Summary
Het protocol introduceert een high-throughput methode voor het meten van de ontspanning van niet-fotochemische quenching door pulsamplitude gemoduleerde chlorofyl fluorometrie. De methode wordt toegepast op in het veld gekweekte Glycine max en kan worden aangepast aan andere soorten om te screenen op genetische diversiteit of broedpopulaties.
Abstract
Fotosynthese is niet geoptimaliseerd in moderne gewasvariëteiten en biedt daarom een mogelijkheid voor verbetering. Het versnellen van de ontspanning van niet-fotochemisch blussen (NPQ) is een effectieve strategie gebleken om de fotosynthetische prestaties te verhogen. Het potentieel om te fokken voor verbeterde NPQ en een volledig begrip van de genetische basis van NPQ-ontspanning ontbreekt echter vanwege beperkingen van oversampling en gegevensverzameling van in het veld gekweekte gewasplanten. Voortbouwend op eerdere rapporten presenteren we een high-throughput assay voor analyse van NPQ-relaxatiesnelheden in Glycine max (sojaboon) met behulp van pulsamplitude gemoduleerde (PAM) chlorofylfluorometrie. Bladschijven worden bemonsterd van in het veld gekweekte sojabonen voordat ze naar een laboratorium worden vervoerd waar NPQ-relaxatie wordt gemeten in een gesloten PAM-fluorometer. NPQ-relaxatieparameters worden berekend door een bi-exponentiële functie toe te passen op de gemeten NPQ-waarden na een overgang van hoog naar weinig licht. Met behulp van deze methode is het mogelijk om binnen een dag honderden genotypen te testen. De procedure heeft het potentieel om mutanten- en diversiteitspanels te screenen op variatie in NPQ-relaxatie en kan daarom worden toegepast op zowel fundamentele als toegepaste onderzoeksvragen.
Introduction
Fotosynthese bestaat uit lichtabsorptie, primaire elektronenoverdracht, energiestabilisatie en de synthese en het transport van fotosynthetische producten1. Het begrijpen van elke stap is van vitaal belang om de inspanningen te begeleiden om de fotosynthetische efficiëntie van het gewas te verhogen. Licht beïnvloedt de snelheid van fotosynthese, waardoor de energievoorziening in evenwicht moet worden gebracht, in de vorm van fotonen, met de vraag naar reducerende equivalenten. Wanneer het aanbod groter is dan de vraag, bijvoorbeeld bij veel licht of tijdens verminderde CO 2-fixatie veroorzaakt door stomatale sluiting, verhoogt de opbouw van reducerend vermogen de kans op de vorming van reactieve zuurstofsoorten met het potentieel om het fotosynthetische apparaat te beschadigen en het elektronentransport te belemmeren. Daarom hebben planten, om schade te voorkomen, verschillende fotobeschermende mechanismen ontwikkeld, waaronder ontgifting van reactieve zuurstofsoorten en niet-fotochemische doven van de geëxciteerde chlorofyltoestanden (NPQ)2.
Het handhaven van hoge snelheden van fotosynthese is een uitdaging onder een veldomgeving. Seizoensgebonden en dagelijkse veranderingen, samen met omgevingsfluctuaties zoals door de wind geïnduceerde bladbewegingen en voorbijgaande bewolking, veroorzaken verschuivingen in de hoeveelheid en intensiteit van het licht dat planten ontvangen voor fotosynthese3. NPQ dissipeert overtollige lichtenergie en kan helpen fotoschade te voorkomen terwijl het zorgt voor aanhoudende fotosynthese bij veel licht4. Langdurige NPQ tijdens overgangen bij hoog naar weinig licht blijft echter energie afvoeren die kan worden gebruikt voor koolstofreductie5. Als gevolg hiervan kan het versnellen van de ontspanning van NPQ de efficiëntie van fotosyntheseverhogen 6, waardoor NPQ-ontspanning een aantrekkelijk doelwit wordt voor gewasverbetering.
Pulsamplitudegemoduleerde chlorofylfluorescentie (PAM)-analyse kan worden gebruikt om NPQ te berekenen op basis van meetbare parameters (aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2)7,8,9. Dit artikel richt zich op het bepalen van NPQ-relaxatiepercentages in in het veld gekweekte planten met als doel de natuurlijke variatie in kiemplasma te screenen. PAM chlorofyl fluorometrie analyse kan echter ook worden gebruikt voor een breed scala aan doeleinden, toegepast op soorten variërend van algen tot hogere planten, en wordt elders beoordeeld 7,8,9.
In een donker aangepast blad of cel zijn de reactiecentra van fotosysteem II (PSII) open om elektronen te ontvangen en is er geen NPQ. Het inschakelen van een laag intensiteit meetlicht lokt chlorofylfluorescentie uit terwijl elektronentransport door PSII wordt vermeden. De geregistreerde minimale fluorescentie in deze aan het donker aangepaste toestand wordt beschreven door de parameter Fo. Het toepassen van een lichtpuls met hoge intensiteit op een donker aangepast blad kan snel de eerste stabiele elektronenacceptorpool van chinonen verminderen die gebonden zijn aan de chinon A-site. Dit blokkeert tijdelijk de elektronenoverdrachtscapaciteit in PSII-reactiecentra, waarvan dan wordt gezegd dat ze gesloten zijn en niet in staat zijn om elektronen te ontvangen van watersplitsing. Door gebruik te maken van een korte pulsduur is er onvoldoende tijd om NPQ te stimuleren. De resulterende chlorofylfluorescentie is gelijk aan de maximale waarde die kan worden verkregen in afwezigheid van NPQ, of maximale fluorescentie, Fm. Het verschil tussen minimale en maximale fluorescentie wordt variabele fluorescentie genoemd, Fv. De maximale fotochemische kwantumopbrengst van fotosysteem II (Fv/Fm) wordt berekend op basis van deze twee parameters met behulp van de volgende vergelijking:
Vv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Dit kan een belangrijke indicator zijn voor de functie en stress van het fotosysteem. Het inschakelen van een actinisch (fotosynthetisch) licht stimuleert niet-fotochemisch blussen, en de daaropvolgende toepassing van een verzadigingsflits maakt het mogelijk om de aan licht aangepaste maximale fluorescentie te meten, Fm'. Door het verschil tussen donkere en licht-aangepaste maximale fluorescentie te vergelijken, kan NPQ worden berekend volgens de Stern-Volmer vergelijking10:
NPQ = Vm/Vm' - 1
In hogere fabrieken is NPQ beschreven als bestaande uit ten minste vijf verschillende componenten, waaronder qE, qT, qZ, qI en qH. De precieze mechanismen die betrokken zijn bij NPQ zijn niet volledig begrepen; qE wordt echter beschouwd als het belangrijkste onderdeel van NPQ in de meeste planten. Cruciale factoren voor volledige betrokkenheid van qE zijn onder meer de opbouw van een protongradiënt over het thylakoïde membraan, de activiteit van fotosysteem II-subeenheid S11,12 en gede-epoxidateerde xanthofylen, antheraxanthine, luteïne en in het bijzonder zeaxanthine13. qE ontspant het snelst van alle NPQ-componenten (< 2 min)14, en omkeerbare activering van qE is daarom bijzonder belangrijk voor aanpassing aan verschuivende lichtintensiteiten. Een tweede langzamere fase van NPQ-ontspanning (~ 2-30 min) omvat zowel qT, gerelateerd aan toestandsovergangen, als qZ, waarbij interconversie van zeaxanthine naar violaxanthine15 betrokken is. Langzaam ontspannen (> 30 min) van NPQ kan zowel foto-inflammatoire quenching (qI)16 als processen onafhankelijk van fotoschade 17,18 omvatten, zoals qH, dat langdurig blussen in de perifere antennes van PSII gemedieerd door een plastide lipocaïn eiwit19,20.
NPQ neemt toe tijdens blootstelling aan veel licht. Daaropvolgende overdracht naar weinig licht kan resulteren in downregulatie van NPQ. Het verval van snelle, intermediaire en langzame ontspannende fasen kan worden vastgelegd in de parameters van een bi-exponentiële functie 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
De theoretische basis voor de bi-exponentiële functie is gebaseerd op de aanname van eerste-orde gebruik van hypothetische quenchers, waaronder qE (Aq1), de gecombineerde ontspanning van qZ en qT (Aq2), met de overeenkomstige tijdconstanten τq1 en τq2, en lange termijn NPQ, waaronder qI en fotoschade onafhankelijke processen (Aq3). Als zodanig biedt de bi-exponentiële functie een meer realistische weergave van de meerdere verbonden biologische processen die betrokken zijn bij het blussen van chlorofylfluorescentie in vergelijking met een eenvoudigere Hill-vergelijking die een theoretische basis mist24.
NPQ kan worden gemeten met behulp van een verscheidenheid aan in de handel verkrijgbare PAM-fluorometers25,26, van eenvoudige draagbare apparaten27 tot meer geavanceerde gesloten systemen28. Een beperking van verschillende van deze benaderingen is echter een relatief lage doorvoer, waardoor het screenen van grote collecties planten een uitdaging is zonder meerdere apparaten en een team van onderzoekers. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelden McAusland et al. een procedure op basis van weggesneden bladweefsel en gebruikten deze om verschillen in chlorofylfluorescentie tussen twee tarwecultivarste identificeren 29. De aantrekkingskracht van deze aanpak is dat het afbeelden van bladschijven, genomen van meerdere planten met één apparaat, het screenen van honderden genotypen binnen een dag kan vergemakkelijken. Dit maakt het mogelijk om variatie in NPQ-relaxatie te beoordelen als onderdeel van genoombrede associatiestudies, of voor het screenen van fokpopulaties met het potentieel om de fotosynthetische efficiëntie van gewassen en uiteindelijk de opbrengst te verhogen.
Voortbouwend op de bevindingen van McAusland et al.29, gebruiken we PAM chlorofyl fluorescentie analyse van bladschijven voor high-throughput screening van NPQ relaxatiesnelheden in Glycine max (G.max; sojabonen). Dit protocol maakt gebruik van de CF Imager25, die vergelijkbaar is met andere in de handel verkrijgbare closed-PAM-systemen, zoals de populaire FluorCam26. Met een donkere ruimte voor aanpassing van monsters kunnen gebruikers 96-well platen, petrischalen en kleine planten in beeld brengen. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de toename van de doorvoer die wordt geboden door het gebruik van bladschijven in vergelijking met sequentiële analyse van individuele planten. Hierin presenteren we representatieve resultaten en een methode voor het bemonsteren, meten en analyseren van NPQ in in het veld gekweekte planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zaadaanplant
- Kies een veldlocatie met vruchtbare, goed gedraineerde, maar geen zandgrond en met een pH van bijna 6,5. Markeer rijenpercelen van 1,2 m met een afstand van 0,75 m door de grond te scoren met een schoffel.
- Plant 50 zaden/m G.max cv. IA3023 op 3 cm diepte langs elk perceel aan het begin van het groeiseizoen wanneer de bodemtemperatuur tussen 25 en 30 °C ligt.
OPMERKING: Met het oog op het screenen van genetische diversiteit wordt verwacht dat meerdere verschillende genotypen worden gekweekt en vergeleken. Plant 2-5 rijen per genotype gerangschikt in een willekeurig blokontwerp. Er moet worden overwogen of de klimatologische omstandigheden passen bij de groei van sojabonen, inclusief bodemtype, temperatuur en daglengte.
2. Het verzamelen van bladmonsters van het veld
- Bemonster de planten op de veldplaats 30 dagen na ontkieming.
OPMERKING: Na 30 dagen zullen sojaplanten zich in de vegetatieve fase bevinden. Het aantal dagen na de ontkieming vóór de bemonstering is afhankelijk van de biologische vraag die wordt aangepakt. - Vul putten van een 24-well plaat tot 1/3rd met gedestilleerd water. Label het deksel en de zijkant van de plaat met de te bemonsteren replica's.
- Selecteer het jongste volledig uitgezette blad aan de bovenkant van de plant dat moet worden bemonsterd. Houd het blad tegen een rubberen stop.
- Druk een # 2 Humboldt kurkboorder door het blad en draai om een schijf te snijden terwijl je de middenrib vermijdt. Verzamel achtereenvolgens 5 schijven van hetzelfde blad voor technische replicaties. Neem ongeveer 30% meer bladschijven voor elk perceel dan nodig is voor het geval bladweefsel tijdens het transport of bij bemonstering wordt beschadigd.
OPMERKING: Het aantal biologische replicaties (percelen of planten) en het aantal technische replicaties (bladschijven van dezelfde plant of hetzelfde perceel) kunnen variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp. - Duw de bladschijven uit de kurkboorder in een enkele put van een 24-wells plaat met behulp van een wattenstaafje. Controleer of alle bladschijven in water drijven. Zo niet, beweeg dan voorzichtig bladschijven die aan de zijkant van een put kleven in een zwevende positie met een wattenstaafje.
- Ga verder met de volgende plot en herhaal stap 2.3 tot en met 2.5. Duw de bladschijven uit de kurkboorder in een aparte put in een bord met 24 putten met behulp van een wattenstaafje. Herhaal deze stap om een derde biologische replicaat te verzamelen.
- Herhaal stap 2.6 totdat een volledige 24-well plaat is bemonsterd. Doe er een deksel op en sluit af met een semi-transparante, flexibele folie. Bewaar de plaat uit direct zonlicht, in een zak, doos of lege koeler (geen ijs).
3. Monsters voorbereiden voor analyse
- Keer na bemonstering terug naar een schone laboratoriumruimte. Tik op het deksel van de verzegelde plaat om bladschijven los te maken die tijdens het transport aan het deksel zijn vastgeplakt. Pak de film uit en verwijder het deksel.
- Breng een bladschijf van de eerste positie van de 24-well plaat over in een verse 96-well plaat, met de bladschijf plat naar beneden gericht op de bodem van de put.
- Snijd een neusaspiratorfilter doormidden. Dompel het resulterende filter halverwege in water en dep op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats het filter in de put met de bladschijf om de luchtvochtigheid op peil te houden.
- Neem een tweede bladschijf vanaf de eerste positie van de 24-well plaat en plaats deze met de voorkant naar beneden in de volgende beschikbare positie van de 96-well plaat. Dompel de resterende helft van het neusfilter geproduceerd in stap 3.3 in water en dep op een papieren handdoek voordat u het in de put steekt met de tweede bladschijf.
- Herhaal stap 3.3 tot en met 3.4 voor een derde bladschijf vanaf de eerste positie van de 24-well plaat.
- Ga verder naar de tweede positie van de 24-well plaat en herhaal stap 3.3 tot en met 3.5.
- Plaats het deksel op de plaat wanneer in alle putjes bladschijven en neusaspiratorfilters zijn geplaatst. Plak de rechterbovenhoek vast om de plaat in het donker te oriënteren voor beeldvorming.
- Sluit platen af met een semi-transparante, flexibele film en wikkel de plaat in aluminiumfolie. Schrijf de plot-ID's en plaat-ID op de aluminiumfolie.
- Plaats platen in een donkere doos of kast gedurende minimaal 30 minuten, om ontspanning van de eerste twee fasen van NPQ (qE, qT, qZ) mogelijk te maken. Gebruik een langere, donkere incubatietijd van 1 uur voordat u in beeld wordt gebracht als langdurige fasen van NPQ van belang zijn.
- Bereid een extra dummyplaat voor om tijdens de analyse scherp te stellen. Om dit te doen, plaatst u een bladschijf in elk van de hoeken van een verse 96-well plaat en een in het midden. Beveilig bladschijven met neusfilters zoals gedaan met eerdere platen. Sluit de plaat af en incubeer in het donker bij kamertemperatuur (24 °C), ~50% relatieve vochtigheid.
4. Meting van niet-fotochemische blussing met behulp van chlorofylfluorescentiebeeldcamera
- Schakel de imager in en open de imaging software. Klik op Instellingen > Protocol om een venster te openen voor het invoeren van stappen in het PAM-experimentele protocol. De technische specificaties van de machine zijn opgenomen in aanvullende tabel 3.
- Stel het programma in om te beginnen met een verzadigingspuls om de maximale kwantumefficiëntie van donker-aangepaste fotosynthese te meten door 20 s in de doos in te voeren: Na een vertraging van. Klik op het vakje Pulse toepassen en voer 1 in het vak in: Dit aantal keren.
- Stel de puls PPFD in op 6152, de pulslengte op 800 ms en vink het vakje Aan voor F' &Fm'-beelden maken met alle pulsen. Klik op Invoegen na om een tweede stap aan het protocol toe te voegen.
- Voer 30 s in het vak in: Na een vertraging van. Selecteer de optie Actinic wijzigen en voer 50 in het vak in: Actinic PPFD, om de lichtintensiteit in de kamer in te stellen op 50 PPFD.
- Klik op Invoegen na om een nieuwe stap aan het protocol toe te voegen. Voer 150 s in het vak in: Selecteer na een vertraging van, Puls toepassen en voer 4 in het vak in: Dit aantal keren, om meetpulsen om de 150 s toe te passen, 4x achter elkaar terwijl het actinische licht op 50 PPFD wordt gehouden.
- Volledige informatie over het protocol wordt gegeven in tabel 1, gebruik stap 4.2 en 4.3 om de lichtintensiteit te wijzigen en stap 4.4 en 4.5 om cycli van verzadigingspulsen in te voeren. Pas de vertraging en lichtintensiteit voor elke stap aan volgens de waarden in tabel 1. Sla uw protocol op als een PCL-bestand op een bekende locatie.
- Doe het licht uit, plaats de dummyplaat op het monstertrap en stel de hoogte van het monstertrapstadium zo in dat de bladschijven zich 140 mm boven de basis van het instrument bevinden. Een dummyplaat wordt gebruikt omdat er herhaaldelijk licht op de plaat wordt geflitst bij het scherpstellen; dit vereist een her-donkere aanpassing van alle te meten monsters en kan fotoschade veroorzaken.
- Klik op het pictogram Verbinding maken/verbreken met imagercamera en hardwarecamera om de camera te starten. Klik op het symbool Focus (fluorescentie) dat wordt weergegeven door een roodgekleurd tweezijdig pijlpictogram met twee groene lijnen aan de basis. Pas de lens en belichting aan om de plaat scherp te stellen.
- Klik nogmaals op het pictogram Focus (fluorescentie) om het knipperende lampje uit te schakelen. Werk in het donker en vervang de dummyplaat door de te analyseren plaat.
- Klik op het camerapictogram Kaartafbeelding . Pas de belichting van de afbeelding aan door het diafragma te openen of te sluiten totdat de balk in het pop-upvenster in de groene zone is geplaatst.
- Klik op de knop Opnieuw proberen na elke aanpassing van het diafragma totdat de belichting correct is aangepast en het instrument een opname maakt. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Afbeeldingsisolatie toepassen om achtergrondsignalen te blokkeren. Het gefocuste bladgebied wordt grijs weergegeven en de achtergrond in blauw.
- Selecteer het gebied/de pixels die u interesseren om alleen de bladschijven op te nemen door het histogram- en gammaniveau aan te passen in het vervolgkeuzemenu Afbeelding wijzigen door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken.
- Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Hoge en lage sneden verwijderen (kleurenkaart) om het lichtblauw gemarkeerde gebied te verwijderen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Strays verwijderen (zwaar) om pixels te verwijderen die ten minste drie andere pixels niet raken.
OPMERKING: Alle gebieden op de afbeelding die als geïsoleerde eilanden worden weergegeven, worden afzonderlijk geanalyseerd en opgenomen in de uiteindelijke gegevensuitvoer. Beeldisolatie en verwijdering van verdwaalde pixels resulteren in schone, begrijpelijke gegevens. - Klik op het pictogram Protocol uitvoeren om het programma te starten, er verschijnt een timer onder aan het scherm die u informeert hoe lang het protocol nog moet worden uitgevoerd.
- Wacht tot het protocol is voltooid, klik op Bestand > Opslaan als en sla de gegevens op als een IGR-bestand. Sluit het venster door op het rode kruis in de rechterbovenhoek van het venster te klikken voordat u een andere monsterplaat gaat uitvoeren.
- Open een nieuw bestand voor het volgende voorbeeld door Bestand > Nieuw te selecteren en herhaal stap 4.10 tot en met 4.15 totdat alle platen zijn gemeten.
OPMERKING: Het is raadzaam om platen binnen een periode van 4 uur of minder te meten om de potentiële impact van circadiane regulatie op de resultaten te minimaliseren
5. Verwerking van chlorofylfluorescentiegegevens
- Open het .igr-bestand in de imaging-software. Exporteer de gegevens door op Bestand > exporteren naar map te klikken om een nieuwe map met alle benodigde bestanden te maken.
- Kopieer de volgende drie MATLAB-bestanden naar de resulterende map: MapAndLabelDiscs.m (aanvullend bestand 1), ProcessFoFm.m (aanvullend bestand 2) en ProcessNPQdata.m (aanvullend bestand 3) en het R-bestand: create_file_to_process. R (Aanvullend dossier 4).
- Open MapAndLabelDiscs.m (Aanvullend bestand 1) in MATLAB en voer uit. Sla de kaart van genummerde bladschijven die in een pop-upvenster zijn gegenereerd op als een .png bestand om de nummering van bladschijven later te controleren.
- Open het bestand ProcessFoFm.m (aanvullend bestand 2) in MATLAB en voer uit om Fo- en Fm-waarden voor elke bladschijf te berekenen. Voer ProcessNPQdata.m (aanvullend bestand 3) uit om NPQ-waarden op elk tijdstip te berekenen.
- Open het bestand create_file_to_process. R (Aanvullend bestand 4) in Rstudio en voeg de datum toe aan de code op regel 5. Voeg het kenteken toe aan regel 8 in create_file_to_process.R.
- Voer create_file_to_process uit. R om Fv/Fm-waarden en NPQ-gegevens te consolideren in één bestand dat is vernoemd naar de gegevens met het achtervoegsel -cf-summary.csv. Controleer de bladschijfnummering in het cf-samenvattingsbestand uit stap 5.5 met behulp van het .png-bestand uit stap 5.3. Add-in informatie met betrekking tot het nummer van het waarnemingspunt en de toetreding.
- Open het R-script CF-data-processing_2.R (Aanvullend bestand 5) en wijzig regel 13 in het pad van de werkmap. Wijzig regel 16 in CF-data-processing_2.R in de naam van het bestand uit stap 5.5.
- Wijzig regel 48 in CF-data-processing_2.R in de naam van een uitvoerbestand. Voer script CF-data-processing_2.R uit om de gegevens opnieuw op te maken voor curve-aanpassing.
- Open het script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Aanvullend bestand 6) in MATLAB en wijzig regel 5 in de naam van het uitvoerbestand uit stap 5.8. Wijzig regel 85 in MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m in een nieuwe naam van het uitvoerbestand. Voer script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m uit om NPQ-ontspanningsparameters te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een typische meting van NPQ in in het veld geteelde sojabonen. Planten werden gekweekt in Urbana, IL (breedtegraad 40.084604 °, lengtegraad -88.227952 °) in de zomer van 2021, met zaden geplant op 5 juni. 2021. De bladschijven zijn na 30 dagen zaadjes planten bemonsterd en er zijn metingen verricht met het bijgeleverde protocol (tabel 1). Fv/Fm - en NPQ-waarden werden berekend voor elke bladschijf (aanvullende tabel 4) en NPQ-relaxatieparameters werden berekend door een bi-exponentiële functie toe te passen (tabel 2). Na een eerste verzadigingsflits om Fv/Fm te bepalen, werden bladschijven blootgesteld aan weinig licht (50 μmol m−2s−1) en werd de gemeten NPQ < 1 (figuur 1A). Bij overdracht naar hoog licht (2000 μmol m−2s−1) steeg de NPQ tot een maximale waarde van 4 na 15 minuten. Een terugkeer naar weinig licht veroorzaakte een snelle initiële afname van NPQ (Aq1) met een tijdconstante van 1,07 min (τq1), gevolgd door een tweede langzamere ontspannende fase (Aq2) met een tijdconstante van 24,5 min (τq2). Resterende NPQ die aan het einde van het protocol overbleef (~ 0,5) werd vastgelegd door de constante (Aq3).
Figuur 1B toont een voorbeeld van een mislukte meting. Bij overdracht naar hoog licht is er een minimale toename van NPQ (0,38), die niet ontspant. Nauwkeurige inspectie van de gegevens onthult dat de bladschijf een lage Fv / Fm-waarde had die wijst op stress (0,27) en dat de gegevens moeten worden weggegooid.
Figuur 1: NPQ-meetgegevens met behulp van in het veld gekweekte sojabonen. (A) NPQ-activerings- en ontspanningskinetiek van G.max cv. IA3023. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde van vijf biologische (afzonderlijke veldplots) en drie technische (bladschijven van hetzelfde waarnemingspunt) replicaties met foutbalken die de standaarddeviatie vertegenwoordigen. (B) Voorbeeld van een mislukte technische replicatie (n = 1) met behulp van G.max cv. IA3023. De grijze en witte balken bovenaan de grafiek geven perioden van verlichting aan met een fotosynthetische fotonenfluxdichtheid (PPFD) van 2000 μmol m−2s−1 (witte balk), PPFD van 50 μmol m−2s−1 (grijze balken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stap | Uitstellen | Actie | Cycli | PPFD (μmol m-2 s-1 ) |
| 1 | 0 s | Actinic wijzigen | - | 0 |
| 2 | 20 s | Pulse toepassen | 1 | 6152 |
| 3 | 30 s | Actinic wijzigen | - | 50 |
| 4 | 150 s | Pulse toepassen | 4 | 6152 |
| 5 | 30 s | Actinic wijzigen | - | 2000 |
| 6 | 150 s | Pulse toepassen | 6 | 6152 |
| 7 | 0 s | Actinic wijzigen | - | 50 |
| 8 | 150 s | Pulse toepassen | 2 | 6152 |
| 9 | 5 min. | Pulse toepassen | 9 | 6152 |
| 10 | 20 s | Actinic wijzigen | - | 0 |
Tabel 1: Chlorofyl fluorescentie beeldvormingsprotocol te gebruiken met de imager.
| Rips | AQ1 | τq1 / min | AQ2 | τq2 / min | AQ3 | MaxNPQ | R2 |
| 1 | 2.00 | 1.12 | 1.88 | 16.62 | 0.29 | 4.17 | 0.9999 |
| 2 | 2.14 | 1.17 | 1.70 | 13.68 | 0.34 | 4.17 | 0.9999 |
| 3 | 1.82 | 0.78 | 1.88 | 18.42 | 0.36 | 4.05 | 0.9997 |
| 4 | 2.05 | 1.28 | 1.67 | 26.89 | 0.15 | 3.87 | 0.9999 |
| 5 | 1.72 | 1.01 | 1.81 | 21.22 | 0.52 | 4.05 | 0.9998 |
| Gemiddeld | 1.94 | 1.07 | 1.79 | 19.37 | 0.33 | 4.06 | |
| S.D. | 0.17 | 0.19 | 0.10 | 5.02 | 0.13 | 0.12 |
Tabel 2: Berekende NPQ-relaxatieparameters voor G.max cv. IA3023. Waarden voor Aq1, Aq2 en Aq3 zijn eenheidsloos, waarden voor τq1 en τq2 worden gerapporteerd in min. Afkortingen: MaxNPQ = maximale geregistreerde NPQ-waarde in het licht, Rep = biologisch replicatiegetal dat overeenkomt met een enkele plot, waarbij de bi-exponentiële functie geschikt is met behulp van drie technische replicaties (bladschijven). S.D. staat voor standaarddeviatie.
Aanvullende tabel 1: Beschrijving van vergelijkingen die in het manuscript worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Beschrijving van parameterwaarden die in het manuscript worden besproken. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Pulsamplitude gemoduleerde fluorescentie technische specificaties. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Berekende Fv/Fm en NPQ waarden van G.max cv. IA3023 bladschijven met behulp van het meegeleverde protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Een script voor het toewijzen van bladschijfposities met behulp van de gegevensuitvoer die door de imager wordt geleverd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Een script voor het berekenen van Fo, Fm, Fm', en Fv/Fm waarden per bladschijf met behulp van de gegevensuitvoer die wordt geleverd door de imager en aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 3: Een script voor het berekenen van NPQ-waarden per bladschijf op elk tijdstip tijdens het protocol met behulp van de gegevensuitvoer uit aanvullend bestand 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 4: Een R-script om de uitvoer van aanvullend bestand 3 te annoteren met Fv/Fm-waarden berekend door aanvullend bestand 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 5: Een R-script voor het opnieuw opmaken van de gegevens uit aanvullend bestand 4 om een bi-exponentiële vervalfunctie te kunnen aanpassen aan berekende NPQ-waarden na ontspanning. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 6: Een script dat past in een bi-exponentiële vervalfunctie om NPQ-waarden te berekenen en ontspanningsparameters te berekenen met behulp van de gegevensuitvoer uit aanvullend bestand 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zorgvuldige keuze en behandeling van bladschijven zijn van cruciaal belang om betrouwbare metingen van NPQ te verkrijgen. Ten eerste zal schade aan het weefsel, zoals ruwe behandeling met een pincet, stress veroorzaken, wat resulteert in lage waarden voor de maximale kwantumefficiëntie van fotosynthese. Niet-gestreste planten hebben doorgaans Fv/Fm-waarden van ongeveer 0,8318, met significante dalingen die wijzen op een afname van de fotosynthetische prestaties9. Planten die onder veldomstandigheden worden gekweekt, ervaren echter doorgaans milde stress, daarom werd een drempel van FvFm > 0,75 vastgesteld voor opname in overeenstemming met eerdere studies die dit kozen als de limiet voor het begin van fotosynthetische achteruitgang30. Het hanteren van de nasale aspiratorfilters die worden gebruikt om bladschijven op hun plaats te houden, vertegenwoordigt een andere veel voorkomende bron van problemen. Als neusaspiratorfilters oververzadigd zijn, zal overtollig water een negatieve invloed hebben op de bladfysiologie, wat ook leidt tot lage kwantumefficiënties; hetzelfde merk moet tijdens het experiment worden gebruikt, omdat verschillende merken verschillende hoeveelheden water kunnen bevatten. Ten derde ervaren veldplanten een fluctuerende omgeving, met verschillen in regenval, temperatuur, vochtigheid en insectendruk. De groeistadia van de planten dragen ook bij aan de efficiëntie van chlorofylfluorescentie. Chlorotische bladeren of uitgebreide plaagschade moeten worden vermeden bij het nemen van monsters. Bij het maken van vergelijkingen is een consistente keuze van bladeren in vergelijkbare ontwikkelingsstadia van vitaal belang om experimentele ruis te verminderen. De snelheid van activering en ontspanning van niet-fotochemisch blussen kan variëren met de bladleeftijd en het ontwikkelingsniveau van de plant31, als gevolg van verschillen in evenwicht tussen lichtabsorptie, chloroplastontwikkeling, energiestatus en langetermijnschaduw. Daarom is een typische keuze om de tarieven van het meest recente volledig geëxpandeerde blad te vergelijken met volwassen chloroplasten.
Dit protocol is ontworpen voor de analyse van in het veld geteelde sojabonen, maar kan worden aangepast voor bemonstering en meting van in de kas gekweekt materiaal of andere hogere planten. Verschillende overwegingen zijn belangrijk bij het aanpassen van het protocol. Ten eerste moet rekening worden gehouden met experimenteel ontwerp om ruis te verminderen en de introductie van bias te voorkomen. In het veld worden sojabonengenotypes vaak gekweekt in percelen van 50-100 planten op een rij, elk perceel wordt beschouwd als een enkele biologische replica. Elk perceel kan verschillende bodem-, blootstellings- en drainageomstandigheden ervaren die van invloed zijn op de fysiologie van de hele plant. Daarom kan het selecteren van een geschikt plotontwerp, zoals een willekeurig blok, vertekening voorkomen en de variabiliteit in het veld verminderen. Om variatie binnen plots te minimaliseren, wordt voorgesteld om meerdere replicaties (drie tot vijf) te meten en schijven van verschillende planten binnen een plot te nemen. Bij het werken met kas- of kamergekweekt materiaal kan een enkele plant echter een biologische replicaat vormen met meerdere schijven uit hetzelfde blad. Verder moet de positie van de plant meerdere keren per week worden gedraaid om vertekening in de ervaren omstandigheden te voorkomen. Ten tweede weerspiegelen de actinische lichtintensiteiten die in dit protocol worden gebruikt de maximale en minimale lichtintensiteiten die een sojakap op een zonnige dag in Illinois ervaart (W 88 °13ʹ42ʺ / N 40 ° 06ʹ31ʺ). Afhankelijk van de experimentele opstelling en de te analyseren installatie, is het raadzaam om de lichtintensiteit aan te passen aan de specifieke groeiomgeving om realistischere meetomstandigheden te bieden. Ten slotte kunnen zowel de bemonsteringsprocedure als het meetprotocol worden aangepast voor gebruik met andere gesloten PAM-fluorometersystemen, met dien verstande dat de stappen die nodig zijn om de meetsoftware te bedienen, voor een bepaald apparaat moeten worden aangepast.
Een belangrijke beperking van de benadering is de interpretatie van de parameterwaarden berekend door de bi-exponentiële functie. Dit is vooral belangrijk bij het toepassen van de procedure op andere hogere planten of algen, omdat de biologische processen die bijdragen aan NPQ per soort kunnen verschillen. Sommige mossen en algen bevatten bijvoorbeeld LHCSR-eiwitten in plaats van PsbS (voor een overzicht zie32). Verder kan het relatieve belang van biologische processen variëren, met toestandsovergangen of qT, die een belangrijker deel van de Aq2-component in algen vertegenwoordigen dan in hogere planten, waar tot 80% van de lichtoogstcomplexen omkeerbaar kan bewegen tussen fotosystemen I en II33. Daarom moet ervan worden uitgegaan dat de bi-exponentiële functie niet altijd de beste keuze is om de biologische processen voor ontspanningskinetiek te verklaren22,29 en dit moet empirisch worden beoordeeld voor de soort van keuze. Zorgvuldige experimenten, waaronder de toepassing van remmers en ontkoppelaars34,35 of studie van mutanten21,23 kunnen worden gebruikt om inzicht te geven in de processen die bijdragen aan NPQ-ontspanning, maar voorzichtigheid is geboden bij het trekken van conclusies.
De hier gepresenteerde methode is vergelijkbaar met die van McAusland et al.29, die een gesloten PAM-imager gebruikten om de fotosynthetische prestaties van kamergekweekte planten te beoordelen. Door bladmonsters echter op vochtig filterpapier te plaatsen in plaats van in platen met 96 putten en weefsel in op maat gemaakte kamers te broeden om de O2 - en CO2-concentraties te regelen, konden McAusland et al. een breder scala aan metingen uitvoeren om fotosynthetische parameters te beoordelen29. De belangrijkste voordelen van de hier gepresenteerde aanpak zijn de eenvoud van de methode, waarvoor geen aangepaste apparatuur nodig is, en het gebruik van 24-wellplaten voor de eerste bemonstering van bladweefsel, waardoor monsters van in het veld gekweekt materiaal kunnen worden verzameld, waardoor mogelijk het aantal genotypen dat een onderzoeker kan screenen, toeneemt.
Samenvattend is PAM chlorofylfluorescentieanalyse een krachtige techniek voor het meten van de efficiëntie van fotosynthese. Conventionele metingen worden echter per installatie uitgevoerd, waardoor de screeningcapaciteit wordt beperkt door de tijd die nodig is of het aantal mensen en apparatuur dat beschikbaar is om assays uit te voeren. Het gebruik van bladschijven in een 96-well plaat biedt een middel om veel genotypen tegelijkertijd te meten, waardoor de testdoorvoer toeneemt. Door de screening van vele genotypen in korte tijd door één onderzoekerte vergemakkelijken 29, is het mogelijk om de meting van NPQ-relaxatie toe te passen op het screenen van de natuurlijke diversiteit van fotosynthese met het potentieel om genoombrede associatiestudies uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het onderzoeksproject Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) dat wordt gefinancierd door de Bill &Melinda Gates Foundation, Foundation for Food and Agriculture Research en het U.K. Foreign, Commonwealth &Development Office onder subsidienummer OPP1172157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
References
- Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
- Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
- Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
- Slattery, R. A., Ort, D. R.
- Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
- Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
- Maxwell, K., Johnson, G. N.
- Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
- Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
- Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
- Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
- Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
- Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
- Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
- Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
- Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
- Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
- Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
- Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
- Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
- Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
- Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
- Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
- Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
- McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
- Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
- Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
- Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
- Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
- Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).
