Summary
본 프로토콜은 왼쪽 심장 질환으로 인한 폐 고혈압의 래트 모델에서 오름차순 대동맥 밴딩을 제거하기 위한 외과적 절차를 기술한다. 이 기술은 폐 순환과 오른쪽 심장에서 역리모델링의 내인성 메커니즘을 연구하여 폐 고혈압 및 / 또는 우심실 기능 장애를 역전시키는 전략을 알려줍니다.
Abstract
왼쪽 심장 질환 (PH-LHD)으로 인한 폐 고혈압은 PH의 가장 일반적인 형태이지만 병리 생리학은 폐 동맥 고혈압 (PAH)보다 잘 특성화되지 않습니다. 결과적으로, PH-LHD의 치료 또는 예방을 위해 승인 된 치료 중재가 누락되었습니다. PAH 환자의 PH를 치료하는 데 사용되는 약물은 왼쪽 심장 보상 상실 및 폐 부종을 유발할 수 있으므로 폐 혈관 저항 (PVR)이 감소하고 폐 혈류가 증가하므로 PH-LHD 치료에 권장되지 않습니다. LHD 환자의 PH를 역전시키기 위한 새로운 전략을 개발해야 합니다. PAH와는 달리, PH-LDD는 왼쪽 심부전 동안 폐 순환으로 혈액이 혼잡하여 발생하는 기계적 부하 증가로 인해 발생합니다. 임상적으로, 대동맥 협착증 환자에서 대동맥 판막 치환 또는 말기 심부전 환자에 LV 보조 장치의 이식에 의한 좌심실 (LV)의 기계적 하역은 폐 동맥 및 우심실 (RV) 압력뿐만 아니라 PVR을 정상화시켜 폐 혈관 구조에서 역 리모델링에 대한 간접적 인 증거를 제공합니다. PH의 후속 개발과 함께 압력 과부하에 의해 촉발된 좌측 심부전으로 인한 PH-LHD의 확립된 래트 모델을 사용하여, 이러한 생리학적 역리모델링 과정의 분자 및 세포 메카니즘을 연구하기 위한 모델이 개발된다. 특히, 대동맥 해체 수술이 수행되어 LV 심근의 역 리모델링과 하역이 이루어졌습니다. 병행하여, RV 수축기 압력의 완전한 정상화 및 RV 비대의 유의하지만 불완전한 반전이 검출가능하였다. 이 모델은 PH-LHD 및 다른 형태의 PH를 치료하기위한 치료 전략 개발을 목표로하는 폐 순환 및 RV에서의 생리적 역 리모델링 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다.
Introduction
심부전은 선진국에서 사망의 주요 원인이며 향후 10 년 동안 25 % 증가 할 것으로 예상됩니다. 폐 고혈압 (PH) - 폐 순환에서 혈압의 병리학 적 증가 - 말기 심부전 환자의 약 70 %에 영향을 미칩니다. 세계 보건기구 (WHO)는 왼쪽 심장 질환 (PH-LHD)1로 인한 PH를 폐 고혈압으로 분류합니다. PH-LHD는 수축기 및/또는 이완기 좌심실(LV) 기능 장애에 의해 개시되어 충전 압력이 상승하고 폐순환 내로의 혈액의 수동적 혼잡을 초래한다2. 초기에 가역적이긴 하지만, PH-LHD는 폐 순환의 모든 구획, 즉 동맥, 모세혈관 및 정맥(3,4)에서 활성 폐혈관 리모델링으로 인해 점차 고정된다. 가역적 및 고정 PH 모두 RV 애프터 로드를 증가시켜 처음에는 적응성 심근 비대를 유발하지만 궁극적으로 RV 팽창, 저동증, 섬유증 및 보상 상실을 유발하여 점진적으로 RV 실패 1,2,5,6을 초래합니다. 이와 같이, PH는 심부전 환자의 질병 진행을 가속화하고, 특히 좌심실 보조 장치(LVAD) 및/또는 심장 이식 7,8,9의 이식에 의한 외과적 치료를 받는 환자에서 사망률을 증가시킨다. 현재 폐혈관 리모델링 과정을 역전시킬 수 있는 치료법은 존재하지 않기 때문에 적절한 모델 시스템에 대한 근본적인 기계론적 연구가 필요하다.
중요하게도, 임상 연구에 따르면 대동맥 협착증 환자에서 빈번한 합병증인 PH-LHD는 대동맥 판막 치환10 후 수술 후 초기 기간에 빠르게 개선될 수 있음을 보여줍니다. 유사하게, 니트로프러스사이드에서 가역적이었던 높은 (>3 우드 유닛) 수술 전 폐 혈관 저항성 (PVR)은 5 년간의 후속 연구11에서 심장 이식 후 지속 가능하게 정상화되었다. 유사하게, LHD 환자에서 가역적 및 고정 PVR 둘 다의 적절한 감소 및 RV 기능의 개선은 이식가능한 박동성 및 비박동성 심실 보조 장치(12,13,14)를 사용하여 좌심실을 하역함으로써 수개월 내에 실현될 수 있었다. 현재, 폐 순환 및 RV 심근에서 역리모델링을 유도하는 세포 및 분자 메커니즘은 불분명하다. 그러나, 이들의 이해는 PH-LHD 및 PH의 다른 형태에서 폐 혈관 및 RV 리모델링을 역전시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있는 생리학적 경로에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있다.
PH-LHD의 병리생리학적 및 분자적 특징을 적절히 복제하는 적합한 전임상 모델은 래트 4,15,16에서 외과적 대동맥 밴딩(AoB)으로 인한 압력 과부하 유발 울혈성 심부전에서의 번역 연구에 사용될 수 있다. 횡단 대동맥 수축 (TAC)17의 뮤린 모델에서 압력 과부하로 인한 유사한 심부전과 비교하여, AoB 래트에서 대동맥 뿌리 위의 오름차순 대동맥의 밴딩은 밴딩 부위가 대동맥으로부터 좌측 경동맥의 유출의 근위이기 때문에 왼쪽 경동맥에서 고혈압을 일으키지 않는다. 그 결과, AoB는 TAC18에 대한 특징인 바와 같이 피질에서 좌측 뉴런 손상을 일으키지 않으며, 이는 연구 결과에 영향을 미칠 수 있다. 외과적으로 유도된 PH-LHD의 다른 설치류 모델과 비교하여, 일반적으로 래트 모델, 및 특히 AoB는 PH-LHD 환자에 대한 폐 순환 특성의 리모델링을 보다 견고하고, 재현 가능하고, 복제하는 것으로 입증되었다. 동시에, 수술 전 치사율은 낮은19입니다. AoB 래트에서 증가된 LV 압력 및 LV 기능장애는 PH-LHD 발달을 유도하여, 상승된 RV 압력 및 RV 리모델링을 초래한다. 이와 같이, AoB 래트 모델은 폐혈관 리모델링의 병리메커니즘을 확인하고 PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25에 대한 잠재적 치료 전략을 시험하기 위해 우리 자신을 포함한 독립적인 그룹에 의한 일련의 이전 연구에서 매우 유용하다는 것이 입증되었다.
본 연구에서, AoB 래트 모델은 폐 혈관구조와 RV에서 역리모델링의 기작을 연구하기 위해 대동맥 해체의 외과적 절차를 확립하는데 활용되었다. 이전에는 마우스26 및 래트27에서 대동맥 해체와 같은 심근 역리모델링 모델이 개발되어 좌심실 비대증의 퇴행을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하고 심근을 촉진하기 위한 잠재적인 치료 옵션을 시험하였다. 복구. 또한, 제한된 수의 초기 연구에서 대동맥 해산이 쥐의 PH-LHD에 미치는 영향을 탐구하고 대동맥 해체가 폐 동맥의 내측 비대를 역전시키고 사전 프로 엔도텔린 1의 발현을 정상화하며 폐 혈역학27,28을 개선하여 심부전 쥐에서 PH의 가역성에 대한 증거를 제공한다는 것을 보여주었습니다. 여기서, 해산 수술의 기술적 절차는 예를 들어, 기관내 삽관 대신 기관 절제술을 적용하거나 둔한 바늘26,27을 갖는 폴리프로필렌 봉합사 대신에 대동맥 밴딩을 위해 정의된 내경의 티타늄 클립을 사용함으로써, 수술 절차의 더 나은 제어, 모델의 재현성 증가 및 향상된 생존율을 제공함으로써 최적화되고 표준화된다.
과학적 관점에서 볼 때, PH-LHD 해체 모델의 중요성은 심부전에서 심혈관 및 폐 표현형의 가역성을 입증하는 데에만 있는 것이 아니라, 더 중요한 것은 폐동맥에서 역리모델링을 유발 및/또는 유지하는 분자 동인의 확인에 있어 미래의 치료 표적화를 위한 유망한 후보로 자리매김하는 것이다.
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Protocol
모든 절차는 "실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"(실험실 동물 자원 연구소, 8th edition 2011)에 따라 수행되었으며 독일 보건 사회 사무국 (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin)의 지방 정부 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. G0030/18). 먼저, 울혈성 심부전은 앞서 설명한 바와 같이 오름차순 대동맥 (대동맥 밴딩, AoB) 상에 0.8 mm 내경을 갖는 티타늄 클립을 배치하여 소아 Sprague-Dawley 래트에서 ∼100 g 체중(bw)(재료 표 참조)에서 외과적으로 유도하였다(대동맥 밴딩, AoB). AoB 후 3주째에(도 1), 대동맥으로부터 클립을 제거하기 위해 디브레이빙(Deb) 수술을 수행하였다. 수행된 AoB 래트에서 PH 역전의 수술 절차 및 검증은 도 1에 개략적으로 묘사되어 있다.
1. 외과 적 준비
- 오토클레이빙을 통해 필요한 수술기구(그림 2)를 멸균합니다.
- 쥐에게 카프로펜 (5 mg / kg bw) ( 재료 표 참조)을 복강 내 (i.p.) 주사하여 수술 30 분 전에 진통제를 위해 주사하십시오.
- 케타민 (87 mg / kg bw)과 자일라진 (13 mg / kg bw)의 i.p. 주사로 쥐를 마취하십시오.
- 전기 면도기를 사용하여 동물의 목선과 가슴에서 머리카락을 제거하십시오.
- 수술 중 눈을 보호하기 위해 눈 연고 한 방울을 바르십시오.
- 쥐를 멸균 된 수술 테이블의 수핀 위치에 놓습니다. 조심스럽게 접착 테이프로 동물의 복부와 팔다리를 고정하십시오.
주: 체온을 유지하려면 수술대 아래에 37°C 가열 매트를 놓으십시오. 눈의 건조를 방지하기 위해 머리 부위의 가열을 피하십시오. - 포비돈-요오드/요오도포어 용액으로 동물 피부를 소독하십시오. 일차 AoB 수술에서 흉터와 봉합사를 기록하고 수술 현장을 드레이프하십시오.
- 발가락을 꼬집음으로써 마취의 적절한 깊이를 보장하십시오.
참고 : 마취의 깊이는 수술 중에 정기적으로 조절해야합니다.
2. 기관지 절제술 및 기계 환기
참고 : 수술 기간 동안 멸균되지 않은 장비를 취급 한 후 장갑을 교체하십시오.
- 미세한 가위(그림 2A)로 7-10mm 길이의 자궁경부 중간선 절개를 만듭니다(그림 3A).
- 한 쌍의 둔한 포셉 (그림 2B')의 도움으로 자궁 경부 연조직을 해부하여 적외선 근육을 노출시킵니다. 기관지를 시각화하기 위해 중간 선에서 근육을 분할하십시오. 일차 AoB 수술에서 봉합사를 자르고 제거하십시오.
- 각진 Noyes 스프링 가위를 사용하여 두 연골 고리 사이에 ~2mm 기관 절개를 만듭니다(그림 2C,3B). 외부 직경 2mm (그림 2D)의 기관 캐뉼라를 기관에 넣고 4-0 실크 봉합사로 고정하십시오 (그림 2E, 3C).
- 기관 캐뉼라를 기계식 인공 호흡기(재료 표 참조)에 연결하면서 데드 스페이스를 최소한으로 유지합니다(그림 3D-E). 수술 전 폐 환기를 8.5 mL/kg bw의 갯벌 부피(Vt)에서 90회 호흡/분의 호흡 속도로 유지하십시오.
3. 대동맥 해산
- 미세한 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이에 ~20mm 길이의 피부를 절개합니다(그림 3F).
- 더 작은 수술용 가위(그림 2F)를 사용하여 근육을 조심스럽게 펼치고 층별로 잘라냅니다(그림 3G). 두 번째와 세 번째 늑골 사이의 늑간 공간을 따라 10mm 측면 절개를하십시오.
참고 : 출혈을 피하기 위해 중흉골 라인을주의 깊게 접근해야합니다. - 늑골 스프레더(그림 2G)를 사용하여 두 번째 늑골과 세 번째 늑골 사이의 늑간 공간을 확장하여 수술 창을 만듭니다(그림 3H).
- 무딘 포셉(그림 2B,B')의 도움으로 흉선을 심장과 도관 동맥에서 조심스럽게 분리하여 클립으로 대동맥을 시각화합니다(그림 4A).
- 포셉의 도움으로 클립을 잡고 클립 주위의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 노출시킵니다.
참고 : 대동맥을 포셉으로 잡거나 들어 올리면 대동맥이 손상되어 출혈과 치명적인 결과를 초래할 수 있으므로 피하십시오. - 바늘 홀더(그림 2H)를 사용하여 클립을 열고(그림 4B) 흉강에서 분리합니다.
- 가슴을 닫기 전에 폐 atelectasis를 열고, 과도한 팽창없이 적절한 폐 모집을 보장하고, 9.5 mL / kg bw의 Ct로 10 분 동안 기계적 환기를 계속하고, 폐를 모집하고 가능한 기흉을 해결하기 위해 8.5 mL / kg bw의 Ct로 돌아갑니다.
- 4-0 실크를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 깊은 근육을 닫습니다. 그런 다음 상부 근육과 피부를 간단한 연속 봉합사로 연결하십시오 (그림 5A, B).
4. 기관 삽관
- 환기 기계에서 기관 캐뉼라를 분리하십시오. 자발적인 호흡이 다시 확립 될 때까지 쥐를주의 깊게 관찰하십시오. 연결이 끊어졌을 때 동물이 자발적으로 숨을 쉬지 못하면 인공 호흡기를 다시 연결하고 추가 5 분 동안 환기를 계속하십시오. 그런 다음 절차를 반복하십시오.
- 자발적인 호흡이 다시 확립 된 후, 기관지에서 캐뉼라를 제거하고 스폰지 포인트로 기관 주변의 액체를 청소하십시오 (그림 2I) ( 재료 표 참조).
- 6-0 프롤렌을 사용하여 간단한 봉합사로 기관을 닫습니다(그림 2E' 및 그림 5C). 그런 다음 4-0 실크를 사용하여 간단한 중단 봉합사에서 적외선 근육을 닫고 (그림 5D), 간단한 연속 봉합사로 피부를 연결합니다 (그림 5E). 이 과정에서 포비돈-요오드/요오드포어 용액으로 근육과 피부를 청소하고 소독합니다.
5. 수술 후 관리
- 외과 적 절차를 완료 한 후 동물을 보충 산소와 적외선 램프가있는 회복 케이지로 조심스럽게 옮겨 회복 단계에서 동물을 따뜻하고 충분히 산소를 공급하십시오. 산소 마스크를 쥐의 가까이에 두십시오. 언제든지 회복 케이지 당 하나의 동물 만 보관하십시오.
- 동물이 깨어 난 후에는 조심스럽게 물과 음식이 들어있는 일반 새장으로 옮깁니다. 다음 12 시간 동안 2 시간 간격으로 조작 된 동물의 건강 상태를 제어하십시오.
- 수술 절차를 완료 한 후 일주일 동안 카프로펜 (5 mg / kg bw)을 i.p. 주사하여 매일 진통제를 적용하십시오.
- 박테리아 감염을 피하려면 수술 후 일주일 동안 식수에 아목시실린 (500 mg / L)을 투여하십시오.
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Representative Results
먼저, 성공적인 대동맥 해빙은 AoB 동물에서 해동 절차 전후에 수행된 흉부 경흉부 심초음파에 의해 확인되었다(도 6). 이를 위해, 대동맥 아치를 파라스테날 장축(PLAX) B 모드 뷰에서 평가하였다. AoB 동물에서 오름차순 대동맥 상의 클립의 위치와 뎁 수술 후 클립의 부재가 가시화되었다(도 6A,B). 다음으로, 대동맥 혈류를 맥파-웨이브 도플러 영상화에 의해 평가하였다(도 6C-F). 클립 전후에 측정된 AoB 동물의 피크 혈류 유속은 각각 733.24 ± 17.39 mm/s 및 5215.08 ± 48.05 mm/s (n = 8 동물)였으며(그림 6C, E), AoB 부위를 가로지르는 가파른 구배를 보여줍니다. 클립 제거 후 피크 혈류 속도는 해당 대동맥 위치에서 각각 28.97mm/s 및 2578.73 ± 42.27mm/s± 1093.79였으며, 기능적 디밴딩에 따라 기울기의 현저한 감쇠를 보여줍니다(그림 6D,F). 대동맥 해체에 의한 좌측 심부전의 역전을 조사하기 위해, 심장 질환31을 평가하기 위한 임상 루틴 파라미터인 뇌 나트륨이뇨 펩티드(BNP)의 발현 수준을 LV 심근에서 액세스하였다. 대동맥 밴딩 후 3주 및 5주째에, AoB 동물은 가짜 조작된 대조군에 비해 BNP의 생산이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 대조적으로, 5주차의 뎁 래트는 가짜 동물에 필적하는 수준으로 BNP를 발현하였고, 이는 대동맥 해체에 의한 LV 실패의 반전을 나타낸다(도 7A-C). 병행하여, 흉부 흉부 심초음파에 의한 LV 기능의 평가는 AoB 래트에 비해 Deb 동물에서 증가된 LV 배출 분율 및 LV 부피를 밝혀냈다(도 7D-E). 뎁 동물에서의 LV 배출 분율은 가짜 래트와 비슷했지만, 뎁 래트의 LV 부피는 가짜 그룹에서 보이는 값으로 완전히 정상화되지 못하여, LV 기능의 역전이 불완전하다는 것을 나타낸다.
뎁 동물이 PH-LHD에서 역폐혈관 및 우심실(RV) 리모델링을 연구하기 위한 전임상 모델로서 작용할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 좌심실 수축기 압력(LVSP), 및 우심실 수축기 압력(RVSP) 마이크로팁 밀라 카테터를 사용하여 평가하였다. 간단히 말해서, 래트는 다시 케타민 (87 mg / kg bw) 및 자일라진 (13 mg / kg bw)으로 마취되고, 기관지로 마취되고, 위에서 설명한 바와 같이 환기되었다. 심장 카테터 삽입은 AoB 동물에서 대동맥 밴드에 의해 방지되는 혈관 경로를 통한 좌심실의 직접 카테터 삽입으로서 각각 (첫 번째) 좌측 및 (두 번째) 우심실의 정점을 통해 중간 흉부 절제술 후32를 수행하였다. 케타민/자일라진의 과다 복용에 의한 안락사 후, 심장은 절제되었고, 심실 비대증은 중격(LV+S) 또는 우심실(RV)을 포함한 좌심실의 무게가 체중(BW)으로 정상화됨으로써 평가되었다. PH-LHD에 대한 확립된 모델로서 AoB 래트에 따르면, AoB 동물은 수술 후 3주째에 가짜 조작된 동물에 비해 유의하게 증가된 LVSP 및 RVSP 및 LV 및 RV 비대를 나타내었다(도 8A-F). AoB 후 3 주에 수행 된 디밴딩 (Deb) 수술은 AoB 후 3 주 및 5 주에 Deb가없는 AoB 동물과 비교하여 LVSP 및 LV 비대 둘 다의 현저한 감소를 가져 왔으며, 대동맥으로부터의 클립 제거에 따른 LV 혈역학의 정상화가 LV 리모델링을 역전시켰다는 것을 입증했다 (도 8C, D). 3 주와 5 주째의 AoB 쥐와 비교할 때, 뎁 동물은 RVSP 및 RV / BW의 현저한 감소를 보여 PH-LHD의 성공적인 반전을 보여주었습니다 (그림 8E, F). 특히, 뎁 래트의 RVSP는 가짜 동물에서 측정된 값과 비슷했으며, 이는 RV 혈역학의 완전한 정상화를 나타낸다. 대조적으로, 뎁 동물의 RV 비대는 RV/BW로 부분적으로만 역전되었고, 가짜 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(도 8E,F).
그림 1: AoB 래트에서 수술 절차 및 PH 반전의 검증의 개략적인 표현. 이 도식은 해산 수술이 PH-LHD를 역전시키는지 여부를 테스트하기 위해 본 연구에 사용 된 다양한 실험 그룹을 묘사합니다. 샴, 가짜 조작 컨트롤; AoB, 대동맥 밴딩; 뎁, 해산. 삼각형은 외과 적 개입의 시점을 표시합니다 : 0 주에는 일차 수술 (sham 또는 AoB; 빨간색)을, 3 주에는 이차 수술 (Deb; 녹색)을 표시합니다. 원은 PH-LHD가 LV 및 RV 압력 및 비대 측정에 의해 각각 평가된 종점 분석을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 수술 도구. (A) 미세 가위 텅스텐 카바이드. (B) 모리아 아이리스 포셉과 (B') Serrated Graefe forceps. 집게의 팁이 확대되어 표시됩니다. (C) 노예스 스프링 가위. (D) 기관 캐뉼라. (E, E') 각각 4-0 및 6-0 봉합사. (F) 미세 가위 텅스텐 카바이드. (G) 갈비뼈 살포기. (H) 마티유 바늘 홀더. (I) 스폰지 점 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기관지 절제술과 흉부 절제술. 이미지는 기관 절제술의 수술 단계를 보여줍니다. (A) 자궁 경부 미드 라인 절개. (B) 두 연골 고리 사이의 기관 절개. (C) 기관 캐뉼라를 기관지에 삽입하고 봉합사로 고정. (D) 기관 캐뉼러는 기계식 인공 호흡기에 연결되어 있습니다. (e) 이미지는 흉부 절제술을 위한 수술 단계를 예시한다. (F) 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이의 피부 절개. (G) 근육의 절단. (H) 두 번째와 세 번째 갈비뼈를 펼침으로써 흉부 수술 창을 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 생체 내 및 생체 외 대동맥 수축 클립의 시각화 . (A) 이미지는 오름차순 대동맥에 티타늄 클립이 놓인 AoB 쥐의 흉강을 보여줍니다. (B) 이미지는 닫히고 열린 클립 전 생체를 보여줍니다. 별표는 바늘 홀더가 클립을 열기 위해 생체 내에서 압축하는 클립의 일부를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 상처 폐쇄. 이미지는 간단한 연속 봉합사로 상부 흉부 근육 (A)과 피부 (B)의 폐쇄를 보여줍니다. 기관지(C)와 적외선 근육(D)은 단순 연속 봉합사에 의해 목(E)의 단순 봉합사와 피부에 의해 폐쇄된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 해산 수술 전후의 대동맥 혈류. (A-B) 경흉부 심초음파에 의한 대동맥 밴딩(AoB, 왼쪽) 및 해산 수술 후 랫트(Deb, 오른쪽)를 가진 래트에서 오름차순 대동맥의 시각화. 화살표는 (B)에 없는 (A)의 대동맥에 티타늄 클립을 보여준다. (C,D) 맥파-웨이브 도플러 심초음파 이미지는 대동맥 해산 수술 하루 전과 하루 후에 촬영한 뎁 래트(D)에서 AoB 래트(C)의 클립 전의 혈류와 상응하는 대동맥 세그먼트에서의 혈류를 각각 보여준다. (E, F) 유사하게, 이미지는 대동맥 해산 수술 하루 전과 하루 후에 촬영한 뎁 래트(F)에서 AoB 래트(E)와 상응하는 대동맥 세그먼트에서 클립 후 대동맥 세그먼트에서의 혈류를 각각 보여준다. 청록색 수직선은 피크 대동맥 유속의 측정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 대동맥 해체에 의한 좌심실 기능의 정상화. (A) 대표적인 웨스턴 블롯은 대동맥 밴딩 후 3주째에 AoB 래트의 좌심실(LV)에서 로딩 대조군으로 BNP와 GAPDH의 단백질 수준을 보여주며(n=5) 및 상응하는 가짜 대조군(n=5)에서 나타났다. (B) 대표적인 웨스턴 블롯은 대동맥 밴딩 후 5주째에 AoB 래트의 좌심실(LV)에서 BNP 및 GAPDH를 보여주고(n=4), 5주째에 뎁 래트에서(n=5), 그리고 일차 수술 후 상응하는 시간에 가짜 대조군(n=4)에서 BNP 및 GAPDH를 보여준다. (c) 박스 및 위스커 플롯은 일차 수술 후 상응하는 시간에 GAPDH 및 가짜 대조군으로 정규화된 BNP 발현의 정량화를 보여준다. 상자는 각각 중앙값, 25 및 75 백분위수를 표시합니다. 수염은 최소값과 최대값을 나타냅니다. 통계 분석을 위해, 스튜던트의 t-검정33 이 사용되었다. *p-값은 0.05<니다. (d) 막대 그래프 (평균 ± 표준 편차)는 M- 및 B 모드 이미지로부터의 심 초음파 촬영에 의해 측정된 바와 같이 5 주째에 가짜 (n = 4), AoB (n = 9) 및 Deb (n = 7) 동물에서 LV 배출 분율 및 부피를 보여준다. (E) 대표적인 M 모드 심초음파 영상은 5주차에 sham, AoB 및 Deb 동물에서 LV 분수 단축의 변화를 보여준다. 통계 분석을 위해 만-휘트니 U 검정33 이 사용되었다. *p-값은 0.05<니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 심실 혈역학은 정상화되고, 심장 비대는 대동맥 해체에 의해 역전된다. (A) 대동맥 밴딩 후 3주 후 랫트에서 좌심실(LV) 및 우심실(RV) 혈압의 대표적인 측정치(AoB)는 상응하는 가짜 대조군과 비교하였다. (b) 대표적인 이미지는 가짜 대조군과 비교하여 대동맥 밴딩 3주 후 AoB 래트에서 심장 비대를 보여준다. (C-F) 상자와 수염 플롯은 좌심실 수축기 압력 (LVSP; C), LV 비대 ([LV+S]/BW; D), 우심실 수축기 압력 (RVSP; E) 및 RV 비대 (RV/BW; F) sham 및 AoB 동물에서 수술 후 3 및 5주째에, Deb 래트에서 파라미터를 정규화하였다(3- 및 5-주 AoB 그룹과 비교하여). 상자는 각각 중앙값, 25 및 75 백분위수를 표시합니다. 수염은 최소값과 최대값을 나타냅니다. n = 9-12마리의 동물을 혈역학 측정을 위해 분석하였고, 심장 체중은 군당 n=7-12마리의 래트로 측정하였다. 통계 분석을 위해 Mann-Whitney U 테스트가 사용되었습니다. *p-값은 0.05<니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 래트 AoB 모델에서 대동맥 해체를 위한 상세한 수술 기술은 폐혈관구조 및 RV에서 역리모델링을 유도하는 PH-LHD와 세포 및 분자 메커니즘의 가역성을 조사하는데 활용될 수 있다고 보고되어 있다. 어린 쥐에서 대동맥 수축의 삼 주 동안 PH-LHD는 LV 압력 증가, LV 비대 및 RV 압력 및 RV 비대 증가와 동시에 증가로 분명합니다. AoB 이후 3 주째에 대동맥 해산은 Deb 후 2 주 이내에 LV를 언로드하고 LV 비대를 완전히 역전시킬 수있었습니다. 동시에, 대동맥 디밴딩은 또한 RV 압력의 완전한 정상화와 RV 비대의 부분적인 역전을 일으켰다.
따라서 본 모델은 연속 유동 특성을 갖는 이식가능한 비박동성 LVAD에 의한 LV의 기계적 언로딩이 이전에 심부전 환자(34,35)에서 PH를 역전시키는 것으로 밝혀진 임상 시나리오의 중요한 측면을 모방한다. 회고 분석에서, LVAD 지지체는 약리학적 치료에도 불구하고 평균 폐동맥압 >25 mm Hg, 폐 혈관 저항 >2.5 우드 유닛 및 평균 압력 경폐 구배 >12 mm Hg로 정의된 고정 PH로 정의된 고정 PH로 가역적 또는 고정된 PH를 갖는 심부전 환자에서 폐동맥 압력을 유사한 정도로 감소시키는 것으로 나타났다(35). 중요하게도, 이러한 발견(34,35)은 좌심실 하역이 수동적 폐 혼잡 및 폐 혈관 톤의 이차적 변화를 감소시킬뿐만 아니라 "생리학적" 메커니즘, 즉 변경된 혈역학에 대한 적응에 의한 폐 혈관의 역리모델링을 촉발시킨다는 간접적인 증거를 제공한다. 폐 혈관구조에서 역리모델링을 유도하는 세포 및 분자 과정에 대한 심층적이고 다중 오믹스 분석은 심부전 환자에서 PH를 치료하기 위한 새로운 치료 옵션과 PAH를 포함한 다른 형태의 PH를 식별하기 위한 새로운 길을 열 수 있습니다. AoB 래트에서 해산의 본 모델은 RVSP의 완전한 정상화가 PH의 효과적인 반전을 확인함에 따라 그러한 분석에 대한 독특한 가능성을 제공하며, 따라서 기계론적 연구가 병든 폐 혈관 구조에서 항상성 과정을 복원 할 수있는 능력을 가진 경로를 식별 할 수있게합니다.
유사한 근거로, 본 모델은 RV의 역리모델링을 유도하는 세포내 및 세포간 과정을 연구하는데 추가로 활용될 수 있다. RV 기능은 최근 심혈관 질환에서 이환률 및 사망률에 대한 예후의 중요한 예측인자로서 인식되고 있다. 그러나 RV 기능(36)을 개선하기 위해 임상적으로 승인된 치료법은 없다. 이와 같이, 동물 모델에서 RV 심근에서 역리모델링 과정을 연구하는 능력은 상당한 지식 격차와 중요한 의학적 요구를 해결할 수 있는 독특한 기회를 제공한다.
AoB 쥐에서 기술적으로 도전적인 대동맥 해체 절차의 성공은 수술 기술과 정확한 수술 전 전략에 달려 있습니다. 다음은 과도한 출혈 (1-5) 또는 불충분 한 호흡 (6)으로 인해 수술 전 치사를 유발할 수있는 중요한 수술 절차 단계와 이러한 합병증을 피하는 권장 사항입니다.
(1) 흉부 절제술 중에는 내부 유방 동맥에 손상을 입히지 않도록 중흉골 라인을 가위로 조심스럽게 접근해야합니다. (2) 심장과 도관 동맥을 시각화하기 위해서는 흉선을 동원하고 두개골 방향으로 조심스럽게 재배치해야합니다. 해산 수술에서 흉선 조직은 종종 원래의 AoB 수술에서 수술 후 유착을 통해 심장과 동맥에 연결됩니다. 이러한 유착은 심혈관 구조에 대한 부상을 피하기 위해 한 쌍의 둔한 포셉으로 조심스럽게 분리해야합니다. (3) 해산 수술에서 클립이있는 대동맥은 결합 조직에 자주 매립됩니다. 이 결합 조직은 클립을 시각화하기 위해 무딘 포셉으로 부드럽게 해부해야합니다. 여기서, 수술 전에 수행되는 흉부 경흉 초음파 검사는 클립이 대동맥 뿌리에 가깝거나, 오름차순 대동맥의 중간에, 또는 상완 구균 동맥에 가까이 있는지 여부를 식별 할 수있는 유용한 준비 단계입니다. 이 지식은 수술 중 클립 할당을위한 귀중한 시간을 절약합니다. (4) 클립의 방향은 초기 대동맥 밴딩 수술 중에 신중하게 고려해야하는 중요한 단계입니다. 대동맥 해체 중에 클립의 최적 평가와 신속한 개방을 용이하게 하려면 바늘 홀더(그림 4B)에 의해 압축되어야 하는 부분은 심실로 배향되어야 합니다. 해산 수술 중 클립 방향 재조정은 대동맥 부상의 위험이 있지만 실현 가능합니다. 클립 방향 재조정을 위해서는 클립을 포셉으로 잡고 주변 결합 조직을 조심스럽게 제거한 다음 클립을 동원하고 돌려야합니다. 대동맥을 포셉으로 잡는 것은 피해야합니다. (5) 디밴딩을 위해서는 클립을 한 손으로 포셉으로 잡고 다른 손으로 바늘 홀더로 열어야합니다. 대동맥은 심실로 들어 올릴 필요가 없습니다. (6) 해산 절차를 완료 한 후, 삽관 된 PH-LHD 쥐는 호흡 부전의 상당한 위험에 처해 있으며, 동물은 일반적으로 마취 상태에있는 동안 수술 후 10-20 분 이내에 사망합니다. 왼쪽 폐의 Atelectasis는이 기간 동안 사망의 가장 흔한 원인이며, 흉부 폐쇄 전에 장기간의 기계적 환기는 폐를 모집하고 수술 후 충분한 호흡을 보장하는 데 도움이됩니다.
우리는 또한 이전 연구26,27에서 수행 된 기관 내 삽관과 비교하여 기관 절제술은 대동맥 해동 중에 특히 관련이있는 수술 절차 중에 적절한 환기를보다 잘 제어 할 수 있다고 제안합니다. 이 개념은 다음과 같은 근거에 근거합니다 : (1) 수술 전 폐 환기를 위해 실험실에서 일상적으로 수행되는 기관지 절제술은 수술 전 또는 수술 후 합병증이없는 간단하고 안전한 기술입니다. (2) 기관지 절제술은 식도 삽관 또는 기관 손상의 위험을 제거합니다. 그것은 기관 캐뉼라의 정확한 위치 및 고정과 수술 절차의 모든 단계에서 캐뉼라의 지속적인 시각적 제어를 가능하게합니다. (3) 대동맥 해산시, AoB 동물은 이미 심부전을 앓고 있으며 추가 스트레스에 더 민감합니다. 결과적으로, 기관내 삽관과 함께 발생할 수있는 잠재적 인 위험은 치사율을 증가시킬 수 있습니다. (4) 마지막으로, 수술 동물이 인공 호흡기에서 젖을 떼었지만 자발적인 호흡이 일어나지 않을 때, 기관 절제술은 신속한 삽관 및 인공 호흡기와의 재 연결을 허용하여 수술 후 장기간의 환기 능력으로 인해 잠재적으로 생명을 구할 수 있습니다.
본 연구는 쥐에서 초기 대동맥 밴딩 후 3 주 후에 수행 된 대동맥 해체 기술을보고합니다. 상이한 PH 단계에서 폐 혈관구조와 RV의 역리모델링을 비교하는 것을 목표로 하는 연구를 위해, 기술된 절차는 또한 대동맥 밴딩 후 나중 시점에서 수행될 수 있다. 그러나 대동맥을 둘러싼 흉터와 결합 조직이 시간이 지남에 따라 더 풍부 해져서 절차가 더욱 복잡해지고 추가 문제 해결 및 개선이 필요하기 때문에주의가 보장됩니다. 동시에, 보고된 프로토콜의 기본 원칙은 여전히 적용된다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다. 모든 공동 저자는 원고의 내용을보고 동의합니다.
Acknowledgments
이 연구는 CK와 WMK에 DZHK (독일 심혈관 연구 센터)의 보조금, BMBF (독일 교육 연구부)가 VasBio의 틀에서 CK에, VasBio, SYMPATH 및 PROVID의 틀에서 WMK 및 WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 및 KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
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