruppsättningar; M: speglar; OM1, OM2: optiska speglar; P0-P2: justeringsplattor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Gränssnittet för fördröjningshanteraren på OPO-kontrollprogramvaran. Den röda pilen anger kryssrutan för användning av kalibrerade fördröjningsdata. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: In vivo TPEF-SRS avbildning av mus ryggmärg. (A) Schematiskt diagram över kirurgisk förberedelse av musen ryggmärg och ljusfält bilden av ryggmärgen. B) Musmonteringsschema för in vivo-avbildning av ryggmärgen. (C) Maximal z projektionsbilder av axoner och myelmantlar i mus ryggmärg. Vita pilspetsar anger platsen för en nod i Ranvier. SRS bilder av myelin är tagna vid Raman skift 2863,5 cm-1. Figur A skapades med BioRender (https://biorender.com/).  Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I det här protokollet beskrivs den grundläggande inställningen av TPEF-SRS-mikroskopet i detalj. För SRS-avbildning överlappas pump- och Stokesstrålarna tidsmässigt och rumsligt inuti OPO. Denna överlappning kan dock störas efter att ha passerat genom mikroskopsystemet. Därför är både rumslig och tidsmässig optimering av colocalization av pumpen och Stokes strålar nödvändigt och avgörande för att uppnå optimal SRS-avbildning. Den tidsmässiga fördröjningen mellan pumpen och Stokes-strålen är relaterad till den optiska banskillnaden hos de två strålarna, som bestäms av spridningen av optiska element i mikroskopsystemet38. När pumpstrålens våglängd är inställd för SRS-avbildning vid olika Raman-skift ändras pumpstrålens optiska banlängd i enlighet därmed eftersom de optiska linsernas brytningsindex är beroende av våglängden38. Därför ändras den tidsmässiga fördröjningen mellan pumpen och Stokes laserpuls med pumpstrålens våglängd och måste därför kalibreras. OPO är utrustad med en programvarustyrd fördröjningslinje för temporal synkronisering av pumpen och Stokes-strålen. För samma optiska inställning förblir fördröjningsdata stabila och behöver bara kalibreras en gång. Som ett resultat kan fördröjningsdata vid olika våglängder av pumpstrålen sparas vid den första mätningen för framtida användning. De kalibrerade fördröjningsdata kan tillämpas automatiskt av OPO-styrprogramvaran när pumpstrålens våglängd ändras, vilket är bekvämt för SRS-avbildning vid olika Raman-skift eller hyperspektral SRS-avbildning. För TPEF-SRS-avbildning är strikt rumslig överlappning av ps- och fs-strålarna efter kombinationen ett kritiskt steg för att undvika FOV-förskjutning mellan de två bildmodellerna. För det första är ps-pumpstrålen och fs-strålen justerade för att se till att de båda är på mikroskopsystemets optiska axel, vilket är avgörande för att undvika FOV-förskjutning när de byter de två bildmodellerna. Sedan justeras Stokes strålposition i enlighet därmed för att uppnå strikt rumslig kolonialisering. Varje justeringsprocedur kräver flera försök för att nå det optimala.

Om SRS-signalen minskar avsevärt bör fasvärdet för inlåsningsförstärkaren och tidsfördröjningsdata kontrolleras först. Eftersom inlåsningsförstärkaren tas ur fas när synkroniseringssignalen har störts kräver fasvärdet justering varje gång dess strömförsörjning eller EOM-synkroniseringssignal avbryts. Den tidsmässiga synkroniseringen av pumpen och Stokes-strålen kan snabbt kontrolleras genom att fördröja fördröjningslinjen något inuti OPO. Om de kalibrerade tidsfördröjningsdata är långt ifrån det optimala värdet bör en nollsökning utföras för att kalibrera om fördröjningsförskjutningen genom att klicka på zero scan-knappen i dialogen för fördröjningshanteraren. Hela nollskanningsproceduren tar ca 10 min. Om SRS-signalen inte återhämtar sig efter optimering av fas- och tidsfördröjningsvärdet, ska EOM-moduleringen av Stokes-strålen kontrolleras enligt beskrivningen i steg 2.1.3-2.1.4. Om utdöendeförhållandet är mycket mindre än 10 dB med observation av små pulstoppar vid stokespulsens avläge, bör EOM startas om och moduleringseffekten och fasen justeras för att uppnå maximalt moduleringsdjup. Vanligtvis kan moduleringsproblemet lösas genom att återställa EOM. Om så inte är fallet bör teknisk support från tillverkaren krävas.

För in vivo-avbildning av tjock vävnad måste epi-SRS-detektionsläge användas. I detta protokoll används en PBS för att skicka excitationslasern och reflektera den bakgrundsstjärnerade SRS-signalen till detektorn. Den detekterade SRL-signalen är beroende av backscattering av den framåtgående pumpstrålen av vävnader. Excitationslasrarna har linjär polarisering och kan helt passera genom PBS, medan den ryggskatterade strålen har skiftat polarisering och kan därför endast delvis återspeglas av PBS. Därför visar det nuvarande signalinsamlingssystemet lägre effektivitet jämfört med den strategi som direkt placerar en ringformad fotodetektor framför målet12. Ändå, på grund av den starka spridningen av lipidrika vävnader39, hög signal-till-brus förhållande SRS bilder (512 x 512 pixlar) av ryggmärgen kan förvärvas med 1-2 s integrationstid, vilket gör detta PBS-baserade samlingsschema ett lämpligt tillvägagångssätt för ryggmärg imaging. Å andra sidan begränsar dock den starka vävnadsspridningen ljuspenetrationsdjupet. För både SRS- och TPEF-avbildning är avbildningsdjupet för ryggmärgen begränsat till ca 50 μm.

Sekventiell bildframställning förfarande för SRS och TPEF imaging är den största begränsningen av den nuvarande dual-modal imaging metoden. I protokollet utförs TPEF- och SRS-avbildning på samma plats sekventiellt med ett 1 s intervall genom att automatiskt byta den motoriserade flippern. Rörelse artefakter kan orsaka en ofullkomlig sammanslagning av TPEF och SRS bilder, vilket begränsar förmågan hos denna metod för att avbilda mycket dynamiska processer eller vävnader som till stor del påverkas av andning och hjärtslag hos djur. En möjlig lösning är att samla in den ps laser-upphetsade två-fotonfluorescensen samtidigt under SRS imaging9. Denna metod är dock endast tillämplig på de biologiska strukturerna med starka fluorescenssignaler, eftersom ps-pulsen har en mycket lägre fluorescens excitationseffektivitet jämfört med fs pulse14. Alternativt kan problemet lösas genom att använda ett fs-SRS-system22,40, där fs-laserkällan möjliggör samtidig excitation av SRS- och TPEF-signalerna effektivt, på bekostnad av låg spektralupplösning av SRS-avbildningen. En annan lösning är att använda den ps laser-upphetsade fluorescensen som erhålls under SRS-avbildning som referens för att registrera fs fluorescensbilderna. Som visas i figur 3 fungerar denna registreringsstrategi bra om ingen signifikant rörelse uppstår under SRS och fluorescensavbildning.

SRS uppvisar unika fördelar med biologisk avbildning eftersom den ger kemisk information om biomolekyler baserat på dess specifika etikettfria kontrastmekanism41. Jämfört med CARS som också har kombinerats med TPEF för multimodal NLO-avbildning visade SRS bättre spektral- och bildtolkningsförmåga11. Därför har det använts i stor utsträckning för avbildningsfetter9,11, protein42,43, DNA44 och bioortogonala komponenter som innehåller alkyne (C ≡ C)13,45, kol−deuterium (C−D)9,46 och syredeuteriumbindningar (O-D)47,48 i biologiska vävnader. I detta protokoll använde vi en ps laserkälla för SRS-avbildning och en fs-laserkälla för TPEF-avbildning, som kombinerar fördelarna med effektiv fluorescens excitation och hög Raman spektralupplösning, vilket möjliggör effektiv differentiering av olika biomolekyler42,44. I ryggmärgen bidrar komplexa cell-mikromiljö interaktioner med gliaceller, nervceller och rekryterade immunceller till utvecklingen av skada49 och sjukdomar50. I kombination med olika fluorescens- och SRS-avbildningssonder kan TPEF-SRS-mikroskopi uppnå samtidig avbildning av olika cellulära strukturer samt deras distinkta biomolekylära komponenter, vilket avsevärt kan underlätta vår förståelse av uppkomsten och utvecklingen av ryggmärgsstörningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja och har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Hong Kong Research Grants Council genom bidrag 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), området för excellensprogram för university grants committee (AoE/M-604/16, AOE/M-16)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

Tags

Bioengineering nummer 178
<em>In vivo</em> Avbildning av biologiska vävnader med kombinerad tvåfoto fluorescens och stimulerad Raman spridningsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S.… More

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter