Summary
Her presenterer vi en protokoll for å skaffe ikke-koronale auditive hjernestammeskiver av kyllingembryoet for undersøkelse av tonotopiske egenskaper og utviklingsbaner innenfor en hjernestammeskive. Disse skivene inkluderer sagittale, horisontale og horisontale / tverrgående seksjoner som omfatter større tonotopiske regioner innenfor et individuelt skiveplan som de tradisjonelle koronale seksjonene.
Abstract
Kyllingembryoet er en allment akseptert dyremodell for å studere den auditive hjernestammen, sammensatt av høyt spesialisert mikrokrets og nevrontopologi differensielt orientert langs en tonotopisk (dvs. frekvens) akse. Den tonotopiske aksen tillater segregert koding av høyfrekvente lyder i rostral-medialplanet og lavfrekvent koding i caudo-laterale regioner. Tradisjonelt tillater koronale hjernestammeskiver av embryonalt vev studiet av relativ individuell iso-frekvens lamina. Selv om det er tilstrekkelig til å undersøke anatomiske og fysiologiske spørsmål knyttet til individuelle isofrekvensregioner, er studiet av tonotopisk variasjon og dens utvikling over større auditive hjernestammeområder noe begrenset. Denne protokollen rapporterer hjernestammeskjæringsteknikker fra kyllingembryoer som omfatter større gradienter av frekvensregioner i den nedre auditive hjernestammen. Bruken av ulike skivemetoder for kylling auditivt hjernestammevev tillater elektrofysiologiske og anatomiske eksperimenter innenfor en hjernestammeskive, hvor større gradienter av tonotopiske egenskaper og utviklingsbaner er bedre bevart enn koronale seksjoner. Flere skiveteknikker muliggjør forbedret undersøkelse av de ulike anatomiske, biofysiske og tonotiske egenskapene til auditive hjernestammemikrokretser.
Introduction
Kyllingembryoet er en verdifull forskningsmodell for å studere grunnleggende biologiske spørsmål på mange og forskjellige vitenskapelige områder, inkludert cellebiologi, immunologi, patologi og utviklingsnevrobiologi. Mikrokretsen til kyllingens auditive hjernestamme er et utmerket eksempel på en høyt spesialisert krets som kan forstås når det gjelder auditiv morfologi og fysiologi. For eksempel beskrev Rubel and Parks (1975) først den tonotopiske orienteringen (dvs. frekvensgradienten) av kyllingkjernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL) som en lineær funksjon over kjernens akse, orientert ~ 30 ° i forhold til sagittalplanet. Individuelle nevroner i NM og NL koder for sin beste lydfrekvens - kjent som deres karakteristiske frekvens (CF) - langs rostral-medialplanet til caudo-lateralområdet. Høyfrekvente følsomme nevroner er i rostral-mediale regionen og lavfrekvente følsomme nevroner ligger caudo-lateralt. Som sådan har tradisjonelle disseksjonsmetoder for auditivt hjernestammevev for å studere tonotiske egenskaper benyttet suksessive koronale skiver. Faktisk har auditive mikrokretser for å utvikle kyllingembryoer blitt etablert som et modellsystem for å studere signalbehandling av tonotopiske auditive funksjoner gjennom suksessive kaudal-til-rostral koronale plan hjernestammeskiver i flere tiår 1,2,3,4,5,6.
Den tonotopiske organiseringen av NM og NL er imidlertid topologisk og morfologisk innviklet. Hørselsnerveinnganger fordeles slik at høye CF-innganger avsluttes i endbulb-lignende strukturer som dekker minst en fjerdedel av en adendritisk NM-celles somatiske omkrets. Omvendt er lave CF-innganger ikke organisert med endepærelignende terminaler, men med flere boutonsynapser på dendritter av NM-nevroner. Midtre CF-innganger avsluttes som både endepære og boutonlignende synapser 4,7,8,9,10,11,12. I NL er den svært stereotype dendritiske gradienten tydelig ikke bare i dendritisk lengde, men også i dendritisk bredde. Denne unike dendritiske gradienten samsvarer tett med den tonotopiske aksen. Dendrittene gjennomgår en 11 ganger økning i lengde og fem ganger økning i bredde fra henholdsvis høy- til lav-CF-nevroner6. For å overvinne slike innviklede fordelinger av disse kjernene i koronale skiver, beskriver denne protokollen disseksjonstilnærminger i sagittale, horisontale og horisontale / tverrgående plan. Disse skiveteknikkene gir eksempler på auditivt hjernestammevev som viser maksimale tonotiske egenskaper i et individuelt skiveplan.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) og ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guidelines for omsorg og bruk av forsøksdyr. Protokollene for disseksjon og klargjøring av hjernestammevev er i samsvar med tidligere protokoller 5,13.
1. Håndtering av egg
- Kjøp befruktede egg (Gallus gallus domesticus) fra en IACUC-godkjent lokal dyreleverandør.
- Oppbevar eggene umiddelbart ved ankomst i kjøleskap ved 14 °C og rug innen 5 dager.
MERK: Embryoets levedyktighet reduseres betydelig etter 1 uke. - Steriliser eggene med 70% etanol før inkubering ved 38 ± 1 ° C og ~ 50% fuktighet.
2. Kunstig cerebral-spinalvæske (ACSF) sammensetning og forberedelse
- Bland følgende kjemikalier i 1 L på 18,2 MΩcm dH 2 O for å lage en 10x ACSF lagerløsning: NaCl (natriumklorid) 130 mM, NaHCO3 (natriumbikarbonat) 26 mM, KCl (kaliumklorid) 2,5 mM, NaH2PO4 (natriumdihydrogenfosfat) 1,25 mM, dekstrose (D-(+)-glukose) 10 mM. Oppbevar lageroppløsningen i kjøleskapet.
- Klargjør MgCl 2 (magnesiumklorid) 1 M og CaCl 2 (kalsiumklorid) 1 M oppløsninger separat i 18,2 MΩcm dH2 O og oppbevares i kjøleskap.
- Umiddelbart før bruk, fortynn 10x ACSF til 1x og boble kontinuerlig med 95% O 2/5% CO 2 i 15-20 min og tilsett MgCl 2 og CaCl 2. For å forberede ACSF og dACSF (dissekere ACSF), juster til en endelig konsentrasjon på henholdsvis Mg 2+ 1 mM, Ca 2+ 3 mM og Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM.
- Still inn boblehastigheten for ACSF slik at pH er 7,2-7,4 med en osmolalitet mellom 300 og 310 mOsm / L.
MERK: Å ha ACSF plassert i et isbad mens du bobler, er gunstig for å opprettholde en lav løsningstemperatur, noe som vil støtte vevets strukturelle integritet mens du dissekerer.
3. Agarose (5%) blokk forberedelse
- Bland 5 g agarose i 100 ml dACSF. Bruk et 100 ° C vannbad eller mikrobølgeovn i 2-3 minutter, rør hver 30. s for å forhindre klumper til agarose oppløses helt og begynner å boble.
- Hell den smeltede agarosen i en tom petriskål opp til 5 mm tykkelse og hold deg i romtemperatur for å sette. Etter innstilling forsegler du petriskålen med parafilm og oppbevares ved 4 °C.
- Klipp agarose i kubiske blokker med et skarpt blad og bruk dem på tidspunktet for disseksjon.
4. Disseksjonsprotokoll og isolering av auditiv hjernestamme
- Rengjør disseksjonsområdet med 70% etylalkoholoppløsningsspray.
- Lim den støttende eller vinklede agaroseblokken på vibratombrettet.
- Velg egg av ønsket alder (E20 og E21 i denne protokollen). Håndter og inkuber eggene etter protokollene nevnt ovenfor som i trinn 1.
- Finn det luftfylte rommet ved å plassere egget under et sterkt lys (candling) og se etter dette rommet på den større eller rundere siden av egget.
- Akklimatiser eggene til romtemperatur, knekk skallet over det luftfylte rommet og utsett membransekken.
- Gjør et forsiktig snitt i sekken for å eksponere nebbet.
- Med en skalpell, trekk forsiktig nakken og hodet ut av egget.
- Quicky halshugge hodet med skarp saks.
- Etter halshugging, rengjør hodet med iskjølt dACSF for å fjerne overflødig blod fra disseksjonsputen.
- Hold hodet stødig i iskald dACSF og gjør et rostro-kaudalsnitt. Start snittet bak og mellom øynene og følg lengden på den høstede nakken.
MERK: Yngre embryoer kan kreve mindre press mens du gjør snittet. - Skill huden for å eksponere skallen.
- Klipp skallen bak øyet i midtlinjen til lateral retning. Gjør dette for begge halvkuler.
MERK: Dette trinnet bidrar til å skille rostraldelen av skallen fra den vedlagte hjernen mens du holder hjernevævet intakt5. - Skjær rostraldelen av skallen. Plasser bladet bak øynene og gjør et raskt kutt.
MERK: Det kan være nødvendig med innsats for å kutte den vedlagte skallen rent. - Senk hodet i en tallerken med kald dACSF.
- Bruk en liten saks, gjør midtlinjen til laterale snitt i den kaudale regionen av skallen for å prøve å skille hjernen fra skallen uten å forårsake vevskader.
- Utsett forsiktig hjernestammen og lillehjernen. Trekk tilbake dorsalområdet på hele skallen, fjern hjernestammen forsiktig og utsett den ved hjelp av en fin pensel med mild aking. Bruk buede tang for å rense hjernestammen fra å koble vev og blodårer. Vær ekstra oppmerksom på det 8. kraniale nerveområdet og sørg for å legge igjen en kort lengde av intakte nervefibre på begge sider.
- Skill hjernestammen fra lillehjernen ved å kutte peduncles og fjerne blodårene forsiktig. Trim hjernestammen til flere blodkar.
MERK: Sørg for at hele prosedyren utføres i iskjølt dACSF kontinuerlig boblet med karbooksygen (95% O 2/5% CO2).
5. Vibratome skiver
MERK: I de følgende trinnene må baksiden av vevet støttes med et kubisk stykke agarose.
- Plasser vibratomebladet langs den horisontale aksen og lim hjernestammen på et skivebrett. Lim rostralsiden, og hold rostral-kaudalaksen vertikal for koronale skiver.
- Hold lateral-medialaksen vertikal for sagittale skiver.
- Lim den ventrale siden, hold dorsal-ventralaksen vertikal for horisontale skiver.
- For å oppnå det akutte vinkelformede sagittal-horisontale planet, lim hjernestammens ventrale side, og hold den ventrale dorsale aksen vertikal på agaroseblokkens hypotenusoverflate, som er kuttet i en 45 ° vinkel. Lim den motsatte overflaten av agaroseblokken mot skivebrettet og hold rostral-kaudalaksen parallelt med bladkanten.
6. Håndtering av skjøre eller store biter av hjernestammevev
- I en alternativ tilnærming til trinn 5, senk den isolerte hjernestammen i 4% lavt smeltepunkt (LMP) agarose ved ~ 40 ° C i en 35 mm x 10 mm petriskål.
- Etter å ha hellet agarose på den nedsenkede hjernestammen, legg petriskålen på is for å stivne. Klipp den kubiske agaroseblokken med innebygd hjernestamme ved hjelp av et skarpt barberblad.
- Lim LMP agaroseblokken på rostralsiden, og hold hjernestammens rostral-kaudale akse vertikal.
- Ta koronale skiver til NM-regionen kan visualiseres.
- Fjern agaroseblokken fra limet med et skarpt blad. For å oppdage kjernene, plasser forsiktig 0,5 μL fargestoff (toluidinblått eller oransje G) på NM med en fin nål.
- Monter denne blokken på skivebrettet for sagittale eller horisontale skiver og identifiser kjernene i forhold til det flekkete området.
- For best ytelse, sett vibratome-skivehastigheten til 4 - 5 (~ 30 ± 4 mm / min), vibrerende frekvens på 85-87 Hz og skiveamplitude ved 4-6 (~ 1 ± 0,2 mm).
- Etter hjernestammeseksjonering, plasser 200-300 μm sekvensielt oppsamlede skiver i et kommersielt tilgjengelig skivekammer for å balansere i 1 time ved romtemperatur i ACSF, kontinuerlig boblet med en blanding av 95% O 2/5% CO 2 (pH 7,2-7,4, osmolaritet 300-310 mOsm / L). Under disse forholdene forblir skiver levedyktige opptil 5-6 timer.
7. Elektrofysiologi: patch klemme prosedyre
- Overfør en hjernestammeskive til opptakskammeret med kontinuerlig perfusjon av karbokmatet ACSF ~ 1,5 ± 0,5 ml / min.
- Trekk plasterpipetter med en mikropipettetrekker med spissdiameter 1-2 μm og motstand i området 3-6 MΩ.
- Fyll pipetter med en K-glukonatbasert intern løsning (for strømklemmeopptak).
- For å teste nevronegenskapene på tvers av de forskjellige tonotopiske regionene i et stykke, finn nevroner i hver ende av skiveplanet og tilnærming med opptakselektroden.
- Oppretthold positivt lufttrykk ved pipettespissen mens du nærmer deg et nevron.
- Flytt mot soma til en innrykk visualiseres på nevronet. Utfør de neste to trinnene raskt.
- Lag en gigaohm (1 GΩ) forsegling ved å slippe ut positivt lufttrykk.
- Hold forsterkerinnstillingen i spenningsklemmemodus og korriger pipetteforskyvningen som null pA. Kjør en tetningstest (10 mV testpuls ved 100 Hz). Påfør negativt lufttrykk for å briste en liten flekk av nevronmembranen.
- For å teste de aktive inneboende egenskapene til auditive nevroner, bruk hyperpolariserende og depolariserende somatiske strøminjeksjoner.
MERK: Eksempler på denne prosedyren kan visualiseres i Supplementary Video S1, S2. Detaljer om denne prosedyren er gitt i videolegendene.
Representative Results
Alle hjernestammeskiver vist her ble hentet fra hjernestammevev (~ 200-300 μm) og avbildet ved hjelp av en 5x objektiv og differensial interferenskontrast (DIC) optikk. Kameraet ble montert på dissekeringsmikroskopet og koblet til en datamaskin med bildeinnsamlingsprogramvare (se Materialfortegnelse). Satellittinnfelt for disse figurene (høyre paneler) ble avbildet ved hjelp av et 60x forstørrelse vann nedsenkningsmål. Det ble tatt hensyn til at alle områder av hjernestammeskiven ble like forstørret mens du fikk digitale bilder. Fotografier ble tatt med optimal lysstyrke og fokus. De digitale bildene av hjernestammeskiver ble sydd på en plan måte basert på overlappende område og importert til en stasjonær datamaskin for ytterligere justeringer av lysstyrke, kontrast og gråtoner. De grunnleggende mikrokretsene til kyllingens auditive hjernestamme ble identifisert i henhold til tidligere arbeid 1,2,5,13. Under mikroskopet (5x objektiv) ble auditive kjerner identifisert som området ved siden av de tungt myeliniserte nervefibrene som går rundt hver kjerne både ipsilateralt og kontralateralt langs skivens dorsale områder.
Figur 1 viser de tradisjonelle koronale delene av hjernestammevev (200-300 μm) fra et E21 kyllingembryo. De fire koronale skivene vist her representerer de relative isofrekvensområdene i de auditive hjernestammekjernene, fra den laveste CF-auditive regionen (figur 1A, caudo-lateral) som utvikler seg til den høyeste CF-auditive regionen (figur 1D, rostral-medial). For alle fire koronale skiver i figur 1A-D vises forstørrede områder av merket NM og NL i den midterste kolonnen og forstørres (60x mål) ved høyre syn på figurpanelet (henholdsvis a og b i satellittinnlegg). Pilen i figur 1A,B viser inngangen til hørselsnervefibre, og pilspissen viser bifurkasjon av NM-aksoner til venstre for skiven. Figur 1C viser en annen aviær cochlear kjernestruktur kjent som nucleus angularis (NA, pil til venstre og pilspiss til høyre). De to mest rostrale koronale skivene viser den overlegne olivarykjernen (SON) som ligger langs den ventrale-laterale regionen av koronalskiven (figur 1C, D, hvite stiplede sirkler).
Figur 2 viser sagittale snitt av hjernestammevev (200-300 μm) fra et E21 kyllingembryo. For alle tre sagittalskivene (figur 2A-C) vises forstørrede områder av merket NM og NL i den midterste kolonnen og forstørres (60x mål) ved høyre syn på figurpanelet (henholdsvis a og b på satellittbilder). NM og NL ble identifisert der de auditive nervefibrene (figur 2A, midtpil) kom inn i klyngen av nevroner observert ved høyere forstørrelse (figur 2A, midtre, små, hvite stiplede sirkler og pilspisser) og fremhever utgangspunktet for den auditive regionen (figur 2A, venstre, stor, hvit stiplet sirkel og pilspiss). SON ble identifisert i den rostro-laterale regionen av den mest laterale skiven (figur 2A, liten, hvit, stiplet sirkel). Figur 2B viser utvidede tonotopiske regioner som inneholder både relativt lav- og høy-CF-hørselsregioner fra NM og NL langs rostral-kaudalaksen (hvite skisserte regioner, se også satellittinnfelt ). Figur 2C viser de ipsilaterale og kontralaterale aksonale tuftene i den mest mediale skiven og endepunktet for hørselsregionen (venstre og midtre pil). Orienteringen av skivene vist her står i kontrast til den tradisjonelle orienteringen av skiver som vist i figur 1 (dvs. koronal). Dette ble utført for å vise retningen som best imøtekommer tilnærmingen til en glasspipette som kreves for elektrofysiologiske opptak.
For å bekrefte at en stor region av den tonotopiske aksen var representert i figur 2B, ble det utført elektrofysiologiopptak med strømklemme fra NM-nevroner. Figur 3 viser funksjonelle likheter og forskjeller mellom modne (E21) NM-nevroner registrert fra en koronal skive (figur 3A,B) og en sagittal skive (figur 3C,D, supplerende video S1, S2). To NM-nevroner ble valgt fra mediale og laterale ender av en koronal skive (lik skiven vist i figur 1B), og to NM-nevroner ble valgt fra rostrale og kaudale ender av NM i en sagittal skive (som i skiven vist i figur 2B). Figur 3A,B viser tilsvarende elektrofysiologiske responsegenskaper som somatiske strøminjeksjoner (−100 pA til +200 pA, +10 pA trinn, 100 ms varighet). Avfyringsmønsteret til disse to NM-nevronene utviser subtile forskjeller i dette skiveplanet, noe som indikerer relativ isofrekvenslamina for mellomfrekvente NM-nevroner. Figur 3C,D viser at avfyringsmønstrene har substansielle forskjeller på tvers av rostral-kaudalaksen, noe som indikerer en relativt høyere tonotopisk gradient fra et lavfrekvent NM-nevron (figur 3C) til et høyfrekvent NM-nevron (figur 3D). Begge nevronene presenterte sine stereotype avfyringsmønstre som tidligere rapportert14,15.
Figur 4 viser horisontale snitt av hjernestammevev (200-300 μm) av et E21 kyllingembryo. For begge horisontale skiver (figur 4A,B) vises forstørrede områder med merket NM og NL i den midterste kolonnen og forstørres (60x mål) ved høyre syn på figurpanelet (henholdsvis a og b i satellittinnfelt). I de horisontale skivene ble NM og NL identifisert mot midtlinjen og nevroner ble spredt langs den laterale mediale aksen (figur 4A, B, midtre, hvite, stiplede konturregioner). De forstørrede bildene viser det store omfanget av den tonotopiske gradienten. Lavfrekvente nevroner er i de caudo-laterale områdene og høyfrekvente nevroner er i rostralmediale områder (figur 4A, B, høyre, satellitter). Fibrene som går gjennom midtlinjen langs rostral-kaudalaksen viser de kontralaterale forbindelsene til de hørbare kjernene, men organisasjonen av disse fibrene er ikke i et enkelt plan. Imidlertid kan akutte vinkelskiver fra en horisontal / tverrgående seksjon følge disse aksonale fibrene mot sagittalplanet. Skiver av 200-300 μM tykt hjernestammevev i spiss vinkel (45°) fra horisontalplan er vist i figur 5. Auditive hjernestammekjerner kan sees over en stor diagonal spredning som starter fra den mest laterale skiven og slutter ved den mest mediale skiven (figur 5A-C, merket midtpaneler, hvitt skissert område). Videre kan vinkelretningen til NM- og NL-regioner også visualiseres i påfølgende asymmetriske skiver (figur 5A-C, merkede midtpaneler, hvitt, stiplet skissert område). Forstørrede bilder (60x objektiv) viser den tonotopiske aksen til de auditive kjernene når den kurser langs den rostralmediale til caudo-laterale aksen (figur 5A-C, høyre, satellittinnfelt). Orienteringen av skiver i figur 5 er lik den i figur 2. De kontrasterer den tradisjonelle presentasjonen av bilder, men er mer egnet for elektrofysiologiske eksperimenter.
Figur 1: Representative koronale serielle deler av hjernestammen. (A-D) Venstre: skiver fra kaudal til rostral akse, de hørbare kjernene og forbindelsesfibre merket med en hvit stiplet sirkel. Den midterste innsatsen er en større visning av hørselsområdet, hvor kjerner vises i hvite stiplede sirkler a: NM og b: NL. Piler viser hørselsnervens afferente fibre, og pilspiss viser NM aksonbifurkasjon i A,B. Pilen viser NA i C. Lateral hvit stiplet sirkel viser SON i C,D. Høyre: satellittinnsats viser disse kjernene ved 60x mål: a: NM og b: NL. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kjerne laminaris; NA = kjerne angularis; SON = overlegen olivary kjerne; LF = relativt lavfrekvente nevroner; MF = mellomfrekvente nevroner; HF = høyfrekvente nevroner; D = dorsal; L = lateral; V = ventral. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative sagittale serielle snitt av hjernestammen. (A-C) Venstre: skiver fra lateral til medial akse med hørselskjernene merket i en hvit stiplet sirkel. Den midterste innsatsen viser det samme hørselskjerneområdet i større visning, merket i hvite stiplede sirkler. (A) Hvit stiplet sirkel i midten av stykket fremhever SON; pil som viser hørselsnervefibre og pilspiss som viser NA. En mørk svart flekk på høyre side av stykket er en bildeartefakt. Regioner i lillehjernen kan ses dorsalt til hørselsområdet i begge skivene A og B i venstre panel. (B) En sagittal skive hvis orientering ble endret til koronalplanet (under skiver). Hørselsområdet ble identifisert med blått fargestoff (svart pil) og igjen skåret i sagittalplanet. (AC) Midtinnsats NM- og NL-område merket under stiplede hvite linjer. Til høyre: satellittvisning viser a: NM og b: NL observert i 60x objektiv forstørrelse. LF og HF tonotopisk gradient i auditive kjerner er vist langs rostro-kaudal akse. Piler som peker mot det mørke området i (C) viser tungt myeliniserte NM-fibre som går over midtlinjen gjennom medialaksen. Fibrene forbinder hver side av hørselskjerner. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kjerne laminaris; NA = kjerne angularis; SON = overlegen olivary kjerne; LF = relativt lavfrekvente nevroner; HF = høyfrekvente nevroner; D = dorsal; V = ventral; R = rostral; C = kaudal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Elektrofysiologiske registreringer av nevronrespons på somatiske strøminjeksjoner (−100 pA til +200 pA, +10 pA-økninger, 100 ms varighet) i gjeldende klemmemodus. Nevroner ble valgt for opptak i samme skive, men i ekstreme motsatte regioner av NM. (A,B) Representative nevronresponser i en enkelt koronal skive som indikerer relative isofrekvensegenskaper med subtile forskjeller. Responsegenskaper representerer to forskjellige MF-nevroner registrert fra de mest mediale (A) og laterale (B) regionene av NM i et koronalt stykke. (C,D) Representative nevronopptak fra en enkelt sagittal skive. Opptakene viser en relativt LF NM-respons (C) og en HF NM-respons (D), som fremhever de materielle forskjellene i tonotopisk gradient langs en enkelt sagittal seksjon. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; LF = relativt lavfrekvente nevroner; MF = mellomfrekvente nevroner; HF = høyfrekvente nevroner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative horisontale serielle deler av hjernestammen. (A,B) Venstre: skiver langs dorsal til ventral akse, auditive kjerner er merket med hvite stiplede sirkler. De 8. hjernenerve afferente fibrene forbinder auditive kjerner merket med pil. Den midterste innsatsen er et større syn på auditive kjerneområder med auditive kjerner merket under hvite stiplede linjer NM- og NL-regioner vises. En klar topologisk bevegelse av auditive kjerner kan ses i A,B. (A,B) Høyre: stor satellittvisning som viser a: NM og b: NL. Høyre innsats viser auditive kjerner observert i 60x objektiv forstørrelse og den buede topologiske aksen fra LF til HF langs en caudo-lateral til rostral-medial akse. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kjerne laminaris; LF = relativt lavfrekvente nevroner; HF = høyfrekvente nevroner; L = lateral; R = rostral; C = kaudal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representative horisontale/tverrgående akutte kantede (45°) serielle seksjoner. (A-C) Venstre: serielle deler av hjernestammen, auditive kjerner merket med hvit stiplet sirkel. Den midterste innsatsen er en større visning av det hørbare området. (A) Midtre innsats viser den største spredningen av NM- og NL-nevroner i disse skivene. (B,C) Midtre innsats: Hørselskjerner merket med hvite stiplede linjer viser gradvis topologisk endring sammenlignet med (A-C). Høyre: satellittinnsats som viser hørselskjerner a: NM og b: NL i 60x objektiv forstørrelse. Den tonotopiske aksen fra LF til HF-regioner i NM og NL roterer kantet fra laterale til mediale skiver. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kjerne laminaris; LF = relativt lavfrekvente nevroner; HF = høyfrekvente nevroner; V = ventral; R = rostral; D = dorsal; C = kaudal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende video S1: Hyperpolariserende og depolariserende somatiske strøminjeksjoner. Responsegenskaper fra et lavfrekvent og høyfrekvent nevron til 100 ms somatiske strøminjeksjoner i nåværende klemmemodus. Nevroner ble valgt fra samme sagittale hjernestammeskive. Injeksjoner varierer fra -100 til +200 pA i trinn på +10 pA trinn, 100 ms varighet. Handlingspotensialer ses som svar på tilstrekkelige depolariserende nåværende trinn. Videoen tilsvarer de endelige sporene vist i figur 3C. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende video S2: Hyperpolariserende og depolariserende somatiske strøminjeksjoner. I likhet med supplerende video S1 viser denne videoen responsegenskaper fra et lavfrekvent og høyfrekvent nevron til 100 ms somatiske strøminjeksjoner i gjeldende klemmemodus. Nevroner ble valgt fra samme sagittale hjernestammeskive. Injeksjoner varierer fra -100 til +200 pA i trinn på +10 pA trinn, 100 ms varighet. Handlingspotensialer ses som svar på tilstrekkelige depolariserende nåværende trinn. Videoen tilsvarer de endelige sporene vist i figur 3D. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Koronale seksjoner av kyllingembryonalt hjernestammevev har gjort det mulig å studere relativ individuell isofrekvenslamina i flere tiår 1,2,5. Imidlertid er den tonotopiske (dvs. frekvens) organiseringen av kyllingens auditive hjernestamme topologisk innviklet og kan være mer tilgjengelig i andre anatomiske akser, avhengig av det spesifikke forskningsspørsmålet. Selv om det er tilstrekkelig til å undersøke anatomiske og fysiologiske spørsmål knyttet til individuelle isofrekvensregioner, er studiet av tonotopiske variasjoner og dets utvikling over større auditive hjernestammeområder noe begrenset av koronale seksjoner. For å overvinne denne begrensningen beskriver denne protokollen tilnærminger i sagittal, horisontale og horisontale / tverrgående plan for å gi ytterligere eksempler på auditivt hjernestammevev som viser maksimale tonotopiske egenskaper og gradienter i en individuell hjernestammeseksjon.
Sagittale seksjoner av auditive hjernestammeregioner viser at forskjellige tonotopiske områder er fordelt over en større region i skiven sammenlignet med koronale seksjoner (sagittalt hørselsområde = ~ 300-600 μm, koronalt hørselsområde = ~ 200-350 μm). For eksempel ble NM- og NL-regioner visualisert over et større område langs rostro-kaudalaksen i sagittale seksjoner (f.eks. Figur 2B), og den funksjonelle tonotopiske gradienten som går langs denne anatomiske aksen var i stor grad inneholdt i en enkelt sagittal skive. Dette ble videre bekreftet med nåværende klemmeopptak av inneboende nevronforskjeller som varierer langs rostral-kaudal gradient som tidligere rapportert14,15 (f.eks . Figur 3C, D). Fremtidige eksperimenter som fremhever anatomiske og immunhistokjemiske egenskaper langs den tonotopiske aksen, kan videre undersøke kjente gradienter av auditive egenskaper i et enkelt sagittalt skiveplan. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, MAP2-farging og kaliumkanaluttrykksmønstre, som er kjente gradienter av dendritisk arkitektur og iboende egenskaper til NM og NL som tidligere er vist i suksessive koronale seksjoner16.
Horisontale seksjoner av auditive hjernestammeregioner viser at NM og NL er plassert mot midtlinjen. En del av auditive aksonale fibre løper diagonalt eller vinkelrett på horisontalplanet (figur 4). Disse fibrene kan følges ved å lage en akutt vinkelskive 45 ° til sagittalplanet. De resulterende horisontale/tverrgående skivene var større enn sagittale eller horisontale skiver, og lange aksonale fibre gikk gjennom rostro-kaudalaksen for både ipsilaterale og kontralaterale sider. Både NM og NL kan visualiseres i et større diagonalt område (~ 400-700 μm) slik at kontralaterale forbindelser kan visualiseres langs en lateral-medial akse. I tillegg viser det horisontale/tverrgående skiveplanet også hvordan de auditive områdene og den resulterende tonotopiske gradienten gjør en vinkelsving (figur 5). Vinkeleksponering av kontralaterale forbindelser i et større område gjør disse skivene mer egnet for elektrofysiologisk stimulering og mikrokretsstudier enn tradisjonelle koronale skiver.
Ekstra fordeler
Dannelsen av auditive mikrokretser krever spatiotemporal koordinering av signaler som fremmer nevronoverlevelse, synaptogenese, aksonal differensiering, dendritisk arkitektur og modning. Dermed kan en alternativ hjernestammeseksjoner av kyllingembryoets auditive mikrokrets brukes til følgende forskningsemner: morfologisk organisering av nevroner i topografisk forskjellige dimensjoner; organisere og kartlegge forbindelsene til alle auditive og vestibulære kjerner; identifisering og karakterisering av aktivitetsmønstrene til kretsbestanddeler i iso-frekvens og tonotopiske plan; den topografiske organisasjonen av eksitatoriske versus hemmende mikrokretser og relasjoner til spesialiserte nevronpopulasjoner (kjerner); romlig plassering av auditive kjerneneuroner og dens prediktive CF17; systematisk målretting av spesifikke tonotopiske nevrontyper; sporing av stamceller og deres utvikling til konserverte kjerner; genetisk avstamning av celler til utviklingen av nevronkretser18; komparativ hjernestammeanatomi mellom arter; undersøkelse av vestibulære kretser som Deiters vestibulære kompleks (DC)19; og synkron og kryssprat mellom vestibulære kjerner.
En mangefasettert tilnærming ved hjelp av forskjellige skiveplan kan bidra til å svare på grunnleggende spørsmål om ukjente anatomiske og biofysiske egenskaper til hjernestammemikrokretser. Et godt eksempel er forholdet mellom store auditive kjerner (NM, NA, NL og SON) og vestibulære kjerner, inkludert dorsalkjernen til lateral lemniscus (LLDp), semilunarkjernen (SLu) 20 og tangentiell kjerne (TN) 3. Denne protokollen og disse skivebaserte studiene har imidlertid noen begrensninger.
Forholdsregler og begrensninger
Avhengig av hvilken institusjon som utfører forsøkene, kan etiske retningslinjer og håndtering av kyllingembryoer variere. Mens National Institutes of Health Guidelines for omsorg og bruk av forsøksdyr tillater rask halshugging, finnes det alternative metoder for kyllingembryo eutanasi21. Tidlig utvikling av kyllingembryo hjernestammevev er mykt og delikat sammenlignet med eldre embryoer. Den har flere tilkoblinger og blodårer på overflaten som trenger ekstra forsiktighet når du fjerner dem. Vev bør oppbevares i iskald dACSF og perfunderes med 95% O 2/5% CO2 for å øke levedyktigheten.
Sagittal skivemetoden er bare nyttig for ipsilateral tonotopi. Denne skivemetoden gir større skiver enn koronale skiver, hvis håndtering kan være usikker. Imidlertid kan man trimme skivene ved hjelp av kryssnålmetoder beskrevet i detalj andre steder22. Bruk av 4% LMP agaroseblokk innebygd hjernestamme kan redde delikate strukturer i skiver, men det må tas hensyn til ikke å helle for varmt agarose. Innstilling av den raskt ved å plassere den agaroseblokkerte hjernestammen i et kjølt miljø i ~ 1 min, gjør skiver mer levedyktige for elektrofysiologiske opptak.
Påføring av superlim i overskytende mengder kan være giftig. Det må påføres minimalt, og overskuddsmengder skal vaskes umiddelbart ved å bytte ut dACSF. For akutte kantede (45°) skiver er det kritisk å kutte vinkelen på agaroseblokken; Man kan bruke et speil for å se frontvinkelen mens man kutter agaroseblokken med et skarpt blad. Kommersielt tilgjengelige kniver kan ha et voksbelegg som bør tørkes av med alkohol og tørkes før bruk. Optimalisering er nødvendig for vibratome skjærehastighet og frekvens som aksonal fiber tufts er hardere enn kortikale eller matrise vev. Å holde en høy amplitude og bruke kjølt disseksjonsløsning kan forhindre vevskader.
Alle løsninger skal tilberedes ferske, og Ca 2+ og Mg2+ skal tilsettes ACSF etter boblende 95% O 2/5% CO 2. Ellers kan det være nedbør av Ca2+. En pensel skal brukes til å håndtere skivene forsiktig i vibratomet. Hold den totale skjæretiden under 15 min hvis mulig. En Pasteur-pipette i glass kan brukes til å manøvrere hjernestammeskiver.
Ikke bruk vaskemiddel eller etsende vaskemidler til glass og utstyr som kommer i kontakt med skivene som brukes i elektrofysiologien. Bildene som er tatt representerer utseendet til 200-300 μM tykt vev under differensiell interferenskontrast (DIC) optikk. Den visuelle kvaliteten vil være dårligere enn immunhistokjemi eller elektronmikroskopi, men den gjenspeiler nøyaktig hva en eksperimentør vil se når han utfører elektrofysiologiske opptak.
Studier knyttet til tidlig utvikling av mikrokretser langs en alternativ anatomisk akse, enten de er dorsal-ventral, rostral-caudal eller ipsilateral-contralateral, er begrenset i kyllingens auditive hjernestamme. En grunn til dette er fordi rollen som transkripsjonskoder og regulering av tonotisk utvikling i hjernestammen fortsatt ikke er fullt ut forstått. Funksjonelle fenomener som top-down modulering og spontan aktivitet går ofte tapt når man observerer aktivitet in vitro. In vivo-forskning suppleres imidlertid med spesifikke og direkte enkeltnevronopptak som bare er mulig under disse skiveforholdene. Forbedringen av å skaffe hjernestammevev langs forskjellige retninger kan gi innsiktsfull informasjon om utviklingen og kompleksiteten av tonotopiske gradienter i kylling auditiv hjernestamme mikrokrets.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer at forskningen ble utført uten kommersiell eller økonomisk interesse, og at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av NIH/NIDCD R01 DC017167-tilskuddet. Vi takker Kristine McLellan for redaksjonelle kommentarer til en tidligere versjon av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
| Anti-vibration table 30"x 36" - OTMC - 63533 | TMC | ||
| Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
| Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
| Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
| DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
| Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
| Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
| Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
| Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
| pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
| pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
| Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
| Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
| Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
| Chemicals- list | |||
| Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
| CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
| Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
| Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
| Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
| KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
| NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
| NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |
References
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., et al. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).
- Shao, M., et al. Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period. Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).
- Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).
- Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).
- Sanchez, J. T., Lu, Y. Glutamate signaling in the auditory brainstem. Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. 64 (4), Springer. New York, NY. 75-108 (2017).
- Parks, T. N. Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study. Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Köppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).
- Fukui, I., et al. Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).
- Wang, X., et al. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- Hong, H., Sanchez, J. T. Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system. Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).
- Hong, H., et al. Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).
- Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis. eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).
- Tabor, K. M., et al. Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).
- Lipovsek, M., Wingate, R. J. Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei. Elife. 7, 40232 (2018).
- Passetto, M. F., et al. Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain. Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).
- Curry, R. J., Lu, Y. Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons. Brain Research. 1752, 147258 (2021).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).
