Summary
Nous présentons ici un protocole pour obtenir des tranches du tronc cérébral auditif non coronal de l’embryon de poulet pour l’étude des propriétés tonotopiques et des trajectoires de développement dans une tranche du tronc cérébral. Ces tranches comprennent des sections sagittales, horizontales et horizontales / transversales englobant des régions tonotopiques plus grandes dans un plan de tranche individuel que les sections coronales traditionnelles.
Abstract
L’embryon de poulet est un modèle animal largement accepté pour étudier le tronc cérébral auditif, composé de microcircuits hautement spécialisés et d’une topologie neuronale orientée différemment le long d’un axe tonotopique (c’est-à-dire de fréquence). L’axe tonotopique permet le codage séparé des sons à haute fréquence dans le plan rostral-médian et le codage basse fréquence dans les régions caudo-latérales. Traditionnellement, les tranches de tissu embryonnaire du tronc cérébral coronal permettent l’étude de la lame iso-fréquence individuelle relative. Bien que suffisante pour étudier les questions anatomiques et physiologiques relatives aux régions iso-fréquences individuelles, l’étude de la variation tonotopique et de son développement dans de plus grandes zones du tronc cérébral auditif est quelque peu limitée. Ce protocole rend compte des techniques de tranchage du tronc cérébral à partir d’embryons de poulet qui englobent de plus grands gradients de régions de fréquence dans le tronc cérébral auditif inférieur. L’utilisation de différentes méthodes de tranchage pour le tissu auditif du tronc cérébral du poulet permet des expériences électrophysiologiques et anatomiques dans une tranche du tronc cérébral, où de plus grands gradients de propriétés tonotopiques et de trajectoires développementales sont mieux préservés que les sections coronales. De multiples techniques de tranchage permettent d’étudier mieux les diverses propriétés anatomiques, biophysiques et tonotopiques des microcircuits auditifs du tronc cérébral.
Introduction
L’embryon de poulet est un modèle de recherche précieux pour étudier des questions biologiques fondamentales dans de nombreux domaines scientifiques, notamment la biologie cellulaire, l’immunologie, la pathologie et la neurobiologie du développement. Le microcircuit du tronc cérébral auditif du poulet est un excellent exemple de circuit hautement spécialisé qui peut être compris en termes de morphologie auditive et de physiologie. Par exemple, Rubel et Parks (1975) ont d’abord décrit l’orientation tonotopique (c.-à-d. le gradient de fréquence) du noyau de poulet magnocellularis (NM) et du noyau laminaire (NL) comme une fonction linéaire à travers l’axe des noyaux, orientée ~30° par rapport au plan sagittal. Les neurones individuels de NM et NL codent leur meilleure fréquence sonore - connue sous le nom de fréquence caractéristique (CF) - le long du plan rostral-médial jusqu’à la région caudo-latérale. Les neurones sensibles aux hautes fréquences se trouvent dans la région rostrale-médiale et les neurones sensibles aux basses fréquences sont situés caudo-latéralement. En tant que telles, les méthodes traditionnelles de dissection du tissu auditif du tronc cérébral pour étudier les propriétés tonotopiques ont utilisé des tranches coronales successives. En effet, des microcircuits auditifs d’embryons de poulet en développement ont été établis comme système modèle pour étudier le traitement du signal des fonctions auditives tonotopiques à travers des tranches successives du tronc cérébral du plan coronal caudal à rostral depuis des décennies 1,2,3,4,5,6.
Cependant, l’organisation tonotopique de NM et NL est topologiquement et morphologiquement alambiquée. Les entrées du nerf auditif sont distribuées de telle sorte que les entrées élevées de fibrose kystique se terminent par des structures ressemblant à des ampoules terminales qui couvrent au moins un quart de la circonférence somatique d’une cellule NM adendritique. Inversement, les faibles entrées de mucoviscidose ne sont pas organisées avec des bornes terminales en forme de bulbe d’extrémité, mais avec de multiples synapses boutons sur les dendrites des neurones NM. Les entrées CF moyennes se terminentpar des synapses 4,7,8,9,10,11,12 en forme d’ampoule terminale et de bouton. À Terre-Neuve-et-Labrador, le gradient dendritique hautement stéréotypé est évident non seulement dans la longueur dendritique, mais aussi dans la largeur dendritique. Ce gradient dendritique unique est étroitement conforme à l’axe tonotopique. Les dendrites subissent une longueur 11 fois plus longue et cinq fois plus grande en largeur des neurones à faible CF, respectivement6. Pour surmonter ces distributions alambiquées de ces noyaux dans les tranches coronales, ce protocole décrit les approches de dissection dans les plans sagittal, horizontal et horizontal/transversal. Ces techniques de tranchage fournissent des exemples de tissu auditif du tronc cérébral qui présente des propriétés tonotopiques maximales dans un plan de tranche individuel.
Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Northwestern et ont été effectuées conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles de dissection et de préparation du tissu du tronc cérébral sont conformes aux protocoles précédents 5,13.
1. Manipulation des œufs
- Achetez des œufs fécondés (Gallus gallus domesticus) auprès d’un fournisseur local d’animaux approuvé par l’IACUC.
- Conservez les œufs immédiatement à leur arrivée au réfrigérateur à 14 °C et incuber dans les 5 jours.
NOTE: La viabilité de l’embryon diminue considérablement après 1 semaine. - Stériliser les œufs avec de l’éthanol à 70% avant l’incubation à 38 ± 1 °C et ~50% d’humidité.
2. Composition et préparation du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
- Mélanger les produits chimiques suivants dans 1 L de 18,2 MΩcmdH2Opour créer une solution mère 10x ACSF : NaCl (chlorure de sodium) 130 mM, NaHCO3 (bicarbonate de sodium) 26 mM, KCl (chlorure de potassium) 2,5 mM, NaH2PO4 (dihydrogénophosphate de sodium) 1,25 mM, dextrose (D-(+)-glucose) 10 mM. Conservez la solution mère au réfrigérateur.
- Préparer les solutions de MgCl 2 (chlorure de magnésium) 1 M et CaCl2(chlorure de calcium) 1 M séparément dans 18,2 MΩcm dH2Oet conserver au réfrigérateur.
- Immédiatement avant utilisation, diluer 10x ACSF à 1x et buller en continu avec 95% O 2/5% CO 2 pendant 15-20 min et ajouter MgCl 2 et CaCl 2. Pour préparer ACSF et dACSF (dissection ACSF), ajuster à une concentration finale de Mg 2+ 1 mM, Ca 2+ 3 mM et Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM, respectivement.
- Réglez la vitesse de bulle pour l’ACSF de sorte que le pH soit de 7,2 à 7,4 avec une osmolalité comprise entre 300 et 310 mOsm/L.
REMARQUE: Avoir l’ACSF placé dans un bain de glace pendant le barbotage est bénéfique pour maintenir une température de solution basse, ce qui favorisera l’intégrité structurelle des tissus lors de la dissection.
3. Préparation du bloc d’agarose (5%)
- Mélanger 5 g d’agarose dans 100 mL de dACSF. Utilisez un bain-marie ou un four à micro-ondes à 100 °C pendant 2-3 minutes, en remuant toutes les 30 s pour éviter les grumeaux jusqu’à ce que l’agarose se dissout complètement et commence à bouillonner.
- Verser l’agarose fondue dans une boîte de Petri vide jusqu’à 5 mm d’épaisseur et conserver à température ambiante pour priser. Après prise, sceller la boîte de Petri à l’aide d’un parafilm et conserver à 4 °C.
- Coupez l’agarose en blocs cubiques avec une lame tranchante et utilisez-les au moment de la dissection.
4. Protocole de dissection et isolement du tronc cérébral auditif
- Nettoyez la zone de dissection en vaporisant une solution d’alcool éthylique à 70 %.
- Collez le bloc d’agarose de support ou angulaire sur le plateau de vibratome.
- Choisissez des œufs de l’âge désiré (E20 et E21 dans le présent protocole). Manipulez et incuber les œufs en suivant les protocoles énumérés ci-dessus comme à l’étape 1.
- Localisez l’espace rempli d’air en plaçant l’œuf sous une lumière vive (mirage) et en cherchant cet espace du côté le plus grand ou le plus rond de l’œuf.
- Acclimatez les œufs à la température ambiante, fissurez la coquille sur l’espace rempli d’air et exposez le sac membranaire.
- Faites une incision douce dans le sac pour exposer le bec.
- Avec un scalpel, retirez doucement le cou et la tête de l’œuf.
- Décapitant rapidement la tête à l’aide de ciseaux tranchants.
- Après la décapitation, nettoyez la tête avec du dACSF glacé pour éliminer l’excès de sang du coussinet de dissection.
- Maintenez la tête stable dans un dACSF glacé et faites une incision rostro-caudale. Commencez l’incision derrière et entre les yeux et suivez la longueur du cou récolté.
REMARQUE: Les embryons plus jeunes peuvent nécessiter moins de pression lors de l’incision. - Séparez la peau pour exposer le crâne.
- Coupez le crâne derrière l’œil dans une ligne médiane à la direction latérale. Faites-le pour les deux hémisphères.
REMARQUE: Cette étape aide à séparer la partie rostrale du crâne du cerveau attaché tout en gardant le tissu cérébral intact5. - Trancher la partie rostrale du crâne. Placez la lame derrière les yeux et faites une coupe rapide.
REMARQUE: Un effort peut être nécessaire pour couper proprement le crâne attaché. - Plongez la tête dans un plat de dACSF froid.
- À l’aide d’une petite paire de ciseaux, faites des incisions médianes à latérales dans la région caudale du crâne pour essayer de séparer le cerveau du crâne sans causer de dommages tissulaires.
- Exposez doucement le tronc cérébral et le cervelet. Rétractez la zone dorsale de tout le crâne, retirez soigneusement le tronc cérébral et exposez-le à l’aide d’un pinceau fin avec une luge douce. Utilisez des pinces incurvées pour nettoyer le tronc cérébral des tissus et des vaisseaux sanguins qui se connectent. Portez une attention particulière à la 8e zone du nerf crânien et assurez-vous de laisser une courte longueur de fibres nerveuses intactes des deux côtés.
- Séparez le tronc cérébral du cervelet en coupant les pédoncules et en enlevant soigneusement les vaisseaux sanguins. Coupez le tronc cérébral des vaisseaux sanguins supplémentaires.
REMARQUE: Assurez-vous que toute la procédure est effectuée dans du dACSF réfrigéré à la glace et continuellement barboté avec du carboxygène (95% O 2/5% CO2).
5. Trancheage de vibratomes
REMARQUE: Dans les étapes suivantes, l’arrière du tissu doit être soutenu par un morceau cubique d’agarose.
- Placez la lame du vibratome le long de l’axe horizontal et collez le tronc cérébral sur un plateau de tranchage. Collez le côté rostral, en gardant l’axe rostral-caudale vertical pour les tranches coronales.
- Gardez l’axe latéral-médian vertical pour les tranches sagittales.
- Collez la face ventrale en gardant l’axe dorso-ventral vertical pour les tranches horizontales.
- Pour obtenir le plan sagittal-horizontal angulaire aigu, collez la face ventrale du tronc cérébral, en maintenant l’axe ventral-dorsal vertical sur la surface hypoténuse du bloc d’agarose, qui est coupée à un angle de 45°. Collez la surface opposée du bloc d’agarose face au plateau de tranchage et maintenez l’axe rostral-caudale parallèle au bord de la lame.
6. Manipulation de morceaux fragiles ou volumineux de tissu du tronc cérébral
- Dans une approche alternative à l’étape 5, immerger le tronc cérébral isolé dans une agarose de 4 % à bas point de fusion (LMP) à ~40 °C dans une boîte de Pétri de 35 mm x 10 mm.
- Après avoir versé de l’agarose sur le tronc cérébral immergé, placez la boîte de Petri sur de la glace pour solidifier. Coupez le bloc d’agarose cubique avec le tronc cérébral intégré à l’aide d’une lame de rasoir tranchante.
- Collez le bloc d’agarose LMP sur son côté rostral, en gardant l’axe rostral-caudale du tronc cérébral vertical.
- Prenez des tranches coronales jusqu’à ce que la région NM puisse être visualisée.
- Retirez le bloc d’agarose de la colle avec une lame tranchante. Pour repérer les noyaux, placez doucement 0,5 μL de colorant (bleu de toluidine ou orange G) sur le NM à l’aide d’une aiguille fine.
- Remontez ce bloc sur le plateau de tranchage pour les tranches sagittales ou horizontales et identifiez les noyaux par rapport à la région colorée.
- Pour des performances optimales, réglez la vitesse de tranchage du vibratome à 4 - 5 (~30 ± 4 mm / min), la fréquence de vibration à 85-87 Hz et l’amplitude de tranchage à 4-6 (~1 ± 0,2 mm).
- Après la section du tronc cérébral, placer les tranches de 200 à 300 μm recueillies séquentiellement dans une chambre à tranches disponible dans le commerce pour équilibrer pendant 1 h à température ambiante dans l’ACSF, en bulles continues avec un mélange de 95 % d’O 2/5 % de CO 2 (pH 7,2-7,4, osmolarité 300-310 mOsm/L). Dans ces conditions, les tranches restent viables jusqu’à 5-6 h.
7. Électrophysiologie : procédure de pince patch
- Transférer une tranche du tronc cérébral dans la chambre d’enregistrement avec perfusion continue d’ACSF carboxygéné ~ 1,5 ± 0,5 mL/min.
- Tirez des pipettes patch avec un extracteur de micropipettes d’un diamètre de pointe de 1-2 μm et d’une résistance comprise entre 3 et 6 MΩ.
- Remplissez les pipettes avec une solution interne à base de K-gluconate (pour l’enregistrement par pince de courant).
- Pour tester les propriétés neuronales dans les différentes régions tonotopiques d’une tranche, localisez les neurones à chaque extrémité du plan de tranche et approchez-vous avec l’électrode d’enregistrement.
- Maintenez une pression d’air positive à l’extrémité de la pipette tout en vous approchant d’un neurone.
- Déplacez-vous vers le soma jusqu’à ce qu’une indentation soit visualisée sur le neurone. Effectuez rapidement les deux étapes suivantes.
- Faites une étanchéité gigaohm (1 GΩ) en libérant une pression d’air positive.
- Maintenez le réglage de l’amplificateur en mode de pince de tension et corrigez le décalage de la pipette en fonction de zéro pA. Exécutez un test d’étanchéité (impulsion d’essai de 10 mV à 100 Hz). Appliquez une pression d’air négative pour rompre une petite parcelle de la membrane neuronale.
- Pour tester les propriétés intrinsèques actives des neurones auditifs, appliquez des injections de courant somatique hyperpolarisantes et dépolarisantes.
REMARQUE : Des exemples de cette procédure peuvent être visualisés dans la vidéo supplémentaire S1, S2. Les détails de cette procédure sont fournis dans les légendes vidéo.
Representative Results
Toutes les tranches du tronc cérébral présentées ici ont été acquises à partir de tissu du tronc cérébral (~200-300 μm) et imagées à l’aide d’un objectif 5x et d’une optique de contraste d’interférence différentielle (DIC). La caméra a été montée sur le microscope à dissection et connectée à un ordinateur avec un logiciel d’acquisition d’images (voir Tableau des matériaux). L’encart satellite pour ces figures (panneaux de droite) a été imagé à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau à grossissement 60x. On a pris soin de s’assurer que toutes les zones de la tranche du tronc cérébral étaient également agrandies lors de l’obtention d’images numériques. Les photographies ont été prises avec une luminosité et une mise au point optimales. Les images numériques des tranches du tronc cérébral ont été assemblées de manière plane en fonction de la zone de chevauchement et importées sur un ordinateur de bureau pour des ajustements supplémentaires de la luminosité, du contraste et des niveaux de gris. Les microcircuits de base du tronc cérébral auditif du poulet ont été identifiés selon les travaux antérieurs 1,2,5,13. Au microscope (objectif 5x), les noyaux auditifs ont été identifiés comme la zone adjacente aux fibres nerveuses fortement myélinisées circulant autour de chaque noyau à la fois ipsilatéralement et conlatéralement le long des régions dorsales de la tranche.
La figure 1 montre les coupes coronales traditionnelles du tissu du tronc cérébral (200-300 μm) provenant d’un embryon de poulet E21. Les quatre coupes coronales montrées ici représentent les régions d’isofréquence relative des noyaux du tronc cérébral auditif, de la région auditive la plus basse (figure 1A, caudo-latérale) progressant vers la région auditive la plus élevée (figure 1D, rostral-médiale). Pour les quatre coupes coronales de la figure 1A à D, les régions agrandies de NM et NL marquées sont représentées dans la colonne du milieu et agrandies (objectif 60x) sur la vue droite du panneau de la figure (a et b, respectivement, dans les encarts satellites). La flèche de la figure 1A,B montre l’entrée des fibres nerveuses auditives, et la pointe de la flèche montre la bifurcation des axones NM à gauche de la tranche. La figure 1C montre une autre structure de noyau cochléaire aviaire connue sous le nom de nucleus angularis (NA, flèche à gauche et pointe de flèche à droite). Les deux tranches coronales les plus rostrales montrent le noyau olivaire supérieur (SON) situé le long de la région ventrale-latérale de la tranche coronale (Figure 1C,D, cercles pointillés blancs).
La figure 2 montre des coupes sagittales de tissu du tronc cérébral (200-300 μm) provenant d’un embryon de poulet E21. Pour les trois tranches sagittales (figure 2A-C), les régions agrandies de NM et NL marquées sont représentées dans la colonne du milieu et agrandies (objectif 60x) sur la vue droite du panneau de la figure (a et b, respectivement dans les images satellites). NM et NL ont été identifiés là où les fibres nerveuses auditives (figure 2A, flèche du milieu) sont entrées dans le groupe de neurones observés à un grossissement plus élevé (figure 2A, milieu, petits, cercles pointillés blancs et pointes de flèches) et met en évidence le point de départ de la région auditive (figure 2A, gauche, grand, cercle pointillé blanc et pointe de flèche). SON a été identifié dans la région rostro-latérale de la tranche la plus latérale (figure 2A, petit cercle blanc, pointillé). La figure 2B montre des régions tonotopiques étendues qui contiennent à la fois des régions auditives relativement faibles et élevées de CF de NM et NL le long de l’axe rostral-caudale (régions à contour blanc, voir aussi l’encart satellite). La figure 2C montre les touffes axonales ipsilatérales et controlatérales dans la tranche la plus médiale et l’extrémité de la région auditive (flèches gauche et milieu). L’orientation des tranches montrées ici contraste avec l’orientation traditionnelle des tranches comme le montre la figure 1 (c.-à-d. coronale). Cela a été effectué pour afficher l’orientation qui convient le mieux à l’approche d’une pipette en verre requise pour les enregistrements électrophysiologiques.
Pour confirmer qu’une grande région de l’axe tonotopique était représentée sur la figure 2B, des enregistrements électrophysiologiques à pince de courant ont été effectués à partir de neurones NM. La figure 3 montre les similitudes fonctionnelles et les différences des neurones NM matures (E21) enregistrés à partir d’une tranche coronale (Figure 3A,B) et d’une tranche sagittale (Figure 3C,D, Vidéo supplémentaire S1, S2). Deux neurones NM ont été sélectionnés à partir des extrémités médiale et latérale d’une tranche coronale (similaire à la tranche illustrée à la figure 1B), et deux neurones NM ont été sélectionnés à partir des extrémités rostrale et caudale de la NM dans une tranche sagittale (comme dans la tranche illustrée à la figure 2B). La figure 3A,B montre des propriétés de réponse électrophysiologique similaires aux injections de courant somatique (-100 pA à +200 pA, incréments de +10 pA, durée de 100 ms). Le schéma de déclenchement de ces deux neurones NM présente des différences subtiles dans ce plan de tranche, indiquant une lame d’isofréquence relative pour les neurones NM de fréquence moyenne. Les figures 3C,D montrent que les schémas de tir présentent des différences substantielles sur l’axe rostral-caudal, indiquant un gradient tonotopique relativement plus élevé d’un neurone NM basse fréquence (Figure 3C) à un neurone NM haute fréquence (Figure 3D). Les deux neurones présentaient leurs schémas de déclenchement stéréotypés comme indiqué précédemment14,15.
La figure 4 montre des coupes horizontales de tissu du tronc cérébral (200-300 μm) d’un embryon de poulet E21. Pour les deux coupes horizontales (figure 4A, B), les régions agrandies de NM et NL marquées sont représentées dans la colonne du milieu et agrandies (objectif 60x) sur la vue droite du panneau de la figure (a et b, respectivement, dans les encarts satellites). Dans les tranches horizontales, NM et NL ont été identifiés vers la ligne médiane et les neurones ont été répartis le long de l’axe latéral-médian (Figure 4A, B, régions médianes, blanches, en pointillés). Les images agrandies montrent la grande étendue du gradient tonotopique. Les neurones à basse fréquence se trouvent dans les régions caudo-latérales et les neurones à haute fréquence dans les zones rostrales-médiales (Figure 4A, B, à droite, satellites). Les fibres qui traversent la ligne médiane le long de l’axe rostral-caudale montrent les connexions controlatérales des noyaux auditifs, mais l’organisation de ces fibres n’est pas dans un plan simple. Cependant, des tranches angulaires aiguës d’une section horizontale / transversale peuvent suivre ces fibres axonales vers le plan sagittal. Des tranches de tissu du tronc cérébral de 200 à 300 μM d’épaisseur à un angle aigu (45°) par rapport à un plan horizontal sont montrées à la figure 5. Les noyaux auditifs du tronc cérébral peuvent être vus sur une grande diagonale allant de la tranche la plus latérale à la tranche la plus médiale (Figure 5A-C, panneaux du milieu étiquetés, zone à contour blanc). De plus, l’orientation angulaire des régions NM et NL peut également être visualisée en tranches asymétriques successives (Figure 5A-C, panneaux centraux étiquetés, zone blanche et soulignée en pointillés). Les images agrandies (objectif 60x) montrent l’axe tonotopique des noyaux auditifs alors qu’il se déplace le long de l’axe rostral-médial à caudo-latéral (Figure 5A-C, à droite, encart satellite). L’orientation des tranches de la figure 5 est similaire à celle de la figure 2. Ils contrastent avec la présentation traditionnelle des images mais sont plus adaptés aux expériences électrophysiologiques.
Figure 1 : Coupes coronales sérielles représentatives du tronc cérébral. (A-D) À gauche : tranches de l’axe caudal-rostral, noyaux auditifs et fibres de connexion marquées d’un cercle pointillé blanc. L’insert du milieu est une vue plus grande de la région auditive, où les noyaux sont représentés dans des cercles pointillés blancs a: NM et b: NL. Les flèches montrent les fibres afférentes du nerf auditif, et la pointe de flèche montre la bifurcation de l’axone NM en A, B. La flèche indique NA en C. Le cercle pointillé blanc latéral montre SON en C, D. A droite : l’encart satellite montre ces noyaux à 60x objectif : a : NM et b : NL. Abréviations : NM = nucleus magnocellularis; NL = noyau laminaire; NA = noyau angularis; SON = noyau olivaire supérieur; LF = neurones relativement basse fréquence; MF = neurones à moyenne fréquence; HF = neurones à haute fréquence; D = dorsale; L = latéral; V = ventral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Coupes sérielles sagittales représentatives du tronc cérébral. (A-C) À gauche : tranches de l’axe latéral à l’axe médian avec les noyaux auditifs marqués dans un cercle pointillé blanc. L’insert du milieu montre la même région des noyaux auditifs dans une vue plus grande, marquée par des cercles pointillés blancs. (A) Un cercle pointillé blanc au centre de la tranche met en évidence le SON; flèche montrant les fibres nerveuses auditives et pointe de flèche montrant NA. Une tache noire foncée à l’extrémité droite de la tranche est un artefact d’imagerie. Les régions du cervelet peuvent être vues dorsales à la région auditive dans les deux tranches A et B dans le panneau gauche. (B) Une tranche sagittale dont l’orientation a été modifiée vers le plan coronal (pendant le tranchage). La région auditive a été identifiée avec un colorant bleu (flèche noire) et à nouveau tranchée dans le plan sagittal. (A-C) Insérer au milieu les régions NM et NL marquées sous des lignes blanches en pointillés. À droite : la vue satellite montre a: NM et b: NL observés en grossissement objectif 60x. Le gradient tonotopique LF et HF dans les noyaux auditifs est représenté le long de l’axe rostro-caudal. Les flèches pointant vers la zone sombre en (C) montrent des fibres NM fortement myélinisées traversant la ligne médiane à travers l’axe médial. Les fibres relient chaque côté des noyaux auditifs. Abréviations : NM = nucleus magnocellularis; NL = noyau laminaire; NA = noyau angularis; SON = noyau olivaire supérieur; LF = neurones relativement basse fréquence; HF = neurones à haute fréquence; D = dorsale; V = ventral; R = rostral; C = caudale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Enregistrements électrophysiologiques de la réponse neuronale aux injections de courant somatique (-100 pA à +200 pA, incréments de +10 pA, durée de 100 ms) en mode de pince de courant. Les neurones ont été sélectionnés pour les enregistrements dans la même tranche mais dans des régions extrêmement opposées de NM. (A,B) Des réponses neuronales représentatives dans une seule tranche coronale indiquant des propriétés d’isofréquence relatives avec des différences subtiles. Les propriétés de réponse représentent deux neurones MF différents enregistrés dans les régions les plus médiales (A) et latérales (B) de la MN dans une tranche coronale. (C, D) Enregistrements neuronaux représentatifs d’une seule tranche sagittale. Les enregistrements montrent une réponse relativement LF NM (C) et une réponse HF NM (D), soulignant les différences substantielles dans le gradient tonotopique le long d’une seule section sagittale. Abréviations : NM = nucleus magnocellularis; LF = neurones relativement basse fréquence; MF = neurones de moyenne fréquence; HF = neurones à haute fréquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coupes sérielles horizontales représentatives du tronc cérébral. (A,B) A gauche : des tranches le long de l’axe dorsal à ventral, les noyaux auditifs sont marqués de cercles pointillés blancs. Les fibres afférentes du 8ème nerf crânien relient les noyaux auditifs marqués d’une flèche. L’insert du milieu est une vue plus grande de la région des noyaux auditifs avec des noyaux auditifs marqués sous des lignes pointillées blanches Les régions NM et NL sont représentées. Un mouvement topologique clair des noyaux auditifs peut être vu dans A,B. (A,B) À droite : grande vue satellite montrant a: NM et b: NL. L’insert de droite montre les noyaux auditifs observés dans un grossissement objectif 60x et l’axe topologique courbe de LF à HF le long d’un axe caudo-latéral à rostral-médial. Abréviations : NM = nucleus magnocellularis; NL = noyau laminaire; LF = neurones relativement basse fréquence; HF = neurones à haute fréquence; L = latéral; R = rostral; C = caudale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Coupes angulaires aiguës (45°) représentatives horizontales/transversales. (A-C) À gauche : coupes en série du tronc cérébral, noyaux auditifs marqués en pointillés blancs. L’insert du milieu est une vue plus grande de la région auditive. (A) L’encart du milieu montre la plus grande propagation de neurones NM et NL dans ces tranches. (B,C) Insertion centrale : les noyaux auditifs marqués en pointillés blancs montrent un changement topologique progressif par rapport à (A-C). A droite : insert satellite montrant les noyaux auditifs a : NM et b : NL en grossissement objectif 60x. L’axe tonotopique des régions LF à HF dans NM et NL tourne angulairement des tranches latérales aux tranches médiales. Abréviations : NM = nucleus magnocellularis; NL = noyau laminaire; LF = neurones relativement basse fréquence; HF = neurones à haute fréquence; V = ventral; R = rostral; D = dorsale; C = caudale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire S1 : Injections de courant somatique hyperpolarisantes et dépolarisantes. Propriétés de réponse d’un neurone basse fréquence et haute fréquence à des injections de courant somatique de 100 ms en mode de serrage actuel. Les neurones ont été sélectionnés à partir de la même tranche sagittale du tronc cérébral. Les injections vont de -100 à +200 pA par paliers de +10 pA, durée de 100 ms. Les potentiels d’action sont observés en réponse à des étapes actuelles de dépolarisation suffisantes. La vidéo correspond aux traces finales montrées à la figure 3C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire S2 : Injections de courant somatique hyperpolarisantes et dépolarisantes. Semblable à la vidéo supplémentaire S1, cette vidéo montre les propriétés de réponse d’un neurone basse fréquence et haute fréquence à des injections de courant somatique de 100 ms en mode de serrage actuel. Les neurones ont été sélectionnés à partir de la même tranche sagittale du tronc cérébral. Les injections vont de -100 à +200 pA par paliers de +10 pA, durée de 100 ms. Les potentiels d’action sont observés en réponse à des étapes actuelles de dépolarisation suffisantes. La vidéo correspond aux traces finales montrées à la figure 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Les coupes coronales de tissu embryonnaire du tronc cérébral du poulet ont permis l’étude de la lame iso-fréquence individuelle relative pendant des décennies 1,2,5. Cependant, l’organisation tonotopique (c.-à-d. la fréquence) du tronc cérébral auditif du poulet est topologiquement alambiquée et peut être plus accessible dans d’autres axes anatomiques selon la question de recherche spécifique. Bien que suffisante pour étudier les questions anatomiques et physiologiques relatives aux régions iso-fréquences individuelles, l’étude des variations tonotopiques et leur développement dans de plus grandes zones auditives du tronc cérébral sont quelque peu limitées par les coupes coronales. Pour surmonter cette limitation, ce protocole décrit des approches dans les plans sagittal, horizontal et horizontal/transversal afin de fournir des exemples supplémentaires de tissu auditif du tronc cérébral qui présente des propriétés tonotopiques et des gradients maximaux dans une section individuelle du tronc cérébral.
Les coupes sagittales des régions du tronc cérébral auditif montrent que différentes zones tonotopiques sont réparties dans une région plus grande dans la tranche par rapport aux sections coronales (zone auditive sagittale = ~300-600 μm, zone auditive coronale = ~200-350 μm). Par exemple, les régions NM et NL ont été visualisées sur une plus grande surface le long de l’axe rostro-caudal en coupes sagittales (p. ex. figure 2B), et le gradient tonotopique fonctionnel qui longe cet axe anatomique était en grande partie contenu dans une seule tranche sagittale. Cela a été confirmé par des enregistrements de pince de courant des différences neuronales intrinsèques qui varient le long du gradient rostral-caudal, comme indiqué précédemment14,15 (par exemple , Figure 3C, D). Des expériences futures mettant en évidence des propriétés anatomiques et immunohistochimiques le long de l’axe tonotopique pourraient étudier davantage les gradients connus des propriétés auditives dans un seul plan de tranche sagittale. Ceux-ci incluent, sans toutefois s’y limiter, la coloration MAP2 et les modèles d’expression des canaux potassiques, qui sont des gradients connus de l’architecture dendritique et des propriétés intrinsèques de NM et NL qui ont déjà été montrés dans les sections coronales successives16.
Des coupes horizontales de régions du tronc cérébral auditif montrent que le NM et le NL sont situés vers la ligne médiane. Une partie des fibres axonales auditives est diagonale ou perpendiculaire au plan horizontal (Figure 4). Ces fibres peuvent être suivies en faisant une tranche angulaire aiguë de 45° au plan sagittal. Les tranches horizontales/transversales résultantes étaient plus grandes que les tranches sagittales ou horizontales, et de longues fibres axonales traversaient l’axe rostro-caudal pour les côtés ipsilatéral et controlatéral. NM et NL peuvent être visualisés dans une plus grande région diagonale (~400-700 μm) de sorte que les connexions controlatérales peuvent être visualisées le long d’un axe latéral-médial. De plus, le plan de tranche horizontal/transversal montre également comment les régions auditives et le gradient tonotopique qui en résulte effectuent un virage angulaire (Figure 5). L’exposition angulaire des connexions controlatérales dans une plus grande surface rend ces tranches plus appropriées pour la stimulation électrophysiologique et les études de microcircuits que les tranches coronales traditionnelles.
Avantages supplémentaires
La formation de microcircuits auditifs nécessite une coordination spatio-temporelle des indices qui favorisent la survie neuronale, la synaptogenèse, la différenciation axonale, l’architecture dendritique et la maturation. Ainsi, une section alternative du tronc cérébral du microcircuit auditif de l’embryon de poulet peut être utilisée pour les sujets de recherche suivants: organisation morphologique des neurones dans des dimensions topographiquement différentes; organiser et cartographier les connectomes de tous les noyaux auditifs et vestibulaires; identification et caractérisation des profils d’activité des constituants du circuit dans les plans iso-fréquence et tonotopique; l’organisation topographique des microcircuits excitateurs par rapport aux microcircuits inhibiteurs et les relations avec les populations de neurones spécialisés (noyaux); localisation spatiale des neurones des noyaux auditifs et de sa prédiction de la fibrose kystique17; ciblage systématique de types neuronaux tonotopiques spécifiques; suivi des cellules progénitrices et de leur développement en noyaux conservés; lignée génétique des cellules à l’évolution des circuits neuronaux18 ; anatomie comparative du tronc cérébral entre les espèces; étude de circuits vestibulaires comme le complexe vestibulaire (DC) de Deiter19 ; et la synchronie et la diaphonie entre les noyaux vestibulaires.
Une approche multidimensionnelle utilisant différents plans de tranche peut aider à répondre à des questions fondamentales sur les propriétés anatomiques et biophysiques inconnues des microcircuits du tronc cérébral. Un bon exemple est la relation entre les noyaux auditifs majeurs (NM, NA, NL et SON) et les noyaux vestibulaires, y compris le noyau dorsal du lemniscus latéral (LLDp), le noyau semi-lunaire (SLu)20 et le noyau tangentiel (TN)3. Cependant, ce protocole et ces études basées sur des tranches ont certaines limites.
Précautions et limites
Selon l’institution effectuant les expériences, les directives éthiques et la manipulation des embryons de poulet peuvent différer. Alors que les National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals autorisent une décapitation rapide, il existe d’autres méthodes pour l’euthanasie des embryons de poulet21. Le tissu du tronc cérébral embryonnaire de poulet en développement précoce est mou et délicat par rapport aux embryons plus âgés. Il a plusieurs connexions et vaisseaux sanguins à la surface qui nécessitent une prudence supplémentaire lors de leur retrait. Les tissus doivent être conservés dans du dACSF glacé et perfusés avec 95% O 2/5% CO2 pour augmenter la viabilité.
La méthode de tranchage sagittal n’est utile que pour la tonotopie ipsilatérale. Cette méthode de tranchage fournit des tranches plus grosses que les tranches coronales, dont la manipulation pourrait être précaire. Cependant, on peut couper les tranches en utilisant des méthodes à aiguilles croisées décrites en détail ailleurs22. L’utilisation de blocs d’agarose à 4% LMP peut sauver des structures délicates en tranches, mais il faut veiller à ne pas verser d’agarose trop chaude. Le réglage rapide en plaçant le tronc cérébral bloqué par l’agarose dans un environnement réfrigéré pendant ~ 1 min rend les tranches plus viables pour les enregistrements électrophysiologiques.
L’application de superglue en quantités excessives peut être toxique. Il doit être appliqué le moins possible, et les quantités excédentaires doivent être lavées immédiatement en changeant le dACSF. Pour les tranches angulaires aiguës (45°), il est essentiel de couper l’angle du bloc d’agarose; On peut utiliser un miroir pour voir l’angle avant tout en coupant le bloc d’agarose avec une lame tranchante. Les lames disponibles dans le commerce peuvent avoir un revêtement de cire qui doit être essuyé avec de l’alcool et séché avant utilisation. Une optimisation est nécessaire pour la vitesse et la fréquence de coupe du vibratome, car les touffes de fibres axonales sont plus dures que les tissus corticaux ou matriciels. Le maintien d’une amplitude élevée et l’utilisation d’une solution de dissection réfrigérée peuvent prévenir les lésions tissulaires.
Toutes les solutions doivent être préparées fraîches et le Ca 2+ et le Mg2+ doivent être ajoutés à l’ACSF après avoir fait bouillonner 95% O 2/5% CO2. Sinon, il peut y avoir des précipitations de Ca2+. Un pinceau doit être utilisé pour manipuler doucement les tranches dans le vibratome. Gardez le temps total de tranchage inférieur à 15 minutes si possible. Une pipette Pasteur en verre peut être utilisée pour manœuvrer des tranches de tronc cérébral.
N’utilisez pas de détergent ou d’agents de lavage corrosifs pour la verrerie et l’équipement qui entrent en contact avec les tranches utilisées en électrophysiologie. Les images prises représentent l’apparition de tissus de 200 à 300 μM d’épaisseur sous optique de contraste interférentiel différentiel (CIVD). La qualité visuelle sera inférieure à celle de l’immunohistochimie ou de la microscopie électronique, mais elle reflète avec précision ce qu’un expérimentateur verra lors de la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques.
Les études relatives au développement précoce de microcircuits le long d’un axe anatomique alternatif, qu’ils soient dorso-ventral, rostral-caudal ou ipsilatéral-conlatéral, sont limitées dans le tronc cérébral auditif du poulet. L’une des raisons en est que le rôle des codes transcriptionnels et de la régulation du développement tonotopique dans le tronc cérébral n’est pas encore entièrement compris. Des phénomènes fonctionnels tels que la modulation descendante et l’activité spontanée sont souvent perdus lors de l’observation de l’activité in vitro. Cependant, la recherche in vivo est complétée par des enregistrements spécifiques et directs d’un seul neurone qui ne sont possibles que dans ces conditions de tranche. Le raffinement de l’obtention de tissu du tronc cérébral le long de différentes orientations pourrait fournir des informations perspicaces sur le développement et la complexité des gradients tonotopiques dans les microcircuits auditifs du tronc cérébral du poulet.
Disclosures
Tous les auteurs déclarent que la recherche a été menée sans aucun intérêt commercial ou financier et qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par la subvention NIH / NIDCD R01 DC017167. Nous remercions Kristine McLellan d’avoir fourni des commentaires éditoriaux sur une version antérieure du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
| Anti-vibration table 30"x 36" - OTMC - 63533 | TMC | ||
| Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
| Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
| Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
| DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
| Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
| Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
| Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
| Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
| pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
| pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
| Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
| Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
| Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
| Chemicals- list | |||
| Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
| CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
| Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
| Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
| Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
| KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
| NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
| NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |
References
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