Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

पल्स आयाम मॉड्यूलेटेड क्लोरोफिल फ्लोरोमेट्री का उपयोग करके फसलों में गैर-फोटोकेमिकल शमन का उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63485
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,2
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

प्रोटोकॉल पल्स आयाम मॉड्यूलेटेड क्लोरोफिल फ्लोरोमेट्री द्वारा गैर-फोटोकेमिकल शमन की छूट को मापने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि का परिचय देता है। विधि क्षेत्र में विकसित ग्लाइसिन अधिकतम पर लागू होती है और आनुवंशिक विविधता या प्रजनन आबादी के लिए स्क्रीन करने के लिए अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित की जा सकती है।

Abstract

प्रकाश संश्लेषण आधुनिक फसल किस्मों में अनुकूलित नहीं है, और इसलिए सुधार के लिए एक अवसर प्रदान करता है। गैर-प्रकाश रासायनिक शमन (एनपीक्यू) की छूट को तेज करना प्रकाश संश्लेषक प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए एक प्रभावी रणनीति साबित हुई है। हालांकि, बेहतर एनपीक्यू के लिए प्रजनन करने की क्षमता और एनपीक्यू छूट के आनुवंशिक आधार की पूरी समझ में ओवरसैम्पलिंग की सीमाओं और क्षेत्र में उगाए गए फसल पौधों से डेटा संग्रह की कमी है। पिछली रिपोर्टों के आधार पर, हम पल्स आयाम मॉड्यूलेटेड (पीएएम) क्लोरोफिल फ्लोरोमेट्री का उपयोग करके ग्लाइसिन अधिकतम (सोयाबीन) में एनपीक्यू विश्राम दरों के विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट परख प्रस्तुत करते हैं। लीफ डिस्क को प्रयोगशाला में परिवहन से पहले क्षेत्र में उगाए गए सोयाबीन से नमूना लिया जाता है जहां एनपीक्यू विश्राम को बंद पीएएम-फ्लोरोमीटर में मापा जाता है। एनपीक्यू विश्राम मापदंडों की गणना उच्च से निम्न प्रकाश में संक्रमण के बाद मापा एनपीक्यू मानों के लिए द्वि-घातीय फ़ंक्शन को फिट करके की जाती है। इस पद्धति का उपयोग करके, एक दिन के भीतर सैकड़ों जीनोटाइप का परीक्षण करना संभव है। प्रक्रिया में एनपीक्यू विश्राम में भिन्नता के लिए उत्परिवर्ती और विविधता पैनलों को स्क्रीन करने की क्षमता है, और इसलिए मौलिक और अनुप्रयुक्त अनुसंधान प्रश्नों दोनों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

प्रकाश संश्लेषण में प्रकाश अवशोषण, प्राथमिक इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण, ऊर्जा स्थिरीकरण और प्रकाश संश्लेषक उत्पादों का संश्लेषण और परिवहन शामिलहै 1. फसल प्रकाश संश्लेषक दक्षता बढ़ाने के प्रयासों का मार्गदर्शन करने के लिए प्रत्येक चरण को समझना महत्वपूर्ण है। प्रकाश प्रकाश संश्लेषण की दर को प्रभावित करता है, फोटॉन के रूप में ऊर्जा आपूर्ति को संतुलित करने की आवश्यकता होती है, समकक्षों को कम करने की मांग के साथ। जब आपूर्ति मांग से अधिक हो जाती है, उदाहरण के लिए उच्च प्रकाश के तहत या स्टोमेटल क्लोजर के कारण कम सीओ2 निर्धारण के दौरान, कम करने की शक्ति का निर्माण प्रकाश संश्लेषक तंत्र को नुकसान पहुंचाने और इलेक्ट्रॉन परिवहन को खराब करने की क्षमता के साथ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के गठन की संभावना को बढ़ाता है। इसलिए, क्षति को रोकने के लिए, पौधों ने प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के विषहरण और उत्साहित क्लोरोफिल राज्यों (एनपीक्यू) 2 के गैर-फोटोकेमिकल शमन सहित कई फोटो-सुरक्षात्मक तंत्र विकसित किए हैं।

प्रकाश संश्लेषण की उच्च दर को बनाए रखना एक क्षेत्र के वातावरण के तहत चुनौतीपूर्ण है। मौसमी और दैनिक परिवर्तन, हवा से प्रेरित पत्ती आंदोलनों और क्षणिक बादल कवर जैसे पर्यावरणीय उतार-चढ़ाव के साथ, प्रकाश संश्लेषण के लिए पौधों द्वारा प्राप्त प्रकाश की मात्रा और तीव्रता में बदलाव का कारण बनते हैं3. एनपीक्यू अतिरिक्त प्रकाश ऊर्जा को नष्ट कर देता है और उच्च-प्रकाश 4 पर प्रकाश संश्लेषण की निरंतर दरों की अनुमति देते हुए फोटो-क्षति को रोकने में मदद कर सकताहै। हालांकि, उच्च से निम्न-प्रकाश संक्रमण के दौरान लंबे समय तक एनपीक्यू ऊर्जा को नष्ट करना जारी रखता है जिसका उपयोग कार्बन कमीके लिए किया जा सकता है 5. नतीजतन, एनपीक्यू की छूट को तेज करने से प्रकाश संश्लेषण6 की दक्षता बढ़ सकती है, जिससे एनपीक्यू विश्राम फसल सुधार के लिए एक आकर्षक लक्ष्य बन सकता है।

पल्स आयाम मॉड्यूलेटेड क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति (पीएएम) विश्लेषण का उपयोग औसत दर्जे का मापदंडों (पूरक तालिका 1 और पूरक तालिका 2)7,8,9 से एनपीक्यू की गणना करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख जर्मप्लाज्म में प्राकृतिक भिन्नता की जांच के उद्देश्य से क्षेत्र में उगाए गए पौधों में एनपीक्यू विश्राम दरों को निर्धारित करने पर केंद्रित है। हालांकि, पीएएम क्लोरोफिल फ्लोरोमेट्री विश्लेषण का उपयोग विभिन्न प्रकार के उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है, शैवाल से लेकर उच्च पौधों तक की प्रजातियों पर लागू किया जाता है, और कहीं और 7,8,9 की समीक्षा की जाती है।

एक अंधेरे अनुकूलित पत्ती या कोशिका में, फोटोसिस्टम द्वितीय (पीएसआईआई) प्रतिक्रिया केंद्र इलेक्ट्रॉनों को प्राप्त करने के लिए खुले होते हैं और कोई एनपीक्यू नहीं होता है। पीएसआईआई के माध्यम से इलेक्ट्रॉन परिवहन से परहेज करते हुए कम तीव्रता वाले प्रकाश को मापने वाले प्रकाश पर स्विच करने से क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति प्राप्त होती है। इस अंधेरे-अनुकूलित अवस्था में दर्ज न्यूनतम प्रतिदीप्ति पैरामीटर एफओ द्वारा वर्णित है। एक अंधेरे-अनुकूलित पत्ती पर एक उच्च तीव्रता वाली प्रकाश नाड़ी लागू करने से क्विनोन ए साइट से बंधे क्विनोन के पहले स्थिर इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता पूल को तेजी से कम किया जा सकता है। यह पीएसआईआई प्रतिक्रिया केंद्रों में इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण क्षमता को अस्थायी रूप से अवरुद्ध करता है, जिसे तब बंद कहा जाता है और पानी के विभाजन से इलेक्ट्रॉनों को प्राप्त करने में असमर्थ होता है। एक छोटी नाड़ी अवधि का उपयोग करके, एनपीक्यू को उत्तेजित करने के लिए अपर्याप्त समय है। परिणामी क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति एनपीक्यू, या अधिकतम प्रतिदीप्ति, एफएम की अनुपस्थिति में प्राप्य अधिकतम मूल्य के बराबर है। न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति के बीच के अंतर को चर प्रतिदीप्ति, एफवी के रूप में जाना जाता है। फोटोसिस्टम II (एफवी /एफएम) की अधिकतम फोटोकेमिकल क्वांटम उपज की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके इन दो मापदंडों से की जाती है:

एफवी/एफएम = (एफएम-एफ ओ)/एफएम

यह फोटोसिस्टम फ़ंक्शन और तनाव का एक महत्वपूर्ण संकेतक प्रदान कर सकता है। एक एक्टिनिक (प्रकाश संश्लेषक) प्रकाश को चालू करना गैर-फोटोकेमिकल शमन को उत्तेजित करता है, और संतृप्त फ्लैश के बाद के आवेदन से प्रकाश-अनुकूलित अधिकतम प्रतिदीप्ति, एफएम 'के माप की अनुमति मिलती है। अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित अधिकतम प्रतिदीप्ति के बीच अंतर की तुलना करके, एनपीक्यू की गणना स्टर्न-वोल्मर समीकरण10 के अनुसार की जा सकती है:

एनपीक्यू = एफएम/एफएम ' - 1

उच्च पौधों में, एनपीक्यू को क्यूई, क्यूटी, क्यूजेड, क्यूआई और क्यूएच सहित कम से कम पांच अलग-अलग घटकों से मिलकर वर्णित किया गया है। एनपीक्यू में शामिल सटीक तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं; हालाँकि, क्यूई को अधिकांश पौधों में एनपीक्यू का प्रमुख घटक माना जाता है। क्यूई की पूर्ण सगाई के लिए महत्वपूर्ण कारकों में थायलाकोइड झिल्ली में एक प्रोटॉन ढाल का निर्माण, फोटोसिस्टम द्वितीय सबयूनिट एस11,12 की गतिविधि, और डी-एपॉक्सीडेटेड ज़ैंथोफिल, एथेरेक्सैंथिन, ल्यूटिन और विशेष रूप से ज़ेक्सैंथिन13 शामिल हैं। क्यूई किसी भी एनपीक्यू घटक (< 2 मिनट) 14 के सबसे तेज़ आराम करता है, और क्यूई की प्रतिवर्ती सक्रियण इसलिए प्रकाश तीव्रता को स्थानांतरित करने के अनुकूलन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एनपीक्यू विश्राम (~ 2-30 मिनट) का एक दूसरा धीमा चरण क्यूटी दोनों को शामिल करता है, जो राज्य संक्रमण से संबंधित है, और क्यूजेड, जिसमें ज़ैक्सैंथिन का वायोलाक्सैंथिन15 में इंटरकनवर्जन शामिल है। एनपीक्यू के धीमी गति से आराम (30 मिनट >) में फोटोइनहिबिटरी शमन (क्यूआई) 16 और फोटोडैमेज17,18 से स्वतंत्र प्रक्रियाएं दोनों शामिल हो सकती हैं, जैसे कि क्यूएच, जो प्लास्टिड लिपोकैलिन प्रोटीन19,20 द्वारा मध्यस्थता वाले पीएसआईआई के परिधीय एंटीना में निरंतर शमन है।

उच्च प्रकाश के संपर्क में आने के दौरान एनपीक्यू बढ़ जाता है। कम रोशनी में बाद में हस्तांतरण के परिणामस्वरूप एनपीक्यू का डाउनरेगुलेशन हो सकता है। तेज, मध्यवर्ती और धीमी गति से आराम करने वाले चरणों के क्षय को द्वि-घातीय फ़ंक्शन 15,21,22,23 के मापदंडों में कैप्चर किया जा सकता है

एनपीक्यू = एक्यू 1(-टी/ω1) + एक्यू2(-टी/ω2) + एक्यू3

द्वि-घातीय फ़ंक्शन के लिए सैद्धांतिक आधार क्यूई (एक्यू 1), क्यूजेड और क्यूटी (एक्यू 2) की संयुक्त छूट सहित काल्पनिक क्वेंचर के पहले-क्रम के उपयोग की धारणा पर आधारित है, इसी समय-स्थिरांक ωq1 और ωq2, और दीर्घकालिक एनपीक्यू के साथ, जिसमें क्यूआई और फोटोडैमेज स्वतंत्र प्रक्रियाएं (एक्यू 3) शामिल हैं। इस प्रकार, द्वि-घातीय फ़ंक्शन एक सरल हिल समीकरण की तुलना में क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति को शमन में शामिल कई जुड़े जैविक प्रक्रियाओं का अधिक यथार्थवादी प्रतिनिधित्व प्रदान करता है जिसमें सैद्धांतिक आधारका अभाव है 24.

एनपीक्यू को विभिन्न प्रकार के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएएम फ्लोरोमीटर25,26 का उपयोग करके मापा जा सकता है, सरल हाथ से आयोजितउपकरणों 27 से अधिक उन्नत बंद सिस्टम28 तक। हालांकि, इनमें से कई दृष्टिकोणों की सीमा अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट है, जो कई उपकरणों और शोधकर्ताओं की एक टीम के बिना पौधों के बड़े संग्रह को चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, मैकऑसलैंड एट अल ने एक्साइज्ड पत्ती ऊतक के आधार पर एक प्रक्रिया विकसित की और इसका उपयोग दो गेहूं की खेती29 के बीच क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति में अंतर की पहचान करने के लिए किया। इस दृष्टिकोण का आकर्षण यह है कि इमेजिंग पत्ती डिस्क, एक ही उपकरण के साथ कई पौधों से ली गई, एक दिन के भीतर सैकड़ों जीनोटाइप की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान कर सकती है। यह जीनोम वाइड एसोसिएशन अध्ययनों के हिस्से के रूप में एनपीक्यू विश्राम में भिन्नता का आकलन करना संभव बनाता है, या फसल प्रकाश संश्लेषक दक्षता और अंततः उपज बढ़ाने की क्षमता के साथ प्रजनन आबादी की स्क्रीनिंग के लिए।

मैकऑसलैंड एट अल .29 के निष्कर्षों पर बिल्डिंग, हम ग्लाइसिन अधिकतम (जी.max; सोयाबीन) में एनपीक्यू विश्राम दरों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए पत्ती डिस्क के पीएएम क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति विश्लेषण का उपयोग करते हैं। यह प्रोटोकॉल सीएफ इमेजर25 का उपयोग करता है, जो अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बंद-पीएएम सिस्टम, जैसे लोकप्रिय फ्लोरकैम26 के बराबर है। नमूनों के अनुकूलन के लिए एक अंधेरे कमरे के साथ, उपयोगकर्ता 96-अच्छी तरह से प्लेटों, पेट्री व्यंजनों और छोटे पौधों की छवि बना सकते हैं। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ व्यक्तिगत पौधों के अनुक्रमिक विश्लेषण की तुलना में पत्ती डिस्क का उपयोग करके थ्रूपुट में वृद्धि है। यहां हम प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं, और क्षेत्र में उगाए गए पौधों में एनपीक्यू के नमूने, मापने और विश्लेषण के लिए एक विधि।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. बीजारोपण

  1. उपजाऊ, अच्छी तरह से सूखा, लेकिन रेतीली मिट्टी के साथ एक क्षेत्र स्थल चुनें, और लगभग 6.5 के पीएच के साथ। कुदाल के साथ जमीन को स्कोर करके 0.75 मीटर की दूरी के साथ 1.2 मीटर पंक्ति भूखंडों को चिह्नित करें।
  2. बढ़ते मौसम की शुरुआत में प्रत्येक भूखंड के साथ 3 सेमी गहराई पर जी.max सीवी आईए 3023 के 50 बीज / मीटर लगाएं जब मिट्टी का तापमान 25 से 30 डिग्री सेल्सियस के बीच होता है।
    नोट: आनुवंशिक विविधता की स्क्रीनिंग के उद्देश्य से, यह उम्मीद की जाती है कि कई अलग-अलग जीनोटाइप उगाए जाते हैं और तुलना की जाती है। एक यादृच्छिक ब्लॉक डिजाइन में व्यवस्थित जीनोटाइप प्रति 2-5 पंक्तियां लगाएं। इस बात पर विचार किया जाना चाहिए कि क्या जलवायु परिस्थितियां मिट्टी के प्रकार, तापमान और दिन की लंबाई सहित सोयाबीन के विकास के अनुरूप हैं।

2. खेत से पत्ती के नमूने एकत्र करना

  1. अंकुरण के 30 दिनों के बाद खेत साइट में पौधों का नमूना लें।
    नोट: 30 दिनों के बाद सोयाबीन के पौधे वनस्पति चरण में होंगे। नमूने लेने से पहले अंकुरण के बाद के दिनों की संख्या जैविक प्रश्न को संबोधित करने पर निर्भर करती है।
  2. आसुत जलके साथ 1 /3 तक 24-अच्छी प्लेट के कुओं को भरें। नमूना लेने के लिए प्रतिकृतियों के साथ ढक्कन और प्लेट के किनारे को लेबल करें।
  3. नमूना लेने के लिए पौधे के शीर्ष पर सबसे कम उम्र के पूरी तरह से विस्तारित पत्ते का चयन करें। एक रबर डाट के खिलाफ पत्ती पकड़ो।
  4. पत्ती के माध्यम से # 2 हम्बोल्ट कॉर्क बोरर दबाएं और मिडरिब से परहेज करते हुए डिस्क को काटने के लिए मोड़ें। तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए एक ही पत्ती से लगातार 5 डिस्क एकत्र करें। पारगमन में या नमूने से पत्ती ऊतक क्षतिग्रस्त होने की स्थिति में आवश्यकता से प्रत्येक भूखंड के लिए लगभग 30% अधिक पत्ती डिस्क लें।
    नोट: जैविक प्रतिकृतियों (भूखंडों या पौधों) की संख्या और तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या (एक ही पौधे या भूखंड से पत्ती डिस्क) प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  5. कॉर्क बोरर से पत्ती डिस्क को कपास झाड़ू का उपयोग करके 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में दबाएं। जांचें कि सभी पत्ती डिस्क पानी में तैर रहे हैं। यदि नहीं, तो धीरे-धीरे एक कपास झाड़ू के साथ एक अस्थायी स्थिति में कुएं के किनारे चिपके हुए पत्ती डिस्क को स्थानांतरित करें।
  6. अगले प्लॉट पर जाएं और चरण 2.3 से 2.5 दोहराएं। कॉर्क बोरर से पत्ती डिस्क को कपास झाड़ू का उपयोग करके 24-अच्छी तरह से प्लेट में एक अलग कुएं में दबाएं। एक तीसरा जैविक प्रतिकृति एकत्र करने के लिए इस चरण को दोहराएं।
  7. एक पूर्ण 24-अच्छी तरह से प्लेट नमूना किया गया है जब तक चरण 2.6 दोहराएँ। एक अर्ध-पारदर्शी, लचीली फिल्म के साथ एक ढक्कन और सील रखें। प्लेट को सीधे सूरज की रोशनी से, एक बैग, बॉक्स या खाली कूलर (कोई बर्फ नहीं) में स्टोर करें।

3. विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करना

  1. नमूने लेने के बाद एक साफ प्रयोगशाला स्थान पर लौटें। परिवहन के दौरान ढक्कन से चिपके पत्ती डिस्क को हटाने के लिए सील प्लेट के ढक्कन को टैप करें। फिल्म को खोलें और ढक्कन हटा दें।
  2. 24-अच्छी तरह से प्लेट की पहली स्थिति से एक पत्ती डिस्क को एक ताजा 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें, जिसमें पत्ती डिस्क कुएं के तल पर सपाट नीचे की ओर हो।
  3. नाक एस्पिरेटर फिल्टर को आधे में काटें। परिणामी फ़िल्टर को आधे रास्ते में पानी में डुबोएं और अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक पेपर तौलिया पर थपकाएं। आर्द्रता बनाए रखने के लिए पत्ती डिस्क के साथ कुएं में फिल्टर डालें।
  4. 24-अच्छी तरह से प्लेट की पहली स्थिति से दूसरी पत्ती डिस्क लें और 96-अच्छी तरह से प्लेट की अगली उपलब्ध स्थिति में चेहरा रखें। चरण 3.3 में उत्पादित नाक फिल्टर के शेष आधे हिस्से को पानी में डुबोएं और दूसरी पत्ती डिस्क के साथ कुएं में डालने से पहले एक पेपर तौलिया पर थपकाएं।
  5. 24-अच्छी तरह से प्लेट की पहली स्थिति से तीसरी पत्ती डिस्क के लिए चरण 3.3 से 3.4 दोहराएं।
  6. 24-अच्छी तरह से प्लेट की दूसरी स्थिति पर जाएं और चरण 3.3 से 3.5 दोहराएं।
  7. प्लेट पर ढक्कन रखें जब सभी कुओं में पत्ती डिस्क और नाक एस्पिरेटर फिल्टर डाले जाते हैं। इमेजिंग के लिए अंधेरे में प्लेट उन्मुख मदद करने के लिए शीर्ष दाएं कोने को टेप करें।
  8. एक अर्ध-पारदर्शी, लचीली फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें और प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। एल्यूमीनियम पन्नी पर प्लॉट आईडी और प्लेट आईडी लिखें।
  9. एनपीक्यू (क्यूई, क्यूटी, क्यूजेड) के पहले दो चरणों की छूट की अनुमति देने के लिए, कम से कम 30 मिनट के लिए एक अंधेरे बॉक्स या कैबिनेट में प्लेटें रखें। यदि एनपीक्यू के दीर्घकालिक चरण ब्याज के हैं तो इमेजिंग से पहले 1 घंटे की लंबी, अंधेरे इनक्यूबेशन अवधि का उपयोग करें।
  10. विश्लेषण के दौरान ध्यान केंद्रित करने के लिए एक अतिरिक्त डमी प्लेट तैयार करें। ऐसा करने के लिए, एक ताजा 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कोनों में एक पत्ती डिस्क रखें और केंद्र में एक। पिछली प्लेटों के साथ किए गए नाक फिल्टर के साथ सुरक्षित पत्ती डिस्क। प्लेट सील और कमरे के तापमान (24 डिग्री सेल्सियस), ~ 50% सापेक्ष आर्द्रता पर अंधेरे में सेते हैं।

4. क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति इमेजर का उपयोग करके गैर-फोटोकेमिकल शमन को मापना

  1. इमेजर चालू करें और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें। PAM प्रायोगिक प्रोटोकॉल में चरणों की प्रविष्टि के लिए कोई विंडो खोलने के लिए सेटिंग्स > प्रोटोकॉल क्लिक करें। मशीन के तकनीकी विनिर्देश पूरक तालिका 3 में प्रदान किए गए हैं।
  2. बॉक्स में 20 एस दर्ज करके अंधेरे-अनुकूलित प्रकाश संश्लेषण की अधिकतम क्वांटम दक्षता को मापने के लिए एक संतृप्त नाड़ी के साथ शुरू करने के लिए कार्यक्रम सेट करें: देरी के बाद। बॉक्स पर क्लिक करें पल्स लागू करें और बॉक्स में 1 दर्ज करें: यह संख्या।
  3. पल्स पीपीएफडी को 6152 पर सेट करें, पल्स की लंबाई 800 एमएस तक, और सभी दालों के साथ बॉक्स टेक एफ 'एंड एफएम' छवियों को चेक करें। प्रोटोकॉल में दूसरा चरण जोड़ने के लिए बाद में सम्मिलित करें क्लिक करें .
  4. बॉक्स में 30 एस दर्ज करें: देरी के बाद। एक्टिनिक बदलें विकल्प का चयन करें और बॉक्स में 50 दर्ज करें: एक्टिनिक पीपीएफडी, चैंबर में प्रकाश की तीव्रता को 50 पीपीएफडी पर सेट करने के लिए।
  5. प्रोटोकॉल में कोई नया चरण जोड़ने के लिए बाद में सम्मिलित करें क्लिक करें . बॉक्स में 150 एस दर्ज करें: देरी के बाद, पल्स लागू करें का चयन करें और बॉक्स में 4 दर्ज करें: यह संख्या, हर 150 एस, एक पंक्ति में 4x मापने वाली दालों को लागू करने के लिए, जबकि एक्टिनिक प्रकाश 50 पीपीएफडी पर आयोजित किया जाता है।
  6. प्रोटोकॉल की पूरी जानकारी तालिका 1 में प्रदान की गई है, संतृप्त दालों के चक्रों में प्रवेश करने के लिए प्रकाश तीव्रता और चरण 4.4 और 4.5 को बदलने के लिए चरण 4.2 और 4.3 का उपयोग करें। तालिका 1 में दिए गए मानों के अनुसार प्रत्येक चरण के लिए देरी और प्रकाश तीव्रता समायोजित करें। अपने प्रोटोकॉल को किसी ज्ञात स्थान पर .pcl फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  7. प्रकाश बंद करें, नमूना चरण पर डमी प्लेट रखें, और नमूना चरण ऊंचाई सेट करें ताकि पत्ती डिस्क उपकरण के आधार से 140 मिमी ऊपर हो। एक डमी प्लेट का उपयोग किया जाता है क्योंकि ध्यान केंद्रित करते समय प्रकाश को बार-बार प्लेट पर चमकाया जाएगा; इसके लिए किसी भी नमूने के फिर से अंधेरे अनुकूलन की आवश्यकता होगी और फोटोडैमेज का कारण बन सकता है।
  8. कैमरा प्रारंभ करने के लिए इमेजर कैमरा और हार्डवेयर कैमरा आइकन से कनेक्ट/डिस्कनेक्ट करें पर क्लिक करें। आधार पर दो हरी रेखाओं के साथ लाल रंग के दो तरफा तीर आइकन द्वारा दर्शाए गए फोकस (प्रतिदीप्ति) प्रतीक पर क्लिक करें। प्लेट को फोकस में लाने के लिए लेंस और एक्सपोजर को समायोजित करें।
  9. चमकती रोशनी को बंद करने के लिए फोकस (प्रतिदीप्ति) आइकन को फिर से क्लिक करें। अंधेरे में काम करते हुए, विश्लेषण की जाने वाली प्लेट के साथ डमी प्लेट को बदलें।
  10. मैप छवि कैमरा आइकन पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में बार ग्रीन ज़ोन में स्थित होने तक एपर्चर को खोलकर या बंद करके छवि एक्सपोजर समायोजित करें।
  11. एपर्चर के प्रत्येक समायोजन के बाद फिर से प्रयास करें बटन पर क्लिक करें जब तक कि एक्सपोज़र सही ढंग से समायोजित न हो जाए और इंस्ट्रूमेंट एक छवि न ले ले। छवि पर राइट-क्लिक करें और पृष्ठभूमि संकेतों को अवरुद्ध करने के लिए छवि अलगाव लागू करें का चयन करें। केंद्रित पत्ती क्षेत्र ग्रे और पृष्ठभूमि नीले रंग में प्रदर्शित किया जाएगा।
  12. छवि पर राइट-क्लिक करके संशोधित छवि पुल-डाउन मेनू से हिस्टोग्राम और गामा स्तर को समायोजित करके केवल पत्ती डिस्क को शामिल करने के लिए रुचि के क्षेत्र / पिक्सेल का चयन करें।
  13. छवि पर राइट-क्लिक करें और हल्के नीले हाइलाइट किए गए क्षेत्र को हटाने के लिए उच्च और निम्न कटौती (रंग मानचित्र) हटाएं का चयन करें। छवि पर राइट-क्लिक करें और कम से कम तीन अन्य पिक्सेल को छूने वाले किसी भी पिक्सेल को हटाने के लिए डिलीट स्ट्रेज़ (हेवी) का चयन करें।
    नोट: अलग-थलग द्वीपों के रूप में दिखाई देने वाली छवि पर किसी भी क्षेत्र का अलग से विश्लेषण किया जाएगा और अंतिम डेटा आउटपुट में शामिल किया जाएगा। छवि अलगाव और आवारा पिक्सेल को हटाने के परिणामस्वरूप स्वच्छ, समझने योग्य डेटा होता है।
  14. प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए प्रोटोकॉल चलाएँ आइकन पर क्लिक करें, स्क्रीन के निचले भाग में एक टाइमर दिखाई देगा जो आपको सूचित करेगा कि प्रोटोकॉल को चलाने के लिए कितना समय बचा है।
  15. प्रोटोकॉल समाप्त होने तक प्रतीक्षा करें, फ़ाइल > इस रूप में सहेजें क्लिक करें, और डेटा को .igr फ़ाइल के रूप में सहेजें. एक और नमूना प्लेट चलाना शुरू करने से पहले विंडो के ऊपरी दाईं ओर रेड-क्रॉस पर क्लिक करके विंडो बंद करें।
  16. फ़ाइल > नया का चयन करके अगले नमूने के लिए एक नई फ़ाइल खोलें और सभी प्लेटों को मापा गया है जब तक कि चरण 4.10 से 4.15 तक दोहराएँ।
    नोट: परिणामों पर सर्कैडियन विनियमन के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए 4 घंटे या उससे कम की अवधि के भीतर प्लेटों को मापने की सलाह दी जाती है

5. प्रसंस्करण क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति डेटा

  1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में .igr फ़ाइल खोलें। सभी आवश्यक फ़ाइलों के साथ एक नया फ़ोल्डर बनाने के लिए फ़ाइल > फ़ोल्डर में निर्यात करें क्लिक करके डेटा निर्यात करें।
  2. परिणामी फ़ोल्डर में निम्नलिखित तीन MATLAB फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ: मैपएंडलेबलडिस्क.एम (पूरक फ़ाइल 1), प्रोसेसफ़ोफिम्म (पूरक फ़ाइल 2), और प्रोसेसएनपीक्यूडेटा.एम (पूरक फ़ाइल 3), और आर फ़ाइल: create_file_to_process। आर (अनुपूरक फ़ाइल 4)।
  3. मैटलैब में मैप एंड लेबलडिस्क.एम (पूरक फ़ाइल 1) खोलें और चलाएं। पॉप-अप विंडो में उत्पन्न क्रमांकित पत्ती डिस्क के मानचित्र को बाद में पत्ती डिस्क नंबरिंग की जांच करने के लिए एक .png फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  4. मैटलैब में फ़ाइल प्रोसेसफॉफम (पूरक फ़ाइल 2) खोलें और प्रत्येक पत्ती डिस्क के लिए एफओ और एफएम मानों की गणना करने के लिए चलाएं। प्रत्येक समय बिंदु पर NPQ मानों की गणना करने के लिए प्रक्रियाNPQdata.m (अनुपूरक फ़ाइल 3) चलाएँ।
  5. फ़ाइल create_file_to_process खोलें। आर (पूरक फ़ाइल 4) Rstudio में और लाइन 5 पर कोड में तारीख जोड़ें। create_file_to_process में लाइन 8 में प्लेट नंबर जोड़ें।
  6. create_file_to_process भागो। एफएम मानों और एनपीक्यू डेटा को एक फ़ाइल में समेकित करने के लिए आर जिसका नाम प्रत्यय -सीएफ-सारांश.csv के साथ डेटा के नाम पर रखा गया है। चरण 5.3 से .png फ़ाइल का उपयोग करके चरण 5.5 से cf-सारांश फ़ाइल में पत्ती डिस्क क्रमांकन की जाँच करें। प्लॉट नंबर और परिग्रहण से संबंधित ऐड-इन जानकारी।
  7. आर स्क्रिप्ट CF-डेटा-processing_2.R (पूरक फ़ाइल 5) खोलें और पंक्ति 13 को कार्यशील निर्देशिका पथ में परिवर्तित करें। चरण 5.5 से फ़ाइल के नाम के लिए CF-डेटा-processing_2.R में पंक्ति 16 परिवर्तित करें।
  8. सीएफ-डेटा-processing_2.आर में लाइन 48 को आउटपुट फ़ाइल के नाम पर परिवर्तित करें। वक्र फिटिंग के लिए डेटा को फिर से स्वरूपित करने के लिए स्क्रिप्ट सीएफ-डेटा-processing_2.आर चलाएं।
  9. MATLAB में MatLab_NPQ_5_fit_model_v5 (अनुपूरक फ़ाइल 6) स्क्रिप्ट खोलें और चरण 5.8 से आउटपुट फ़ाइल के नाम के लिए पंक्ति 5 परिवर्तित करें। पंक्ति 85 MatLab_NPQ_5_fit_model_v5 में एक नया आउटपुट फ़ाइल नाम में परिवर्तित करें। एनपीक्यू विश्राम पैरामीटर की गणना करने के लिए स्क्रिप्ट MatLab_NPQ_5_fit_model_v5 चलाएं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 ए क्षेत्र में उगाए गए सोयाबीन में एनपीक्यू के एक विशिष्ट माप को दर्शाता है। 5 जून को लगाए गए बीजों के साथ गर्मियों 2021 के दौरान उरबाना, आईएल (अक्षांश 40.084604 °, देशांतर -88.227952 °) में पौधे उगाए गए थे। 2021. बीज बोने के 30 दिनों के बाद पत्ती डिस्क का नमूना लिया गया था, और प्रदान किए गए प्रोटोकॉल (तालिका 1) के साथ माप किए गए थे। एफ एम और एनपीक्यू मूल्यों की गणना प्रत्येक पत्ती डिस्क (पूरक तालिका 4) के लिए की गई थी और एनपीक्यू विश्राम मापदंडों की गणना द्वि-घातीय फ़ंक्शन (तालिका 2) को फिट करके की गई थी। एफ एम निर्धारित करने के लिए एक प्रारंभिक संतृप्त फ्लैश के बाद, पत्ती डिस्क को कम रोशनी (50 μmol m−2s−1) के संपर्क में लाया गया था और मापा एनपीक्यू 1 (चित्रा 1A) < गया था। उच्च प्रकाश (2000 μmol m−2 s−1) में स्थानांतरित होने पर, एनपीक्यू 15 मिनट के बाद 4 के अधिकतम मूल्य तक पहुंच गया। कम रोशनी में वापसी के कारण एनपीक्यू (एक्यू 1) में 1.07 मिनट (ωq1) के समय स्थिरांक के साथ तेजी से प्रारंभिक कमी आई, इसके बाद 24.5 मिनट (ωq2) के समय स्थिरांक के साथ दूसरा धीमा आराम चरण (ωq2) हुआ। अवशिष्ट एनपीक्यू जो प्रोटोकॉल (~ 0.5) के अंत में बना रहा, स्थिरांक (एक्यू 3) द्वारा कब्जा कर लिया गया था।

चित्रा 1 बी एक असफल माप का एक उदाहरण दर्शाता है। उच्च प्रकाश में स्थानांतरित होने पर एनपीक्यू (0.38) में न्यूनतम वृद्धि होती है, जो आराम नहीं करती है। डेटा के करीबी निरीक्षण से पता चलता है कि पत्ती डिस्क में तनाव (0.27) का संकेत देने वाला कम एफवी / एफएम मूल्य था, और डेटा को त्याग दिया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: क्षेत्र-उगाए गए सोयाबीन का उपयोग करके एनपीक्यू माप डेटा( ए) जी.max सीवी आईए 3023 के एनपीक्यू सक्रियण और विश्राम कैनेटीक्स। डेटा को मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि सलाखों के साथ पांच जैविक (अलग-अलग क्षेत्र भूखंडों) और तीन तकनीकी (एक ही भूखंड से पत्ती डिस्क) प्रतिकृतियों के माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (बी) जी का उपयोग करके एक असफल तकनीकी प्रतिकृति (एन = 1) का उदाहरण.max सीवी। ग्राफ के शीर्ष पर ग्रे और सफेद सलाखों 2000 μmol m−2 s−1 (सफेद पट्टी), 50 μmol m−2s−1 (ग्रे सलाखों) के पीपीएफडी के प्रकाश संश्लेषक फोटॉन प्रवाह घनत्व (पीपीएफडी) के साथरोशनी की अवधि का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क़दम देरी क्रिया चक्र पीपीएफडी (μmol m-2 s-1 )
1 0 एस एक्टिनिक परिवर्तित करें - 0
2 20 सेकंड पल्स लागू करें 1 6152
3 30 सेकंड एक्टिनिक परिवर्तित करें - 50
4 150 सेकंड पल्स लागू करें 4 6152
5 30 सेकंड एक्टिनिक परिवर्तित करें - 2000
6 150 सेकंड पल्स लागू करें 6 6152
7 0 एस एक्टिनिक परिवर्तित करें - 50
8 150 सेकंड पल्स लागू करें 2 6152
9 5 मिनट पल्स लागू करें 9 6152
10 20 सेकंड एक्टिनिक परिवर्तित करें - 0

तालिका 1: क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रोटोकॉल इमेजर के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए।

प्रतिनिधि एक्यू 1 ωq1 / एक्यू 2 ωq2 / एक्यू 3 अधिकतम एनपीक्यू आर2
1 2.00 1.12 1.88 16.62 0.29 4.17 0.9999
2 2.14 1.17 1.70 13.68 0.34 4.17 0.9999
3 1.82 0.78 1.88 18.42 0.36 4.05 0.9997
4 2.05 1.28 1.67 26.89 0.15 3.87 0.9999
5 1.72 1.01 1.81 21.22 0.52 4.05 0.9998
औसत 1.94 1.07 1.79 19.37 0.33 4.06
एस.डी. 0.17 0.19 0.10 5.02 0.13 0.12

तालिका 2: जी.max सीवी आईए 3023 के लिए गणना एनपीक्यू विश्राम पैरामीटर। Aq1, Aq2 और Aq3 के मान इकाईरहित हैं, ωq1 और ωq2 के मान मिनट में रिपोर्ट किए गए हैं। संक्षिप्त नाम: MaxNPQ = प्रकाश में अधिकतम रिकॉर्ड किया गया NPQ मान, रेप = एक एकल भूखंड के अनुरूप जैविक प्रतिकृति संख्या, जहां द्वि-घातीय फ़ंक्शन तीन तकनीकी प्रतिकृतियों (पत्ती डिस्क) का उपयोग करके फिट होता है। एसडी मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है।

अनुपूरक तालिका 1: पांडुलिपि में प्रयुक्त समीकरणों का वर्णन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 2: पांडुलिपि में चर्चा पैरामीटर मूल्यों का वर्णन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 3: पल्स आयाम प्रतिदीप्ति तकनीकी विनिर्देशों को संशोधित करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 4: एफ एम और जी के एनपीक्यू मूल्यों की गणना की.max सीवी आईए 3023 लीफ डिस्क प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 1: इमेजर द्वारा प्रदान किए गए डेटा आउटपुट का उपयोग करके पत्ती डिस्क पदों के मानचित्रण के लिए एक स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: इमेजर और पूरक फ़ाइल 1 द्वारा प्रदान किए गए डेटा आउटपुट का उपयोग करके प्रति पत्ती डिस्क एफ ओ, एफ एम, एफ एम ', और एफवी / एफएम मानों की गणना करने के लिए एक स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 3: अनुपूरक फ़ाइल 2 से डेटा आउटपुट का उपयोग करप्रोटोकॉल के दौरान प्रत्येक समय बिंदु पर प्रति पत्ती डिस्क एनपीक्यू मानों की गणना के लिए एक स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 4: पूरक फ़ाइल 2 द्वारा गणना किए गए एफवी/एफ एम मानों के साथ पूरक फ़ाइल 3 से आउटपुट को एनोटेट करने के लिए एक आर स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 5: विश्राम के बाद एनपीक्यू मानों की गणना करने के लिए द्वि-घातीय क्षय फ़ंक्शन को फिट करने की अनुमति देने के लिए पूरक फ़ाइल 4 से डेटा को फिर से स्वरूपित करने के लिए एक आर स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 6: एनपीक्यू मानों की गणना करने और अनुपूरक फ़ाइल 5 से डेटा आउटपुट का उपयोग करके विश्राम मापदंडों की गणना करने के लिए द्वि-घातीय क्षय फ़ंक्शन को फिट करने के लिए एक स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एनपीक्यू के विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए लीफ डिस्क की सावधानीपूर्वक पसंद और हैंडलिंग महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, ऊतक को नुकसान, जैसे चिमटी के साथ किसी न किसी हैंडलिंग, तनाव का परिचय देगा, जिसके परिणामस्वरूप प्रकाश संश्लेषण की अधिकतम क्वांटम दक्षता के लिए कम मूल्य होंगे। गैर-तनावग्रस्त पौधों में आमतौर पर लगभग 0.8318 के एफ वी / एफएम मान होते हैं, जिसमें प्रकाश संश्लेषक प्रदर्शन में कमी का संकेत देने वाली महत्वपूर्ण गिरावटहोती है 9. हालांकि, क्षेत्र की स्थितियों के तहत उगाए जाने वाले पौधे आमतौर पर हल्के तनाव का अनुभव करते हैं, इसलिए एफ वीएफ एम > 0.75 की एक सीमा पिछले अध्ययनों के अनुसार शामिल करने के लिए निर्धारित की गई थी, जिसने इसे प्रकाश संश्लेषक गिरावट30 की शुरुआत की सीमा के रूप में चुना था। उनके स्थान पर पत्ती डिस्क रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले नाक एस्पिरेटर फिल्टर की हैंडलिंग समस्याओं के एक और सामान्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करती है। यदि नाक एस्पिरेटर फिल्टर ओवरसैचुरेटेड होते हैं, तो अतिरिक्त पानी पत्ती शरीर विज्ञान को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा जिससे कम क्वांटम क्षमता भी होगी; पूरे प्रयोग में एक ही ब्रांड का उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि विभिन्न ब्रांड अलग-अलग मात्रा में पानी पकड़ सकते हैं। तीसरा, क्षेत्र में उगाए गए पौधे वर्षा, तापमान, आर्द्रता और कीट दबाव में अंतर के साथ उतार-चढ़ाव वाले वातावरण का अनुभव करते हैं। पौधों के विकास चरण भी क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति की दक्षता में योगदान करते हैं। नमूना लेते समय क्लोरोटिक पत्तियों या व्यापक कीट क्षति से बचा जाना चाहिए। तुलना करते समय, प्रयोगात्मक शोर को कम करने के लिए समान विकास चरणों में पत्तियों की लगातार पसंद महत्वपूर्ण है। प्रकाश अवशोषण, क्लोरोप्लास्ट विकास, ऊर्जा की स्थिति और दीर्घकालिक छायांकन के बीच संतुलन में अंतर के परिणामस्वरूप, गैर-फोटोकेमिकल शमन की सक्रियता और विश्राम की दर पत्ती की उम्र और पौधे के विकास चरण31 के साथ भिन्न हो सकती है। इसलिए, एक विशिष्ट विकल्प परिपक्व क्लोरोप्लास्ट के साथ सबसे हाल ही में पूरी तरह से विस्तारित पत्ती से दरों की तुलना करना है।

यह प्रोटोकॉल क्षेत्र में उगाए गए सोयाबीन के विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन ग्रीनहाउस-उगाई गई सामग्री या अन्य उच्च पौधों के नमूने और माप के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय कई विचार महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, शोर को कम करने और पूर्वाग्रह की शुरूआत से बचने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन को ध्यान में रखा जाना चाहिए। क्षेत्र में, सोयाबीन जीनोटाइप आमतौर पर एक पंक्ति में 50-100 पौधों के भूखंडों में उगाए जाते हैं, प्रत्येक भूखंड को एक एकल जैविक प्रतिकृति माना जाता है। प्रत्येक भूखंड विभिन्न मिट्टी, जोखिम और जल निकासी की स्थिति का अनुभव कर सकता है जो पूरे पौधे के शरीर विज्ञान को प्रभावित करेगा। इसलिए, एक उपयुक्त प्लॉट डिज़ाइन का चयन करना, जैसे कि यादृच्छिक ब्लॉक, पूर्वाग्रह से बच सकता है और इन-फील्ड परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है। भूखंडों के भीतर भिन्नता को कम करने के लिए, कई प्रतिकृतियों (तीन से पांच) को मापने और एक भूखंड के भीतर विभिन्न पौधों से डिस्क लेने का सुझाव दिया जाता है। हालांकि, ग्रीनहाउस या चैंबर-विकसित सामग्री के साथ काम करते समय, एक एकल पौधा एक ही पत्ती से ली गई कई डिस्क के साथ एक जैविक प्रतिकृति का गठन कर सकता है। इसके अलावा, अनुभवी स्थितियों में पूर्वाग्रह को रोकने के लिए पौधे की स्थिति को सप्ताह में कई बार घुमाया जाना चाहिए। दूसरा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली एक्टिनिक प्रकाश तीव्रता इलिनोइस में धूप वाले दिन सोयाबीन चंदवा द्वारा अनुभव की जाने वाली अधिकतम और न्यूनतम प्रकाश तीव्रता को दर्शाती है (डब्ल्यू 88 ° 1342 ° / एन 40 ° 0631 ° )। विश्लेषण के तहत प्रयोगात्मक सेटअप और संयंत्र के आधार पर, अधिक यथार्थवादी मापने की स्थिति प्रदान करने के लिए विशेष विकास वातावरण में प्रकाश तीव्रता को समायोजित करने की सलाह दी जाती है। अंत में, नमूना प्रक्रिया और मापने वाले प्रोटोकॉल दोनों को अन्य बंद पीएएम फ्लोरोमीटर सिस्टम के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, इस प्रावधान के साथ कि मापने वाले सॉफ़्टवेयर को संचालित करने के लिए आवश्यक चरणों को किसी दिए गए डिवाइस के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी।

दृष्टिकोण की एक प्रमुख सीमा द्वि-घातीय फ़ंक्शन द्वारा गणना किए गए पैरामीटर मानों की व्याख्या है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि प्रक्रिया को अन्य उच्च पौधों या शैवाल पर लागू किया जाता है, क्योंकि एनपीक्यू में योगदान देने वाली जैविक प्रक्रियाएं प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, कुछ काई और शैवाल में पीएसबीएस के बजाय एलएचसीएसआर प्रोटीन होते हैं (समीक्षा के लिएदेखें 32). इसके अलावा, जैविक प्रक्रियाओं का सापेक्ष महत्व राज्य संक्रमण या क्यूटी के साथ भिन्न हो सकता है, जो उच्च पौधों की तुलना में शैवाल में एक्यू 2 घटक के अधिक महत्वपूर्ण हिस्से का प्रतिनिधित्व करता है, जहां 80% तक प्रकाश-कटाई परिसर फोटोसिस्टम I और II33 के बीच प्रतिवर्ती रूप से स्थानांतरित हो सकते हैं। इसलिए, यह माना जाना चाहिए कि द्वि-घातीय फ़ंक्शन हमेशा विश्राम कैनेटीक्स22,29 को नियंत्रित करने वाली जैविक प्रक्रियाओं की व्याख्या करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं हो सकता है और इसका मूल्यांकन पसंद की प्रजातियों के लिए अनुभवजन्य रूप से किया जाना चाहिए। सावधानीपूर्वक प्रयोग, जिसमें अवरोधक और अनकपलर34,35 या म्यूटेंट21,23 का अध्ययन शामिल है, का उपयोग एनपीक्यू विश्राम में योगदान देने वाली प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन निष्कर्ष निकालने में सावधानी बरती जानी चाहिए।

यहां प्रस्तुत विधि मैकऑसलैंड एट अल .29 के समान है, जिसने चैंबर-उगाए गए पौधों के प्रकाश संश्लेषक प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक बंद-पीएएम इमेजर का उपयोग किया था। हालांकि, 96-अच्छी तरह से प्लेटों के बजाय नम फिल्टर पेपर पर पत्ती के नमूने रखकर, और ओ2 और सीओ2 सांद्रता को नियंत्रित करने के लिए कस्टम-निर्मित कक्षों में ऊतक को इनक्यूबेट करके, मैकऑसलैंड एट अल प्रकाश संश्लेषक मापदंडों का आकलन करने वाले मापकी एक विस्तृत श्रृंखला करने में सक्षम थे। यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण के मुख्य लाभों में विधि की सादगी शामिल है, जिसके लिए कस्टम उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है, और पत्ती ऊतक के प्रारंभिक नमूने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग होता है जो क्षेत्र-विकसित सामग्री से नमूनों के संग्रह को सक्षम बनाता है, संभावित रूप से जीनोटाइप की संख्या में वृद्धि एक शोधकर्ता स्क्रीन करने में सक्षम है।

संक्षेप में, पीएएम क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति विश्लेषण प्रकाश संश्लेषण की दक्षता के माप के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। हालांकि, पारंपरिक माप प्रति-संयंत्र आधार पर किए जाते हैं, स्क्रीनिंग क्षमता को या तो लगने वाले समय या परख करने के लिए उपलब्ध लोगों और उपकरणों की संख्या तक सीमित करते हैं। 96-अच्छी तरह से प्लेट में पत्ती डिस्क का उपयोग एक साथ कई जीनोटाइप को मापने का एक साधन प्रदान करता है, जिससे परख थ्रूपुट बढ़ जाता है। एक एकल अन्वेषक29 द्वारा थोड़े समय में कई जीनोटाइप की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करके, जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन करने की क्षमता के साथ प्रकाश संश्लेषण की प्राकृतिक विविधता की स्क्रीनिंग के लिए एनपीक्यू विश्राम के माप को लागू करना संभव है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं दी है

Acknowledgments

यह काम अनुसंधान परियोजना बढ़ी हुई प्रकाश संश्लेषक दक्षता (आरआईपीई) द्वारा समर्थित है जो अनुदान संख्या ओपीपी 1172157 के तहत बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन, फाउंडेशन फॉर फूड एंड एग्रीकल्चर रिसर्च और यूके फॉरेन, कॉमनवेल्थ एंड डेवलपमेंट ऑफिस द्वारा वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012929 Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012931 Country of Origin: United States of America
Aluminum foil Antylia Scientific  61018-56 Country of Origin: United States of America
Black marker pen Sharpie SAN30001 Country of Origin: United States of America
CF imager Technologica Ltd. N/A chlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm Humboldt Mfg Co H9665 Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software Technologica Ltd. N/A imaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters Amazon  B07P6XCTGV Country of Origin: United States of America
Marker stakes John Henry Company KN0151 Country of Origin: United States of America
Paper scissors VWR 82027-596 Country of Origin: United States of America
Parafilm Bemis Company Inc.  S3-594-6 Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers Fisher Scientific 14-130M Country of Origin: United States of America

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Tags

जीव विज्ञान अंक 185
पल्स आयाम मॉड्यूलेटेड क्लोरोफिल फ्लोरोमेट्री का उपयोग करके फसलों में गैर-फोटोकेमिकल शमन का उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M.,… More

Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M., Hinkle, A., Kromdijk, J., Burgess, S. J. High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry. J. Vis. Exp. (185), e63485, doi:10.3791/63485 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter