Ved hjælp af transgene fluorescerende mus beskrives detaljerede protokoller for at vurdere in vivo axonal transport af signalende endosomer og mitokondrier inden for motoriske og sensoriske axoner af den intakte iskiasnerve hos levende dyr.
Axonal transport opretholder neuronal homeostase ved at muliggøre tovejshandel med forskellige organeller og laster. Forstyrrelser i axonal transport har ødelæggende konsekvenser for individuelle neuroner og deres netværk og bidrager til en overflod af neurologiske lidelser. Da mange af disse tilstande involverer både celleautonome og ikke-autonome mekanismer og ofte viser et spektrum af patologi på tværs af neuronale undertyper, er metoder til nøjagtigt at identificere og analysere neuronale delmængder afgørende.
Dette papir beskriver protokoller til vurdering af in vivo axonal transport af signalendedosomer og mitokondrier i iskiasnerver hos bedøvede mus. Trinvise instruktioner gives til 1) skelne motoriske fra sensoriske neuroner in vivo, in situ og ex vivo ved hjælp af mus, der selektivt udtrykker fluorescerende proteiner i kolinerge motorneuroner; og 2) separat eller samtidig vurdere in vivo axonal transport af signalendedosomer og mitokondrier. Disse komplementære intravitale tilgange letter samtidig billeddannelse af forskellige laster i forskellige perifere nerveaksoner for kvantitativt at overvåge aksonal transport i sundhed og sygdom.
Det perifere nervesystem (PNS) forbinder centralnervesystemet (CNS) med dets distale mål, hvilket gør det muligt for relæet af efferente signaler at udøve motorisk kontrol og afferente signaler for at give sensorisk feedback. Ved hjælp af de mange fremskridt inden for musegenetik har forskere udviklet forskellige musemodeller til at undersøge mange sygdomme / syndromer, der rammer PNS 1,2,3. Da de fleste neurodegenerative patologier er multifaktorielle med celleautonome og ikke-autonome bidrag 4,5, kan frigørelse af celle-/neuronspecifikke patologier give afgørende, ny indsigt i sygdomsmekanismer.
Til dette formål har udviklingen af bakterielle kunstige kromosom (BAC) -transgene mus6 muliggjort selektiv endogen ekspression af fluorescerende proteiner i målrettede undergrupper af neuroner. For eksempel er BAC-transgene mus tilgængelige, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i kolinerge7 eller glycinerge neuroner8 eller en variant rødt fluorescerende protein (tdTomato) i parvalbumin-positive neuroner9. Alternativt kan selektiv neuronal ekspression af fluorescerende proteiner opnås via Cre-loxP-teknologi 10. For eksempel kan musestammer, der udtrykker Cre-rekombinase i undergrupper af neuroner (f.eks. Cholinacetyltransferase (ChAT)-Cre), opdrættes med mus, der udtrykker et fluorescerende protein (f.eks. tdTomato eller GFP) fra et konstitutivt sted (f.eks. Gt (ROSA)26Sor) under kontrol af en transkriptionel repressor flankeret af loxP-steder11 (f.eks. genererende mus, der kun udtrykker tdTomato i kolinerge neuroner). Ved hjælp af Cre-loxP-rekombination er der faktisk genereret transgene mus, der udtrykker gult fluorescerende protein i axoner i den faldende corticospinalkanal12.
Derudover muliggør nylige fremskridt inden for CRISPR / Cas9-genredigering, såsom ORANGE, fluorescerende mærkning af flere endogene neuronale proteiner, hvor ekspression kan opnås ved nanoskalaopløsning13. Desuden kan ORANGE-CAKE i kombination med Cre-ekspressive musestammer bruges til at mærke flere endogene proteiner i individuelle neuroner13. Alternativt tillader viral medieret neuronal sporing også mærkning af neuronale delmængder og kan opnås med målrettede kombinationer af virale serotyper og / eller cellespecifikke promotorer 14,15,16,17.
Ud over de neuronale mærkningsmetoder er muselinjer også blevet konstrueret til at udtrykke reporterproteiner rettet mod specifikke organeller, såsom mitokondrier, der udtrykker cyan fluorescerende protein (Mito.CFP)18 eller autofagosomer, der udtrykker GFP (LC3.GFP)19. Desuden er muselinjer blevet konstrueret til at vurdere calciumdynamik specifikt i neuroner (f.eks. Thy1.GCaMP)20,21. Alt i alt, med udviklingen af sådanne modeller, gør nye eksperimentelle applikationer det muligt for forskere at stille mere præcise biologiske og patologiske spørgsmål om CNS og PNS.
Hovedrollen af perifere motoriske nerver er at transmittere elektriske signaler til skeletmuskulaturen for at fremkalde bevægelse. Derudover og forekommer over længere tidsskalaer, neurokemiske og fysiologiske meddelelser i form af forskellige organeller (f.eks. Mitokondrier, endolysosomer, signalerende endosomer) krydser det cytoskeletale netværk på en en- eller tovejs måde for at hjælpe med at opretholde neuronal homeostase 22,23,24. Forringelser i aksonal transport har katastrofale konsekvenser for neuronal sundhed og er forbundet med mange neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme25. På molekylært niveau kan forringelser i axonal transport forstyrre fysiologiske hændelser, der regulerer synaptisk signalering og plasticitet, gentransskription og lokal translation gennem axon26,27. Mens der er en lang række værktøjer til at studere disse begivenheder i dyrkede celler / neuroner28,29, er det nødvendigt at vurdere axonal transportdynamik og axonalbundne biologiske begivenheder in vivo for at bekræfte nøgleindsigt i fysiologiske og patologiske processer30.
I årenes løb har Schiavo Laboratory optimeret protokoller til at stille forskellige spørgsmål om axonal transport 31,32,33,34,35,36. Disse eksperimenter er udvidet fra opdagelsen af, at et fluorescerende mærket atoksisk fragment af stivkrampe neurotoksin (HCT) internaliseres i axonterminaler i skeletmuskulatur gennem interaktioner med nidogens og polysialogangliosider37. Når HCTer internaliseret, transporteres H C T retrogradt i Rab7-positive, neurotrofinholdige signalendedosomer, der er bestemt til cellelegemerne i motoriske og sensoriske neuroner 38,39,40,41. Parallelt hermed har fremskridt inden for billeddannelsesteknologi muliggjort realtidsanalyse af perifere nervebundter og individuelle axoner i levende, bedøvede mus30. Det første forsøg på at vurdere in vivo axonal transportdynamik i patologi afslørede præsymptomatiske svækkelser i transporten af signalendedosomer og mitokondrier i SOD1G93A musemodellen af amyotrofisk lateral sklerose (ALS)35. Det er vigtigt, at disse defekter sandsynligvis ikke blot repræsenterer sekundære konsekvenser af neurodegeneration, da det konstateres, at motorneurontab kan forekomme i fravær af aksonale transportforstyrrelser i en musemodel af Kennedys sygdom42 og en heterozygot mutant FUS-model af ALS43. Sådanne aksonale transportunderskud kan afhjælpes hos ALS-mus ved anvendelse af inhibitorer af specifikke kinaser33 eller vækstfaktorreceptorer34. Desuden ændrer behandling af neuroner med en specifik histon deacetylaseblokker mitokondrietransport in vivo36. Senest rapporterer vi, at den BDNF-afhængige modulering af axonal transport er dysreguleret i forskellige motorneuronundertyper i ALS-mus44.
Ved at bruge et stadigt voksende værktøjssæt til vurdering af aksonal transportdynamik 28,29 skitserer denne videoprotokol flere applikationer, der giver yderligere indsigt i forskellige biologiske og patologiske scenarier. For det første bruges transgene mus, der selektivt udtrykker fluorescerende proteiner i kolinerge neuroner (dvs. motorneuroner) til at skelne mellem motoriske og sensoriske axoner både in vivo og ex vivo. Fluorescerende mærket HCT indlæses derefter i signalende endosomer i tre transgene linjer for at differentiere aksonal transportdynamik i forskellige perifere neuroner. Den næste eksperimentelle protokol beskriver en multiplex fluorescens tilgang til at vurdere mitokondrietransport specifikt i motorneuroner ved at opdrætte ChAT.tdTomato mus med Mito-CFP mus. Endelig gives der instruktioner om, hvordan man samtidig afbilder mitokondrier og signalerer endosomer inden for samme axon in vivo.
Denne protokol beskriver trin til vurdering in vivo axonal transport af signalendedosomer og mitokondrier i intakte axoner i musens iskiasnerve. Faktisk tilvejebringes en eksperimentel opsætning, der gør det muligt for brugerne at 1) skelne motoriske fra sensoriske neuroner in vivo, in situ og ex vivo ved hjælp af mus, der udtrykker fluorescerende reporterproteiner selektivt udtrykt i motorneuroner; 2) vurdere in vivo axonal transport af signalendedosomer specifikt i motorneuron axoner ved hjælp af tre forskellige transgene mus; 3) undersøge in vivo axonal transport af mitokondrier specifikt i motorneuron axoner; og 4) samtidig vurdere in vivo transportdynamik af signalering af endosomer og mitokondrier inden for samme axon. Denne tilgang har et stort potentiale til at undersøge aksonal transport under basale forhold og kan bruges til at vurdere patologiske forstyrrelser i forskellige sygdomme, der påvirker perifere motoriske og sensoriske nerver.
Ved hjælp af tidligere eksperimentelle paradigmer som fundament31,32 har vi her detaljerede nye, robuste måder at differentiere aksonal transport, der forekommer i motoriske versus sensoriske neuroner ved hjælp af transgene reportermus. Ved hjælp af Mito.CFP-musen er denne fremgangsmåde blevet videreudviklet til at vurdere in vivo mitokondrietransport ved at undgå intrasciatiske nerveinjektioner af TMRE36. Dette omgår mulige neurale skader og forstyrrelser i aksonal transport forårsaget af probens intranerve injektion. Desuden tillader denne protokol visualisering af aksonal transport af flere organeller i motoraksoner, der innerverer muskler med forskellige fysiologiske egenskaber (f.eks. hurtige træk fedtbare muskler vs. langsomme træthedsresistente muskler). Som sådan kan signalering af endosom og / eller mitokondrieaksonal transportdynamik vurderes i forskellige undergrupper af α-motoriske neuroner44. Desuden kan den aksonale transport af disse organeller i patologiske omgivelser også vurderes gennem krydsning med musemodeller af forskellige neurodegenerative sygdomme 1,2,3.
Det aksonale transportværktøjssæt udvides løbende28,29, og ex vivo-protokoller er blevet udviklet til at vurdere transportdynamikken ved hjælp af dyrkede museventrale horneksplolanter49 eller udskårne musenervemuskelpræparater50. Desuden har udviklingen af protokoller til vurdering af axonal transport i induceret human pluripotent stamcelle (hiPSC) afledte kortikale51 neuroner eller hiPSC-afledte spinalmotorneuroner52 muliggjort undersøgelse af humane neuroner med sygdomsfremkaldende mutationer. Sådanne banebrydende protokoller i musevæv og humane celler kan give kritisk indsigt i neuronal funktion, lette ny patomekanistisk opdagelse i neurodegenerative sygdomsmodeller og bruges til at teste terapeutiske molekyler og strategier.
Flere kritiske trin skal følges for en vellykket implementering af disse teknikker, og nogle vigtige noter er angivet i protokolafsnittet. De vigtigste krav til intravital billeddannelse er det omvendte konfokale mikroskop med tilpasset trinindsats og udstyret til at opretholde anæstesi og optimal temperatur. Faktisk er der behov for et specialiseret mobilt bedøvelsessystem til 1) induktion af anæstesi, 2) dissektion / vævsbehandling (dvs. udsættelse af iskiasnerven) og 3) opretholdelse af anæstesi under intravital billeddannelse (som tidligere beskrevet i 31,32). Især når du bruger højere forstørrelsesmål (f.eks. 40x eller 63x), kan anæstesidybden påvirke billedkvaliteten, da dybere anæstesi inducerer store ‘gaspy’ vejrtrækninger, der resulterer i hyppige skift i fokus. Sådanne store bevægelser vil utvivlsomt påvirke transportanalyser efter billeddannelse (f.eks. Sporing af laster ved hjælp af Fiji-plugins TrackMate53 eller KymoAnalyzer54), da vejrtrækningsbevægelserne producerer artefakter i time-lapse-videoer, der kan gøre dem uegnede til automatiseret sporing eller kræve mere tidskrævende vurdering. Desuden har vi også observeret billeddannelsesartefakter forårsaget af pulserende arterier i iskiasnerven, som kun kan løses ved at vælge en anden billeddannelsesregion. Mikroskopet skal være udstyret med et miljøkammer, der er i stand til at opretholde konstant kropstemperatur, da temperatur og pH påvirker aksonal transport55. Desuden bør anvendelse af smertestillende midler efter operationen undgås, da de kan ændre transportdynamikken56. Hvis forsøgsdesignet er tidssvarende og kræver gentagen billeddannelse (f.eks. 57), skal dissektionsprotokollerne justeres på passende vis, så de er minimalt invasive, og kan kræve yderligere etisk godkendelse/licensgodkendelse.
Visse eksperimentelle overvejelser skal tages i betragtning. For det første involverer de fleste af de protokoller, der er beskrevet heri, brugen af transgene mus, der besidder fluorescerende reporterproteiner i mitokondrier eller motorneuronaksoner. Hver af disse muselinjer skal opdrættes og afbildes som hemi-/heterozygote. Undtagelserne er dog ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato muselinjer, der kan opretholdes separat som homozygoter, med det resulterende hemizygote-afkom, der muliggør tdTomato-ekspression i kolinerge neuroner efter Cre-loxP-rekombination . Når man krydser transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. Mito.CFP) med andre transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. ChAT.eGFP), skal man nøje overveje avlsstrategien, da det kan være tidskrævende at opnå det ønskede antal dobbeltmutante afkom. Når man opdrætter F1-generationen af ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato-mus (dvs. ChAT.tdTomato) med yderligere transgene stammer (f.eks. Mito.CFP), bør man desuden forvente endnu færre mus, der bærer de ønskede tredobbelte transgener. Derudover skal man også overveje det potentielle fluoroforoverlap, når man opdrætter to-reportermus med nærliggende bølgelængdeegenskaber (f.eks. Mito-CFP-excitation: 435 nm, emission: 485 nm, opdrættet med ChAT.eGFP-excitation: 488 nm, emission: 510 nm), selvom det kan være muligt at overvinde dette problem med spektral ublanding58.
Denne teknik har nogle begrænsninger, der skal overvejes. I dette arbejde og vores tidligere protokoller31,32 har vi vist, hvordan flere genetisk kodede markører og forskellige farvningsmetoder kan bruges til at mærke og spore forskellige organeller in vivo. Imidlertid er ikke alle sonder egnede til denne eksperimentelle tilgang. Vi vurderede injektioner i enten TA eller soleus muskel af koleratoksin beta-underenhed (CTB)-488 (0,5-1,5 μg / μL ~ 4 timer før billeddannelse), en sonde, der rutinemæssigt bruges til at mærke motorneuroncellelegemer i in vivo retrograde sporstofeksperimenter59,60. Men når den blev injiceret alene eller injiceret sammen med HCT-555, var CTB-488-mærkningen dårlig på trods af anvendelse af koncentrationer svarende til dem, der blev brugt til vellykket retrograd motorneuronsporing. Således konkluderer vi, at på trods af at CTB er en fremragende in vitro-markør for signalering af endosomer i neuronale kulturer61, forbliver HCT guldstandardproben til at identificere signalende endosomer in vivo i iskiasnerveaksoner.
Ved hjælp af forskellige ruter testede vi også sonder, der rutinemæssigt blev brugt til mærkning af lysosomer, såsom LysoTracker grøn DND-26, og markører af aktive lysosomale hydrolaser, såsom BODIPY-FL-pepstatin A for Cathepsin D62 og Magic Red for Cathepsin B, men uden succes. Vi prøvede intramuskulær levering af BODIPY-FL-pepstatin A (2,5 μg i TA ~ 4 timer før billeddannelse) samt intrasciatisk nerveinjektion af 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) eller Magic Red (1/10) 30-60 min før billeddannelse. På trods af at disse sonder fremhævede nerven, kunne vi ikke finde tydeligt mærkede organeller. Sonderne akkumulerede omkring axoner, sandsynligvis bevaret af Schwann-celler. Derfor kan den mislykkede mærkning af lysosomer skyldes mangelfuld sondeafgivelse i neuroner, selvom eksistensen af mere egnede koncentrationer ikke kan udelukkes. I betragtning af at TMRE-mærkning fungerer under lignende forhold (dvs. intrasciatiske nerveinjektioner), kan mærkningsintensiteten være farvestofafhængig og skal testes for hver markør uafhængigt. Vi konkluderer imidlertid, at målretning af lysosomer in vivo med disse sonder ikke er mulig i de ovennævnte koncentrationer.
Anæstesimetoder kan ændre forskellige fysiologiske aflæsninger (f.eks. Cochlea-funktion63 og kortikal elektrofysiologi64); men om anæstesi påvirker in vivo axonal transport i iskiasnerven er i øjeblikket ukendt. I betragtning af den reducerede neuromuskulære aktivitet under isofluraninduceret anæstesi er det muligt, at transportkinetik adskiller sig i forhold til den vågne tilstand. Den eneste in vivo-undersøgelse, der direkte har undersøgt dette, afslørede imidlertid, at transport af tætte kernevesikler i thalamokortiske fremskrivninger ikke adskiller sig mellem bedøvede og vågne mus65. Da sondringer i transport mellem vildtype- og sygdomsmodelmus kan påvises under anæstesi35,43, er det desuden klart, at isofluraneksponering ikke forhindrer identifikation af forstyrrelser i signalering af endosom eller mitokondriehandel.
Denne protokol har andre potentielle anvendelser, som er beskrevet nedenfor. Opdræt af de transgene mus, der er skitseret i denne protokol (f.eks. Mito.CFP, ChAT.eGFP) med neurodegenerative sygdomsmusmodeller 1,2,3 vil muliggøre neuronundertype- og / eller lastspecifikke undersøgelser. Desuden ville nyligt udviklede muselinjer66 også tillade visualisering af fluorescerende reporterproteiner i forskellige sensoriske axonpopulationer. For eksempel kan Rosa26.tdTomato mus krydses med et neuropeptid Y receptor-2-ekspressive (Npy2r). Cre mus for at aktivere tdTomato fluorescens i myelinerede A-fiber nociceptorer67. Desuden kan tidsmæssig kontrol også opnås ved hjælp af inducerbare Cre-systemer (f.eks. Tamoxifen)68. En anden potentiel anvendelse er afhængig af tilgængeligheden af transgene mus, der udtrykker fluorescerende reporterproteiner i Schwann-celler. Faktisk muliggør S100-GFP69 og PLP-GFP70 mus in vivo og / eller in situ billeddannelse af Schwann-celler og har været i spidsen for forskning involveret i Schwann-cellemigration under perifer nerveregenerering.
Ud over disse anvendelser og som supplement til Mito.CFP-musen er tilgængeligheden af flere transgene muselinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner i forskellige organeller, såsom mitokondrier og autofagosomer. For eksempel kan det være muligt at undersøge in vivo mitokondrietransport med mito::mKate2 mus71 eller den fotokonverterbare mitoDendra mus57. Desuden kan in vivo mitophagosomtransport være mulig ved hjælp af den pH-følsomme mito-Keima mus72 og mito-QC mus73 til mitofagianalyser. Desuden kan de lysosomale mærkningsvanskeligheder, vi stødte på, overvindes ved hjælp af mus, der udtrykker LAMP1-GFP, med det forbehold, at LAMP1 også er til stede i endocytiske organeller, der adskiller sig fra lysosomer74.
Sammenfattende har vi givet nye måder at vurdere in vivo axonal transport af flere organeller i specifikke perifere nerveaksoner fra forskellige transgene mus. Den samtidige billeddannelse af forskellige organeller vil være særlig vigtig i betragtning af nylige fund af aksonale interaktioner og co-trafficking af organeller såsom mitokondrier og endosomer75,76. Vi mener, at de præsenterede metoder vil være nyttige til at forbedre forståelsen af axoners basale fysiologi in vivo og udrede vigtige patomechanismer, der driver neurodegeneration af perifere nerver.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for at dele ChAT-eGFP, ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato mus og Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for at dele HB9. GFP-mus. Vi vil gerne takke Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers og Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af et Junior Non-Clinical Fellowship fra Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini / Oct20 / 973-799) (APT), Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z og 223022 / Z / 21 / Z) (GS), en UK Dementia Research Institute Foundation-pris (GS); og en medicinsk forskningsråds karriereudviklingspris (MR / S006990 / 1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |