Ved bruk av transgene fluorescerende mus beskrives detaljerte protokoller for å vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier i motoriske og sensoriske aksoner av den intakte isjiasnerven hos levende dyr.
Aksonal transport opprettholder nevronal homeostase ved å muliggjøre toveis handel med forskjellige organeller og laster. Forstyrrelser i aksonal transport har ødeleggende konsekvenser for individuelle nevroner og deres nettverk, og bidrar til en mengde nevrologiske lidelser. Siden mange av disse forholdene involverer både celleautonome og ikke-autonome mekanismer, og ofte viser et spekter av patologi på tvers av nevronale subtyper, er metoder for nøyaktig å identifisere og analysere nevronale delmengder avgjørende.
Dette papiret beskriver protokoller for å vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier i isjiasnerver hos bedøvede mus. Trinnvise instruksjoner er gitt for å 1) skille motoriske fra sensoriske nevroner in vivo, in situ og ex vivo ved å bruke mus som selektivt uttrykker fluorescerende proteiner i kolinerge motorneuroner; og 2) separat eller samtidig vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier. Disse komplementære intravitale tilnærmingene letter samtidig avbildning av forskjellige laster i forskjellige perifere nerveaksoner for kvantitativt å overvåke aksonal transport i helse og sykdom.
Det perifere nervesystemet (PNS) kobler sentralnervesystemet (CNS) til dets distale mål, slik at reléet av efferente signaler kan utøve motorisk kontroll og avferente signaler for å gi sensorisk tilbakemelding. Ved hjelp av de mange fremskrittene innen musegenetikk har forskere utviklet forskjellige musemodeller for å undersøke mange sykdommer / syndromer som rammer PNS 1,2,3. Siden de fleste nevrodegenerative patologier er multifaktorielle med celleautonome og ikke-autonome bidrag 4,5, kan untangling av celle- / nevronspesifikke patologier gi avgjørende, ny innsikt i sykdomsmekanismer.
For dette formål har utviklingen av bakterielle kunstige kromosom (BAC) -transgene mus6 muliggjort selektivt endogent uttrykk av fluorescerende proteiner i målrettede delmengder av nevroner. For eksempel er BAC-transgene mus tilgjengelige, som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i kolinerg7 eller glycinergiske nevroner8, eller en variant rødt fluorescerende protein (tdTomato) i parvalbumin-positive nevroner9. Alternativt kan selektivt nevronuttrykk av fluorescerende proteiner oppnås via Cre-loxP-teknologi 10. For eksempel kan musestammer som uttrykker Cre-recombinase i undergrupper av nevroner (f.eks. Kolin acetyltransferase (ChAT) -Cre) avles med mus som uttrykker et fluorescerende protein (f.eks. TdTomato eller GFP) fra et konstitutivt lokus (f.eks. Gt (ROSA) 26Sor) under kontroll av en transkripsjonell repressor flankert av loxP-steder11 (f.eks. genererer mus som uttrykker tdTomato bare i kolinerge nevroner). Faktisk, ved bruk av Cre-loxP-rekombinasjon, har transgene mus blitt generert som uttrykker gult fluorescerende protein i aksoner i den synkende kortikospinale kanalen12.
I tillegg muliggjør nylige fremskritt innen CRISPR / Cas9-genredigering, som ORANGE, fluorescerende merking av flere endogene nevronproteiner, med uttrykk som kan oppnås ved nanoskalaoppløsning13. Videre, i kombinasjon med Cre-uttrykkende musestammer, kan ORANGE-CAKE brukes til å merke flere endogene proteiner i individuelle nevroner13. Alternativt tillater viralmediert nevronsporing også merking av nevronale undergrupper og kan oppnås med målrettede kombinasjoner av virale serotyper og / eller cellespesifikke promotorer 14,15,16,17.
I tillegg til de nevrale merkingsmetodene har muselinjer også blitt konstruert for å uttrykke reporterproteiner rettet mot spesifikke organeller, for eksempel mitokondrier som uttrykker cyan fluorescerende protein (Mito.CFP)18 eller autofagosomer som uttrykker GFP (LC3.GFP)19. Videre har muselinjer blitt konstruert for å vurdere kalsiumdynamikk spesifikt i nevroner (f.eks. Thy1.GCaMP)20,21. Til sammen, med utviklingen av slike modeller, gjør nye eksperimentelle applikasjoner forskere i stand til å stille mer presise biologiske og patologiske spørsmål om CNS og PNS.
Hovedrollen til perifere motoriske nerver er å overføre elektriske signaler til skjelettmuskulatur for å fremkalle bevegelse. I tillegg, og forekommer over lengre tidsskalaer, krysser nevrokjemiske og fysiologiske meldinger i form av forskjellige organeller (f.eks. Mitokondrier, endolysosomer, signalende endosomer) cytoskeletalnettverket på en uni- eller toveis måte for å opprettholde nevronal homeostase 22,23,24. Svekkelser i aksonal transport har katastrofale konsekvenser for nevronhelsen og er knyttet til mange nevrodevelopmentale og neurodegenerative sykdommer25. På molekylært nivå kan svekkelser i aksonal transport forstyrre fysiologiske hendelser som regulerer synaptisk signalering og plastisitet, gentranskripsjon og lokal oversettelse gjennom hele aksonet26,27. Mens det er en rekke verktøy for å studere disse hendelsene i dyrkede celler / nevroner28,29, er det nødvendig å vurdere aksonal transportdynamikk og aksonale koblede biologiske hendelser in vivo for å bekrefte nøkkelinnsikt i fysiologiske og patologiske prosesser30.
Gjennom årene har Schiavo-laboratoriet optimalisert protokoller for å stille forskjellige spørsmål om aksonal transport 31,32,33,34,35,36. Disse forsøkene har utvidet seg fra oppdagelsen av at et fluorescerende merket atoksisk fragment av tetanusneurotoksin (HCT) internaliseres til aksonterminaler i skjelettmuskulatur gjennom interaksjoner med nidogener og polysialogangliosider37. Når internalisert, blir HCT retrograd transportert i Rab7-positive, nevrotrofinholdige signalende endosomer som er bestemt for cellelegemene til motoriske og sensoriske nevroner 38,39,40,41. Parallelt har fremskritt innen bildebehandlingsteknologi muliggjort sanntidsanalyse av perifere nervebunter og individuelle aksoner i levende, bedøvede mus30. Det første forsøket på å vurdere in vivo aksonal transportdynamikk i patologi avslørte presymptomatiske svekkelser i transporten av signalende endosomer og mitokondrier i SOD1G93A-musemodellen for amyotrofisk lateral sklerose (ALS)35. Det er viktig at disse feilene ikke bare representerer sekundære konsekvenser av nevrodegenerasjon, gitt funnet at motorneurontap kan oppstå i fravær av aksonale transportforstyrrelser i en musemodell av Kennedys sykdom42 og en heterozygot mutant FUS-modell av ALS43. Slike aksonale transportunderskudd kan avhjelpes hos ALS-mus ved bruk av hemmere av spesifikke kinaser33 eller vekstfaktorreseptorer34. Videre endrer behandling av nevroner med en spesifikk histon deacetylaseblokker mitokondriell transport in vivo36. Senest rapporterer vi at den BDNF-avhengige moduleringen av aksonal transport er dysregulert i forskjellige motornevronundertyper i ALS-mus44.
Ved å bruke et stadig voksende verktøysett for å vurdere aksonal transportdynamikk28,29, skisserer denne videoprotokollen flere applikasjoner som vil gi ytterligere innsikt i forskjellige biologiske og patologiske scenarier. For det første brukes transgene mus som selektivt uttrykker fluorescerende proteiner i kolinerge nevroner (dvs. motorneuroner) til å diskriminere mellom motoriske og sensoriske aksoner både in vivo og ex vivo. Fluorescerende merket HCT lastes deretter inn i signalende endosomer i tre transgene linjer for å differensiere aksonal transportdynamikk i forskjellige perifere nevroner. Den neste eksperimentelle protokollen beskriver en multipleks fluorescensmetode for å vurdere mitokondriell transport spesielt i motorneuroner ved å avle ChAT.tdTomato-mus med Mito-CFP-mus. Til slutt blir det gitt instruksjoner om hvordan man samtidig kan avbilde mitokondrier og signalisere endosomer innenfor samme akson in vivo.
Denne protokollen beskriver trinn for å vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier i intakte aksoner av musens isjiasnerve. Faktisk er det gitt et eksperimentelt oppsett som gjør det mulig for brukere å 1) skille motoriske fra sensoriske nevroner in vivo, in situ og ex vivo ved å bruke mus som uttrykker fluorescerende reporterproteiner selektivt uttrykt i motorneuroner; 2) vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer spesielt i motornevronaksoner ved bruk av tre forskjellige transgene mus; 3) undersøke in vivo aksonal transport av mitokondrier spesielt i motor neuron axoner; og 4) samtidig vurdere in vivo transportdynamikk av signalende endosomer og mitokondrier innenfor samme akson. Denne tilnærmingen har stort potensial for å undersøke aksonal transport under basale forhold og kan brukes til å vurdere patologiske forstyrrelser i forskjellige sykdommer som påvirker perifere motoriske og sensoriske nerver.
Ved å bruke tidligere eksperimentelle paradigmer som grunnlag31,32, har vi her detaljerte nye, robuste måter å skille aksonal transport som forekommer i motoriske versus sensoriske nevroner ved hjelp av transgene reportermus. Ved hjelp av Mito.CFP-musen har denne tilnærmingen blitt videreutviklet for å vurdere mitokondriell transport in vivo ved å unngå intrasciatiske nerveinjeksjoner av TMRE36. Dette omgår mulige nevrale skader og forstyrrelser i aksonal transport forårsaket av den intranerve injeksjonen av sonden. Videre tillater denne protokollen visualisering av aksonal transport av flere organeller i motoraksoner som innerverer muskler med distinkte fysiologiske egenskaper (f.eks. hurtigtrekkende utmattende muskler vs. sakte rykninger tretthetsresistente muskler). Som sådan kan signalende endosom og / eller mitokondriell aksonal transportdynamikk vurderes i forskjellige undergrupper av α-motorneuroner44. Videre kan den aksonale transporten av disse organellene i patologiske omgivelser også vurderes gjennom kryssavl med musemodeller av forskjellige nevrodegenerative sykdommer 1,2,3.
Det aksonale transportverktøyet utvides kontinuerlig28,29, og ex vivo-protokoller er utviklet for å vurdere transportdynamikk ved hjelp av dyrkede museventrale horn explants49 eller skåret ut mus nervemuskelpreparater50. Videre har utviklingen av protokoller for å vurdere aksonal transport i indusert human pluripotent stamcelle (hiPSC)-avledet kortikal51 nevroner eller hiPSC-avledede spinalmotorneuroner52 muliggjort undersøkelse av humane nevroner med sykdomsfremkallende mutasjoner. Slike banebrytende protokoller i musevev og humane celler kan gi kritisk innsikt i nevronfunksjonen, legge til rette for ny pathomechanistisk oppdagelse i nevrodegenerative sykdomsmodeller, og brukes til å teste terapeutiske molekyler og strategier.
Flere kritiske trinn må følges for en vellykket implementering av disse teknikkene, og noen viktige notater er gitt i protokolldelen. De viktigste kravene til intravital avbildning er det inverterte konfokale mikroskopet med tilpasset sceneinnsats og utstyret for å opprettholde anestesi og optimal temperatur. Faktisk er det nødvendig med et spesialisert mobilbedøvelsessystem for 1) induksjon av anestesi, 2) disseksjon / vevsbehandling (dvs. eksponering av isjiasnerven) og 3) opprettholdelse av anestesi under intravital avbildning (som tidligere beskrevet i 31,32). Spesielt når du bruker høyere forstørrelsesmål (f.eks. 40x eller 63x), kan anestesidybden påvirke bildekvaliteten, da dypere anestesi induserer store “gaspy” pust som resulterer i hyppige skift i fokus. Slike store bevegelser vil utvilsomt påvirke transportanalyser etter bildebehandling (f.eks. sporing av laster ved hjelp av Fiji-pluginene TrackMate53 eller KymoAnalyzer54) ettersom pustebevegelsene produserer artefakter i time-lapse-videoer som kan gjøre dem uegnet for automatisert sporing eller kreve mer tidkrevende vurdering. Videre har vi også observert bildeartefakter forårsaket av pulserende arterier i isjiasnerven, som bare kan løses ved å velge et annet bildebehandlingsområde. Mikroskopet må være utstyrt med et miljøkammer som er i stand til å opprettholde konstant kroppstemperatur, da temperatur og pH påvirker aksonal transport55. Videre bør bruk av analgetika etter kirurgi unngås, da de kan endre transportdynamikk56. Hvis det eksperimentelle designet er langsgående og krever gjentatt avbildning (f.eks. 57), må disseksjonsprotokollene justeres hensiktsmessig for å være minimalt invasive og kan kreve ytterligere etisk / lisensgodkjenning.
Visse eksperimentelle hensyn må tas i betraktning. For det første involverer de fleste protokollene som er beskrevet her, bruk av transgene mus som har fluorescerende reporterproteiner i mitokondrier eller motorneuronaksoner. Hver av disse muselinjene skal avles og avbildes som hemi-/heterozygote. Unntakene er imidlertid ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato muselinjer som kan opprettholdes separat som homozygoter, med de resulterende hemizygote avkomene som muliggjør tdTomato-uttrykk i kolinerge nevroner etter Cre-loxP-rekombinasjon . Ved kryssavl av transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. Mito.CFP) med andre transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. ChAT.eGFP), må man nøye vurdere avlsstrategien, da det kan være tidkrevende å oppnå ønsket antall dobbeltmutantavkom. Videre, når man avler F1-generasjonen av ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato mus (dvs. ChAT.tdTomato) med ekstra transgene stammer (f.eks. Mito.CFP), bør man forvente enda færre mus som bærer de ønskede trippeltransgene. I tillegg må man også vurdere den potensielle fluoroforoverlappingen når man avler to-reportermus med nærliggende bølgelengdeegenskaper (f.eks. Mito-CFP-eksitasjon: 435 nm, utslipp: 485 nm, avlet med ChAT.eGFP-eksitasjon: 488 nm, utslipp: 510 nm), selv om det kan være mulig å overvinne dette problemet med spektral blanding58.
Denne teknikken har noen begrensninger som skal vurderes. I dette arbeidet og våre tidligere protokoller31,32 har vi vist hvordan flere genetisk kodede markører og forskjellige fargemetoder kan brukes til å merke og spore forskjellige organeller in vivo. Imidlertid er ikke alle prober egnet for denne eksperimentelle tilnærmingen. Vi vurderte injeksjoner i enten TA- eller soleusmuskel av koleratoksin beta-subenhet (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μL ~4 timer før avbildning), en sonde som rutinemessig brukes til å merke motornevroncellelegemer i in vivo retrograde tracereksperimenter59,60. Imidlertid, når den ble injisert alene eller co-injisert med HCT-555, var CTB-488-merkingen dårlig til tross for bruk av konsentrasjoner som ligner de som brukes til vellykket retrograd motorneuronsporing. Dermed konkluderer vi med at til tross for at CTB er en utmerket in vitro-markør for signaliserende endosomer i nevronkulturer61, forblir HCT gullstandardsonden for å identifisere signalende endosomer in vivo i isjiasnerveaksoner.
Ved hjelp av forskjellige ruter testet vi også prober som rutinemessig brukes til merking av lysosomer, for eksempel LysoTracker grønn DND-26, og markører for aktive lysosomale hydrolaser, som BODIPY-FL-pepstatin A for Cathepsin D62 og Magic Red for Cathepsin B, men uten suksess. Vi prøvde intramuskulær tilførsel av BODIPY-FL-pepstatin A (2,5 μg i TA ~4 timer før bildediagnostikk), samt intrasciatic nerveinjeksjon av 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) eller Magic Red (1/10) 30-60 min før bildediagnostikk. Til tross for at disse sondene fremhevet nerven, klarte vi ikke å finne tydelig merkede organeller. Sondene samlet seg rundt aksoner, sannsynligvis beholdt av Schwann-celler. Derfor kan den mislykkede merkingen av lysosomer skyldes mangelfull sondelevering i nevroner, selv om eksistensen av mer egnede konsentrasjoner ikke kan utelukkes. Gitt at TMRE-merking fungerer under lignende forhold (dvs. intrasciatic nerveinjeksjoner), kan merkingsintensiteten være fargeavhengig og må testes for hver markør uavhengig. Vi konkluderer imidlertid med at målretting av lysosomer in vivo med disse probene ikke er mulig ved konsentrasjonene angitt ovenfor.
Anestesimetoder kan endre distinkte fysiologiske avlesninger (f.eks. cochleafunksjon63 og kortikal elektrofysiologi64); Hvorvidt anestesi påvirker in vivo aksonal transport i isjiasnerven er imidlertid foreløpig ukjent. Gitt den reduserte nevromuskulære aktiviteten under isofluranindusert anestesi, er det mulig at transportkinetikken varierer sammenlignet med våken tilstand. Den eneste in vivo-studien som direkte har undersøkt dette, viste imidlertid at transport av tette kjernevesikler i thalamokortiske fremspring ikke skiller seg mellom bedøvede og våkne mus65. Videre, fordi forskjeller i transport mellom villtype og sykdomsmodellmus kan påvises under anestesi35,43, er det klart at isofluraneksponering ikke forhindrer identifisering av forstyrrelser i signalisering av endosom eller mitokondriell handel.
Denne protokollen har andre potensielle applikasjoner, som er beskrevet nedenfor. Oppdrett av de transgene musene som er skissert i denne protokollen (f.eks. Mito.CFP, ChAT.eGFP) med nevrodegenerative sykdomsmusmodeller 1,2,3 vil muliggjøre nevronundertype- og / eller lastspesifikke undersøkelser. Videre vil nylig utviklede mus Cre linjer66 også tillate visualisering av fluorescerende reporterproteiner i forskjellige sensoriske aksonpopulasjoner. For eksempel kan Rosa26.tdTomato mus krysses med et neuropeptid og reseptor-2-ekspresserende (Npy2r). Cre mus for å aktivere tdTomato fluorescens i myeliniserte A-fiber nociceptorer67. Videre kan temporal kontroll også oppnås ved å bruke induserbare Cre-systemer (f.eks. Tamoxifen)68. En annen potensiell applikasjon er avhengig av tilgjengeligheten av transgene mus som uttrykker fluorescerende reporterproteiner i Schwann-celler. Faktisk muliggjør S100-GFP69 og PLP-GFP70 mus in vivo og / eller in situ avbildning av Schwann-celler og har vært i forkant av forskningen involvert i Schwann-cellemigrasjon under periferneregenerering.
I tillegg til disse applikasjonene og komplementere Mito.CFP-musen er tilgjengeligheten av flere transgene muselinjer som uttrykker fluorescerende proteiner i forskjellige organeller, som mitokondrier og autofagosomer. For eksempel kan det være mulig å undersøke in vivo mitokondriell transport med mito::mKate2 mus71 eller fotokonverterbar mitoDendra mus57. Videre kan in vivo mitophagosomtransport være mulig ved bruk av den pH-sensitive mito-Keima-musen72 og mito-QC-musen73 for mitofagianalyser. Videre kan de lysosomale merkingsvanskene vi opplevde overvinnes ved å bruke mus som uttrykker LAMP1-GFP, med forbehold om at LAMP1 også er tilstede i endocytiske organeller som er forskjellige fra lysosomer74.
Oppsummert har vi gitt nye måter å vurdere in vivo aksonal transport av flere organeller i spesifikke perifere nerveaksoner fra forskjellige transgene mus. Samtidig avbildning av ulike organeller vil være spesielt viktig, gitt nyere funn av aksonale interaksjoner og samhandel med organeller som mitokondrier og endosomer75,76. Vi tror at de presenterte metodene vil være nyttige for å forbedre forståelsen av den basale fysiologien til aksoner in vivo og løsne viktige pathomechanisms som driver nevrodegenerasjon av perifere nerver.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for å dele ChAT-eGFP, ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato mus, og Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for å dele HB9. GFP mus. Vi takker Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers og Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et Junior Non-Clinical Fellowship fra Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini / Oct20 / 973-799) (APT), Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z og 223022 / Z / 21 / Z) (GS), en UK Dementia Research Institute Foundation Award (GS); og Medical Research Council Career Development Award (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |