Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla icke-koronala auditiva hjärnstamskivor av kycklingembryot för undersökning av tonotopiska egenskaper och utvecklingsbanor inom en hjärnstamsskiva. Dessa skivor inkluderar sagittala, horisontella och horisontella / tvärgående sektioner som omfattar större tonotopiska regioner inom ett enskilt skivplan som de traditionella koronala sektionerna.
Abstract
Kycklingembryot är en allmänt accepterad djurmodell för att studera den auditiva hjärnstammen, bestående av högspecialiserad mikrokrets och neuronal topologi differentiellt orienterad längs en tonotopisk (dvs frekvens) axel. Den tonotopiska axeln tillåter segregerad kodning av högfrekventa ljud i det rostral-mediala planet och lågfrekvent kodning i caudo-laterala regioner. Traditionellt tillåter koronala hjärnstamskivor av embryonal vävnad studier av relativ individuell iso-frekvenslamina. Även om det är tillräckligt för att undersöka anatomiska och fysiologiska frågor som rör enskilda isofrekvensregioner, är studien av tonotopisk variation och dess utveckling över större auditiva hjärnstamsområden något begränsad. Detta protokoll rapporterar hjärnstamsskivningstekniker från kycklingembryon som omfattar större gradienter av frekvensregioner i den nedre auditiva hjärnstammen. Användningen av olika skivningsmetoder för kyckling auditiv hjärnstamsvävnad tillåter elektrofysiologiska och anatomiska experiment inom en hjärnstamsskiva, där större gradienter av tonotopiska egenskaper och utvecklingsbanor är bättre bevarade än koronasektioner. Flera skivningstekniker möjliggör förbättrad undersökning av de olika anatomiska, biofysiska och tonotopiska egenskaperna hos auditiva hjärnstamsmikrokretsar.
Introduction
Kycklingembryot är en värdefull forskningsmodell för att studera grundläggande biologiska frågor inom många och olika vetenskapliga områden inklusive cellbiologi, immunologi, patologi och utvecklingsneurobiologi. Mikrokretsen i kycklingens auditiva hjärnstam är ett utmärkt exempel på en högspecialiserad krets som kan förstås när det gäller hörselmorfologi och fysiologi. Till exempel beskrev Rubel and Parks (1975) först den tonotopiska orienteringen (dvs frekvensgradienten) hos kycklingkärnan magnocellularis (NM) och nucleus laminaris (NL) som en linjär funktion över kärnans axel, orienterad ~ 30 ° med avseende på sagittalplanet. Enskilda neuroner i NM och NL kodar för sin bästa ljudfrekvens - känd som deras karakteristiska frekvens (CF) - längs det rostral-mediala planet till caudo-laterala regionen. Högfrekventa känsliga neuroner ligger i den rostral-mediala regionen och lågfrekvent-känsliga neuroner är belägna caudo-lateralt. Som sådan har traditionella dissektionsmetoder för auditiv hjärnstamsvävnad för att studera tonotopiska egenskaper använt successiva koronala skivor. Faktum är att auditiva mikrokretsar för att utveckla kycklingembryon har etablerats som ett modellsystem för att studera signalbehandling av tonotopiska hörselfunktioner genom successiva kaudala till rostrala koronaplana hjärnstamskivor i årtionden 1,2,3,4,5,6.
Den tonotopiska organisationen av NM och NL är emellertid topologiskt och morfologiskt invecklad. Hörselnervens ingångar fördelas så att höga CF-ingångar slutar i endbulbliknande strukturer som täcker minst en fjärdedel av en adendritisk NM-cells somatiska omkrets. Omvänt är låga CF-ingångar inte organiserade med ändlampaliknande terminaler utan med flera boutonsynapser på dendriter av NM-neuroner. Mellersta CF-ingångar avslutas som både ändlampa och boutonliknande synapser 4,7,8,9,10,11,12. I NL är den mycket stereotypa dendritiska gradienten uppenbar inte bara i dendritisk längd utan också i dendritisk bredd. Denna unika dendritiska gradient överensstämmer nära den tonotopiska axeln. Dendriterna genomgår en 11-faldig ökning i längd och femfaldig ökning av bredden från hög- till låg-CF-neuroner, respektive6. För att övervinna sådana invecklade fördelningar av dessa kärnor i koronala skivor beskriver detta protokoll dissektionsmetoder i sagittala, horisontella och horisontella / tvärgående plan. Dessa skivningstekniker ger exempel på auditiv hjärnstamsvävnad som uppvisar maximala tonotopiska egenskaper i ett enskilt skivplan.
Protocol
Alla procedurer godkändes av Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) och utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals. Protokollen för dissektion och beredning av hjärnstamsvävnad överensstämmer med tidigare protokoll 5,13.
1. Ägghantering
- Köp befruktade ägg (Gallus gallus domesticus) från en IACUC-godkänd lokal djurleverantör.
- Förvara äggen omedelbart vid ankomsten i kylskåp vid 14 °C och inkubera inom 5 dagar.
OBS: Embryots livskraft minskar avsevärt efter 1 vecka. - Sterilisera äggen med 70% etanol före inkubation vid 38 ± 1 °C och ~50% luftfuktighet.
2. Konstgjord cerebral-spinalvätska (ACSF) sammansättning och beredning
- Blanda följande kemikalier i 1 liter 18,2 MΩcmdH2Oför att skapa en 10x ACSF-stamlösning: NaCl (natriumklorid) 130 mM,NaHCO3 (natriumbikarbonat) 26 mM, KCl (kaliumklorid) 2,5 mM,NaH2PO4(natriumdivätefosfat) 1,25 mM, dextros (D-(+)-glukos) 10 mM. Förvara stamlösningen i kylskåpet.
- FörberedMgCl2 (magnesiumklorid) 1 M och CaCl2( kalciumklorid) 1 M lösningar separat i 18,2 MΩcm dH2O och förvara i kylskåp.
- Späd omedelbart före användning 10x ACSF till 1x och bubbla kontinuerligt med 95%O 2/5% CO2 i 15-20 min och tillsätt MgCl2 och CaCl2. För att förbereda ACSF och dACSF (dissekering av ACSF), justera till en slutlig koncentration av Mg 2+ 1 mM, Ca 2+ 3 mM respektive Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM.
- Ställ in bubblingshastigheten för ACSF så att pH är 7,2-7,4 med en osmolalitet mellan 300 och 310 mOsm / L.
OBS: Att ha ACSF placerad i ett isbad medan du bubblar är fördelaktigt för att upprätthålla en låg lösningstemperatur, vilket kommer att stödja vävnadens strukturella integritet vid dissekering.
3. Agaros (5%) blockberedning
- Blanda 5 g agaros i 100 ml dACSF. Använd ett 100 °C vattenbad eller mikrovågsugn i 2-3 minuter under omrörning var 30:e sekund för att förhindra klumpar tills agarosen löser sig helt och börjar bubbla.
- Häll den smälta agarosen i en tom petriskål upp till 5 mm tjocklek och håll vid rumstemperatur för att ställa in. Efter inställning, försegla petriskålen med parafilm och förvara vid 4 °C.
- Skär agarosen i kubiska block med ett skarpt blad och använd dem vid dissektionstillfället.
4. Dissektionsprotokoll och isolerande auditiv hjärnstam
- Rengör dissektionsområdet med 70% etylalkohollösningsspray.
- Limma det bärande eller vinklade agarosblocket på vibratombrickan.
- Välj ägg av önskad ålder (E20 och E21 i detta protokoll). Hantera och inkubera äggen enligt protokollen ovan som i steg 1.
- Leta reda på det luftfyllda utrymmet genom att placera ägget under ett starkt ljus (candling) och leta efter detta utrymme på den större eller rundare sidan av ägget.
- Acklimatisera äggen till rumstemperatur, knäck skalet över det luftfyllda utrymmet och exponera membransäcken.
- Gör ett försiktigt snitt i säcken för att exponera näbben.
- Med en skalpell, dra försiktigt nacken och huvudet ur ägget.
- Snabbt halshugga huvudet med en skarp sax.
- Efter halshuggning, rengör huvudet med iskyld dACSF för att ta bort överflödigt blod från dissektionsdynan.
- Håll huvudet stadigt i iskyld dACSF och gör ett rostro-caudalt snitt. Starta snittet bakom och mellan ögonen och följ längden på den skördade nacken.
OBS: Yngre embryon kan kräva mindre tryck när snittet görs. - Separera huden för att exponera skallen.
- Skär skallen bakom ögat i en mittlinje i sidled. Gör detta för båda halvklotet.
OBS: Detta steg hjälper till att separera den rostrala delen av skallen från den bifogade hjärnan samtidigt som hjärnvävnaden hålls intakt5. - Skiva den rostrala delen av skallen. Placera bladet bakom ögonen och gör ett snabbt snitt.
OBS: Ansträngning kan krävas för att skära den bifogade skallen rent. - Sänk ner huvudet i en skål med kall dACSF.
- Använd en liten sax, gör mittlinjen till laterala snitt i den kaudala regionen av skallen för att försöka separera hjärnan från skallen utan att orsaka vävnadsskada.
- Exponera försiktigt hjärnstammen och lillhjärnan. Dra tillbaka dorsalområdet i hela skallen, ta bort hjärnstammen försiktigt och exponera den med hjälp av en fin pensel med mild släde. Använd böjda tångar för att rengöra hjärnstammen från att ansluta vävnad och blodkärl. Var extra uppmärksam på det 8: e kranialnervområdet och var noga med att lämna en kort längd av intakta nervfibrer på båda sidor.
- Separera hjärnstammen från lillhjärnan genom att skära pedunclesna och ta bort blodkärlen försiktigt. Trimma hjärnstammen av ytterligare blodkärl.
OBS: Se till att hela proceduren utförs i iskyld dACSF kontinuerligt bubblad med karboxygen (95% O2/5%CO2).
5. Vibratomskivning
OBS: I följande steg måste vävnadens baksida stödjas med en kubisk bit agaros.
- Placera vibratombladet längs den horisontella axeln och limma hjärnstammen på en skivbricka. Limma rostralsidan och håll den rostrala kaudala axeln vertikal för koronaskivor.
- Håll den laterala mediala axeln vertikal för sagittala skivor.
- Limma den ventrala sidan och håll den dorsal-ventrala axeln vertikal för horisontella skivor.
- För att uppnå det akuta vinkel sagittal-horisontella planet, limma hjärnstammens ventrala sida och håll den ventrala dorsala axeln vertikal på agarosblockets hypotenusyta, som skärs i en 45 ° vinkel. Limma den motsatta ytan av agarosblocket mot skivbrickan och håll den rostral-kaudala axeln parallell med bladkanten.
6. Hantering av ömtåliga eller stora bitar av hjärnstamsvävnad
- I ett alternativt tillvägagångssätt för steg 5, sänk ner den isolerade hjärnstammen i 4% låg smältpunkt (LMP) agaros vid ~ 40 ° C i en 35 mm x 10 mm petriskål.
- Efter att ha hällt agaros på den nedsänkta hjärnstammen, placera petriskålen på is för att stelna. Skär det kubiska agarosblocket med inbäddad hjärnstam med ett skarpt rakblad.
- Limma LMP-agarosblocket på dess rostrala sida och håll hjärnstammens rostral-kaudala axel vertikal.
- Ta koronala skivor tills NM-regionen kan visualiseras.
- Ta bort agarosblocket från limet med ett skarpt blad. För att upptäcka kärnorna, placera försiktigt 0,5 μL färgämne (toluidinblått eller orange G) på NM med en fin nål.
- Montera om detta block på skivbrickan för sagittala eller horisontella skivor och identifiera kärnorna med avseende på det färgade området.
- För bästa prestanda, ställ in vibratomskivhastigheten på 4 - 5 (~ 30 ± 4 mm / min), vibrerande frekvens vid 85-87 Hz och skivamplitud vid 4-6 (~ 1 ± 0,2 mm).
- Efter hjärnstamssektionering, placera de 200-300 μm sekventiellt uppsamlade skivorna i en kommersiellt tillgänglig skivkammare för att balansera i 1 h vid rumstemperatur i ACSF, kontinuerligt bubblad med en blandning av 95% O 2/5%CO2 (pH 7,2-7,4, osmolaritet 300-310 mOsm / L). Under dessa förhållanden förblir skivorna livskraftiga upp till 5-6 timmar.
7. Elektrofysiologi: procedur för lappklämma
- Överför en hjärnstamsskiva till inspelningskammaren med kontinuerlig perfusion av karboxygenerad ACSF ~ 1,5 ± 0,5 ml / min.
- Dra plåsterpipetter med en mikropipettdragare med spetsdiameter 1-2 μm och motstånd i intervallet 3-6 MΩ.
- Fyll pipetter med en K-glukonatbaserad intern lösning (för inspelning av strömklämma).
- För att testa de neuronala egenskaperna över de olika tonotopiska regionerna i en skiva, lokalisera neuroner i vardera änden av skivplanet och närma dig med inspelningselektroden.
- Behåll positivt lufttryck vid pipettspetsen medan du närmar dig en neuron.
- Flytta mot soma tills en indragning visualiseras på neuronen. Utför de följande två stegen snabbt.
- Gör en gigaohm (1 GΩ) tätning genom att släppa ut positivt lufttryck.
- Håll förstärkarinställningen i spänningsklämläge och korrigera pipettförskjutningen som noll pA. Kör ett tätningstest (10 mV testpuls vid 100 Hz). Applicera negativt lufttryck för att brista en liten fläck av neuronmembranet.
- För att testa de aktiva inneboende egenskaperna hos hörselneuroner, applicera hyperpolariserande och depolariserande somatiska ströminjektioner.
OBS: Exempel på denna procedur kan visualiseras i Supplementary Video S1, S2. Detaljer om denna procedur finns i videolegenderna.
Representative Results
Alla hjärnstamsskivor som visas här förvärvades från hjärnstamsvävnad (~ 200-300 μm) och avbildades med hjälp av en 5x objektiv och differentiell interferenskontrast (DIC) optik. Kameran monterades på dissekeringsmikroskopet och kopplades till en dator med bildinhämtningsprogram (se Materialförteckning). Satellitinsats för dessa figurer (högra paneler) avbildades med ett 60x förstoringsvattensänkningsmål. Försiktighet vidtogs för att säkerställa att alla delar av hjärnstamsskivan förstorades lika samtidigt som man fick digitala bilder. Fotografier togs med optimal ljusstyrka och fokus. De digitala bilderna av hjärnstamsskivor syddes på ett plant sätt baserat på överlappande område och importerades till en stationär dator för ytterligare justeringar av ljusstyrka, kontrast och gråskala. De grundläggande mikrokretsarna i kycklingens auditiva hjärnstam identifierades enligt tidigare arbete 1,2,5,13. Under mikroskopet (5x-målet) identifierades hörselkärnor som området intill de kraftigt myeliniserade nervfibrerna som kurar runt varje kärna både ipsilateralt och kontralateralt längs skivans dorsala regioner.
Figur 1 visar de traditionella koronala delarna av hjärnstamsvävnad (200-300 μm) från ett E21-kycklingembryo. De fyra koronala skivorna som visas här representerar de relativa isofrekvensregionerna i de auditiva hjärnstamskärnorna, från den lägsta CF-hörselregionen (figur 1A, caudo-lateral) som utvecklas till den högsta CF-hörselregionen (figur 1D, rostral-medial). För alla fyra koronala skivor i figur 1A-D visas förstorade regioner av märkt NM och NL i mittkolumnen och förstoras (60x mål) på höger sikt av figurpanelen (a respektive b i satellitinsatser). Pilen i figur 1A,B visar ingången till hörselnervfibrer, och pilspetsen visar förgrening av NM-axoner till vänster om skivan. Figur 1C visar en annan aviär cochleär kärnstruktur som kallas nucleus angularis (NA, pil till vänster och pilspets till höger). De två mest rostrala koronala skivorna visar den överlägsna olivkärnan (SON) som ligger längs den ventrala laterala regionen av koronalskivan (figur 1C,D, vita streckade cirklar).
Figur 2 visar sagittala sektioner av hjärnstamsvävnad (200-300 μm) från ett E21-kycklingembryo. För alla tre sagittala skivor (figur 2A-C) visas förstorade regioner av märkta NM och NL i mittkolumnen och förstoras (60x mål) på höger sikt av figurpanelen (a respektive b i satellitbilder). NM och NL identifierades där hörselnervfibrerna (figur 2A, mittpil) kom in i klustret av neuroner som observerades vid högre förstoring (figur 2A, mellersta, små, vita streckade cirklar och pilspetsar) och markerar utgångspunkten för hörselområdet (figur 2A, vänster, stor, vit streckad cirkel och pilspets). SON identifierades i rostro-laterala regionen av den mest laterala skivan (Figur 2A, liten, vit, streckad cirkel). Figur 2B visar utökade tonotopiska regioner som innehåller både relativt låg- och hög-CF-hörselregioner från NM och NL längs den rostral-kaudala axeln (vita konturerade regioner, se även satellitinsats ). Figur 2C visar de ipsilaterala och kontralaterala axonala tuftsna i den mest mediala skivan och slutpunkten för hörselområdet (vänster och mellersta pilar). Orienteringen av skivorna som visas här står i kontrast till den traditionella orienteringen av skivor som ses i figur 1 (dvs. korona). Detta utfördes för att visa den orientering som bäst rymmer tillvägagångssättet för en glaspipett som krävs för elektrofysiologiska inspelningar.
För att bekräfta att ett stort område av den tonotopiska axeln var representerat i figur 2B, utfördes elektrofysiologiska inspelningar med strömklämma från NM-neuroner. Figur 3 visar funktionella likheter och skillnader mellan mogna (E21) NM-neuroner inspelade från en koronalskiva (figur 3A,B) och en sagittal skiva (figur 3C,D, kompletterande video S1, S2). Två NM-neuroner valdes från de mediala och laterala ändarna av en koronalskiva (liknande den skiva som visas i figur 1B), och två NM-neuroner valdes från de rostrala och kaudala ändarna av NM i en sagittal skiva (som i skivan som visas i figur 2B). Figur 3A,B visar liknande elektrofysiologiska responsegenskaper som somatiska ströminjektioner (−100 pA till +200 pA, +10 pA steg, 100 ms varaktighet). Avfyrningsmönstret för dessa två NM-neuroner uppvisar subtila skillnader i detta skivplan, vilket indikerar relativ iso-frekvens lamina för mellanfrekventa NM-neuroner. Figur 3C,D visar att avfyrningsmönstren har väsentliga skillnader över den rostral-kaudala axeln, vilket indikerar en relativt högre tonotopisk gradient från en lågfrekvent NM-neuron (figur 3C) till en högfrekvent NM-neuron (figur 3D). Båda neuronerna presenterade sina stereotypa skjutmönster som tidigare rapporterats14,15.
Figur 4 visar horisontella sektioner av hjärnstamsvävnad (200-300 μm) av ett E21-kycklingembryo. För båda horisontella segmenten (figur 4A,B) visas förstorade regioner med etiketterna NM och NL i mittkolumnen och förstoras (60x målet) på figurpanelens högra sikt (a respektive b i satellitinfällningar). I de horisontella skivorna identifierades NM och NL mot mittlinjen och neuroner spreds längs den lateral-mediala axeln (figur 4A, B, mitten, vita, streckade konturregioner). De förstorade bilderna visar den stora omfattningen av den tonotopiska gradienten. Lågfrekventa neuroner finns i caudo-laterala regioner och högfrekventa neuroner finns i de rostral-mediala områdena (Figur 4A,B, höger, satelliter). Fibrerna som löper genom mittlinjen längs den rostral-kaudala axeln visar de kontralaterala anslutningarna hos hörselkärnorna, men organisationen av dessa fibrer är inte i ett enkelt plan. Emellertid kan akuta vinkelskivor från en horisontell / tvärgående sektion följa dessa axonala fibrer mot sagittalplanet. Skivor av 200–300 μM tjock hjärnstamsvävnad i spetsig vinkel (45°) från ett horisontellt plan visas i figur 5. Auditiva hjärnstamskärnor kan ses över en stor diagonal spridning som börjar från den mest laterala skivan och slutar vid den mest mediala skivan (figur 5A-C, märkta mittpaneler, vitt skisserat område). Dessutom kan vinkelorienteringen för NM- och NL-regioner också visualiseras i på varandra följande asymmetriska skivor (figur 5A-C, märkta mittpaneler, vitt, streckat konturerat område). Förstorade bilder (60x mål) visar den tonotopiska axeln för hörselkärnorna när den går längs den rostral-mediala till caudo-laterala axeln (figur 5A-C, höger, satellitinsats). Segmentens orientering i figur 5 liknar den i figur 2. De kontrasterar den traditionella presentationen av bilder men är mer lämpade för elektrofysiologiska experiment.
Figur 1: Representativa koronala seriella delar av hjärnstammen. (A-D) Vänster: skivor från kaudal till rostral axel, hörselkärnorna och anslutande fibrer markerade med en vit streckad cirkel. Den mellersta insatsen är en större bild av hörselområdet, där kärnor visas inom vita streckade cirklar a: NM och b: NL. Pilar visar hörselnerv afferenta fibrer, och pilspetsen visar NM axon bifurcation i A,B. Pilen visar NA i C. Lateral vit streckad cirkel visar SON i C,D. Höger: satellitinsats visar dessa kärnor vid 60x mål: a: NM och b: NL. Förkortningar: NM = kärna magnocellularis; NL = kärna laminaris; NA = kärnans vinkel; SON = överlägsen olivkärna; LF = relativt lågfrekventa neuroner; MF = medelfrekventa neuroner; HF = högfrekventa neuroner; D = dorsal; L = lateral; V = ventral. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa sagittala seriella delar av hjärnstammen. (A-C) Vänster: skivor från lateral till medial axel med hörselkärnorna märkta i en vit streckad cirkel. Den mellersta insatsen visar samma hörselkärnregion i större vy, markerad inom vita streckade cirklar. (A) Vit streckad cirkel i mitten av skivan markerar SON; pil som visar hörselnervfibrer och pilspets som visar NA. En mörk svart fläck på höger sida av segmentet är en avbildningsartefakt. Regioner i cerebellum kan ses dorsal till hörselområdet i båda skivorna A och B i vänster panel. (B) En sagittal skiva vars orientering ändrades till koronalplanet (under skivning). Hörselområdet identifierades med blått färgämne (svart pil) och skivades igen i sagittalplanet. (AC) Mellersta infoga NM- och NL-regionen markerad under streckade vita linjer. Höger: satellitvy visar a: NM och b: NL observerad i 60x objektiv förstoring. LF och HF tonotopisk gradient i hörselkärnor visas längs rostro-caudal axel. Pilar som pekar på det mörka området i (C) visar kraftigt myeliniserade NM-fibrer som löper över mittlinjen genom den mediala axeln. Fibrerna förbinder vardera sidan av hörselkärnorna. Förkortningar: NM = kärna magnocellularis; NL = kärna laminaris; NA = kärnans vinkel; SON = överlägsen olivkärna; LF = relativt lågfrekventa neuroner; HF = högfrekventa neuroner; D = dorsal; V = ventral; R = rostral; C = kaudal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Elektrofysiologiska registreringar av neuronalt svar på somatiska ströminjektioner (−100 pA till +200 pA, +10 pA steg, 100 ms varaktighet) i aktuellt klämläge. Neuroner valdes ut för inspelningar i samma skiva men vid extrema motsatta regioner av NM. (A,B) Representativa neuronala svar i en enda koronal skiva som indikerar relativa isofrekvensegenskaper med subtila skillnader. Responsegenskaper representerar två olika MF-neuroner registrerade från de mest mediala (A) och laterala (B) regionerna av NM i en koronal skiva. (C,D) Representativa neuronala inspelningar från en enda sagittal skiva. Inspelningarna visar ett relativt LF NM-svar (C) och ett HF NM-svar (D), vilket belyser de väsentliga skillnaderna i tonotopisk gradient längs med en enda sagittal sektion. Förkortningar: NM = kärna magnocellularis; LF = relativt lågfrekventa neuroner; MF = mellanfrekventa neuroner; HF = högfrekventa neuroner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa horisontella seriella delar av hjärnstammen. (A,B) Vänster: skivor längs dorsal till ventral axel, hörselkärnor är markerade med vita streckade cirklar. De 8: e kranialnervafferenta fibrerna förbinder hörselkärnor markerade med pil. Den mellersta insatsen är en större bild av hörselkärnans region med hörselkärnor markerade under vita streckade linjer NM- och NL-regioner visas. En tydlig topologisk rörelse av hörselkärnor kan ses i A,B. (A,B) Höger: stor satellitvy som visar a: NM och b: NL. Höger insats visar hörselkärnor observerade i 60x objektiv förstoring och den krökta topologiska axeln från LF till HF längs en caudo-lateral till rostral-medial axel. Förkortningar: NM = kärna magnocellularis; NL = kärna laminaris; LF = relativt lågfrekventa neuroner; HF = högfrekventa neuroner; L = lateral; R = rostral; C = kaudal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa horisontella/tvärgående akuta vinkelsektioner (45°). (A-C) Vänster: seriella delar av hjärnstammen, hörselkärnor markerade i vit streckad cirkel. Den mellersta insatsen är en större bild av hörselområdet. (A) Mellersta insatsen visar den största spridningen av NM- och NL-neuroner i dessa skivor. (B,C) Mittinsats: hörselkärnor markerade i vita streckade linjer visar gradvis topologisk förändring jämfört med (A-C). Höger: satellitinsats som visar hörselkärnor a: NM och b: NL i 60x objektiv förstoring. Den tonotopiska axeln från LF till HF-regioner i NM och NL roterar vinkelvis från laterala till mediala skivor. Förkortningar: NM = kärna magnocellularis; NL = kärna laminaris; LF = relativt lågfrekventa neuroner; HF = högfrekventa neuroner; V = ventral; R = rostral; D = dorsal; C = kaudal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video S1: Hyperpolariserande och depolariserande somatiska ströminjektioner. Responsegenskaper från en lågfrekvent och högfrekvent neuron till 100 ms somatiska ströminjektioner i strömklämläge. Neuroner valdes från samma sagittala hjärnstamsskiva. Injektioner sträcker sig från -100 till +200 pA i steg om +10 pA steg, 100 ms tidslängd. Åtgärdspotentialer ses som svar på tillräckliga depolariserande nuvarande steg. Videon motsvarar de slutliga spåren som visas i figur 3C. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S2: Hyperpolariserande och depolariserande somatiska ströminjektioner. I likhet med kompletterande video S1 visar den här videon svarsegenskaper från en lågfrekvent och högfrekvent neuron till 100 ms somatiska ströminjektioner i strömklämläge. Neuroner valdes från samma sagittala hjärnstamsskiva. Injektioner sträcker sig från -100 till +200 pA i steg om +10 pA steg, 100 ms tidslängd. Åtgärdspotentialer ses som svar på tillräckliga depolariserande nuvarande steg. Videon motsvarar de slutliga spåren som visas i figur 3D. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Koronala sektioner av kycklingembryonal hjärnstamsvävnad har möjliggjort studier av relativ individuell iso-frekvens lamina i årtionden 1,2,5. Den tonotopiska (dvs frekvens) organisationen av kycklingens auditiva hjärnstam är emellertid topologiskt invecklad och kan vara mer tillgänglig i andra anatomiska axlar beroende på den specifika forskningsfrågan. Även om det är tillräckligt för att undersöka anatomiska och fysiologiska frågor som rör enskilda isofrekvensregioner, är studien av tonotopiska variationer och dess utveckling över större auditiva hjärnstamsområden något begränsad av koronala sektioner. För att övervinna denna begränsning beskriver detta protokoll tillvägagångssätt i sagittala, horisontella och horisontella / tvärgående plan för att ge ytterligare exempel på auditiv hjärnstamsvävnad som uppvisar maximala tonotopiska egenskaper och gradienter i en enskild hjärnstamsektion.
Sagittala sektioner av auditiva hjärnstamsregioner visar att olika tonotopiska områden är fördelade över en större region inom skivan jämfört med koronala sektioner (sagittal hörselarea = ~ 300-600 μm, koronal hörselarea = ~ 200-350 μm). Till exempel visualiserades NM- och NL-regioner över ett större område längs den rostro-kaudala axeln i sagittala sektioner (t.ex. figur 2B), och den funktionella tonotopiska gradienten som löper längs denna anatomiska axel fanns till stor del i en enda sagittal skiva. Detta bekräftades ytterligare med strömkläminspelningar av inneboende neuronala skillnader som varierar längs den rostral-kaudala gradienten som tidigare rapporterats14,15 (t.ex . figur 3C,D). Framtida experiment som belyser anatomiska och immunohistokemiska egenskaper längs den tonotopiska axeln kan ytterligare undersöka kända gradienter av hörselegenskaper inom ett enda sagittalt skivplan. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, MAP2-färgning och kaliumkanaluttrycksmönster, som är kända gradienter av dendritisk arkitektur och inneboende egenskaper hos NM och NL som tidigare har visats i på varandra följande koronala avsnitt16.
Horisontella sektioner av auditiva hjärnstamsregioner visar att NM och NL ligger mot mittlinjen. En del av de auditiva axonala fibrerna löper diagonalt eller vinkelrätt mot horisontalplanet (figur 4). Dessa fibrer kan följas genom att göra en akut vinkelskiva 45° till sagittalplanet. De resulterande horisontella / tvärgående skivorna var större än sagittala eller horisontella skivor, och långa axonala fibrer gick genom den rostro-kaudala axeln för både ipsilaterala och kontralaterala sidor. Både NM och NL kan visualiseras i ett större diagonalt område (~ 400-700 μm) så att kontralaterala anslutningar kan visualiseras längs en lateral-medial axel. Dessutom visar det horisontella/tvärgående segmentplanet också hur hörselområdena och den resulterande tonotopiska gradienten gör en vinkelsväng (figur 5). Vinkelexponering av kontralaterala anslutningar i ett större område gör dessa skivor mer lämpade för elektrofysiologisk stimulering och mikrokretsstudier än traditionella koronalskivor.
Ytterligare fördelar
Bildandet av auditiva mikrokretsar kräver spatiotemporal samordning av ledtrådar som främjar neuronal överlevnad, synaptogenes, axonal differentiering, dendritisk arkitektur och mognad. Således kan en alternativ hjärnstamsektion av kycklingembryots auditiva mikrokrets användas för följande forskningsämnen: morfologisk organisation av neuroner i topografiskt olika dimensioner; organisera och kartlägga connectomes av alla auditiva och vestibulära kärnor; Identifiering och karakterisering av kretsbeståndsdelarnas aktivitetsmönster i ISO-frekvens- och tonotopiska plan. den topografiska organisationen av excitatoriska kontra hämmande mikrokretsar och relationer till specialiserade neuronpopulationer (kärnor); rumslig placering av hörselkärnor neuroner och dess prediktiva CF17; systematisk inriktning av specifika tonotopiska neuronala typer; spåra stamceller och deras utveckling till konserverade kärnor; genetisk härstamning av celler till utvecklingen av neuronala kretsar18; jämförande hjärnstamsanatomi mellan arter; undersökning av vestibulära kretsar som Deiters vestibulära komplex (DC)19; och synkronisering och korsprat mellan vestibulära kärnor.
Ett mångfacetterat tillvägagångssätt med olika skivplan kan hjälpa till att svara på grundläggande frågor om okända anatomiska och biofysiska egenskaper hos hjärnstamsmikrokretsar. Ett bra exempel är förhållandet mellan stora hörselkärnor (NM, NA, NL och SON) och de vestibulära kärnorna, inklusive dorsalkärnan i lateral lemniscus (LLDp), semilunarkärnan (SLu)20 och den tangentiella kärnan (TN)3. Detta protokoll och dessa skivbaserade studier har dock vissa begränsningar.
Försiktighetsåtgärder och begränsningar
Beroende på vilken institution som utför experimenten kan etiska riktlinjer och hanteringen av kycklingembryon skilja sig åt. Medan National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals tillåter snabb halshuggning, finns det alternativa metoder för dödshjälp av kycklingembryon21. Tidigt utvecklande kycklingembryo hjärnstamsvävnad är mjuk och känslig jämfört med äldre embryon. Den har flera anslutningar och blodkärl på ytan som behöver extra försiktighet när du tar bort dem. Vävnad bör förvaras i iskall dACSF och perfuseras med 95% O2/5%CO2 för att öka livskraften.
Sagittal skivningsmetoden är endast användbar för ipsilateral tonotopi. Denna skivningsmetod ger större skivor än koronaskivor, vars hantering kan vara osäker. Man kan dock trimma skivorna med hjälp av korsnålsmetoder som beskrivs i detalj någon annanstans22. Att använda 4% LMP agarosblock inbäddad hjärnstam kan spara känsliga strukturer i skivor, men man måste vara försiktig så att man inte häller alltför varm agaros. Att ställa in det snabbt genom att placera den agarosblockerade hjärnstammen i en kyld miljö i ~ 1 min gör skivorna mer livskraftiga för elektrofysiologiska inspelningar.
Applicering av superlim i överskott kan vara giftigt. Det måste appliceras minimalt, och överskottsmängder bör tvättas omedelbart genom att byta ut dACSF. För akuta vinkelskivor (45 °) är skärning av vinkeln på agarosblocket avgörande; Man kan använda en spegel för att se den främre vinkeln medan man skär Agaros-blocket med ett skarpt blad. Kommersiellt tillgängliga blad kan ha en vaxbeläggning som ska torkas av med alkohol och torkas före användning. Optimering krävs för vibratomskärningshastigheten och frekvensen eftersom axonala fibertufts är hårdare än kortikal eller matrisvävnad. Att hålla en hög amplitud och använda kyld dissektionslösning kan förhindra vävnadsskador.
Alla lösningar ska beredas färska och Ca 2+ och Mg2+ ska tillsättas ACSF efter bubblande 95%O 2/5%CO2. Annars kan det bli nederbörd på Ca2+. En pensel ska användas för att hantera skivorna försiktigt i vibratomet. Håll den totala skivtiden under 15 min om möjligt. En pasteurpipett i glas kan användas för att manövrera hjärnstamskivor.
Använd inte tvättmedel eller frätande tvättmedel för glas och utrustning som kommer i kontakt med skivorna som används i elektrofysiologi. Bilderna som tagits representerar utseendet på 200-300 μM tjock vävnad under differentiell interferenskontrast (DIC) optik. Den visuella kvaliteten kommer att vara sämre än immunhistokemi eller elektronmikroskopi, men den återspeglar exakt vad en experimenter kommer att se när man utför elektrofysiologiska inspelningar.
Studier som hänför sig till den tidiga utvecklingen av mikrokretsar längs en alternativ anatomisk axel, oavsett om de är dorsal-ventrala, rostral-kaudala eller ipsilaterala-kontralaterala, är begränsade i kycklingens auditiva hjärnstam. En anledning till detta är att transkriptionella koders roll och reglering av tonotopisk utveckling i hjärnstammen fortfarande inte är helt förstådd. Funktionella fenomen som top-down-modulering och spontan aktivitet går ofta förlorade när man observerar aktivitet in vitro. In vivo-forskning kompletteras dock med specifika och direkta enskilda neuroninspelningar endast möjliga under dessa skivförhållanden. Förfining av att erhålla hjärnstamsvävnad längs olika orienteringar kan ge insiktsfull information om utvecklingen och komplexiteten hos tonotopiska gradienter i kycklingens auditiva hjärnstamsmikrokretsar.
Disclosures
Alla författare förklarar att forskningen genomfördes utan kommersiellt eller ekonomiskt intresse och att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH/NIDCD R01 DC017167-bidraget. Vi tackar Kristine McLellan för att hon gav redaktionella kommentarer till en tidigare version av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
| Anti-vibration table 30"x 36" - OTMC - 63533 | TMC | ||
| Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
| Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
| Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
| DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
| Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
| Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
| Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
| Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
| pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
| pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
| Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
| Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
| Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
| Chemicals- list | |||
| Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
| CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
| Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
| Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
| Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
| KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
| NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
| NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |
References
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., et al. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).
- Shao, M., et al. Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period. Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).
- Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).
- Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).
- Sanchez, J. T., Lu, Y. Glutamate signaling in the auditory brainstem. Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. 64 (4), Springer. New York, NY. 75-108 (2017).
- Parks, T. N. Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study. Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Köppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).
- Fukui, I., et al. Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).
- Wang, X., et al. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- Hong, H., Sanchez, J. T. Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system. Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).
- Hong, H., et al. Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).
- Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis. eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).
- Tabor, K. M., et al. Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).
- Lipovsek, M., Wingate, R. J. Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei. Elife. 7, 40232 (2018).
- Passetto, M. F., et al. Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain. Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).
- Curry, R. J., Lu, Y. Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons. Brain Research. 1752, 147258 (2021).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).
