Summary
Her præsenterer vi en protokol til opnåelse af ikke-koronale auditive hjernestammeskiver af kyllingembryoet til undersøgelse af tonotopiske egenskaber og udviklingsbaner inden for en hjernestammeskive. Disse skiver inkluderer sagittale, vandrette og vandrette / tværgående sektioner, der omfatter større tonotopiske regioner inden for et individuelt skiveplan end de traditionelle koronale sektioner.
Abstract
Kyllingembryoet er en bredt accepteret dyremodel til at studere den auditive hjernestamme, der består af højt specialiseret mikrokredsløb og neuronal topologi differentielt orienteret langs en tonotopisk (dvs. frekvens) akse. Den tonotopiske akse tillader segregeret kodning af højfrekvente lyde i det rostral-mediale plan og lavfrekvent kodning i caudo-laterale regioner. Traditionelt tillader koronale hjernestammeskiver af embryonalt væv undersøgelsen af relativ individuel isofrekvenslamina. Selvom det er tilstrækkeligt til at undersøge anatomiske og fysiologiske spørgsmål vedrørende individuelle isofrekvensregioner, er undersøgelsen af tonotopisk variation og dens udvikling på tværs af større auditive hjernestammeområder noget begrænset. Denne protokol rapporterer hjernestammeskæringsteknikker fra kyllingembryoner, der omfatter større gradienter af frekvensområder i den lavere auditive hjernestamme. Anvendelsen af forskellige udskæringsmetoder til kyllingens auditive hjernestammevæv tillader elektrofysiologiske og anatomiske eksperimenter inden for en hjernestammeskive, hvor større gradienter af tonotopiske egenskaber og udviklingsbaner bevares bedre end koronale sektioner. Flere udskæringsteknikker giver mulighed for forbedret undersøgelse af de forskellige anatomiske, biofysiske og tonotopiske egenskaber ved auditive hjernestammemikrokredsløb.
Introduction
Kyllingembryoet er en værdifuld forskningsmodel til at studere grundlæggende biologiske spørgsmål inden for mange og forskellige videnskabelige områder, herunder cellebiologi, immunologi, patologi og udviklingsneurobiologi. Mikrokredsløbet i kyllingens auditive hjernestamme er et glimrende eksempel på et højt specialiseret kredsløb, der kan forstås med hensyn til auditiv morfologi og fysiologi. For eksempel beskrev Rubel and Parks (1975) først den tonotopiske orientering (dvs. frekvensgradient) af kyllingenurne magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL) som en lineær funktion over kernens akse, orienteret ~ 30 ° i forhold til sagittalplanet. Individuelle neuroner i NM og NL koder for deres bedste lydfrekvens - kendt som deres karakteristiske frekvens (CF) - langs det rostral-mediale plan til den caudo-laterale region. Højfrekvente følsomme neuroner er i den rostral-mediale region, og lavfrekvente følsomme neuroner er placeret caudo-lateralt. Som sådan har traditionelle dissektionsmetoder af auditivt hjernestammevæv til undersøgelse af tonotopiske egenskaber brugt successive koronale skiver. Faktisk er auditive mikrokredsløb til udvikling af kyllingembryoner blevet etableret som et modelsystem til undersøgelse af signalbehandling af tonotopiske auditive funktioner gennem successive kaudale til rostrale koronale plan hjernestammeskiver i årtier 1,2,3,4,5,6.
Imidlertid er den tonotopiske organisation af NM og NL topologisk og morfologisk indviklet. Auditive nerveindgange fordeles således, at høje CF-indgange slutter i endepærelignende strukturer, der dækker mindst en fjerdedel af en adendritisk NM-celles somatiske omkreds. Omvendt er lave CF-indgange ikke organiseret med endepærelignende terminaler, men med flere boutonsynapser på dendritter af NM-neuroner. Midterste CF-indgange slutter som både endepære og boutonlignende synapser 4,7,8,9,10,11,12. I NL er den meget stereotype dendritiske gradient tydelig ikke kun i dendritisk længde, men også i dendritisk bredde. Denne unikke dendritiske gradient er tæt i overensstemmelse med den tonotopiske akse. Dendritterne gennemgår en 11 gange stigning i længden og fem gange stigning i bredden fra henholdsvis høj- til lav-CF neuroner6. For at overvinde sådanne indviklede fordelinger af disse kerner i koronale skiver beskriver denne protokol dissektionsmetoder i de sagittale, vandrette og vandrette / tværgående planer. Disse udskæringsteknikker giver eksempler på auditivt hjernestammevæv, der udviser maksimale tonotopiske egenskaber i et individuelt skiveplan.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) og blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals. Protokollerne for dissektion og forberedelse af hjernestammevæv er i overensstemmelse med tidligere protokoller 5,13.
1. Håndtering af æg
- Køb befrugtede æg (Gallus gallus domesticus) fra en IACUC-godkendt lokal dyreleverandør.
- Æggene opbevares straks ved ankomsten i køleskab ved 14 °C og inkuberes inden for 5 dage.
BEMÆRK: Embryons levedygtighed falder betydeligt efter 1 uge. - Steriliser æggene med 70% ethanol inden inkubation ved 38 ± 1 °C og ~50% fugtighed.
2. Kunstig cerebral-spinalvæske (ACSF) sammensætning og præparat
- Bland følgende kemikalier i 1 L af 18,2 MΩcm dH2 O for at skabeen 10x ACSF-stamopløsning: NaCl (natriumchlorid) 130 mM, NaHCO3 (natriumbicarbonat) 26 mM, KCl (kaliumchlorid) 2,5 mM, NaH2PO4 (natriumdihydrogenphosphat) 1,25 mM, dextrose (D-(+)-glucose) 10 mM. Opbevar lageropløsningen i køleskabet.
- MgCl 2 (magnesiumchlorid) 1 M og CaCl 2 (calciumchlorid) 1 M opløsninger fremstilles separat i 18,2 MΩcm dH2 O og opbevares i køleskabet.
- Umiddelbart før brug fortyndes 10x ACSF til 1x og bobles kontinuerligt med 95% O 2/5% CO 2 i 15-20 min. og tilsæt MgCl 2 og CaCl 2. For at forberede ACSF og dACSF (dissekering af ACSF) justeres til en endelig koncentration på henholdsvis Mg 2+ 1 mM, Ca2+ 3 mM og Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM.
- Indstil boblehastigheden for ACSF, så pH er 7,2-7,4 med en osmolalitet mellem 300 og 310 mOsm / L.
BEMÆRK: At have ACSF placeret i et isbad, mens den bobler, er gavnlig for at opretholde en lav opløsningstemperatur, hvilket vil understøtte vævets strukturelle integritet under dissekering.
3. Agarose (5%) blok forberedelse
- Bland 5 g agarose i 100 ml dACSF. Brug et 100 °C vandbad eller mikrobølgeovn i 2-3 minutter under omrøring hver 30. sek. for at forhindre klumper, indtil agarosen opløses helt og begynder at boble.
- Hæld den smeltede agarose i en tom petriskål op til 5 mm tykkelse og hold ved stuetemperatur for at indstille. Efter indstilling forsegles petriskålen ved hjælp af parafilm og opbevares ved 4 °C.
- Skær agarosen i kubiske blokke med et skarpt blad og brug dem på dissektionstidspunktet.
4. Dissektionsprotokol og isolering af auditiv hjernestamme
- Rengør dissektionsområdet med 70% ethylalkoholopløsningsspray.
- Lim den understøttende eller vinklede agaroseblok på vibratombakken.
- Vælg æg i den ønskede alder (E20 og E21 i den nuværende protokol). Håndter og inkuber æggene efter protokollerne ovenfor som i trin 1.
- Find det luftfyldte rum ved at placere ægget under et stærkt lys (candling) og se efter dette rum på den større eller rundere side af ægget.
- Akklimatisere æggene til stuetemperatur, knæk skallen over det luftfyldte rum, og udsæt membransækken.
- Lav et blidt snit i sækken for at udsætte næb.
- Træk forsigtigt halsen og hovedet ud af ægget med en skalpel.
- Quicky afhug hovedet ved hjælp af en skarp saks.
- Efter halshugning skal du rense hovedet med iskkølet dACSF for at fjerne overskydende blod fra dissektionspuden.
- Hold hovedet stabilt i iskølet dACSF og lav et rostro-kaudalt snit. Start snittet bag og mellem øjnene og følg længden af den høstede hals.
BEMÆRK: Yngre embryoner kan kræve mindre tryk, mens de foretager snittet. - Adskil huden for at udsætte kraniet.
- Skær kraniet bag øjet i en midterlinje til lateral retning. Gør dette for begge halvkugler.
BEMÆRK: Dette trin hjælper med at adskille den rostrale del af kraniet fra den vedhæftede hjerne, samtidig med at hjernevævet holdes intakt5. - Skær den rostrale del af kraniet. Placer bladet bag øjnene og lav et hurtigt snit.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt med en indsats for at skære det vedhæftede kranium rent. - Dyp hovedet i en skål med kold dACSF.
- Brug en lille saks til at lave midterlinje til laterale snit i kraniets kaudale område for at forsøge at adskille hjernen fra kraniet uden at forårsage vævsskade.
- Udsæt forsigtigt hjernestammen og lillehjernen. Træk dorsalområdet af hele kraniet tilbage, fjern hjernestammen forsigtigt, og udsæt det ved hjælp af en fin pensel med mild slæde. Brug buede tang til at rense hjernestammen fra at forbinde væv og blodkar. Vær ekstra opmærksom på det 8. kraniale nerveområde, og sørg for at efterlade en kort længde intakte nervefibre på begge sider.
- Adskil hjernestammen fra lillehjernen ved at skære peduncles og fjerne blodkarrene omhyggeligt. Trim hjernestammen af yderligere blodkar.
BEMÆRK: Sørg for, at hele proceduren udføres i iskølet dACSF kontinuerligt boblet med carboxygen (95% O 2/5% CO2).
5. Vibratome skæring
BEMÆRK: I de følgende trin skal bagsiden af vævet understøttes med et kubisk stykke agarose.
- Placer vibratombladet langs den vandrette akse og lim hjernestammen på en skærebakke. Lim den rostrale side, og hold den rostrale-kaudale akse lodret for koronale skiver.
- Hold den laterale-mediale akse lodret for sagittale skiver.
- Lim den ventrale side, og hold den dorsale-ventrale akse lodret for vandrette skiver.
- For at opnå det akutte vinkel sagittal-vandrette plan limes hjernestammens ventrale side og holder den ventral-dorsale akse lodret på agaroseblokkens hypotenusoverflade, som skæres i en 45 ° vinkel. Lim den modsatte overflade af agaroseblokken mod skærebakken, og hold den rostrale-kaudale akse parallel med knivkanten.
6. Håndtering af skrøbelige eller store stykker hjernestammevæv
- I en alternativ tilgang til trin 5 nedsænkes den isolerede hjernestamme i 4% lavt smeltepunkt (LMP) agarose ved ~ 40 ° C i en 35 mm x 10 mm petriskål.
- Efter at have hældt agarose på den nedsænkede hjernestamme, skal du placere petriskålen på is for at størkne. Skær den kubiske agaroseblok med indlejret hjernestamme ved hjælp af et skarpt barberblad.
- Lim LMP-agaroseblokken på dens rostrale side, og hold hjernestammens rostral-kaudale akse lodret.
- Tag koronale skiver, indtil NM-regionen kan visualiseres.
- Fjern agaroseblokken fra limen med et skarpt blad. For at få øje på kernerne skal du forsigtigt placere 0,5 μL farvestof (toluidinblåt eller orange G) på NM med en fin nål.
- Monter denne blok igen på skærebakken til sagittale eller vandrette skiver, og identificer kernerne i forhold til det farvede område.
- For at opnå den bedste ydeevne skal du indstille vibrationsskivehastigheden til 4 - 5 (~ 30 ± 4 mm / min), vibrerende frekvens ved 85-87 Hz og skæreamplitude ved 4-6 (~ 1 ± 0,2 mm).
- Efter hjernestammesektionering placeres de 200-300 μm sekventielt opsamlede skiver i et kommercielt tilgængeligt skivekammer for at ækvilibrere i 1 time ved stuetemperatur i ACSF, kontinuerligt boblet med en blanding af 95% O 2/5% CO 2 (pH 7,2-7,4, osmolaritet 300-310 mOsm / L). Under disse forhold forbliver skiver levedygtige op til 5-6 timer.
7. Elektrofysiologi: patch klemme procedure
- Overfør en hjernestammeskive til optagekammeret med kontinuerlig perfusion af carboxygeneret ACSF ~ 1,5 ± 0,5 ml / min.
- Træk patchpipetter med en mikropipettetrækker med spidsdiameter 1-2 μm og modstand i området 3-6 MΩ.
- Fyld pipetter med en K-gluconatbaseret intern løsning (til optagelse af strømklemme).
- For at teste neuronale egenskaber på tværs af de forskellige tonotopiske regioner i en skive skal du lokalisere neuroner i hver ende af skiveplanet og nærme sig med optageelektroden.
- Oprethold positivt lufttryk ved pipettespidsen, mens du nærmer dig en neuron.
- Bevæg dig mod somaen, indtil en fordybning visualiseres på neuronen. Udfør de næste to trin hurtigt.
- Lav en gigaohm (1 GΩ) tætning ved at frigive positivt lufttryk.
- Hold forstærkerindstillingen i spændingsklemmetilstand, og korriger pipetteforskydningen som nul pA. Kør en tætningstest (10 mV testpuls ved 100 Hz). Påfør negativt lufttryk for at sprænge en lille patch af neuronalmembranen.
- For at teste de aktive iboende egenskaber ved auditive neuroner skal du anvende hyperpolariserende og depolariserende somatiske strøminjektioner.
BEMÆRK: Eksempler på denne procedure kan visualiseres i supplerende video S1, S2. Detaljer om denne procedure findes i videolegenderne.
Representative Results
Alle hjernestammeskiver vist her blev erhvervet fra hjernestammevæv (~ 200-300 μm) og afbildet ved hjælp af en 5x objektiv og differentiel interferenskontrast (DIC) optik. Kameraet blev monteret på dissekeringsmikroskopet og forbundet til en computer med billedoptagelsessoftware (se Materialetabel). Satellitindsats for disse figurer (højre paneler) blev afbildet ved hjælp af et 60x forstørrelsesvandsnedsænkningsmål. Der blev sørget for at sikre, at alle områder af hjernestammeskiven blev lige forstørret, mens der blev opnået digitale billeder. Fotografier blev taget med optimal lysstyrke og fokus. De digitale billeder af hjernestammeskiver blev syet på en plan måde baseret på overlappende område og importeret til en stationær computer for yderligere justeringer af lysstyrke, kontrast og gråtoner. De grundlæggende mikrokredsløb i kyllingens auditive hjernestamme blev identificeret i henhold til tidligere arbejde 1,2,5,13. Under mikroskopet (5x mål) blev auditive kerner identificeret som området ved siden af de stærkt myeliniserede nervefibre, der løber rundt om hver kerne både ipsilateralt og kontralateralt langs skivens dorsale regioner.
Figur 1 viser de traditionelle koronale sektioner af hjernestammevæv (200-300 μm) fra et E21 kyllingembryo. De fire koronale skiver, der er vist her, repræsenterer de relative isofrekvensregioner i de auditive hjernestammekerner, fra den laveste CF-auditive region (figur 1A, caudo-lateral), der går videre til den højeste CF-auditive region (figur 1D, rostral-medial). For alle fire koronale skiver i figur 1A-D vises forstørrede områder af mærket NM og NL i den midterste kolonne og forstørres (60x mål) på højre side af figurpanelet (henholdsvis a og b i satellitindsatser). Pilen i figur 1A,B viser input af auditive nervefibre, og pilespidsen viser bifurcation af NM-axoner til venstre for skiven. Figur 1C viser en anden fuglekernestruktur kendt som nucleus angularis (NA, pil til venstre og pilespids til højre). De to mest rostrale koronale skiver viser den overlegne olivarkerne (SON) placeret langs den ventral-laterale region af koronalskiven (figur 1C, D, hvide stiplede cirkler).
Figur 2 viser sagittale sektioner af hjernestammevæv (200-300 μm) fra et E21 kyllingembryo. For alle tre sagittale skiver (figur 2A-C) vises forstørrede områder af mærket NM og NL i den midterste kolonne og forstørres (60x mål) på højre side af figurpanelet (henholdsvis a og b på satellitbilleder). NM og NL blev identificeret, hvor de auditive nervefibre (figur 2A, mellempil) kom ind i klyngen af neuroner observeret ved højere forstørrelse (figur 2A, midterste, små, hvide stiplede cirkler og pilespidser) og fremhæver udgangspunktet for det auditive område (figur 2A, venstre, stor, hvid stiplet cirkel og pilespids). SON blev identificeret i rostro-lateral region af den mest laterale skive (figur 2A, lille, hvid, stiplet cirkel). Figur 2B viser udvidede tonotopiske regioner, der indeholder både relativt lav- og høj-CF auditive regioner fra NM og NL langs den rostral-kaudale akse (hvide skitserede regioner, se også satellitindsats). Figur 2C viser de ipsilaterale og kontralaterale axonale tufts i den mest mediale skive og slutpunktet for det auditive område (venstre og midterste pile). Orienteringen af skiverne vist her står i kontrast til den traditionelle orientering af skiver som vist i figur 1 (dvs. koronal). Dette blev udført for at vise den orientering, der bedst imødekommer tilgangen til en glaspipette, der kræves til elektrofysiologiske optagelser.
For at bekræfte, at en stor region af tonotopaksen var repræsenteret i figur 2B, blev strømklemmeelektrofysiologioptagelser udført fra NM-neuroner. Figur 3 viser funktionelle ligheder og forskelle mellem modne (E21) NM-neuroner registreret fra en koronal skive (figur 3A, B) og en sagittal skive (figur 3C, D, supplerende video S1, S2). To NM-neuroner blev valgt fra de mediale og laterale ender af en koronal skive (svarende til skiven vist i figur 1B), og to NM-neuroner blev valgt fra de rostrale og kaudale ender af NM i en sagittal skive (som i skiven vist i figur 2B). Figur 3A,B viser lignende elektrofysiologiske responsegenskaber som somatiske strøminjektioner (-100 pA til +200 pA, +10 pA trin, 100 ms varighed). Affyringsmønsteret for disse to NM-neuroner udviser subtile forskelle i dette skiveplan, hvilket indikerer relativ iso-frekvens lamina for mellemfrekvente NM-neuroner. Figur 3C,D viser, at affyringsmønstrene har væsentlige forskelle på tværs af den rostral-kaudale akse, hvilket indikerer en relativt højere tonotopisk gradient fra en lavfrekvent NM-neuron (figur 3C) til en højfrekvent NM-neuron (figur 3D). Begge neuroner præsenterede deres stereotype fyringsmønstre som tidligere rapporteret14,15.
Figur 4 viser vandrette sektioner af hjernestammevæv (200-300 μm) af et E21 kyllingembryo. For begge vandrette skiver (figur 4A, B) vises forstørrede områder af mærket NM og NL i den midterste kolonne og forstørres (60x mål) på højre side af figurpanelet (henholdsvis a og b i satellitindsatser). I de vandrette skiver blev NM og NL identificeret mod midterlinjen, og neuroner blev spredt langs den laterale-mediale akse (figur 4A, B, midterste, hvide, stiplede konturregioner). De forstørrede billeder viser den store udstrækning af den tonotopiske gradient. Lavfrekvente neuroner er i de caudo-laterale regioner, og højfrekvente neuroner er i de rostral-mediale områder (figur 4A, B, højre, satellitter). Fibrene, der løber gennem midterlinjen langs den rostral-kaudale akse, viser de kontralaterale forbindelser mellem de auditive kerner, men organisationen af disse fibre er ikke i et simpelt plan. Imidlertid kan akutte vinkelskiver fra et vandret / tværgående snit følge disse aksonale fibre mod sagittalplanet. Skiver af 200-300 μM tykt hjernestammevæv i en spids vinkel (45°) fra et vandret plan er vist i figur 5. Auditive hjernestammekerner kan ses over en stor diagonal spredning, der starter fra den mest laterale skive og slutter ved den mest mediale skive (figur 5A-C, mærkede midterpaneler, hvidt skitseret område). Desuden kan vinkelorienteringen af NM- og NL-regioner også visualiseres i successive asymmetriske skiver (figur 5A-C, mærkede midterpaneler, hvidt, stiplet skitseret område). Forstørrede billeder (60x mål) viser den tonotopiske akse af de auditive kerner, når den løber langs den rostral-mediale til caudo-laterale akse (figur 5A-C, højre, satellitindsats). Orienteringen af skiver i figur 5 svarer til retningen i figur 2. De kontrasterer den traditionelle præsentation af billeder, men er mere egnede til elektrofysiologiske eksperimenter.
Figur 1: Repræsentative koronale serielle sektioner af hjernestammen. (A-D) Til venstre: skiver fra kaudal til rostral akse, de auditive kerner og forbindelsesfibre markeret med en hvid stiplet cirkel. Den midterste indsats er en større visning af det auditive område, hvor kerner vises inden for hvide stiplede cirkler a: NM og b: NL. Pile viser auditive nerveafferente fibre, og pilespids viser NM axon bifurcation i A, B. Pilen viser NA i C. Lateral hvid stiplet cirkel viser SON i C, D. Til højre: satellitindsats viser disse kerner ved 60x mål: a: NM og b: NL. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kernelaminaris; NA = kerne angularis; SON = overlegen olivarkerne; LF = relativt lavfrekvente neuroner; MF = mellemfrekvente neuroner; HF = højfrekvente neuroner; D = dorsal; L = lateral; V = ventral. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative sagittale serielle sektioner af hjernestammen. (A-C) Til venstre: skiver fra lateral til medial akse med de auditive kerner mærket i en hvid stiplet cirkel. Den midterste indsats viser det samme auditive kerneområde i større visning, markeret inden for hvide stiplede cirkler. (A) Hvid stiplet cirkel i midten af skiven fremhæver SON; pil, der viser auditive nervefibre og pilespids, der viser NA. En mørk sort plet i højre side af skiven er en billedartefakt. Regioner i lillehjernen kan ses dorsal til den auditive region i både skiver A og B i venstre panel. (B) En sagittal skive, hvis orientering blev ændret til koronalplanet (under udskæring). Den auditive region blev identificeret med blåt farvestof (sort pil) og igen skåret i sagittalplanet. (A-C) Midterste indsats NM og NL region markeret under stiplede hvide linjer. Til højre: satellitvisning viser a: NM og b: NL observeret i 60x objektiv forstørrelse. LF og HF tonotopisk gradient i auditive kerner er vist langs rostro-kaudal akse. Pile, der peger på det mørke område i (C), viser stærkt myeliniserede NM-fibre, der løber over midterlinjen gennem medialaksen. Fibrene forbinder hver side af auditive kerner. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kernelaminaris; NA = kerne angularis; SON = overlegen olivarkerne; LF = relativt lavfrekvente neuroner; HF = højfrekvente neuroner; D = dorsal; V = ventral; R = rostral; C = kaudal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Elektrofysiologiske optagelser af neuronal respons på somatiske strøminjektioner (-100 pA til +200 pA, +10 pA trin, 100 ms varighed) i nuværende klemmetilstand. Neuroner blev udvalgt til optagelser i samme skive, men i ekstreme modsatte områder af NM. (A,B) Repræsentative neuronale reaktioner i en enkelt koronal skive, der indikerer relative isofrekvensegenskaber med subtile forskelle. Responsegenskaber repræsenterer to forskellige MF-neuroner registreret fra de mest mediale (A) og laterale (B) regioner af NM i en koronal skive. (C,D) Repræsentative neuronale optagelser fra en enkelt sagittal skive. Optagelserne viser et relativt LF NM-respons (C) og et HF NM-respons (D), der fremhæver de væsentlige forskelle i tonotopisk gradient inden for et enkelt sagittalafsnit. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; LF = relativt lavfrekvente neuroner; MF = mellemfrekvente neuroner; HF = højfrekvente neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative vandrette serielle sektioner af hjernestammen. (A,B) Til venstre: skiver langs dorsal til ventral akse, auditive kerner er markeret med hvide stiplede cirkler. De 8. kraniale nerveafferentefibre forbinder auditive kerner markeret med pil. Den midterste indsats er en større visning af auditive kerner region med auditive kerner markeret under hvide stiplede linjer NM og NL regioner vises. En klar topologisk bevægelse af auditive kerner kan ses i A, B. (A,B) Til højre: stor satellitvisning, der viser a: NM og b: NL. Højre indsats viser auditive kerner observeret i 60x objektiv forstørrelse og den buede topologiske akse fra LF til HF langs en caudo-lateral til rostral-medial akse. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kernelaminaris; LF = relativt lavfrekvente neuroner; HF = højfrekvente neuroner; L = lateral; R = rostral; C = kaudal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative vandrette/tværgående akutte vinkel (45°) serielle sektioner. (A-C) Til venstre: serielle sektioner af hjernestammen, auditive kerner markeret med hvid stiplet cirkel. Den midterste indsats er et større overblik over den auditive region. (A) Mellemindsats viser den største spredning af NM- og NL-neuroner i disse skiver. (B,C) Midterste indsats: auditive kerner markeret med hvide stiplede linjer viser gradvis topologisk ændring sammenlignet med (AC). Til højre: satellitindsats, der viser auditive kerner a: NM og b: NL i 60x objektiv forstørrelse. Den tonotopiske akse fra LF til HF-regioner i NM og NL roterer vinkelret fra laterale til mediale skiver. Forkortelser: NM = nucleus magnocellularis; NL = kernelaminaris; LF = relativt lavfrekvente neuroner; HF = højfrekvente neuroner; V = ventral; R = rostral; D = dorsal; C = kaudal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video S1: Hyperpolariserende og depolariserende somatiske strøminjektioner. Responsegenskaber fra en lavfrekvent og højfrekvent neuron til 100 ms somatiske strøminjektioner i nuværende klemmetilstand. Neuroner blev valgt fra den samme sagittale hjernestammeskive. Injektioner spænder fra -100 til +200 pA i trin på +10 pA trin, 100 ms tidsvarighed. Handlingspotentialer ses som reaktion på tilstrækkelige depolariserende nuværende trin. Videoen svarer til de sidste spor vist i figur 3C. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video S2: Hyperpolariserende og depolariserende somatiske strøminjektioner. I lighed med supplerende video S1 viser denne video responsegenskaber fra en lavfrekvent og højfrekvent neuron til 100 ms somatiske strøminjektioner i nuværende klemmetilstand. Neuroner blev valgt fra den samme sagittale hjernestammeskive. Injektioner spænder fra -100 til +200 pA i trin på +10 pA trin, 100 ms tidsvarighed. Handlingspotentialer ses som reaktion på tilstrækkelige depolariserende nuværende trin. Videoen svarer til de sidste spor vist i figur 3D. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Koronale sektioner af kyllingembryonalt hjernestammevæv har tilladt undersøgelsen af relativ individuel iso-frekvens lamina i årtier 1,2,5. Imidlertid er den tonotopiske (dvs. frekvens) organisering af kyllingens auditive hjernestamme topologisk indviklet og kan være mere tilgængelig i andre anatomiske akser afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål. Selvom det er tilstrækkeligt til at undersøge anatomiske og fysiologiske spørgsmål vedrørende individuelle isofrekvensregioner, er undersøgelsen af tonotopiske variationer og dens udvikling på tværs af større auditive hjernestammeområder noget begrænset af koronale sektioner. For at overvinde denne begrænsning beskriver denne protokol tilgange i de sagittale, vandrette og vandrette / tværgående planer for at give yderligere eksempler på auditivt hjernestammevæv, der udviser maksimale tonotopiske egenskaber og gradienter i et individuelt hjernestammeafsnit.
Sagittale sektioner af auditive hjernestammeregioner viser, at forskellige tonotopiske områder er fordelt over en større region inden for skiven sammenlignet med koronale sektioner (sagittal auditivt område = ~ 300-600 μm, koronalt auditivt område = ~ 200-350 μm). For eksempel blev NM- og NL-regioner visualiseret over et større område langs rostro-kaudalaksen i sagittale sektioner (f.eks. Figur 2B), og den funktionelle tonotopgradient, der løber langs denne anatomiske akse, var stort set indeholdt i en enkelt sagittal skive. Dette blev yderligere bekræftet med aktuelle klemmeoptagelser af iboende neuronale forskelle, der varierer langs den rostrale-kaudale gradient som tidligere rapporteret14,15 (f.eks . Figur 3C,D). Fremtidige eksperimenter, der fremhæver anatomiske og immunohistokemiske egenskaber langs tonotopisk akse, kunne yderligere undersøge kendte gradienter af auditive egenskaber inden for et enkelt sagittalt skiveplan. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, MAP2-farvnings- og kaliumkanalekspressionsmønstre, som er kendte gradienter af dendritisk arkitektur og iboende egenskaber af NM og NL, der tidligere er vist i successive koronale afsnit16.
Vandrette sektioner af auditive hjernestammeregioner viser, at NM og NL er placeret mod midterlinjen. En del af auditive axonale fibre løber diagonalt eller vinkelret på det vandrette plan (figur 4). Disse fibre kan efterfølges ved at lave en akut vinkelskive 45 ° til sagittalplanet. De resulterende vandrette / tværgående skiver var større end sagittale eller vandrette skiver, og lange aksonale fibre løb gennem rostro-kaudalaksen til både ipsilaterale og kontralaterale sider. Både NM og NL kan visualiseres i et større diagonalt område (~ 400-700 μm), således at kontralaterale forbindelser kan visualiseres langs en lateral-medial akse. Derudover viser det vandrette/tværgående skiveplan også, hvordan de auditive regioner og den resulterende tonotopiske gradient laver en vinkeldrejning (figur 5). Vinkeleksponering af kontralaterale forbindelser i et større område gør disse skiver mere egnede til elektrofysiologisk stimulering og mikrokredsløbsundersøgelser end traditionelle koronale skiver.
Yderligere fordele
Dannelsen af auditive mikrokredsløb kræver spatiotemporal koordinering af signaler, der fremmer neuronal overlevelse, synaptogenese, axonal differentiering, dendritisk arkitektur og modning. Således kan en alternativ hjernestamme sektioner af kyllingembryo auditive mikrokredsløb anvendes til følgende forskningsemner: morfologisk organisering af neuroner i topografisk forskellige dimensioner; organisering og kortlægning af forbindelserne mellem alle auditive og vestibulære kerner; identifikation og karakterisering af aktivitetsmønstre for kredsløbsbestanddele i isofrekvens- og tonotopiske planer den topografiske organisering af excitatoriske versus hæmmende mikrokredsløb og relationer til specialiserede neuronpopulationer (kerner); rumlig placering af auditive kerneneuroner og dens forudsigelige CF17; systematisk målretning af specifikke tonotopiske neuronale typer; sporing af stamceller og deres udvikling til konserverede kerner; genetisk afstamning af celler til udviklingen af neuronale kredsløb18; sammenlignende hjernestamme anatomi mellem arter; undersøgelse af vestibulære kredsløb som Deiters vestibulære kompleks (DC)19; og synkronitet og krydstale mellem vestibulære kerner.
En mangesidet tilgang ved hjælp af forskellige skiveplaner kan hjælpe med at besvare grundlæggende spørgsmål om ukendte anatomiske og biofysiske egenskaber ved hjernestammemikrokredsløb. Et godt eksempel er forholdet mellem større auditive kerner (NM, NA, NL og SON) og de vestibulære kerner, herunder dorsalkernen i lateral lemniscus (LLDp), semilunar kernen (SLu) 20 og tangentiel kerne (TN)3. Denne protokol og disse skivebaserede undersøgelser har dog nogle begrænsninger.
Forholdsregler og begrænsninger
Afhængigt af den institution, der udfører forsøgene, kan etiske retningslinjer og håndtering af kyllingembryoner variere. Mens National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals tillader hurtig halshugning, er der alternative metoder til kyllingembryo-eutanasi21. Tidligt udviklende kyllingembryo hjernestammevæv er blødt og delikat sammenlignet med ældre embryoner. Det har flere forbindelser og blodkar på overfladen, der kræver ekstra forsigtighed, når de fjernes. Væv skal opbevares i iskold dACSF og perfunderes med 95% O 2/5% CO2 for at øge levedygtigheden.
Sagittal slicing-metoden er kun nyttig til ipsilateral tonotopi. Denne udskæringsmetode giver større skiver end koronale skiver, hvis håndtering kan være usikker. Man kan dog trimme skiverne ved hjælp af krydsnålsmetoder, der er beskrevet detaljeret andetsteds22. Brug af 4% LMP agarose blok indlejret hjernestamme kan redde sarte strukturer i skiver, men man skal passe på ikke at hælde for varm agarose. At indstille det hurtigt ved at placere den agaroseblokerede hjernestamme i et kølet miljø i ~ 1 minut gør skiver mere levedygtige til elektrofysiologiske optagelser.
Anvendelse af superlim i overskydende mængder kan være giftigt. Det skal påføres minimalt, og overskydende mængder skal vaskes straks ved at skifte dACSF ud. For akutte kantede (45 °) skiver er det kritisk at skære vinklen på agaroseblokken; Man kan bruge et spejl til at se frontvinklen, mens man skærer agaroseblokken med et skarpt blad. Kommercielt tilgængelige knive kan have en voksbelægning, som skal tørres af med alkohol og tørres før brug. Optimering er nødvendig for vibrationsskæringshastigheden og frekvensen, da axonale fibertufts er hårdere end kortikalt eller matrixvæv. At holde en høj amplitude og bruge kølet dissektionsopløsning kan forhindre vævsskade.
Alle opløsninger skal fremstilles friske, og Ca 2+ og Mg2+ skal tilsættes til ACSF efter boblende 95% O 2/5% CO2 . Ellers kan der være nedbør af Ca2+. En pensel skal bruges til at håndtere skiverne forsigtigt i vibratomet. Hold den samlede udskæringstid under 15 minutter, hvis det er muligt. En glas Pasteur pipette kan bruges til at manøvrere hjernestamme skiver.
Brug ikke vaskemiddel eller ætsende vaskemidler til glasvarer og udstyr, der kommer i kontakt med skiverne, der anvendes i elektrofysiologi. De billeder, der er taget, repræsenterer udseendet af 200-300 μM tykt væv under differentiel interferenskontrast (DIC) optik. Den visuelle kvalitet vil være dårligere end immunhistokemi eller elektronmikroskopi, men det afspejler nøjagtigt, hvad en eksperimentator vil se, når han udfører elektrofysiologiske optagelser.
Undersøgelser vedrørende den tidlige udvikling af mikrokredsløb langs en alternativ anatomisk akse, uanset om de er dorsal-ventrale, rostral-kaudale eller ipsilaterale-kontralaterale, er begrænsede i kyllingens auditive hjernestamme. En af grundene til dette er, at rollen som transkriptionskoder og regulering af tonotopisk udvikling i hjernestammen stadig ikke er fuldt ud forstået. Funktionelle fænomener som top-down modulering og spontan aktivitet går ofte tabt, når man observerer aktivitet in vitro. In vivo-forskning suppleres imidlertid med specifikke og direkte enkeltneuronoptagelser, der kun er mulige under disse skiveforhold. Forfining af at opnå hjernestammevæv langs forskellige orienteringer kunne give indsigtsfuld information om udviklingen og kompleksiteten af tonotopiske gradienter i kyllingens auditive hjernestammemikrokredsløb.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at forskningen blev udført uden nogen kommerciel eller økonomisk interesse, og at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af NIH/NIDCD R01 DC017167-bevillingen. Vi takker Kristine McLellan for at give redaktionelle kommentarer til en tidligere version af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
| Anti-vibration table 30"x 36" - OTMC - 63533 | TMC | ||
| Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
| Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
| Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
| DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
| Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
| Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
| Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
| Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
| pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
| pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
| Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
| Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
| Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
| Chemicals- list | |||
| Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
| CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
| Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
| Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
| Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
| KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
| NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
| NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |
References
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., et al. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).
- Shao, M., et al. Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period. Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).
- Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).
- Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).
- Sanchez, J. T., Lu, Y. Glutamate signaling in the auditory brainstem. Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. 64 (4), Springer. New York, NY. 75-108 (2017).
- Parks, T. N. Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study. Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Köppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).
- Fukui, I., et al. Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).
- Wang, X., et al. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- Hong, H., Sanchez, J. T. Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system. Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).
- Hong, H., et al. Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).
- Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis. eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).
- Tabor, K. M., et al. Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).
- Lipovsek, M., Wingate, R. J. Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei. Elife. 7, 40232 (2018).
- Passetto, M. F., et al. Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain. Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).
- Curry, R. J., Lu, Y. Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons. Brain Research. 1752, 147258 (2021).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).
