À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.
Le transport axonal maintient l’homéostasie neuronale en permettant le trafic bidirectionnel de divers organites et cargaisons. Les perturbations du transport axonal ont des conséquences dévastatrices pour les neurones individuels et leurs réseaux, et contribuent à une pléthore de troubles neurologiques. Comme beaucoup de ces conditions impliquent à la fois des mécanismes cellulaires autonomes et non autonomes, et présentent souvent un spectre de pathologie à travers les sous-types neuronaux, des méthodes pour identifier et analyser avec précision les sous-ensembles neuronaux sont impératives.
Cet article détaille les protocoles pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les nerfs sciatiques de souris anesthésiées. Des instructions par étapes sont fournies pour 1) distinguer les neurones moteurs des neurones sensoriels in vivo, in situ et ex vivo en utilisant des souris qui expriment sélectivement des protéines fluorescentes dans les motoneurones cholinergiques; et 2) évaluer séparément ou simultanément le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries. Ces approches intravitales complémentaires facilitent l’imagerie simultanée de différentes cargaisons dans des axones nerveux périphériques distincts pour surveiller quantitativement le transport axonal dans la santé et la maladie.
Le système nerveux périphérique (SNP) relie le système nerveux central (SNC) à ses cibles distales, permettant au relais de signaux efférents d’exercer un contrôle moteur et des signaux afférents pour fournir une rétroaction sensorielle. En utilisant la multitude de progrès de la génétique de la souris, les scientifiques ont développé différents modèles murins pour étudier de nombreuses maladies / syndromes affectant le SNP 1,2,3. Comme la plupart des pathologies neurodégénératives sont multifactorielles avec des contributions cellulaires autonomes et non autonomes 4,5, démêler les pathologies spécifiques aux cellules / neurones peut fournir des informations cruciales et nouvelles sur les mécanismes de la maladie.
À cette fin, le développement de souris bactériennes transgéniques à chromosome artificiel (BAC)6 a permis l’expression endogène sélective de protéines fluorescentes dans des sous-ensembles ciblés de neurones. Par exemple, des souris bac-transgéniques sont disponibles, qui expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans les neurones cholinergiques7 ou glycinergiques8, ou une variante de la protéine fluorescente rouge (tdTomato) dans les neurones positifs à la parvalbumine9. Alternativement, l’expression neuronale sélective des protéines fluorescentes peut être obtenue via la technologie Cre-loxP 10. Par exemple, les souches de souris exprimant la Cre-recombinase dans des sous-ensembles de neurones (p. ex., la choline acétyltransférase (ChAT)-Cre) peuvent être élevées avec des souris qui expriment une protéine fluorescente (p. ex., tdTomato ou GFP) à partir d’un locus constitutif (p. ex., Gt(ROSA)26Sor) sous le contrôle d’un répresseur transcriptionnel flanqué de sites loxP11 (p. ex., générant des souris qui expriment tdTomato uniquement dans les neurones cholinergiques). En effet, en utilisant la recombinaison Cre-loxP, des souris transgéniques ont été générées qui expriment la protéine fluorescente jaune dans les axones du tractus corticospinal descendant12.
En outre, les progrès récents dans l’édition de gènes CRISPR/Cas9, tels que ORANGE, permettent le marquage fluorescent de plusieurs protéines neuronales endogènes, avec une expression réalisable à l’échelle nanométrique13. De plus, en combinaison avec des souches de souris exprimant Cre, ORANGE-CAKE peut être utilisé pour marquer plusieurs protéines endogènes dans des neurones individuels13. Alternativement, le traçage neuronal à médiation virale permet également le marquage de sous-ensembles neuronaux et peut être réalisé avec des combinaisons ciblées de sérotypes viraux et / ou de promoteurs spécifiques aux cellules 14,15,16,17.
En plus des méthodes de marquage neuronal, des lignées de souris ont également été conçues pour exprimer des protéines rapporteures ciblant des organites spécifiques, telles que les mitochondries exprimant la protéine fluorescente cyan (Mito.CFP)18 ou les autophagosomes exprimant GFP (LC3.GFP)19. De plus, des lignées de souris ont été conçues pour évaluer la dynamique du calcium spécifiquement dans les neurones (par exemple, Thy1.GCaMP)20,21. Dans l’ensemble, avec l’avancement de tels modèles, de nouvelles applications expérimentales permettent aux scientifiques de poser des questions biologiques et pathologiques plus précises sur le SNC et le SNP.
Le rôle principal des nerfs moteurs périphériques est de transmettre des signaux électriques au muscle squelettique pour provoquer le mouvement. De plus, et se produisant sur des échelles de temps plus longues, des messages neurochimiques et physiologiques sous la forme de divers organites (p. ex., mitochondries, endolysosomes de signalisation) traversent le réseau cytosquelettique de manière unidirectionnelle ou bidirectionnelle pour aider à maintenir l’homéostasie neuronale 22,23,24. Les déficiences du transport axonal ont des conséquences désastreuses sur la santé neuronale et sont liées à de nombreuses maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives25. Au niveau moléculaire, les déficiences du transport axonal peuvent perturber les événements physiologiques régulant la signalisation synaptique et la plasticité, la transcription des gènes et la traduction locale dans l’ensemble de l’axone26,27. Bien qu’il existe une multitude d’outils pour étudier ces événements dans les cellules/neurones cultivés28,29, l’évaluation de la dynamique du transport axonal et des événements biologiques liés à l’axonale in vivo est nécessaire pour confirmer des informations clés sur les processus physiologiques et pathologiques30.
Au fil des ans, le laboratoire Schiavo a optimisé les protocoles pour poser diverses questions sur le transport axonal 31,32,33,34,35,36. Ces expériences se sont étendues à partir de la découverte qu’un fragment toxique de neurotoxine tétanique (HCT) marqué par fluorescence est internalisé en terminaisons axonales dans le muscle squelettique par des interactions avec les nidogènes et les polysialogangliosides37. Une fois internalisé, HCT est transporté rétrogradement dans des endosomes de signalisation Rab7 positifs contenant de la neurotrophine qui sont destinés aux corps cellulaires des neurones moteurs et sensoriels 38,39,40,41. En parallèle, les progrès de la technologie d’imagerie ont permis l’analyse en temps réel des faisceaux nerveux périphériques et des axones individuels chez des souris anesthésiées vivantes30. La première incursion dans l’évaluation de la dynamique du transport axonal in vivo en pathologie a révélé des déficiences présymptomatiques dans le transport des endosomes de signalisation et des mitochondries dans le modèle murin SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique (SLA)35. Il est important de noter qu’il est peu probable que ces défauts représentent simplement des conséquences secondaires de la neurodégénérescence, étant donné la découverte que la perte de motoneurones peut se produire en l’absence de perturbations du transport axonal dans un modèle murin de la maladie de Kennedy42 et un modèle FUS mutant hétérozygote de la SLA43. De tels déficits de transport axonal peuvent être corrigés chez les souris SLA en utilisant des inhibiteurs de kinasesspécifiques 33 ou des récepteurs du facteur de croissance34. De plus, le traitement des neurones avec un bloqueur spécifique de l’histone désacétylase modifie le transport mitochondrial in vivo36. Plus récemment, nous rapportons que la modulation dépendante du BDNF du transport axonal est dérégulée dans des sous-types distincts de motoneurones chez les souris SLA44.
En utilisant une boîte à outils en constante expansion pour évaluer la dynamique du transport axonal28,29, ce protocole vidéo décrit plusieurs applications qui permettront d’approfondir les connaissances sur différents scénarios biologiques et pathologiques. Premièrement, les souris transgéniques qui expriment sélectivement des protéines fluorescentes dans les neurones cholinergiques (c’est-à-dire les motoneurones) sont utilisées pour discriminer les axones moteurs et sensoriels in vivo et ex vivo. Le HCT marqué par fluorescence est ensuite chargé dans des endosomes de signalisation dans trois lignées transgéniques pour différencier la dynamique du transport axonal dans des neurones périphériques distincts. Le protocole expérimental suivant détaille une approche de fluorescence multiplex pour évaluer le transport mitochondrial spécifiquement dans les motoneurones en élevant des souris ChAT.tdTomato avec des souris Mito-CFP. Enfin, des instructions sont fournies sur la façon d’imager simultanément les mitochondries et les endosomes de signalisation dans le même axone in vivo.
Ce protocole détaille les étapes pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones intacts du nerf sciatique de la souris. En effet, une configuration expérimentale est fournie qui permet aux utilisateurs de 1) distinguer les neurones moteurs des neurones sensoriels in vivo, in situ et ex vivo en utilisant des souris exprimant des protéines rapporteures fluorescentes exprimées sélectivement dans les motoneurones; 2) évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation spécifiquement dans les axones des motoneurones en utilisant trois souris transgéniques différentes; 3) étudier le transport axonal in vivo des mitochondries spécifiquement dans les axones des motoneurones; et 4) évaluer simultanément la dynamique de transport in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries au sein du même axone. Cette approche a un vaste potentiel pour étudier le transport axonal dans des conditions basales et peut être utilisée pour évaluer les perturbations pathologiques dans différentes maladies affectant les nerfs moteurs et sensoriels périphériques.
En utilisant les paradigmes expérimentaux précédents comme base31,32, nous avons ici de nouvelles façons robustes et détaillées de différencier le transport axonal se produisant dans les neurones moteurs des neurones sensoriels à l’aide de souris rapporteures transgéniques. En utilisant la souris Mito.CFP, cette approche a été développée pour évaluer le transport mitochondrial in vivo en évitant les injections de nerf intrasciatique de TMRE36. Cela permet de contourner les dommages neuronaux possibles et les perturbations dans le transport axonal causés par l’injection intranerve de la sonde. De plus, ce protocole permet de visualiser le transport axonal de plusieurs organites dans les axones moteurs innervant les muscles ayant des propriétés physiologiques distinctes (par exemple, les muscles fatigables à contraction rapide par rapport aux muscles résistants à la fatigue à contraction lente). En tant que tel, la dynamique de l’endosome de signalisation et/ou du transport axonal mitochondrial peut être évaluée dans différents sous-ensembles de neuronesα-moteurs 44. De plus, le transport axonal de ces organites dans des contextes pathologiques peut également être évalué par croisement avec des modèles murins de différentes maladies neurodégénératives 1,2,3.
La boîte à outils de transport axonal est en constante expansion28,29, et des protocoles ex vivo ont été développés pour évaluer la dynamique de transport en utilisant des explants de corne ventrale de souris cultivées49 ou des préparations nerveuses et musculaires de souris excisées50. En outre, le développement de protocoles pour évaluer le transport axonal dans les neurones corticaux51 dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) ou les motoneurones spinaux dérivés de hiPSC52 a permis d’étudier les neurones humains présentant des mutations pathogènes. De tels protocoles de pointe dans les tissus de souris et les cellules humaines peuvent fournir des informations critiques sur la fonction neuronale, faciliter la découverte pathomécanistique dans les modèles de maladies neurodégénératives et être utilisés pour tester des molécules et des stratégies thérapeutiques.
Plusieurs étapes critiques doivent être suivies pour la mise en œuvre réussie de ces techniques, et certaines notes importantes ont été fournies dans la section du protocole. Les principales exigences pour l’imagerie intravitale sont le microscope confocal inversé avec insert de scène personnalisé et l’équipement pour maintenir l’anesthésie et la température optimale. En effet, un système d’anesthésie mobile spécialisé est nécessaire pour 1) l’induction de l’anesthésie, 2) la dissection / traitement des tissus (c.-à-d. l’exposition du nerf sciatique) et 3) le maintien de l’anesthésie pendant l’imagerie intravitale (comme détaillé précédemment dans 31,32). Surtout lorsque vous utilisez des objectifs de grossissement plus élevés (par exemple, 40x ou 63x), la profondeur de l’anesthésie peut avoir un impact sur la qualité de l’image, car une anesthésie plus profonde induit de grandes respirations « haletantes » qui entraînent des changements fréquents de mise au point. De tels mouvements importants auront sans aucun doute un impact sur les analyses de transport post-imagerie (par exemple, le suivi des cargaisons à l’aide des plugins fidjiens TrackMate53 ou KymoAnalyzer54), car les mouvements respiratoires produisent des artefacts dans des vidéos en accéléré qui peuvent les rendre impropres au suivi automatisé ou nécessiter une évaluation plus longue. De plus, nous avons également observé des artefacts d’imagerie causés par des artères pulsées dans le nerf sciatique, qui ne peuvent être résolus qu’en choisissant une région d’imagerie différente. Le microscope doit être équipé d’une chambre environnementale capable de maintenir une température corporelle constante, car la température et le pH influencent le transport axonal55. En outre, l’application d’analgésiques après la chirurgie doit être évitée, car ils peuvent modifier la dynamique de transport56. Si la conception expérimentale est longitudinale et nécessite une imagerie répétée (p. ex., 57), les protocoles de dissection doivent être ajustés de manière appropriée pour être peu invasifs et peuvent nécessiter une approbation éthique ou de licence supplémentaire.
Certaines considérations expérimentales doivent être gardées à l’esprit. Tout d’abord, la plupart des protocoles détaillés ici impliquent l’utilisation de souris transgéniques qui possèdent des protéines rapporteures fluorescentes dans les mitochondries ou les axones des motoneurones. Chacune de ces lignées de souris doit être élevée et imagée comme hémi-/hétérozygote. Les exceptions, cependant, sont les lignées de souris ChAT.Cre et Rosa26.tdTomato qui peuvent être maintenues séparément en tant qu’homozygotes, la progéniture hémizygote résultante permettant l’expression de tdTomato dans les neurones cholinergiques après la recombinaison Cre-loxP. Lors du croisement de souris hémi-/hétérozygotes transgéniques (p. ex., Mito.CFP) avec d’autres souris hémi-/hétérozygotes transgéniques (p. ex., ChAT.eGFP), il faut examiner attentivement la stratégie de reproduction, car l’obtention du nombre souhaité de descendants double mutant peut prendre beaucoup de temps. De plus, lors de la reproduction de la génération F1 de souris ChAT.Cre et Rosa26.tdTomato (c’est-à-dire ChAT.tdTomato) avec des souches transgéniques supplémentaires (par exemple, Mito.CFP), il faut s’attendre à encore moins de souris porteuses des triples transgènes souhaités. En outre, il faut également tenir compte du chevauchement potentiel des fluorophores lors de la sélection de souris à deux rapporteurs ayant des propriétés de longueur d’onde proches (par exemple, excitation Mito-CFP: 435 nm, émission: 485 nm, élevée avec ChAT.eGFP-excitation: 488 nm, émission: 510 nm), bien qu’il puisse être possible de surmonter ce problème avec le démélange spectral58.
Cette technique a quelques limites à considérer. Dans ce travail et nos protocoles précédents31,32, nous avons montré comment plusieurs marqueurs génétiquement codés et différentes méthodes de coloration peuvent être utilisés pour étiqueter et suivre des organites distincts in vivo. Cependant, toutes les sondes ne conviennent pas à cette approche expérimentale. Nous avons évalué les injections dans l’AT ou le muscle soléaire de la sous-unité bêta de la toxine cholérique (CTB)-488 (0,5-1,5 μg / μL ~ 4 h avant l’imagerie), une sonde couramment utilisée pour marquer les corps cellulaires des motoneurones dans des expériences de traçage rétrograde in vivo 59,60. Cependant, lorsqu’il était injecté seul ou co-injecté avec HCT-555, le marquage CTB-488 était médiocre malgré l’utilisation de concentrations similaires à celles utilisées pour le traçage rétrograde réussi des motoneurones. Ainsi, nous concluons que, bien que le CTB soit un excellent marqueur in vitro des endosomes de signalisation dans les cultures neuronales61, HCT reste la sonde de référence pour identifier les endosomes de signalisation in vivo dans les axones du nerf sciatique.
En utilisant différentes voies, nous avons également testé des sondes couramment utilisées pour le marquage des lysosomes, telles que LysoTracker vert DND-26, et des marqueurs d’hydrolases lysosomales actives, tels que BODIPY-FL-pepstatine A pour Cathepsin D62 et Magic Red pour Cathepsin B, mais sans succès. Nous avons essayé l’administration intramusculaire de BODIPY-FL-pepstatine A (2,5 μg dans le TA ~ 4 h avant l’imagerie), ainsi que l’injection intrasciatique de 2 μL de LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatine A (10 μM) ou Magic Red (1/10) 30-60 min avant l’imagerie. Malgré ces sondes mettant en évidence le nerf, nous n’avons pas pu trouver d’organites clairement étiquetés. Les sondes se sont accumulées autour des axones, probablement retenues par les cellules de Schwann. Par conséquent, le marquage infructueux des lysosomes peut être dû à une livraison déficiente de la sonde dans les neurones, bien que l’existence de concentrations plus appropriées ne puisse être exclue. Étant donné que le marquage TMRE fonctionne dans des conditions similaires (c.-à-d. injections de nerf intrasciatique), l’intensité du marquage peut dépendre du colorant et doit être testée pour chaque marqueur indépendamment. Cependant, nous concluons que le ciblage in vivo des lysosomes avec ces sondes n’est pas réalisable aux concentrations indiquées ci-dessus.
Les méthodes d’anesthésie peuvent modifier des lectures physiologiques distinctes (p. ex., fonction cochlée63 et électrophysiologie corticale64); cependant, on ignore actuellement si l’anesthésie influence le transport axonal in vivo dans le nerf sciatique. Compte tenu de la réduction de l’activité neuromusculaire sous anesthésie induite par l’isoflurane, il est possible que la cinétique de transport diffère par rapport à l’état d’éveil. Cependant, la seule étude in vivo qui a directement étudié cela a révélé que le transport de vésicules centrales denses dans les projections thalamocorticales ne diffère pas entre les souris anesthésiées et éveillées65. En outre, étant donné que les distinctions dans le transport entre les souris de type sauvage et les souris modèles de maladie sont détectables sous anesthésie35,43, il est clair que l’exposition à l’isoflurane n’empêche pas l’identification des perturbations dans la signalisation du trafic d’endosomes ou de mitochondries.
Ce protocole a d’autres applications potentielles, qui ont été décrites ci-dessous. L’élevage des souris transgéniques décrites dans ce protocole (p. ex., Mito.CFP, ChAT.eGFP) avec des modèles murins de maladie neurodégénérative 1,2,3 permettra des investigations spécifiques au sous-type de neurone et/ou à la cargaison. De plus, les lignées Cre66 récemment développées permettraient également la visualisation de protéines rapporteures fluorescentes dans des populations d’axones sensoriels distinctes. Par exemple, les souris Rosa26.tdTomato peuvent être croisées avec un neuropeptide Y exprimant le récepteur 2 (Npy2r). Cre souris pour activer la fluorescence tdTomato dans les nocicepteurs de fibres A myélinisés67. En outre, le contrôle temporel peut également être obtenu en utilisant des systèmes Cre inductibles (par exemple, le tamoxifène)68. Une autre application potentielle repose sur la disponibilité de souris transgéniques exprimant des protéines rapporteures fluorescentes dans les cellules de Schwann. En effet, les souris S100-GFP69 et PLP-GFP70 permettent l’imagerie in vivo et/ou in situ des cellules de Schwann et ont été à la pointe de la recherche impliquée dans la migration des cellules de Schwann lors de la régénération nerveuse périphérique.
En plus de ces applications et en complément de la souris Mito.CFP est la disponibilité de plusieurs lignées de souris transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes dans des organites distincts, tels que les mitochondries et les autophagosomes. Par exemple, l’étude du transport mitochondrial in vivo pourrait être possible avec la souris mito::mKate271 ou la souris mitoDendra photoconvertible57. De plus, le transport in vivo des mitophagosomes peut être possible en utilisant la souris mito-Keima72 sensible au pH et la souris mito-QC73 pour les analyses de mitophagie. En outre, les difficultés de marquage lysosomal que nous avons rencontrées peuvent être surmontées en utilisant des souris exprimant LAMP1-GFP, avec la mise en garde que LAMP1 est également présent dans les organites endocytaires distincts des lysosomes74.
En résumé, nous avons fourni de nouvelles façons d’évaluer le transport axonal in vivo de plusieurs organites dans des axones nerveux périphériques spécifiques provenant de diverses souris transgéniques. L’imagerie simultanée de différents organites sera particulièrement importante, compte tenu des découvertes récentes d’interactions axonales et de co-trafic d’organites tels que les mitochondries et les endosomes75,76. Nous pensons que les méthodes présentées seront utiles pour améliorer la compréhension de la physiologie basale des axones in vivo et démêler d’importants mécanismes pathologiques conduisant à la neurodégénérescence des nerfs périphériques.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) pour avoir partagé les souris ChAT-eGFP, ChAT.Cre et Rosa26.tdTomato, et Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) pour avoir partagé le HB9. Souris GFP. Nous tenons à remercier Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers et Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) pour leur lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse non clinique junior de la Motor Neuron Disease Association (Royaume-Uni) (Tosolini / Oct20 /973-799) (APT), les Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z et 223022 / Z / 21 / Z) (GS), une bourse de la Fondation du Uk Dementia Research Institute (GS); et une bourse de développement de carrière du Conseil de recherches médicales (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |