Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل عالي الإنتاجية للتبريد غير الكيميائي الضوئي في المحاصيل باستخدام قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل لسعة النبض

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63485
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,2
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

يقدم البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية لقياس استرخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي عن طريق قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل بسعة النبض. يتم تطبيق هذه الطريقة على الجلايسين ماكس المزروع في الحقل ويمكن تكييفه مع الأنواع الأخرى للكشف عن التنوع الوراثي أو مجموعات التكاثر.

Abstract

لا يتم تحسين التمثيل الضوئي في أصناف المحاصيل الحديثة ، وبالتالي يوفر فرصة للتحسين. لقد أثبت تسريع استرخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQ) أنه استراتيجية فعالة لزيادة أداء التمثيل الضوئي. ومع ذلك ، فإن القدرة على التكاثر من أجل تحسين NPQ والفهم الكامل للأساس الجيني لتخفيف NPQ غير موجودة بسبب القيود المفروضة على أخذ العينات الزائدة وجمع البيانات من نباتات المحاصيل المزروعة في الحقول. بناء على التقارير السابقة ، نقدم مقايسة عالية الإنتاجية لتحليل معدلات استرخاء NPQ في Glycine max (فول الصويا) باستخدام قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل لسعة النبض (PAM). يتم أخذ عينات من أقراص الأوراق من فول الصويا المزروع في الحقل قبل نقله إلى المختبر حيث يتم قياس استرخاء NPQ في مقياس فلورومتر PAM مغلق. يتم حساب معلمات استرخاء NPQ عن طريق تركيب دالة ثنائية الأس لقيم NPQ المقاسة بعد الانتقال من الإضاءة العالية إلى الإضاءة المنخفضة. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن اختبار مئات الأنماط الجينية في غضون يوم واحد. هذا الإجراء لديه القدرة على فحص لوحات الطفرات والتنوع بحثا عن التباين في استرخاء NPQ ، وبالتالي يمكن تطبيقه على كل من أسئلة البحث الأساسية والتطبيقية.

Introduction

يتكون التمثيل الضوئي من امتصاص الضوء ، ونقل الإلكترون الأولي ، وتثبيت الطاقة ، وتوليف ونقل منتجات التمثيل الضوئي1. يعد فهم كل خطوة أمرا حيويا لتوجيه الجهود الرامية إلى زيادة كفاءة التمثيل الضوئي للمحاصيل. يؤثر الضوء على معدل التمثيل الضوئي ، مما يتطلب موازنة إمدادات الطاقة ، في شكل فوتونات ، مع الطلب على تقليل المعادلات. عندما يتجاوز العرض الطلب ، على سبيل المثال تحت الضوء العالي أو أثناء انخفاض تثبيت CO2 الناجم عن إغلاق الفم ، فإن تراكم الطاقة المخفضة يزيد من احتمال تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية مع إمكانية إتلاف جهاز التمثيل الضوئي وإضعاف نقل الإلكترون. لذلك ، لمنع الضرر ، طورت النباتات العديد من آليات الحماية الضوئية ، بما في ذلك إزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية والتبريد غير الكيميائي الضوئي لحالات الكلوروفيل المثارة (NPQ)2.

الحفاظ على معدلات عالية من التمثيل الضوئي أمر صعب في ظل بيئة ميدانية. التغيرات الموسمية والنهارية ، إلى جانب التقلبات البيئية مثل حركات الأوراق التي تسببها الرياح والغطاء السحابي العابر ، تسبب تحولات في كمية وشدة الضوء الذي تتلقاه النباتات لعملية التمثيل الضوئي3. يبدد NPQ الطاقة الضوئية الزائدة ويمكن أن يساعد في منع تلف الصور مع السماح بمعدلات مستدامة من التمثيل الضوئي عند الإضاءة العالية4. ومع ذلك ، فإن NPQ المطول أثناء التحولات في الإضاءة العالية إلى المنخفضة يستمر في تبديد الطاقة التي يمكن استخدامها للحد من الكربون5. ونتيجة لذلك ، فإن تسريع استرخاء NPQ يمكن أن يزيد من كفاءة التمثيل الضوئي6 ، مما يجعل استرخاء NPQ هدفا جذابا لتحسين المحاصيل.

يمكن استخدام تحليل فلورة الكلوروفيل المعدلة بسعة النبض (PAM) لحساب NPQ من المعلمات القابلة للقياس (الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2)7،8،9. تركز هذه المقالة على تحديد معدلات استرخاء NPQ في النباتات المزروعة في الحقول لغرض فحص التباين الطبيعي في البلازما الجرثومية. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام تحليل قياس فلوروفيل الكلوروفيل PAM لمجموعة واسعة من الأغراض ، وتطبيقه على الأنواع التي تتراوح من الطحالب إلى النباتات الأعلى ، ويتم مراجعته في مكان آخر 7,8,9.

في ورقة أو خلية متكيفة مع الظلام ، تكون مراكز تفاعل النظام الضوئي II (PSII) مفتوحة لاستقبال الإلكترونات ولا يوجد NPQ. يؤدي تشغيل ضوء قياس منخفض الكثافة إلى استثارة فلورة الكلوروفيل مع تجنب نقل الإلكترون عبر PSII. يتم وصف الحد الأدنى من التألق المسجل في هذه الحالة المظلمة المتكيفة بواسطة المعلمة Fo. إن تطبيق نبضة ضوئية عالية الكثافة على ورقة متكيفة مع الظلام يمكن أن يقلل بسرعة من أول تجمع مستقر لمستقبل الإلكترون من الكينونات المرتبطة بموقع الكينون أ. هذا يمنع مؤقتا قدرة نقل الإلكترون في مراكز تفاعل PSII ، والتي يقال بعد ذلك إنها مغلقة وغير قادرة على استقبال الإلكترونات من تقسيم الماء. باستخدام مدة نبض قصيرة ، لا يوجد وقت كاف لتحفيز NPQ. ويعادل تألق الكلوروفيل الناتج القيمة القصوى التي يمكن الحصول عليها في غياب NPQ أو الحد الأقصى للتألق Fm. يشار إلى الفرق بين الحد الأدنى والحد الأقصى من التألق باسم التألق المتغير ، Fv. يتم حساب الحد الأقصى للعائد الكمومي الكيميائي الضوئي للنظام الضوئي II (F v/Fm) من هاتين المعلمتين باستخدام المعادلة التالية:

Fv/F m = (F m-Fo)/F m

هذا يمكن أن يوفر مؤشرا مهما لوظيفة النظام الضوئي والإجهاد. يؤدي تشغيل ضوء أكتينيك (photoyntic) إلى تحفيز التبريد غير الكيميائي الضوئي ، ويسمح التطبيق اللاحق للفلاش المشبع بقياس التألق الأقصى المتكيف مع الضوء ، Fm'. من خلال مقارنة الفرق بين التألق الأقصى للضوء والظلام المتكيف مع الضوء ، يمكن حساب NPQ وفقا لمعادلة Stern-Volmer10:

NPQ = F m/Fm' - 1

في المصانع العليا ، تم وصف NPQ بأنه يتكون من خمسة مكونات متميزة على الأقل ، بما في ذلك qE و qT و qZ و qI و qH. والآليات الدقيقة التي ينطوي عليها الإطار الوطني للرصد ليست مفهومة تماما؛ ومع ذلك ، يعتبر qE المكون الرئيسي ل NPQ في معظم النباتات. وقد وجد أن العوامل الحاسمة للمشاركة الكاملة ل qE تشمل تراكم تدرج البروتون عبر غشاء الثايلاكويد ، ونشاط الوحدة الفرعية للنظام الضوئي II S11,12 ، و xanthophylls de-epoxided ، antheraxanthin ، lutein ، وعلى وجه الخصوص zeaxanthin13. يرتاح qE بشكل أسرع من أي مكون من مكونات NPQ (< 2 دقيقة)14 ، وبالتالي فإن التنشيط العكسي ل qE مهم بشكل خاص للتكيف مع شدة الضوء المتغيرة. تشمل المرحلة الثانية الأبطأ من استرخاء NPQ (~ 2-30 دقيقة) كلا من qT ، المتعلقة بانتقالات الحالة ، و qZ ، التي تنطوي على التحويل البيني للزياكسانثين إلى violaxanthin15. قد يشمل الاسترخاء البطيء (> 30 دقيقة) من NPQ كلا من التبريد المثبط للضوء (qI)16 والعمليات المستقلة عن الضرر الضوئي17,18 ، مثل qH ، الذي يستمر في التبريد في الهوائيات الطرفية ل PSII بوساطة بروتين ليبوكالين البلاستيد 19,20.

يزداد NPQ أثناء التعرض للضوء العالي. يمكن أن يؤدي النقل اللاحق إلى الإضاءة المنخفضة إلى خفض تنظيم NPQ. يمكن التقاط اضمحلال مراحل الاسترخاء السريعة والمتوسطة والبطيئة في معلمات الدالة ثنائية الأس 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

يعتمد الأساس النظري للدالة ثنائية الأس على افتراض الاستخدام من الدرجة الأولى للمروي الافتراضي ، بما في ذلك qE (Aq1) ، والاسترخاء المشترك ل qZ و qT (Aq2) ، مع الثوابت الزمنية المقابلة τq1 و τq2 ، و NPQ طويل الأجل ، والذي يتضمن عمليات مستقلة للضرر الضوئي (Aq3). على هذا النحو ، توفر الدالة ثنائية الأس تمثيلا أكثر واقعية للعمليات البيولوجية المتعددة المتصلة المشاركة في إخماد فلورة الكلوروفيل مقارنة بمعادلة هيل الأبسط التي تفتقر إلى الأساس النظري24.

يمكن قياس NPQ باستخدام مجموعة متنوعة من مقاييس الفلورومتر PAM المتاحة تجاريا 25,26 ، من الأجهزة المحمولة باليد البسيطة27 إلى الأنظمة المغلقة الأكثر تقدما28. ومع ذلك ، فإن الحد من العديد من هذه الأساليب هو الإنتاجية المنخفضة نسبيا ، مما يجعل فحص مجموعات كبيرة من النباتات أمرا صعبا بدون أجهزة متعددة وفريق من الباحثين. ولمعالجة هذه المسألة، طور ماكاوسلاند وآخرون إجراء يستند إلى أنسجة الأوراق المستثناة واستخدموه لتحديد الاختلافات في تألق الكلوروفيل بين صنفين من القمح29. وتكمن جاذبية هذا النهج في أن تصوير أقراص الأوراق، المأخوذة من نباتات متعددة بجهاز واحد، يمكن أن يسهل فحص مئات الأنماط الجينية في غضون يوم واحد. وهذا يجعل من الممكن تقييم التباين في استرخاء NPQ كجزء من دراسات الارتباط على نطاق الجينوم ، أو لفحص مجموعات التكاثر مع إمكانية زيادة كفاءة التمثيل الضوئي للمحاصيل والعائد في نهاية المطاف.

بناء على نتائج McAusland et al.29 ، نستخدم تحليل تألق الكلوروفيل PAM لأقراص الأوراق للفحص عالي الإنتاجية لمعدلات استرخاء NPQ في Glycine max (G.max ؛ فول الصويا). يستخدم هذا البروتوكول CF Imager25 ، والذي يمكن مقارنته بأنظمة PAM المغلقة الأخرى المتاحة تجاريا ، مثل FluorCam26 الشهير. مع غرفة مظلمة لتكييف العينات ، يمكن للمستخدمين تصوير 96 لوحة جيدة ، وأطباق بتري ، ونباتات صغيرة. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي الزيادة في الإنتاجية التي يوفرها استخدام أقراص الأوراق مقارنة بالتحليل المتسلسل للنباتات الفردية. نقدم هنا نتائج تمثيلية ، وطريقة لأخذ العينات وقياسها وتحليلها من NPQ في النباتات المزروعة في الحقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة البذور

  1. اختر موقعا حقليا ذا تربة خصبة جيدة التصريف ، ولكن ليس رملية ، وبدرجة حموضة تبلغ حوالي 6.5. حدد قطع الأراضي الصفية التي يبلغ طولها 1.2 متر مع تباعد 0.75 متر عن طريق تسجيل الأرض بمجرفة.
  2. زرع 50 بذرة / م من G.max السيرة الذاتية IA3023 على عمق 3 سم على طول كل قطعة أرض في بداية موسم النمو عندما تكون درجات حرارة التربة بين 25 إلى 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: لغرض فحص التنوع الجيني، من المتوقع أن يتم زراعة ومقارنة العديد من الأنماط الجينية المختلفة. زرع 2-5 صفوف لكل نمط وراثي مرتبة في تصميم كتلة عشوائية. يجب النظر فيما إذا كانت الظروف المناخية تناسب نمو فول الصويا ، بما في ذلك نوع التربة ودرجة الحرارة وطول اليوم.

2. جمع عينات الأوراق من الحقل

  1. عينة من النباتات في الموقع الميداني بعد 30 يوما من الإنبات.
    ملاحظة: بعد 30 يوما ستكون نباتات فول الصويا في المرحلة الخضرية. يعتمد عدد الأيام التي تلي الإنبات قبل أخذ العينات على المسألة البيولوجية التي يتم تناولها.
  2. املأ آبارا من 24 بئرا حتى 1/3ثانية بالماء المقطر. قم بتسمية الغطاء وجانب اللوحة باستخدام النسخ المتماثلة المراد أخذ عينات منها.
  3. اختر أصغر ورقة موسعة بالكامل في الجزء العلوي من النبات ليتم أخذ عينات منها. امسك الورقة ضد سدادة مطاطية.
  4. اضغط على حفار الفلين هومبولت # 2 من خلال الورقة وقم بلف لقطع القرص مع تجنب الضلع الأوسط. جمع 5 أقراص على التوالي من نفس الورقة للنسخ المتماثلة التقنية. خذ ما يقرب من 30٪ من أقراص الأوراق لكل قطعة أرض أكثر مما هو مطلوب في حالة تلف أنسجة الأوراق أثناء النقل أو من أخذ العينات.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد النسخ المتماثلة البيولوجية (قطع الأراضي أو النباتات) وعدد النسخ المتماثلة التقنية (أقراص الأوراق من نفس النبات أو قطعة الأرض) اعتمادا على التصميم التجريبي.
  5. ادفع أقراص الأوراق خارج حفار الفلين إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام قطعة قطن. تحقق من أن جميع أقراص الأوراق تطفو في الماء. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتحريك أقراص الأوراق بلطف ملتصقة بجانب البئر في وضع عائم باستخدام قطعة قطن.
  6. انتقل إلى المخطط التالي وكرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5. ادفع أقراص الأوراق خارج حفار الفلين إلى بئر منفصل في صفيحة من 24 بئرا باستخدام قطعة قطن. كرر هذه الخطوة لجمع نسخة بيولوجية ثالثة.
  7. كرر الخطوة 2.6 حتى يتم أخذ عينة كاملة من 24 بئرا. ضع غطاء وختمه بفيلم شبه شفاف ومرن. قم بتخزين الطبق بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة أو في كيس أو صندوق أو مبرد فارغ (بدون ثلج).

3. إعداد العينات للتحليل

  1. العودة إلى مساحة المختبر النظيفة بعد أخذ العينات. اضغط على غطاء اللوحة المختومة لإزاحة أقراص الأوراق العالقة بالغطاء أثناء النقل. قم بفك الفيلم وإزالة الغطاء.
  2. انقل قرص ورقة من الموضع الأول للوحة المكونة من 24 بئرا إلى صفيحة جديدة من 96 بئرا ، مع مواجهة قرص الورقة بشكل مسطح لأسفل في أسفل البئر.
  3. قطع مرشح شفاط الأنف إلى النصف. اغمس الفلتر الناتج في منتصف الطريق في الماء وربت على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. أدخل الفلتر في البئر باستخدام قرص الورقة للحفاظ على الرطوبة.
  4. خذ قرصا ورقيا ثانيا من الموضع الأول للوحة المكونة من 24 بئرا وضع وجهه لأسفل في الموضع التالي المتاح للوحة 96 بئرا. اغمس النصف المتبقي من مرشح الأنف المنتج في الخطوة 3.3 في الماء وربت على منشفة ورقية قبل إدخاله في البئر باستخدام قرص الورقة الثاني.
  5. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4 لقرص ورقة ثالث من الموضع الأول من اللوحة المكونة من 24 بئرا.
  6. انتقل إلى الموضع الثاني من اللوحة المكونة من 24 بئرا وكرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5.
  7. ضع الغطاء على اللوحة عندما تحتوي جميع الآبار على أقراص أوراق ومرشحات شفاط أنف مدخلة. قم بلصق الزاوية العلوية اليمنى للمساعدة في توجيه اللوحة في الظلام للتصوير.
  8. قم بختم الألواح بفيلم شبه شفاف ومرن ولف اللوحة بورق الألومنيوم. اكتب معرفات المؤامرة ومعرف اللوحة على رقائق الألومنيوم.
  9. ضع الألواح في صندوق مظلم أو خزانة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، للسماح باسترخاء المرحلتين الأوليين من NPQ (qE ، qT ، qZ). استخدم فترة حضانة أطول ومظلمة مدتها 1 ساعة قبل التصوير إذا كانت المراحل طويلة الأجل من NPQ ذات أهمية.
  10. قم بإعداد لوحة وهمية إضافية للتركيز أثناء التحليل. للقيام بذلك ، ضع قرصا ورقيا في كل زاوية من زوايا لوحة جديدة من 96 بئرا وواحدة في الوسط. قم بتأمين أقراص الأوراق باستخدام مرشحات الأنف كما هو الحال مع اللوحات السابقة. ختم اللوحة واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة (24 درجة مئوية) ، ~ 50 ٪ الرطوبة النسبية.

4. قياس التبريد غير الكيميائي الضوئي باستخدام جهاز تصوير فلورة الكلوروفيل

  1. قم بتشغيل جهاز التصوير وافتح برنامج التصوير. انقر فوق إعدادات > البروتوكول لفتح نافذة لإدخال الخطوات في بروتوكول PAM التجريبي. وترد المواصفات الفنية للآلة في الجدول التكميلي 3.
  2. اضبط البرنامج ليبدأ بنبضة مشبعة لقياس أقصى قدر من الكفاءة الكمومية لعملية التمثيل الضوئي المتكيفة مع الظلام عن طريق إدخال 20 ثانية في الصندوق: بعد تأخير. انقر فوق المربع تطبيق نبض وأدخل 1 في المربع: هذا العدد من المرات.
  3. اضبط نبضة PPFD على 6152 ، وطول النبض على 800 مللي ثانية ، وحدد المربع التقط صور F و Fm مع جميع النبضات. انقر فوق إدراج بعد لإضافة خطوة ثانية إلى البروتوكول.
  4. أدخل 30 ثانية في المربع: بعد تأخير. حدد الخيار تغيير actinic وأدخل 50 في المربع: Actinic PPFD ، لضبط شدة الضوء في الغرفة على 50 PPFD.
  5. انقر فوق إدراج بعد لإضافة خطوة جديدة إلى البروتوكول. أدخل 150 ثانية في المربع: بعد تأخير ، حدد تطبيق نبضة وأدخل 4 في المربع: هذا العدد من المرات ، لتطبيق نبضات القياس كل 150 ثانية ، 4x على التوالي بينما يتم الاحتفاظ بالضوء السفعي عند 50 PPFD.
  6. وترد معلومات كاملة عن البروتوكول في الجدول 1، واستخدم الخطوتين 4-2 و4-3 لتغيير شدة الضوء، والخطوتين 4-4 و4-5 للدخول في دورات النبضات المشبعة. اضبط التأخير وشدة الضوء لكل خطوة وفقا للقيم الواردة في الجدول 1. احفظ البروتوكول كملف .pcl في موقع معروف.
  7. أطفئ الضوء، وضع اللوحة الوهمية على مرحلة العينة، واضبط ارتفاع مرحلة العينة بحيث تكون أقراص الأوراق أعلى من قاعدة الأداة بمقدار 140 مم. يتم استخدام لوحة وهمية حيث سيتم وميض الضوء بشكل متكرر على اللوحة عند التركيز ؛ سيتطلب ذلك إعادة تكييف الظلام لأي عينات يتم قياسها وقد يتسبب في تلف ضوئي.
  8. انقر فوق أيقونة اتصال/قطع الاتصال بكاميرا Imager وكاميرا الأجهزة لبدء تشغيل الكاميرا. انقر فوق رمز التركيز (التألق) الذي يمثله رمز سهم على الوجهين أحمر اللون مع خطين أخضرين في القاعدة. اضبط العدسة والتعريض الضوئي لإخراج اللوحة إلى التركيز البؤري.
  9. انقر فوق أيقونة التركيز البؤري (التألق) مرة أخرى لإيقاف تشغيل الضوء الوامض. العمل في الظلام ، استبدل اللوحة الوهمية باللوحة المراد تحليلها.
  10. انقر فوق أيقونة كاميرا صورة الخريطة . اضبط تعريض الصورة عن طريق فتح الفتحة أو إغلاقها حتى يتم وضع الشريط الموجود في النافذة المنبثقة في المنطقة الخضراء.
  11. انقر فوق الزر حاول مرة أخرى بعد كل ضبط لفتحة العدسة حتى يتم ضبط التعريض الضوئي بشكل صحيح ويلتقط الجهاز صورة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد تطبيق عزل الصورة لحجب إشارات الخلفية. سيتم عرض منطقة الأوراق المركزة باللون الرمادي والخلفية باللون الأزرق.
  12. حدد المساحة/وحدات البكسل ذات الأهمية لتضمين أقراص الأوراق فقط عن طريق ضبط الرسم البياني ومستوى غاما من القائمة المنسدلة تعديل الصورة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة.
  13. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد حذف القصات العالية والمنخفضة (خريطة ملونة) لحذف المنطقة المميزة باللون الأزرق الفاتح. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد حذف الضالات (ثقيلة) لإزالة أي وحدات بكسل لا تلمس ثلاثة وحدات بكسل أخرى على الأقل.
    ملاحظة: سيتم تحليل أي مناطق على الصورة تظهر كجزر معزولة بشكل منفصل وتضمينها في إخراج البيانات النهائي. يؤدي عزل الصور وإزالة وحدات البكسل الضالة إلى بيانات نظيفة ومفهومة.
  14. انقر فوق رمز تشغيل البروتوكول لبدء تشغيل البرنامج ، وسيظهر مؤقت في أسفل الشاشة لإعلامك بالمدة المتبقية لتشغيل البروتوكول.
  15. انتظر حتى يتم الانتهاء من البروتوكول، انقر فوق ملف > حفظ باسم، واحفظ البيانات كملف .igr. أغلق النافذة بالنقر فوق الصليب الأحمر في أعلى يمين النافذة قبل البدء في تشغيل لوحة عينة أخرى.
  16. افتح ملفا جديدا للنموذج التالي عن طريق تحديد ملف > جديد وكرر الخطوات من 4.10 إلى 4.15 حتى يتم قياس كافة اللوحات.
    ملاحظة: من المستحسن قياس اللوحات في غضون فترة 4 ساعات أو أقل لتقليل التأثير المحتمل لتنظيم الساعة البيولوجية على النتائج

5. معالجة بيانات فلورة الكلوروفيل

  1. افتح ملف .igr في برنامج التصوير. تصدير البيانات بالنقر فوق ملف > تصدير إلى مجلد لإنشاء مجلد جديد مع كافة الملفات الضرورية.
  2. انسخ ملفات MATLAB الثلاثة التالية إلى المجلد الناتج: MapAndLabelDiscs.m (الملف التكميلي 1) وProcessFoFm.m (الملف التكميلي 2) وProcessNPQdata.m (الملف التكميلي 3) والملف R: create_file_to_process. R (الملف التكميلي 4).
  3. افتح MapAndLabelDiscs.m (الملف التكميلي 1) في MATLAB وقم بتشغيله. احفظ خريطة أقراص الأوراق المرقمة التي تم إنشاؤها في نافذة منبثقة كملف .png للتحقق من ترقيم قرص الورقة لاحقا.
  4. افتح الملف ProcessFoFm.m (الملف التكميلي 2) في MATLAB وقم بتشغيله لحساب قيم F o و Fm لكل قرص ورقة. قم بتشغيل ProcessNPQdata.m (الملف التكميلي 3) لحساب قيم NPQ في كل نقطة زمنية.
  5. افتح create_file_to_process الملفات. R (الملف التكميلي 4) في Rstudio وأضف التاريخ إلى الرمز على السطر 5. أضف رقم اللوحة إلى السطر 8 في create_file_to_process.R.
  6. تشغيل create_file_to_process. R لدمج قيم F v / Fm وبيانات NPQ في ملف واحد يتم تسميته بعد البيانات باللاحقة -cf-summary.csv. تحقق من ترقيم قرص الورقة في ملف ملخص cf من الخطوة 5.5 باستخدام ملف .png من الخطوة 5.3. معلومات إضافية تتعلق برقم قطعة الأرض والانضمام.
  7. افتح البرنامج النصي R CF-data-processing_2.R (الملف التكميلي 5) وقم بتغيير السطر 13 إلى مسار دليل العمل. تغيير السطر 16 في CF-data-processing_2.R إلى اسم الملف من الخطوة 5.5.
  8. تغيير السطر 48 في CF-data-processing_2.R إلى اسم ملف إخراج. قم بتشغيل البرنامج النصي CF-data-processing_2.R لإعادة تنسيق البيانات لتركيب المنحنى.
  9. افتح البرنامج النصي MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (الملف التكميلي 6) في MATLAB وقم بتغيير السطر 5 إلى اسم ملف الإخراج من الخطوة 5.8. تغيير السطر 85 في MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m إلى اسم ملف إخراج جديد. قم بتشغيل البرنامج النصي MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m لحساب معلمات استرخاء NPQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويصور الشكل 1 ألف قياسا نموذجيا ل NPQ في فول الصويا المزروع في الحقول. نمت النباتات في أوربانا ، إلينوي (خط العرض 40.084604 درجة ، خط الطول -88.227952 درجة) خلال صيف عام 2021 ، مع البذور المزروعة في 5 يونيو. 2021. تم أخذ عينات من أقراص الأوراق بعد 30 يوما من زراعة البذور ، وتم إجراء القياسات باستخدام البروتوكول المقدم (الجدول 1). وحسبت قيم F v/Fm وNPQ لكل قرص ورقة (الجدول التكميلي 4) وحسبت بارامترات استرخاء NPQ بتركيب دالة ثنائية الأس (الجدول 2). بعد وميض تشبع أولي لتحديد F v / F m ، تعرضت أقراص الأوراق للإضاءة المنخفضة (50 ميكرومول m−2s−1) وكان NPQ المقاس < 1 (الشكل 1A). عند النقل إلى الإضاءة العالية (2000 ميكرومول m−2s−1) ، زادت NPQ لتصل إلى قيمة قصوى تبلغ 4 بعد 15 دقيقة. تسببت العودة إلى الإضاءة المنخفضة في انخفاض أولي سريع في NPQ (Aq1) مع ثابت زمني قدره 1.07 دقيقة (τq1) ، تليها مرحلة استرخاء أبطأ ثانية (Aq2) مع ثابت زمني قدره 24.5 دقيقة (τq2). تم التقاط NPQ المتبقي الذي بقي في نهاية البروتوكول (~ 0.5) بواسطة الثابت (Aq3).

ويصور الشكل 1 باء مثالا على القياس الفاشل. عند النقل إلى الإضاءة العالية ، هناك زيادة طفيفة في NPQ (0.38) ، والتي لا تسترخي. يكشف الفحص الدقيق للبيانات أن قرص الورقة كان يحتوي على قيمة Fv / Fm منخفضة تشير إلى الإجهاد (0.27) ، ويجب التخلص من البيانات.

Figure 1
الشكل 1: بيانات قياس NPQ باستخدام فول الصويا المزروع في الحقل. (A) تنشيط NPQ وحركية الاسترخاء ل G.max cv. IA3023. يتم تقديم البيانات كمتوسط لخمسة مخططات بيولوجية (مخططات حقل منفصلة) وثلاثة أقراص تقنية (أقراص أوراق من نفس المخطط) تتكرر مع أشرطة خطأ تمثل الانحراف المعياري. (ب) مثال على تكرار تقني فاشل (n = 1) باستخدام G.max cv. IA3023. تشير الأشرطة الرمادية والبيضاء في الجزء العلوي من الرسم البياني إلى فترات الإضاءة مع كثافة تدفق فوتون التمثيل الضوئي (PPFD) البالغة 2000 ميكرومول m−2 s−1 (الشريط الأبيض) ، PPFD من 50 ميكرومول m−2s−1 (القضبان الرمادية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

درج تأخر فعل دورات PPFD (ميكرومول م-2 س-1)
1 0 ثانية تغيير أكتينيك - 0
2 20 ثانية تطبيق نبض 1 6152
3 30 ثانية تغيير أكتينيك - 50
4 150 ثانية تطبيق نبض 4 6152
5 30 ثانية تغيير أكتينيك - 2000
6 150 ثانية تطبيق نبض 6 6152
7 0 ثانية تغيير أكتينيك - 50
8 150 ثانية تطبيق نبض 2 6152
9 5 دقائق تطبيق نبض 9 6152
10 20 ثانية تغيير أكتينيك - 0

الجدول 1: بروتوكول التصوير الفلوري الكلوروفيل الذي سيستخدم مع جهاز التصوير.

مندوب Aq1 τq1 / دقيقة Aq2 τq2 / دقيقة Aq3 maxNPQ آر2
1 2.00 1.12 1.88 16.62 0.29 4.17 0.9999
2 2.14 1.17 1.70 13.68 0.34 4.17 0.9999
3 1.82 0.78 1.88 18.42 0.36 4.05 0.9997
4 2.05 1.28 1.67 26.89 0.15 3.87 0.9999
5 1.72 1.01 1.81 21.22 0.52 4.05 0.9998
متوسط 1.94 1.07 1.79 19.37 0.33 4.06
س. د. 0.17 0.19 0.10 5.02 0.13 0.12

الجدول 2: معلمات استرخاء NPQ المحسوبة ل G.max cv. IA3023. قيم Aq1 و Aq2 و Aq3 غير موحدة ، ويتم الإبلاغ عن قيم τq1 و τq2 في الحد الأدنى من الاختصارات: MaxNPQ = الحد الأقصى لقيمة NPQ المسجلة في الضوء ، Rep = رقم النسخ المتماثل البيولوجي المقابل لمخطط واحد ، حيث تكون الدالة ثنائية الأس مناسبة باستخدام ثلاثة نسخ متماثلة تقنية (أقراص ورقة). S.D. يمثل الانحراف المعياري.

الجدول التكميلي 1: وصف المعادلات المستخدمة في المخطوطة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: وصف قيم المعلمات التي نوقشت في المخطوطة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 3: سعة النبض المعدلة المواصفات الفنية التألق. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 4: قيم F v/Fm وNPQ المحسوبة لأقراص أوراق G.max CV. IA3023 باستخدام البروتوكول المقدم. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: برنامج نصي لتعيين مواضع قرص الورقة باستخدام مخرجات البيانات التي يوفرها المصور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: برنامج نصي لحساب قيم F o و F m و F m و Fv/F m لكل قرص ورقة باستخدام مخرجات البيانات التي يوفرها المصور والملف التكميلي 1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: برنامج نصي لحساب قيم NPQ لكل قرص ورقة في كل نقطة زمنية أثناء البروتوكول باستخدام إخراج البيانات من الملف التكميلي 2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: برنامج نصي R لإضافة تعليق توضيحي على المخرجات من الملف التكميلي 3 بقيم F v/Fm محسوبة بواسطة الملف التكميلي 2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: برنامج نصي R لإعادة تنسيق البيانات من الملف التكميلي 4 للسماح بتركيب دالة اضمحلال ثنائية الأس لقيم NPQ المحسوبة بعد الاسترخاء. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: برنامج نصي لاحتواء دالة الاضمحلال ثنائية الأس لحساب قيم NPQ وحساب معلمات الاسترخاء باستخدام إخراج البيانات من الملف التكميلي 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد الاختيار الدقيق لأقراص الأوراق والتعامل معها أمرا بالغ الأهمية للحصول على قياسات موثوقة ل NPQ. أولا ، سيؤدي تلف الأنسجة ، مثل التعامل الخشن مع الملقط ، إلى الإجهاد ، مما يؤدي إلى قيم منخفضة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الكمومية لعملية التمثيل الضوئي. عادة ما يكون للنباتات غير المجهدة قيم F v / Fm تبلغ حوالي 0.8318 ، مع انخفاضات كبيرة تشير إلى انخفاض في أداء التمثيل الضوئي9. ومع ذلك ، فإن النباتات التي تزرع في ظل ظروف ميدانية عادة ما تعاني من إجهاد خفيف ، لذلك تم تعيين عتبة F vFm > 0.75 لإدراجها وفقا للدراسات السابقة التي اختارت هذا كحد لبدايات انخفاض التمثيل الضوئي30. يمثل التعامل مع مرشحات شفاط الأنف المستخدمة لتثبيت أقراص الأوراق في مكانها مصدرا شائعا آخر للمشاكل. إذا كانت مرشحات شفاط الأنف مشبعة ، فإن الماء الزائد سيؤثر سلبا على فسيولوجيا الأوراق مما يؤدي أيضا إلى انخفاض الكفاءة الكمومية ؛ يجب استخدام نفس العلامة التجارية طوال التجربة حيث يمكن للعلامات التجارية المختلفة الاحتفاظ بكميات مختلفة من الماء. ثالثا ، تعاني النباتات المزروعة في الحقول من بيئة متقلبة ، مع اختلافات في هطول الأمطار ودرجة الحرارة والرطوبة وضغط الحشرات. تساهم مراحل نمو النباتات أيضا في كفاءة فلورة الكلوروفيل. يجب تجنب الأوراق الكلوروتيكية أو أضرار الآفات واسعة النطاق عند أخذ العينات. عند إجراء المقارنات ، يعد الاختيار المتسق للأوراق في مراحل النمو المماثلة أمرا حيويا لتقليل الضوضاء التجريبية. يمكن أن تختلف معدلات تنشيط واسترخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي باختلاف عمر الورقة والمرحلة31 من نمو النبات ، نتيجة للاختلافات في التوازن بين امتصاص الضوء ، وتطوير البلاستيدات الخضراء ، وحالة الطاقة ، والتظليل على المدى الطويل. لذلك ، فإن الخيار النموذجي هو مقارنة المعدلات من أحدث ورقة موسعة بالكامل مع البلاستيدات الخضراء الناضجة.

تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل فول الصويا المزروع في الحقل ولكن يمكن تعديله لأخذ العينات وقياس المواد المزروعة في الدفيئة أو غيرها من النباتات العليا. هناك العديد من الاعتبارات المهمة عند تكييف البروتوكول. أولا ، يجب أن يؤخذ التصميم التجريبي في الاعتبار لتقليل الضوضاء وتجنب إدخال التحيز. في هذا المجال ، تزرع الأنماط الوراثية لفول الصويا عادة في قطع من 50-100 نبات على التوالي ، وتعتبر كل قطعة أرض نسخة بيولوجية واحدة. يمكن أن تواجه كل قطعة أرض ظروفا مختلفة للتربة والتعرض والصرف الصحي والتي ستؤثر على فسيولوجيا النبات بالكامل. لذلك ، فإن اختيار تصميم مؤامرة مناسب ، مثل كتلة عشوائية ، يمكن أن يتجنب التحيز ويقلل من التباين في المجال. لتقليل التباين داخل المؤامرات ، يقترح قياس النسخ المتماثلة المتعددة (من ثلاثة إلى خمسة) وأخذ أقراص من نباتات مختلفة داخل قطعة أرض. ومع ذلك ، عند العمل مع الدفيئة أو المواد المزروعة في الغرفة ، قد يشكل نبات واحد نسخة بيولوجية مع أقراص متعددة مأخوذة من نفس الورقة. علاوة على ذلك ، يجب تدوير موضع النبات عدة مرات في الأسبوع لمنع التحيز في الظروف التي تمر بها. ثانيا ، تعكس شدة الضوء الأكتينية المستخدمة في هذا البروتوكول شدة الضوء القصوى والدنيا التي تعاني منها مظلة فول الصويا في يوم مشمس في إلينوي (W 88 ° 13 '42 ' / N 40 ° 06 '31 ʺ). اعتمادا على الإعداد التجريبي والنبات قيد التحليل ، ينصح بضبط شدة الضوء على بيئة النمو الخاصة لتوفير ظروف قياس أكثر واقعية. وأخيرا، يمكن تكييف كل من إجراء أخذ العينات وبروتوكول القياس للاستخدام مع أنظمة مقياس الفلورومتر PAM المغلقة الأخرى، مع النص على ضرورة تعديل الخطوات المطلوبة لتشغيل برنامج القياس لجهاز معين.

أحد القيود الرئيسية للنهج هو تفسير قيم المعلمات المحسوبة بواسطة الدالة ثنائية الأس. هذا مهم بشكل خاص إذا تم تطبيق الإجراء على النباتات أو الطحالب العليا الأخرى ، حيث يمكن أن تختلف العمليات البيولوجية التي تسهم في NPQ بين الأنواع. على سبيل المثال ، تحتوي بعض الطحالب والطحالب على بروتينات LHCSR بدلا من PsbS (للمراجعة انظر32). علاوة على ذلك ، يمكن أن تختلف الأهمية النسبية للعمليات البيولوجية ، حيث تمثل انتقالات الحالة أو qT ، جزءا أكثر أهمية من مكون Aq2 في الطحالب مقارنة بالنباتات الأعلى ، حيث يمكن لما يصل إلى 80٪ من مجمعات حصاد الضوء الانتقال بشكل عكسي بين الأنظمة الضوئية I و II33. لذلك ، ينبغي النظر في أن الدالة ثنائية الأس قد لا تكون دائما الخيار الأفضل لشرح العمليات البيولوجية التي تحكم حركية الاسترخاء22,29 ويجب تقييم ذلك تجريبيا للأنواع المختارة. يمكن استخدام التجريب الدقيق ، بما في ذلك تطبيق المثبطات و uncouplers 34,35 أو دراسة الطفرات 21,23 لتوفير نظرة ثاقبة للعمليات التي تسهم في استرخاء NPQ ، ولكن يجب توخي الحذر في استخلاص الاستنتاجات.

تشبه الطريقة المعروضة هنا طريقة McAusland et al.29 ، التي استخدمت جهاز تصوير PAM مغلق لتقييم أداء التمثيل الضوئي للنباتات المزروعة في الغرفة. ومع ذلك ، من خلال وضع عينات الأوراق على ورق ترشيح رطب بدلا من لوحات 96 بئرا ، واحتضان الأنسجة في غرف مصنوعة خصيصا للتحكم في تركيزات O 2 و CO2 ، تمكن McAusland et al. من إجراء مجموعة واسعة من القياسات لتقييم معلمات التمثيل الضوئي29. تشمل المزايا الرئيسية للنهج المعروض هنا بساطة الطريقة ، التي لا تتطلب معدات مخصصة ، واستخدام لوحات 24 بئرا لأخذ العينات الأولية من أنسجة الأوراق التي تمكن من جمع عينات من المواد المزروعة في الميدان ، مما قد يزيد من عدد الأنماط الجينية التي يمكن للباحث فحصها.

باختصار ، يعد تحليل تألق الكلوروفيل PAM تقنية قوية لقياس كفاءة التمثيل الضوئي. ومع ذلك، يتم إجراء القياسات التقليدية على أساس كل مصنع، مما يحد من قدرة الفحص إما بالوقت المستغرق أو عدد الأشخاص والمعدات المتاحة لإجراء الفحوصات. يوفر استخدام أقراص الأوراق في صفيحة 96 بئرا وسيلة لقياس العديد من الأنماط الجينية في وقت واحد ، مما يزيد من إنتاجية الفحص. من خلال تسهيل فحص العديد من الأنماط الجينية في فترة زمنية قصيرة من قبل باحث واحد29 ، من الممكن تطبيق قياس استرخاء NPQ على فحص التنوع الطبيعي لعملية التمثيل الضوئي مع إمكانية إجراء دراسات الارتباط على نطاق الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أفاد المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال المشروع البحثي تحقيق زيادة كفاءة التمثيل الضوئي (RIPE) الذي تموله مؤسسة بيل وميليندا غيتس ، ومؤسسة أبحاث الأغذية والزراعة ، ومكتب الخارجية والكومنولث والتنمية في المملكة المتحدة تحت رقم المنحة OPP1172157.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012929 Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012931 Country of Origin: United States of America
Aluminum foil Antylia Scientific  61018-56 Country of Origin: United States of America
Black marker pen Sharpie SAN30001 Country of Origin: United States of America
CF imager Technologica Ltd. N/A chlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm Humboldt Mfg Co H9665 Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software Technologica Ltd. N/A imaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters Amazon  B07P6XCTGV Country of Origin: United States of America
Marker stakes John Henry Company KN0151 Country of Origin: United States of America
Paper scissors VWR 82027-596 Country of Origin: United States of America
Parafilm Bemis Company Inc.  S3-594-6 Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers Fisher Scientific 14-130M Country of Origin: United States of America

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Tags

علم الأحياء ، العدد 185 ،
تحليل عالي الإنتاجية للتبريد غير الكيميائي الضوئي في المحاصيل باستخدام قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل لسعة النبض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M.,… More

Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M., Hinkle, A., Kromdijk, J., Burgess, S. J. High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry. J. Vis. Exp. (185), e63485, doi:10.3791/63485 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter