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Bioengineering

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

Abstract

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de los tejidos biológicos en su microambiente natural basado en la vibración molecular intrínseca, proporcionando así una herramienta perfecta para el estudio in vivo de los procesos biológicos a resolución subcelular. Al integrar imágenes de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) en el microscopio SRS, las imágenes in vivo de doble modal de los tejidos pueden adquirir información bioquímica y biofísica crítica desde múltiples perspectivas, lo que ayuda a comprender los procesos dinámicos involucrados en el metabolismo celular, la respuesta inmune y la remodelación de tejidos, etc. En este protocolo de video, se introduce la configuración de un sistema de microscopio TPEF-SRS, así como el método de imágenes in vivo de la médula espinal animal. La médula espinal, como parte del sistema nervioso central, juega un papel crítico en la comunicación entre el cerebro y el sistema nervioso periférico. La vaina de mielina, abundante en fosfolípidos, rodea y aísla el axón para permitir la conducción saltatoria de los potenciales de acción. Las imágenes in vivo de las vainas de mielina en la médula espinal son importantes para estudiar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y la lesión de la médula espinal. El protocolo también describe la preparación animal y los métodos de imagen TPEF-SRS in vivo para adquirir imágenes biológicas de alta resolución.

Introduction

La microscopía Raman1,2 está emergiendo como un poderoso método libre de etiquetas para obtener imágenes de tejidos biológicos basado en las frecuencias características de varios enlaces químicos en biomoléculas. Debido a su capacidad de imagen no invasiva y bien adaptativa, la microscopía Raman se ha utilizado ampliamente para obtener imágenes de componentes enriquecidos con lípidos en tejidos biológicos como la vaina de mielina3,4,5, los adipocitos6,7 y las gotas lipídicas8,9,10 . La señal de dispersión Raman estimulada (SRS) adquirida como ganancia Raman estimulada (SRG) o pérdida Raman estimulada (SRL) no tiene fondo, mostrando un parecido espectral perfecto con la dispersión Raman espontánea11,12. Además, SRL y SRG dependen linealmente de la concentración de analitos, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes bioquímicos9,11,13. La microscopía de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) se ha utilizado ampliamente para imágenes biológicas in vivo debido a su capacidad de seccionamiento óptico inherente, profundidad de penetración profunda y baja fototoxicidad14,15,16. Sin embargo, el rendimiento de las imágenes TPEF depende de las características de las etiquetas fluorescentes, y el número de colores resolubles es limitado debido a los espectros de fluorescencia de banda ancha8,17,18,19. Las imágenes SRS sin etiqueta y las imágenes TPEF basadas en fluorescencia son dos modalidades de imágenes complementarias, y su combinación puede proporcionar abundante información biofísica y bioquímica de los tejidos. Estas dos modalidades de imagen se basan en los procesos ópticos no lineales (NLO), lo que permite una integración simple en un sistema de microscopio. La combinación de las imágenes SRS y TPEF, las llamadas imágenes de doble modal, permite la obtención de imágenes de alta dimensión y el perfil de células y tejidos, lo que facilita una comprensión integral de los sistemas biológicos complejos. Específicamente, la microscopía SRS de picosegundos (ps) puede lograr imágenes de enlace químico con alta resolución espectral en comparación con la técnica SRS de femtosegundo (fs)11, lo que permite diferenciar múltiples componentes bioquímicos en el tejido biológico, especialmente en la región de huellas dactilares abarrotada20,21. Además, en comparación con otro sistema de microscopio NLO de doble modal de uso común con integración de microscopio de dispersión anti-Stokes coherente (CARS), SRS muestra un rendimiento superior al CARS en términos de interpretación espectral y de imagen, así como sensibilidad de detección11. El microscopio SRS-TPEF se ha utilizado como una poderosa herramienta para estudiar diversos sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cerebro de ratón23,24, médula espinal25,26, nervio periférico27, tejido adiposo7, etc.

La médula espinal junto con el cerebro constituye el sistema nervioso central (SNC). La visualización de las actividades celulares en el SNC in vivo en condiciones fisiológicas y patológicas es fundamental para comprender los mecanismos de los trastornos del SNC28,29,30 y para desarrollar las terapias correspondientes31,32,33. La vaina de mielina, que envuelve y aísla los axones para la conducción potencial de acción a alta velocidad, desempeña un papel importante en el desarrollo del SNC. La desmielinización se considera un sello distintivo en los trastornos de la sustancia blanca, como la esclerosis múltiple34. Además, después de una lesión medular35, los restos de mielina pueden modular la activación de los macrófagos, contribuyendo a la inflamación crónica y a la lesión secundaria36. Por lo tanto, las imágenes in vivo de la vaina de mielina junto con las neuronas y las células gliales en modelos de ratones vivos son de gran ayuda para comprender los procesos dinámicos en los trastornos del SNC.

En este protocolo, se describen los procedimientos fundamentales de configuración de un microscopio TPEF-SRS construido en casa y se introducen los métodos de imagen in vivo de doble modal para la médula espinal de ratón.

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Protocol

Todos los procedimientos en animales realizados en este trabajo se llevan a cabo de acuerdo con las directrices de la Instalación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST) y han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de HKUST. Se requiere capacitación en seguridad para el manejo del láser para configurar y operar el microscopio TPEF-SRS. Siempre use gafas de seguridad láser con el rango de longitud de onda apropiado cuando se trate de láser.

1. Configuración del microscopio TPEF-SRS (para el esquema de configuración, consulte la Figura 1)

  1. Utilice un oscilador paramétrico óptico (OPO) integrado conectado con un láser de fibra de iterbio bloqueado como fuente láser ps para imágenes SRS.
    NOTA: OPO emite un haz Stokes (1031 nm) y un haz de bomba (sintonizable de 780 nm a 960 nm) con una duración de pulso de 2 ps y una tasa de repetición de 80 MHz. El haz de Stokes está modulado a 20 MHz por un modulador electroóptico (EOM) incorporado para la detección SRS sensible a la fase de alta frecuencia a nivel de MHz.
  2. Utilice un láser de titanio fs (Ti): zafiro como fuente láser para imágenes TPEF.
  3. Utilice un par de lentes (L1 y L2) para colimar y ajustar el tamaño del haz fs a 3 mm.
  4. Utilice un par de lentes (L3 y L4) para colimar el rayo láser ps y ampliar su diámetro a 3 mm.
  5. Cambie la polarización del rayo láser fs de polarización p a polarización s utilizando una placa de media onda.
  6. Combine los dos rayos láser con un divisor de haz polarizador (PBS).
  7. Agregue un par de espejos galvanómetros XY-scan de 3 mm detrás del PBS para el escaneo de haz.
  8. Utilice una lente de escaneo telecéntrico (L5) y una lente de tubo corregida al infinito (L6) para conjugar el espejo de escaneo y la pupila trasera de la lente de objetivo 25x. Expanda el rayo láser mediante la lente de escaneo y la lente de tubo para llenar la abertura posterior del objetivo.
  9. Coloque un PBS o un espejo dicroico (D2) entre la lente del tubo y la lente del objetivo para la recolección de señales srS o de fluorescencia. Utilice un aleta motorizada para cambiar entre PBS y D2.
    NOTA: Parte de la señal SRS retrodispersada se pierde al pasar a través del PBS como resultado de su polarización desplazada aleatoriamente.
  10. Utilice un par de lentes (L7 y L9) para estrechar el haz de detección y conjugar la pupila trasera de la lente objetivo 25x con un sensor de fotodiodo.
  11. Utilice un par de lentes (L8 y L10) para estrechar el haz de detección y conjugar la pupila trasera del objetivo 25x con la superficie de detección del fotomultiplicador (PMT).
  12. Utilice un espejo dicroico (D3) para separar la ruta de detección de las señales de fluorescencia y SRS.
  13. Coloque un juego de filtros (Fs1) delante del detector de fotodiodos para bloquear el láser Stokes y pasar solo el haz de la bomba.
  14. Coloque un juego de filtros (Fs2) delante del detector PMT para pasar solo la señal de fluorescencia objetivo.
  15. Conecte el PMT a un amplificador de corriente para la amplificación de la señal.
  16. Conecte el fotodiodo a un amplificador de bloqueo.
  17. Conecte la señal de sincronización de la salida EOM incorporada a la entrada de referencia del amplificador de bloqueo para la demodulación de la señal SRS.
  18. Conecte el amplificador PMT y las salidas del amplificador de bloqueo al módulo de adquisición de datos.

2. Calibración del sistema de microscopio TPEF-SRS

  1. Puesta en marcha de los láseres
    1. Cambie el interruptor de la tecla de la posición Standby a On para encender el láser Ti: zafiro y espere 30 minutos a que el láser se caliente.
    2. Encienda el OPO haciendo clic en el botón Inicio en el panel de control del OPO y espere 20 minutos a que el láser se caliente.
    3. Después de que el láser ps se caliente, use un fotodetector de alta velocidad para verificar la profundidad de modulación del haz stokes. Abra el obturador láser para el rayo Stokes. Haga clic en el cuadro Establecer alimentación OPO e ingrese 20. Coloque el fotodetector de alta velocidad en la salida OPO para detectar el haz. Conecte el puerto de salida del fotodetector al puerto de entrada de un osciloscopio mediante un cable coaxial con conector Bayonet Neill-Concelman (BNC) para controlar el pulso láser.
    4. Abra la ventana Control EOM en el software de control OPO. Ajuste la potencia y la fase de la MOE de acuerdo con el diagrama de intensidad de pulso que se muestra en el osciloscopio para lograr la máxima profundidad de modulación a 20 MHz.
      NOTA: El rendimiento de la MOE suele ser estable y solo debe verificarse cuando la señal SRS se encuentra significativamente disminuida.
  2. Alineación óptica del microscopio TPEF-SRS combinado
    1. Realizar la alineación óptica para la colocalización de los haces ps y fs como se describe en los pasos 2.2.2 a 2.2.13.
    2. Abra el obturador láser de la bomba mientras detiene la salida stokes en el software de control OPO. Utilice el software de control OPO para establecer la longitud de onda del haz de la bomba en 796 nm haciendo clic en el cuadro Establecer señal e introduciendo el valor de longitud de onda 796. Haga clic en el cuadro Establecer potencia OPO e ingrese 20 para establecer su potencia al mínimo (~ 20 mW) para la alineación óptica.
    3. Encienda la computadora del microscopio y todos los componentes electrónicos asociados, incluidos escáneres, actuadores objetivos, fotodiodos, PMT, amplificadores de corriente, amplificadores de bloqueo y aletas motorizadas. Inicie el software de control del microscopio.
      NOTA: El software de control del microscopio es una interfaz casera.
    4. Coloque dos placas de alineación (P1 y P2 en la Figura 1) en la trayectoria óptica. Coloque P1 detrás de PBS a una distancia de aproximadamente 10 cm y coloque P2 detrás de P1 a una distancia de aproximadamente 30 cm.
      NOTA: Los haces ps y fs se combinan utilizando un PBS (Figura 1). Las dos placas de alineación se utilizan para comprobar la alineación, así como la colocalización de los dos rayos láser.
    5. Abra el obturador del microscopio para el rayo láser ps.
    6. Ajuste el espejo M1 para ubicar el centro del rayo láser ps en el orificio pasante de P1. Utilice un visor infrarrojo (IR) para observar la posición del punto del haz en P1 al ajustar el espejo M1.
    7. Ajuste el espejo M2 para ubicar el centro del rayo láser ps en el orificio pasante de P2. Utilice el visor IR para observar la posición del punto del haz en P2 al ajustar el espejo M2.
    8. Repita los pasos 2.2.6 y 2.2.7 hasta que el centro del haz ps se ubique en el orificio pasante de ambas placas de alineación. Cierre el obturador del haz ps en el software de control del microscopio.
    9. Ajuste la longitud de onda de fs Ti: láser de zafiro a 740 nm y abra el obturador láser. Ajuste la potencia del láser a 5 mW (medido en el puerto de entrada del sistema de microscopio) para la alineación óptica.
    10. Abra el obturador del microscopio para el rayo láser fs.
    11. Ajuste el espejo M3 para ubicar el centro del punto de haz láser fs en el orificio pasante de P1.
    12. Ajuste el espejo M4 para ubicar el centro del punto de rayo láser en el orificio pasante de P2.
    13. Repita los pasos 2.2.11 y 2.2.12 hasta que el centro del rayo láser fs se localice en los orificios pasantes de dos placas de alineación. Cierre el obturador del microscopio para el haz fs.
    14. Realice la superposición espacial de la bomba y las vigas stokes como se describe en los pasos 2.2.15 a 2.2.18.
      NOTA: Aunque la bomba y los haces de Stokes están aproximadamente superpuestos dentro del láser ps, se requiere un ajuste fino de las posiciones de los dos rayos láser para lograr un rendimiento SRS óptimo. Dado que el haz de la bomba se alinea en primer lugar como se describió anteriormente, a continuación, el haz de Stokes se ajusta para colocarse con el haz de la bomba.
    15. Coloque una cámara en la posición del objetivo para visualizar la ubicación de dos puntos de haz. Marque la posición del haz de la bomba en la pantalla de la cámara como referencia.
    16. Coloque una placa de alineación P0 antes de L3 (Figura 1). Utilice una llave hexagonal para ajustar el espejo óptico 1 (OM1) de modo que el centro del haz de Stokes pase por el orificio pasante de la placa de alineación y se coloque con el haz de la bomba en el puerto de salida del láser. Utilice el visor IR para confirmar la posición del punto del haz en P0 durante el ajuste.
      NOTA: OM1 y OM2 son dos espejos en el cabezal OPO para ajustar la posición del haz Stokes de 1031 nm.
    17. Retire la placa de alineación P0 y utilice la tecla hexagonal para ajustar el OM2 de modo que el centro del haz stokes se coloque con la marca de referencia del haz de la bomba en la cámara.
    18. Repita los pasos 2.2.16 y 2.2.17 hasta que el haz de Stokes se superponga estrictamente con el haz de la bomba tanto en los planos P0 como en los de la cámara.
      NOTA: Al visualizar los puntos de haz en la cámara, todas las placas de alineación deben eliminarse de la trayectoria óptica.
  3. Optimice las condiciones de imagen
    1. Realice el ajuste de fase del amplificador de bloqueo como se describe en los pasos 2.3.2. a 2.3.7.
      NOTA: La detección de SRS se basa en un esquema sensible a la fase de alta frecuencia. Para la detección srL, la intensidad del haz stokes se modula a 20 MHz y se utiliza un amplificador de bloqueo para demodular la señal. La fase y el desplazamiento del amplificador de bloqueo deben ajustarse para lograr el contraste de imagen óptimo.
    2. Abra el software de control del amplificador de bloqueo.
    3. Ajuste la longitud de onda del láser de la bomba a 796 nm y la potencia de la bomba y el haz stokes a 15 mW y 25 mW en la muestra, respectivamente.
      NOTA: Aquí use aceite de oliva para la optimización y calibración de imágenes SRS. El pico Raman del aceite de oliva en la región de carbono-hidrógeno es de 2863.5 cm-1, correspondiente a la longitud de onda del haz de la bomba a 796 nm.
    4. Selle el aceite de oliva en un portaobjetos y coloque un papel de seda doblado en la parte inferior de la diapositiva para mejorar la retrodispersión de la señal para la detección de epi-SRS. Coloque la muestra de aceite de oliva en el escenario y ajuste el enfoque del objetivo 25x en la muestra.
    5. Utilice el software de control del microscopio para establecer los parámetros de imagen de la siguiente manera: 512 x 512 píxeles para un campo de visión (FOV) de 500 μm x 500 μm, tiempo de permanencia de píxeles de 6,4 μs. Utilice el software de control del amplificador de bloqueo para establecer el valor de la constante de tiempo en 10 μs, que está cerca del tiempo de permanencia de píxeles.
    6. Escanee el rayo láser sobre la muestra. Utilice el software de control del amplificador de bloqueo para ajustar la fase (0-180 °) con un tamaño de paso de 22,5 ° hasta que la intensidad de la señal SRS alcance el máximo.
      NOTA: En este amplificador de bloqueo totalmente analógico, la salida de señal es el componente en fase, que depende de la fase de la señal de referencia. La fase se puede ajustar mediante el software de control del amplificador de bloqueo con una resolución de 11 °, lo que permite maximizar la señal detectada dentro de ~ 2% 12. El amplificador de bloqueo se desfase una vez que se interrumpe la señal de sincronización. La fase debe reajustarse cada vez que se restablezca la señal de sincronización.
    7. Escanee la muestra con el obturador láser cerrado. Utilice el software de control del amplificador de bloqueo para ajustar el valor de desplazamiento con un tamaño de paso de 1 mV hasta que la señal SRS promedio esté cerca de cero.
      NOTA: La señal SRS promedio se estima como la intensidad promedio de todos los píxeles en la imagen SRS, que se calcula automáticamente mediante el software de control del microscopio. Las compensaciones son útiles para cancelar señales coherentes de fase no deseadas.
    8. Realice la optimización de la sincronización temporal como se describe en los pasos 2.3.9 a 2.3.14.
    9. Abra el cuadro de diálogo Delay Manager (Figura 2) en el software de control OPO.
    10. Escanee el aceite de oliva y ajuste la etapa de retardo hasta que la señal SRS del aceite de oliva alcance su máximo.
      NOTA: Por primera vez en la obtención de imágenes SRS, cuando no se ha optimizado la fase del amplificador de bloqueo, la sincronización temporal se ajusta primero aproximadamente para visualizar la señal SRS de la muestra antes de optimizar la fase del amplificador de bloqueo.
    11. Deje de escanear y haga clic en el botón Agregar datos en el diálogo del administrador de retrasos para registrar los datos de retraso actuales.
    12. Repita los pasos 2.3. 10 y 2.3.11 para diferentes muestras químicas en diferentes longitudes de onda.
      NOTA: Las perlas de poliestireno, agua pesada, 5-Etinil-2′-desoxiuridina, glicerol se utilizan para medir los datos de retardo en diferentes bandas vibratorias.
    13. Seleccione el Ajuste de datos y el Orden 5 en el diálogo del gestor de retardo para ajustar los puntos de datos actuales con la función polinómica de quinto orden. Aplique los datos ajustados haciendo clic en el botón Usar como personalizado y marcando la casilla de verificación. La etapa de retardo se ajustará automáticamente en diferentes longitudes de onda de acuerdo con la curva de retardo ajustada.
    14. Guarde todos los datos de retraso en un archivo de texto, que se puede cargar para su uso futuro.

3. Preparación quirúrgica de ratón para fluorescencia in vivo e imágenes SRS

  1. Esterilice todas las herramientas requeridas, incluidos bisturíes, tijeras de resorte, fórceps, fundas y almohadillas de gasa.
  2. Desinfectar todas las superficies, que se tocarían durante la cirugía con etanol al 70%. Cubra el área de trabajo de la mesa de trabajo con cortinas estériles. Coloque una almohadilla térmica debajo de la cortina.
  3. Use Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 ratones transgénicos que expresan proteína de fluorescencia amarilla mejorada (EYFP) en neuronas aferentes del ganglio de la raíz dorsal para imágenes de la médula espinal in vivo . Pesar el ratón e inducir la anestesia mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de la mezcla de ketamina-xilazina (87,5 mg kg-1 y 12,5 mg kg-1).
  4. Pellizque el dedo del pie del ratón para asegurar una anestesia profunda. Suplementar con la mitad de la dosis original de los anestésicos si es necesario. Aplique ungüento en los ojos del ratón para prevenir la sequedad corneal.
  5. Afeitar el vello en la parte posterior por encima de la columna torácica, y luego eliminar completamente el vello con crema depilante. Desinfecte el área afeitada con solución de yodo.
  6. Haga una pequeña incisión en la línea media (~ 1,5 cm) de la piel sobre la vértebra T11-T13 con un bisturí.
  7. Incise los músculos y tendones tanto en la parte superior como en los lados de la vértebra T11-T13 con tijeras de resorte y fórceps. Exponga las tres vértebras adyacentes. Use gasas estériles y solución salina estéril para controlar el sangrado y limpiar el sitio quirúrgico.
  8. Estabilice la columna vertebral con la ayuda de las dos barras laterales de acero inoxidable en una etapa de estabilización diseñada a medida (Figura 2B).
  9. Use un forcep #2 para realizar una laminectomía en T12. Use cuidadosamente el forcep para romper la lámina pieza por pieza hasta que se elimine toda la lámina de la vértebra T12.
  10. Lave la sangre que recubre la médula espinal con solución salina estéril y use la gasa para absorber el exceso de líquido. Aplique presión sobre el sitio de sangrado con un trozo de gasa para controlar el sangrado.
  11. Coloque un cubrehojas (22 x 22 mm) en la barra de sujeción y llene el interespacio entre el lacubierta y la médula espinal con solución salina.

4. Imágenes TPEF-SRS in vivo de la médula espinal de ratón

  1. Monte la etapa de estabilización en una etapa de cinco ejes debajo del microscopio TPEF-SRS.
    NOTA: La etapa de cinco ejes permite la traslación de tres ejes y ±5 ° de inclinación y movimiento de flexión de balanceo.
  2. Asegure la cabeza del ratón con dos barras de cabeza y baje la placa de sujeción para ofrecer suficiente espacio para el movimiento del pecho durante la respiración, aliviando los artefactos de movimiento.
  3. Inserte una almohadilla térmica debajo del ratón para mantener el ratón caliente durante la toma de imágenes.
  4. Ajuste la etapa de traslación z para ajustar el enfoque hasta que la imagen de campo brillante de la vasculatura de la médula espinal se pueda observar bajo un objetivo 10x.
  5. Localice la vena dorsal de la médula espinal en el centro del CAMPO de visión ajustando la etapa de traslación de dos ejes de la etapa de cinco ejes.
  6. Ajuste los ángulos de balanceo y cabeceo de la etapa de cinco ejes para ajustar la superficie dorsal de la médula espinal perpendicular al eje objetivo en función de la imagen de campo brillante.
  7. Reemplace el 10x con un objetivo de inmersión en agua de 25x para imágenes TPEF-SRS.
  8. Establezca la longitud de onda del haz fs en 920 nm. Ajuste la potencia del haz fs para que sea de 10 mW en la muestra.
  9. Ajuste la longitud de onda del haz de la bomba a 796 nm. Ajuste la potencia de la bomba y el haz stokes para que sea de 60 mW y 75 mW en la muestra, respectivamente.
    NOTA: Las imágenes de SRS de la médula espinal se realizan con un número de onda de 2863.5 cm-1, que corresponde al pico Raman de las vainas de mielina en la región de carbono-hidrógeno basado en los espectros SRS medidos7,9. La potencia del láser se determina para garantizar imágenes TPEF-SRS de alta resolución de la médula espinal. El daño tisular no se observa en las condiciones actuales de imagen.
  10. Para las imágenes SRS, seleccione PBS sobre el objetivo utilizando una aleta motorizada presionando el botón Interruptor conectado a la aleta motorizada.
  11. Establezca los parámetros de imagen de la siguiente manera: 512 x 512 píxeles para 150 μm x 150 μm FOV, tiempo de permanencia de píxeles de 3,2 μs, constante de tiempo de 2 μs.
  12. Comience a escanear la muestra y fije el foco en la superficie dorsal de la médula espinal.
  13. Ajuste con precisión la etapa de retardo mediante el software de control OPO hasta que se alcance la máxima señal SRS de la médula espinal.
    NOTA: Las muestras biológicas pueden inducir una dispersión cromática adicional, la etapa de retardo puede requerir ser ajustada para optimizar la sincronización temporal. Sin embargo, cuando las imágenes SRS se realizan cerca de la superficie superior del tejido, la diferencia temporal de los dos pulsos láser introducidos por el tejido biológico y la ventana de imágenes suele ser pequeña (menos de varios cientos de fs).
  14. Para las imágenes TPEF, seleccione el espejo dicroico D2 sobre el objetivo utilizando una aleta motorizada presionando el botón Interruptor conectado a la aleta motorizada.
  15. Establezca los parámetros de imagen y comience a escanear la muestra. Para capturar la pila de imágenes TPEF-SRS, adquiera las imágenes TPEF y SRS secuencialmente con un intervalo de 1 s a la misma profundidad antes de pasar a la siguiente profundidad. Los parámetros de imagen para las imágenes TPEF son 512 x 512 píxeles, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs de tiempo de permanencia de píxeles.
  16. Retire al animal de la etapa de estabilización después de que se recopilen todas las imágenes.
  17. Limpie el tejido expuesto enjuagando la solución salina y absorba el exceso de líquido con una gasa. Aplique gel de silicona en la médula espinal expuesta y espere ~ 5 minutos hasta que se cure.
  18. Sutura la piel con la sutura quirúrgica #6-0 para cerrar la herida. Aplique crema para quemaduras en la piel del sitio quirúrgico para prevenir infecciones. Administrar tratamiento analgésico por vía subcutánea (0,1 mg/kg de buprenorfina).
  19. Coloque al animal en una jaula limpia y coloque la jaula en una almohadilla térmica hasta que el ratón se recupere completamente de la anestesia.
  20. Repita la administración de analgésicos cada 12 horas durante 3 días después de la cirugía.
  21. Cierre el obturador de OPO y fs laser. Ajuste la potencia de la bomba y el haz stokes al máximo.
    NOTA: Establecer la potencia máxima antes de apagar el láser es beneficioso para el mantenimiento del láser.
  22. Ajuste la longitud de onda del haz de la bomba y el láser fs a 800 nm.
  23. Coloque los dos láseres en modo de espera, cierre todo el software de control electrónico y apague todos los equipos asociados.

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Representative Results

La obtención de imágenes dual-modales in vivo de los axones espinales, así como de las vainas de mielina, se realiza utilizando los ratones transgénicos Thy1-YFPH, que expresan EYFP en las neuronas aferentes del ganglio de la raíz dorsal (Figura 3). Estas neuronas aferentes marcadas transmiten la información sensorial del nervio periférico a la médula espinal, con la rama central ubicada en la columna dorsal de la médula espinal. Con el microscopio TPEF-SRS, la vaina de mielina densamente distribuida se puede visualizar claramente utilizando imágenes SRS sin etiqueta, y los axones YFP escasamente marcados se pueden observar utilizando imágenes TPEF. La imagen de modelo dual revela que los axones están estrechamente envueltos por una gruesa capa de vainas de mielina (Figura 3C). Los nodos de Ranvier (NR), donde el axolemma está desnudo de la vaina de mielina, desempeñan un papel esencial en la rápida propagación saltatoria de los potenciales de acción. Como se puede observar en la imagen de la médula espinal TPEF-SRS (Figura 3C), nr muestran disminución del diámetro axonal y axolemma directamente expuesto a la matriz extracelular. Es esencial obtener imágenes de los axones junto con las vainas de mielina circundantes para confirmar la existencia y ubicación de NR. Por lo tanto, la microscopía TPEF-SRS nos permite observar los cambios dinámicos de los axones y las vainas de mielina en el desarrollo de trastornos de la médula espinal, lo cual es significativo para comprender los mecanismos de la dinámica celular.

Figure 1
Figura 1: El diagrama esquemático del sistema de microscopio TPEF-SRS. La bomba y los haces stokes se combinan con un espejo dicroico (D1) en el láser de picosegundos (ps). El haz ps y el haz de femtosegundos (fs) están colimados y expandidos/estrechados por un par de lentes (L3, L4 y L1, L2, respectivamente) para que coincidan con los espejos galvanómetro XY-scan de 3 mm. El haz fs se gira de polarización horizontal a vertical mediante una placa de media onda (HWP), y luego se combina con el haz ps mediante un divisor de haz polarizador (PBS). Los espejos de barrido y la pupila trasera de la lente objetivo están conjugados por una lente de escaneo telecéntrica L5 y una lente de tubo corregida al infinito L6. El rayo láser se expande mediante la lente de escaneo y tubo para llenar la abertura posterior del objetivo 25x. Para la obtención de imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS), el haz de bomba retrodispersado recogido por el objetivo es reflejado por un PBS y dirigido a un fotodiodo de silicio (PD) de gran área (10 mm x 10 mm). Para las imágenes de dos fotones, la señal de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) es reflejada por un divisor de haz dicroico D2 a la unidad de fotodetección. Se utiliza un módulo fotomultiplicador actual (PMT) para detectar la señal TPEF. Abreviaturas-L1-L10: lentes; OL: lente del objetivo; D1-D3: espejos dicroicos; Fs1, Fs2: conjuntos de filtros; M: espejos; OM1, OM2: espejos ópticos; P0-P2: placas de alineación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La interfaz del gestor de retardo en el software de control OPO. La flecha roja indica la casilla de verificación para aplicar los datos de retardo calibrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes TPEF-SRS in vivo de la médula espinal del ratón. (A) Diagrama esquemático de la preparación quirúrgica de la médula espinal del ratón y la imagen de campo brillante de la médula espinal. (B) Esquema de montaje en ratón para imágenes in vivo de la médula espinal. (C) Imágenes de proyección z máxima de axones y vainas de mielina en la médula espinal del ratón. Las puntas de flecha blancas indican la ubicación de un nodo de Ranvier. Las imágenes SRS de mielina se toman en el turno Raman de 2863.5 cm-1. La figura A se creó utilizando BioRender (https://biorender.com/).  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este protocolo, se describe en detalle la configuración básica del microscopio TPEF-SRS. Para las imágenes SRS, la bomba y los haces stokes se superponen temporal y espacialmente dentro del OPO. Sin embargo, esta superposición puede interrumpirse después de pasar a través del sistema de microscopio. Por lo tanto, la optimización espacial y temporal de la colocalización de la bomba y los haces de Stokes es necesaria y crítica para lograr una imagen SRS óptima. El retardo temporal entre la bomba y el haz de Stokes está relacionado con la diferencia de trayectoria óptica de los dos haces, que viene determinada por la dispersión de elementos ópticos en el sistema del microscopio38. Cuando la longitud de onda del haz de la bomba se ajusta para la obtención de imágenes SRS en diferentes turnos Raman, la longitud de la trayectoria óptica del haz de la bomba cambia en consecuencia porque el índice de refracción de las lentes ópticas depende de la longitud de onda38. Por lo tanto, el retardo temporal entre la bomba y el pulso del láser Stokes cambia con la longitud de onda del haz de la bomba y, por lo tanto, debe calibrarse. El OPO está equipado con una línea de retardo controlada por software para la sincronización temporal de la bomba y el haz stokes. Para la misma configuración óptica, los datos de retardo permanecen estables y solo deben calibrarse una vez. Como resultado, los datos de retardo en diferentes longitudes de onda del haz de la bomba se pueden guardar en la primera medición para su uso futuro. Los datos de retardo calibrados pueden ser aplicados automáticamente por el software de control OPO cuando se cambia la longitud de onda del haz de la bomba, lo que es conveniente para imágenes SRS en diferentes turnos Raman o imágenes SRS hiperespectrales. Para las imágenes TPEF-SRS, la superposición espacial estricta de los haces ps y fs después de la combinación es un paso crítico para evitar cualquier cambio de FOV entre los dos modelos de imagen. En primer lugar, el haz de la bomba ps y el haz fs están alineados para asegurarse de que ambos estén en el eje óptico del sistema de microscopio, lo cual es fundamental para evitar cualquier cambio de FOV al cambiar los dos modelos de imagen. Luego, utilizando el haz de la bomba como referencia, la posición del haz de Stokes se ajusta en consecuencia para lograr una colocalización espacial estricta. Cada procedimiento de alineación requiere varias pruebas para alcanzar el óptimo.

Si la señal SRS disminuye significativamente, primero se debe verificar el valor de fase del amplificador de bloqueo y los datos de retardo de tiempo. Dado que el amplificador de bloqueo se desfase una vez que se interrumpe la señal de sincronización, el valor de fase requiere reajustarse cada vez que se interrumpe su fuente de alimentación o señal de sincronización EOM. La sincronización temporal de la bomba y el haz stokes se puede comprobar rápidamente ajustando ligeramente la línea de retardo dentro del OPO. Si los datos de retardo de tiempo calibrados están lejos del valor óptimo, se debe realizar un análisis cero para recalibrar el desplazamiento de retardo haciendo clic en el botón Análisis cero en el diálogo del gestor de retardo. Todo el procedimiento de escaneo cero toma aproximadamente 10 minutos. Si la señal SRS no se recupera después de la optimización del valor de fase y retardo de tiempo, se debe comprobar la modulación EOM del haz de Stokes como se describe en los pasos 2.1.3-2.1.4. Si la relación de extinción es mucho menor que 10 dB con la observación de pequeños picos de pulso en la posición de apagado del tren de pulsos de Stokes, la MOE debe reiniciarse y la potencia y la fase de modulación deben reajustarse para lograr la profundidad de modulación máxima. Por lo general, el problema de modulación se puede resolver restableciendo la MOE. De lo contrario, se debe requerir el soporte técnico del fabricante.

Para las imágenes de tejidos gruesos in vivo, se debe utilizar el modo de detección epi-SRS. En este protocolo, se utiliza un PBS para pasar el láser de excitación y reflejar la señal SRS retrodispersada al detector. La señal SRL detectada depende de la retrodispersión del haz de la bomba hacia adelante por los tejidos. Los láseres de excitación tienen polarización lineal y pueden pasar completamente a través del PBS, mientras que el haz retrodispersado ha cambiado la polarización y, por lo tanto, solo puede ser reflejado parcialmente por el PBS. Por lo tanto, el esquema actual de recolección de señales muestra una menor eficiencia en comparación con la estrategia que coloca directamente un fotodetector anular frente al objetivo12. Sin embargo, debido a la fuerte dispersión de los tejidos ricos en lípidos39, se pueden adquirir imágenes SRS de alta relación señal-ruido (512 x 512 píxeles) de la médula espinal con un tiempo de integración de 1-2 s, lo que hace que este esquema de recolección basado en PBS sea un enfoque apropiado para las imágenes de la médula espinal. Por otro lado, sin embargo, la fuerte dispersión del tejido limita la profundidad de penetración de la luz. Tanto para las imágenes SRS como para TPEF, la profundidad de imagen de la médula espinal se limita a aproximadamente 50 μm.

El procedimiento de imágenes secuenciales para imágenes SRS y TPEF es la principal limitación del método actual de imágenes de doble modal. En el protocolo, las imágenes TPEF y SRS se realizan en la misma ubicación secuencialmente con un intervalo de 1 s cambiando el flipper motorizado automáticamente. Los artefactos de movimiento pueden causar una fusión imperfecta de las imágenes TPEF y SRS, lo que limita la capacidad de este método para obtener imágenes de procesos altamente dinámicos o tejidos afectados en gran medida por la respiración y los latidos del corazón de los animales. Una posible solución es recolectar la fluorescencia de dos fotones excitada por láser ps simultáneamente durante las imágenes SRS9. Sin embargo, este método solo es aplicable a las estructuras biológicas con fuertes señales de fluorescencia, ya que el pulso ps tiene una eficiencia de excitación de fluorescencia mucho menor en comparación con el pulso fs14. Alternativamente, el problema se puede resolver mediante el uso de un sistema fs-SRS22,40, donde la fuente láser fs permite la excitación simultánea de las señales SRS y TPEF de manera efectiva, a expensas de la baja resolución espectral de las imágenes SRS. Otra solución es utilizar la fluorescencia excitada por láser ps obtenida durante las imágenes SRS como referencia para registrar las imágenes de fluorescencia fs. Como se muestra en la Figura 3, esta estrategia de registro funciona bien si no se produce un movimiento significativo durante el SRS y las imágenes de fluorescencia.

SRS exhibe ventajas únicas en imágenes biológicas, ya que proporciona información química de biomoléculas basada en su mecanismo de contraste específico sin etiquetas41. En comparación con CARS, que también se ha combinado con TPEF para imágenes NLO multimodales, SRS mostró una mejor capacidad de interpretación espectral y de imágenes11. Por lo tanto, se ha aplicado ampliamente para imágenes de lípidos9,11, proteínas42,43, ADN44 y componentes bio-ortogonales que contienen enlaces alquino (C ≡ C)13,45, carbono-deuterio (C−D)9,46 y oxígeno-deuterio (O-D)47,48 en tejidos biológicos. En este protocolo, utilizamos una fuente láser ps para imágenes SRS y una fuente láser fs para imágenes TPEF, que combina las ventajas de la excitación de fluorescencia eficiente y la alta resolución espectral Raman, lo que permite la diferenciación efectiva de diversas biomoléculas42,44. En la médula espinal, las complejas interacciones célula-microambiente que involucran células gliales, neuronas y células inmunes reclutadas contribuyen a la progresión de lesiones49 y enfermedades50. Combinada con varias sondas de imágenes de fluorescencia y SRS, la microscopía TPEF-SRS puede lograr imágenes simultáneas de varias estructuras celulares, así como sus distintos componentes de biomoléculas, lo que puede facilitar significativamente nuestra comprensión de la aparición y el desarrollo de trastornos de la médula espinal.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar y no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong a través de subvenciones 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Comisión de Innovación y Tecnología (ITCPD/17-9), el Esquema de Área de Excelencia del Comité de Becas Universitarias (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) y la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST) a través de la subvención RPC10EG33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

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References

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Bioingeniería Número 178
<em>In vivo</em> Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada
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