Summary
Настоящий протокол описывает хирургическую процедуру по удалению восходящей аортальной полосы в крысиной модели легочной гипертензии из-за болезни левого сердца. Этот метод изучает эндогенные механизмы обратного ремоделирования в легочном кровообращении и правом сердце, тем самым информируя о стратегиях обращения вспять легочной гипертензии и / или дисфункции правого желудочка.
Abstract
Легочная гипертензия из-за болезни левого сердца (PH-LHD) является наиболее распространенной формой PH, но ее патофизиология плохо характеризуется, чем легочная артериальная гипертензия (ЛАГ). В результате утвержденные терапевтические вмешательства для лечения или профилактики PH-LHD отсутствуют. Лекарства, используемые для лечения ЛГ у пациентов с ЛАГ, не рекомендуются для лечения PH-LHD, так как снижение легочного сосудистого сопротивления (PVR) и увеличение легочного кровотока при наличии повышенного левостороннего давления наполнения может вызвать декомпенсацию левого сердца и отек легких. Необходимо разработать новые стратегии для обращения вспять ЛГ у пациентов с ЛЕГ. В отличие от ЛАГ, PH-LHD развивается из-за повышенной механической нагрузки, вызванной застоем крови в легочном кровообращении при левой сердечной недостаточности. Клинически механическая разгрузка левого желудочка (ЛЖ) путем замены аортального клапана у пациентов со стенозом аорты или путем имплантации вспомогательных устройств ЛЖ у пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности нормализует не только давление легочной артерии и правого желудочка (RV), но и PVR, обеспечивая тем самым косвенные доказательства обратного ремоделирования в легочной сосудистой системе. Используя установленную крысиную модель PH-LHD из-за левой сердечной недостаточности, вызванной перегрузкой давлением с последующим развитием PH, разрабатывается модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов этого физиологического процесса обратного ремоделирования. В частности, была проведена операция по обезвреживанию аорты, которая привела к обратному ремоделированию миокарда ЛЖ и его разгрузке. Параллельно была выявлена полная нормализация систолического давления RV и значительное, но неполное обращение вспять гипертрофии RV. Эта модель может представлять собой ценный инструмент для изучения механизмов физиологического обратного ремоделирования в легочном кровообращении и RV, с целью разработки терапевтических стратегий лечения PH-LHD и других форм PH.
Introduction
Сердечная недостаточность является основной причиной смерти в развитых странах и, как ожидается, увеличится на 25% в течение следующего десятилетия. Легочная гипертензия (ЛГ) – патологическое повышение артериального давления в малом круге кровообращения – поражает примерно 70% пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности; Всемирная организация здравоохранения классифицирует PH как легочную гипертензию из-за болезни левого сердца (PH-LHD)1. PH-LHD инициируется нарушением систолической и/или диастолической функции левого желудочка (LV), что приводит к повышенному давлению наполнения и пассивному застою крови в легочном кровообращении2. Хотя изначально обратимый, PH-LHD постепенно становится фиксированным за счет активного легочного сосудистого ремоделирования во всех отсеках легочного кровообращения, т. е. артериях, капиллярах и венах 3,4. Как обратимый, так и фиксированный РН увеличивают послегрузку РВ, первоначально приводя к адаптивной гипертрофии миокарда, но в конечном итоге вызывая дилатацию РВ, гипокинез, фиброз и декомпенсацию, которые постепенно приводят к недостаточности РВ 1,2,5,6. Таким образом, PH ускоряет прогрессирование заболевания у пациентов с сердечной недостаточностью и увеличивает смертность, особенно у пациентов, проходящих хирургическое лечение путем имплантации вспомогательных устройств левого желудочка (LVAD) и / или трансплантации сердца 7,8,9. В настоящее время не существует лечебных методов лечения, которые могли бы обратить вспять процесс ремоделирования легочных сосудов, поэтому необходимы фундаментальные механистические исследования в соответствующих модельных системах.
Важно отметить, что клинические исследования показывают, что PH-LHD как частое осложнение у пациентов со стенозом аорты может быстро улучшаться в раннем послеоперационном периоде после замены аортального клапана10. Аналогичным образом, высокое (>3 единицы древесины) предоперационное легочное сосудистое сопротивление (PVR), которое, однако, было обратимым на нитропруссиде, было устойчиво нормализовано после трансплантации сердца в 5-летнем последующем исследовании11. Аналогичным образом, адекватное снижение как обратимого, так и фиксированного PVR и улучшение функции RV у пациентов с LHD может быть достигнуто в течение нескольких месяцев путем разгрузки левого желудочка с использованием имплантируемых пульсирующих и непульсатильных желудочковых вспомогательных устройств 12,13,14. В настоящее время клеточные и молекулярные механизмы, которые управляют обратным ремоделированием в легочном кровообращении и RV миокарде, неясны. Тем не менее, их понимание может дать важное представление о физиологических путях, которые могут быть терапевтически использованы для обращения вспять ремоделирования сосудов легких и RV при PH-LHD и других формах PH.
Подходящая доклиническая модель, которая адекватно воспроизводит патофизиологические и молекулярные особенности PH-LHD, может быть использована для трансляционных исследований при вызванной перегрузкой давления застойной сердечной недостаточности из-за хирургического полосирования аорты (AoB) у крыс 4,15,16. По сравнению с аналогичной сердечной недостаточностью из-за перегрузки давлением в мышиной модели поперечного сужения аорты (TAC)17, полосатость восходящей аорты над корнем аорты у крыс AoB не вызывает гипертонии в левой сонной артерии, поскольку место полосы находится проксимально от оттока левой сонной артерии из аорты. В результате AoB не вызывает левостороннего повреждения нейронов в коре головного мозга, как это характерно для TAC18, и что может повлиять на результат исследования. По сравнению с другими моделями грызунов хирургически индуцированного PH-LHD, модели крыс в целом и AoB в частности оказываются более надежными, воспроизводимыми и воспроизводят ремоделирование легочного кровообращения, характерное для пациентов с PH-LHD. При этом периоперационная летальность низкая19. Повышенное давление ЛЖ и дисфункция ЛЖ у крыс AoB вызывают развитие PH-LHD, что приводит к повышению давления RV и ремоделированию RV. Таким образом, модель крыс aoB оказалась чрезвычайно полезной в серии предыдущих исследований независимых групп, включая нас самих, для выявления патомеханизмов ремоделирования легочных сосудов и тестирования потенциальных стратегий лечения PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.
В настоящем исследовании модель крысы AoB была использована для установления хирургической процедуры деформирования аорты для изучения механизмов обратного ремоделирования в легочной сосудистой системе и RV. Ранее были разработаны модели обратного ремоделирования миокарда, такие как деформирование аорты у мышей26 и крыс27, для исследования клеточных и молекулярных механизмов, регулирующих регрессию гипертрофии левого желудочка, и тестирования потенциальных терапевтических возможностей для продвижения миокарда выздоровление. Кроме того, ограниченное число более ранних исследований изучало влияние деформирования аорты на PH-LHD у крыс и показало, что деформирование аорты может обратить вспять медиальную гипертрофию в легочных артериолах, нормализовать экспрессию препро-эндотелина 1 и улучшить легочную гемодинамику27,28, обеспечивая доказательства обратимости PH у крыс с сердечной недостаточностью. Здесь технические процедуры операции по дебандированию оптимизируются и стандартизируются, например, путем применения трахеотомии вместо эндотрахеальной интубации или путем использования титановых клипс определенного внутреннего диаметра для полосирования аорты вместо полипропиленовых швов тупой иглой26,27, что обеспечивает лучший контроль хирургических процедур, повышенную воспроизводимость модели и улучшенную выживаемость.
С научной точки зрения, значение модели дебандирования PH-LHD заключается не только в демонстрации обратимости сердечно-сосудистого и легочного фенотипа при сердечной недостаточности, но и, что более важно, в выявлении молекулярных драйверов, которые вызывают и / или поддерживают обратное ремоделирование в легочных артериях, в качестве перспективных кандидатов для будущего терапевтического таргетирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (Институт ресурсов лабораторных животных, 8-е издание 2011 года) и одобрены местным правительственным комитетом по уходу за животными и их использованию Государственным ведомством Германии по здравоохранению и социальным вопросам (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Берлин; протокол No. Г0030/18). Во-первых, застойная сердечная недостаточность была хирургически индуцирована у ювенильных крыс Sprague-Dawley ~ 100 г массы тела (bw) (см. Таблицу материалов) путем размещения титанового клипса с внутренним диаметром 0,8 мм на восходящую аорту (аортальная полоса, AoB), как описано ранее29,30. На 3-й неделе после AoB (рисунок 1) была проведена операция по удалению зажима из аорты. Хирургические процедуры и валидация изменения рН у крыс AoB схематично изображены на рисунке 1.
1. Хирургические препараты
- Стерилизуйте необходимые хирургические инструменты (рисунок 2) путем автоклавирования.
- Вводят крысам карпрофен (5 мг/кг веса тела) (см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно (в т..) для обезболивания за 30 мин до операции.
- Обезболить крыс путем внутривенной инъекции кетамина (87 мг/кг веса тела) и ксилазина (13 мг/кг веса тела).
- Удалите шерсть с декольте и груди животного с помощью электробритвы.
- Нанесите каплю глазной мази для защиты глаз во время операции.
- Поместите крысу в лежачее положение на стерилизованном хирургическом столе. Аккуратно зафиксируйте живот и конечности животного скотчем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания температуры тела поместите нагревательный коврик при температуре 37 °C под хирургический стол. Избегайте нагрева области головы, чтобы предотвратить пересыхание глаз. - Дезинфицировать кожу животных раствором повидон-йода/йодофора. Обратите внимание на шрамы и швы от первичной операции AoB и задрапируйте хирургическое поле.
- Обеспечьте достаточную глубину анестезии путем защемления пальцев ног.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина анестезии должна регулярно контролироваться во время операции.
2. Трахеотомия и искусственная вентиляция легких
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции меняйте перчатки после работы с нестерильным оборудованием.
- Тонкими ножницами (рисунок 2А) сделайте шейный разрез средней линии длиной 7-10 мм (рисунок 3А).
- С помощью пары тупых щипцов (рисунок 2B') рассекните мягкие ткани шейки матки, чтобы обнажить инфрагиоидные мышцы. Расщепление мышц по средней линии для визуализации трахеи. Отрежьте и снимите шов после первичной операции AoB.
- Сделайте разрез трахеи ~2 мм между двумя хрящевыми кольцами с помощью угловых пружинных ножниц Noyes (рисунок 2C,3B). Вставьте в трахею канюлю наружного диаметра 2 мм (рисунок 2D) и закрепите ее шелковым швом 4-0 (рисунок 2E,3C).
- Подключите канюлю трахеи к аппарату искусственной вентиляции легких (см. Таблицу материалов), сведя мертвое пространство к минимуму (рисунок 3D-E). Держите периоперационную вентиляцию легких со скоростью дыхания 90 вдохов / мин при приливном объеме (Vt) 8,5 мл / кг веса тела.
3. Деформирование аорты
- Сделайте разрез кожи длиной ~20 мм между вторым и третьим ребрами с помощью тонких ножниц (рисунок 3F).
- С помощью небольших хирургических ножниц (рисунок 2F) аккуратно распределите мышцы и разрезайте их слой за слоем (рисунок 3G). Сделайте боковой разрез 10 мм вдоль межреберного пространства между вторым и третьим ребром.
ПРИМЕЧАНИЕ: К средней грудной линии нужно осторожно подходить, чтобы избежать кровотечения. - Используйте реберный распределитель (рисунок 2G) для расширения межреберного пространства между вторым и третьим ребром для создания хирургического окна (рисунок 3H).
- С помощью тупых щипцов (рисунок 2B,B') осторожно отделите тимус от сердца и впустите артерии, чтобы визуализировать аорту с помощью клипсы (рисунок 4A).
- Удерживайте зажим с помощью щипцов и осторожно удалите соединительную ткань вокруг зажима, чтобы обнажить его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте удержания или подъема аорты щипцами, так как это может повредить аорту, что приведет к кровотечению и летальному исходу. - С помощью держателя иглы (рисунок 2H) откройте зажим (рисунок 4B) и извлеките его из грудной полости.
- Прежде чем закрыть грудную клетку, вскройте ателектаз легких, обеспечьте адекватный набор легких без чрезмерного раздражения, продолжайте искусственную вентиляцию легких с Vt 9,5 мл / кг веса тела в течение еще 10 минут и вернитесь к Vt 8,5 мл / кг bw, чтобы набрать легкие и разрешить возможный пневмоторакс.
- Закройте глубокие мышцы простым прерванным швом с использованием шелка 4-0. Затем соедините верхние мышцы и кожу простым непрерывным швом (рисунок 5A,B).
4. Экстубация трахеи
- Отсоедините канюлю трахеи от вентиляционной машины. Внимательно наблюдайте за крысой до тех пор, пока спонтанное дыхание не восстановится. Если животное не может дышать спонтанно при отключении, снова подключите вентилятор и продолжайте вентиляцию в течение дополнительных 5 минут. Затем повторите процедуру.
- После восстановления спонтанного дыхания удалите канюлю из трахеи и очистите жидкость вокруг трахеи губчатыми точками (рисунок 2I) (см. Таблицу материалов).
- Закройте трахею простым швом, используя 6-0 пролена (рисунок 2E' и рисунок 5C). Затем закройте инфрагиоидные мышцы простым прерванным швом с помощью шелка 4-0 (рисунок 5D) и соедините кожу в простой непрерывный шов (рисунок 5E). Очищайте и дезинфицируйте мышцы и кожу во время процесса раствором повидон-йод/йодофор.
5. Послеоперационный уход
- После завершения хирургической процедуры осторожно переместите животное в клетку восстановления с дополнительным кислородом и инфракрасной лампой, чтобы держать животных в тепле и достаточном количестве кислорода во время фазы восстановления. Поместите кислородную маску близко к морде крысы. В любое время держите только одно животное в клетке восстановления.
- После того, как животное проснется, осторожно переместите его в обычную клетку, снабженную водой и едой. В течение следующих 12 ч контролируйте состояние здоровья прооперированного животного с интервалом в 2 ч.
- После завершения хирургической процедуры ежедневно применяют анальгезию путем внутривенной инъекции карпрофена (5 мг/кг веса тела) в течение одной недели.
- Чтобы избежать бактериальной инфекции, вводите амоксициллин (500 мг / л) в питьевую воду в течение одной недели после операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во-первых, успешная деформирование аорты была подтверждена трансторакальной эхокардиографией, выполненной до и после процедуры дебандирования у животных AoB (рисунок 6). С этой целью дуга аорты была оценена в виде B-режима парастернальной длинной оси (PLAX). Было визуализировано положение клипса на восходящей аорте у животных AoB и его отсутствие после операции Deb (рисунок 6A,B). Затем аортальный кровоток оценивали с помощью импульсно-волновой допплерографии (рисунок 6C-F). Пиковая скорость кровотока у животных AoB, измеренная до и после клипа, составила 733,24 ± 17,39 мм / с и 5215,08 ± 48,05 мм / с (n = 8 животных) соответственно (рисунок 6C, E), демонстрируя крутой градиент по всему участку AoB. После удаления клипа пиковая скорость кровотока составляла 1093,79 ± 28,97 мм/с и 2578,73 ± 42,27 мм/с соответственно в соответствующих местах аорты, показывая заметное затухание градиента в соответствии с функциональным распутыванием (рисунок 6D,F). Чтобы исследовать обращение вспять левой сердечной недостаточности путем де-де-полосации аорты, уровни экспрессии натрийуретического пептида мозга (BNP), клинического рутинного параметра для оценки сердечных заболеваний31, были доступны в миокарде ЛЖ. На 3 и 5 неделях после полосирования аорты животные AoB показали значительно повышенную выработку BNP по сравнению с фиктивным контролем. Напротив, крысы Deb на 5-й неделе экспрессировали BNP на уровнях, сопоставимых с фиктивными животными, что указывает на обращение вспять отказа РН путем деформирования аорты (рисунок 7A-C). Параллельно оценка функции ЛЖ с помощью трансторакальной эхокардиографии выявила увеличение фракции выброса ЛЖ и объема ЛЖ у животных Deb по сравнению с крысами AoB (рисунок 7D-E). В то время как фракция выброса LV у животных Deb была сопоставима с фиктивными крысами, объем LV у крыс Deb не смог полностью нормализоваться до значений, наблюдаемых в фиктивной группе, что указывает на то, что изменение функции LV является неполным.
Чтобы выяснить, могут ли животные Deb служить доклинической моделью для изучения обратного легочного сосудистого и правожелудочкового (RV) ремоделирования в PH-LHD, систолическое давление левого желудочка (LVSP) и систолическое давление правого желудочка (RVSP), оценивали с помощью катетера Миллара с микроконтинком. Короче говоря, крыс снова анестезировали кетамином (87 мг / кг веса тела) и ксилазином (13 мг / кг веса тела), трахеотомизировали и вентилировали, как описано выше. Катетеризацию сердца проводили после срединной торакотомии32 через вершину (первого) левого и (второго) правого желудочка соответственно, так как прямая катетеризация левого желудочка по сосудистому пути предотвращается аортальным бандажем у животных AoB. После эвтаназии передозировкой кетамина / ксилазина сердце было иссечено, а гипертрофия желудочков оценивалась как вес левого желудочка, включая перегородку (LV + S) или правый желудочек (RV), нормализованный до массы тела (BW). В соответствии с AoB крысами в качестве установленной модели для PH-LHD, животные AoB показали значительно повышенную гипертрофию LVSP и RV и LV и RV по сравнению с животными с фиктивной операцией через 3 недели после операции (рисунок 8A-F). Операция debanding (Deb), выполненная на 3-й неделе после AoB, привела к значительному снижению гипертрофии LVSP и LV по сравнению с животными AoB без Deb на 3-й неделе и неделе 5 после AoB, демонстрируя, что нормализация гемодинамики LV после удаления клипа из аорты изменила ремоделирование LV (рисунок 8C, D). По сравнению с крысами AoB на 3-й и 5-й неделях, животные Deb также показали значительное снижение RVSP и RV / BW, продемонстрировав успешное обращение PH-LHD (рисунок 8E, F). Примечательно, что RVSP у крыс Deb был сопоставим со значениями, измеренными у фиктивных животных, что указывает на полную нормализацию гемодинамики RV. Напротив, гипертрофия RV у животных Deb была лишь частично обращена вспять с RV / BW, оставаясь значительно увеличенной по сравнению с фиктивной контрольной группой (рисунок 8E, F).
Рисунок 1: Схематическое изображение хирургических процедур и валидация изменения рН у крыс AoB. На схеме изображены различные экспериментальные группы, используемые в настоящем исследовании для проверки того, обращает ли операция по дебандингу вспять PH-LHD. Фиктивные, фиктивные средства управления; AoB, полосатость аорты; Деб, дебандинг. Треугольники обозначают временную точку хирургических вмешательств: первичная операция (фиктивная или AoB; красная) на 0-й неделе и вторичная операция (Deb; зеленая) на 3-й неделе. Круги обозначают конечные точки анализа, при которых PH-LHD оценивался с помощью измерений давления LV и RV и гипертрофии соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Хирургические инструменты. (А) Тонкие ножницы Карбид вольфрама. (B) Щипцы Moria Iris и (B') зазубренные щипцы Graefe. Кончики щипцов показаны увеличенными. (C) Пружинные ножницы Noyes. (D) Трахеальная канюля. (E, E') 4-0 и 6-0 швов соответственно. (F) Тонкие ножницы Карбид вольфрама. (G) Реберный разбрасыватель. (H) Держатель иглы Матье. (I) Губчатые точки ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Трахеотомия и торакотомия. Изображения иллюстрируют хирургические этапы трахеотомии. (A) Разрез средней линии шейки матки. (B) Разрез трахеи между двумя хрящевыми кольцами. (C) Трахеальная канюля, вставленная в трахею и закрепленная швом. (D) Трахеальная канюля соединена с аппаратом искусственной вентиляции легких. (E) Изображения иллюстрируют хирургические этапы торакотомии. (F) Разрез кожи между вторым и третьим ребрами. (G) Резка мышц. H) Создание торакального хирургического окна путем разведения второго и третьего ребер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Визуализация аортально-сужающего зажима in vivo и ex vivo. (A) На изображении показана грудная полость крысы AoB с титановым зажимом, помещенным на восходящую аорту. (B) На изображении показан закрытый и открытый клип ex vivo. Звездочкой отмечена часть зажима, которую держатель иглы сжимает in vivo , чтобы открыть зажим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Закрытие раны. Изображения иллюстрируют закрытие верхних грудных мышц (А) и кожи (В) простым непрерывным швом. Трахея (C) и инфрагиоидные мышцы (D) закрываются простым швом, а кожа на шее (E) — простым непрерывным швом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Кровоток аорты до и после операции по обезвреживанию. (A-B) Визуализация восходящей аорты у крысы с аортальной полосой (AoB, слева) и крысы после операции по дебандингу (Deb, справа) с помощью трансторакальной эхокардиографии. Стрелка показывает титановый зажим на аорте в (А) отсутствует в (В). (С,Г) Импульсно-волновые допплеровские эхокардиографические изображения показывают кровоток перед клипом у крысы AoB (C) и кровоток в соответствующем сегменте аорты у крысы Deb (D), взятый за день до и через день после операции по дебандированию аорты, соответственно. (Э,Ф) Аналогичным образом, изображения показывают кровоток в сегменте аорты после клипа у крысы AoB (E) и в соответствующем сегменте аорты у крысы Deb (F), сделанной за день до и через день после операции по дебантингу аорты, соответственно. Бирюзовые вертикальные линии иллюстрируют измерения пиковой скорости потока аорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Нормализация функции левого желудочка путем деформирования аорты. (A) Репрезентативные вестерн-блоты показывают уровни белка BNP и с GAPDH в качестве контроля нагрузки в левых желудочках (LV) крыс AoB на 3-й неделе после полосирования аорты (n = 5) и в соответствующих фиктивных контрольных группах (n = 5). (B) Репрезентативные вестерн-блоты показывают BNP и GAPDH в левых желудочках (LV) крыс AoB на 5-й неделе после бандажирования аорты (n = 4), у крыс Deb на 5-й неделе (n = 5) и в фиктивной контрольной группе в соответствующее время после первичной операции (n = 4). (C) Графики коробки и усов показывают количественную оценку экспрессии BNP, нормализованной до GAPDH и фиктивного контроля в соответствующее время после первичной операции. На полях показаны медианы, 25 и 75 процентилей соответственно; усы обозначают минимальное и максимальное значения. Для статистического анализа использовался t-тест33 Стьюдента. *p-значение < 0,05. (D) Гистограммы (среднее ± стандартное отклонение) показывают фракцию и объем выброса РН в фиктивном (n = 4), AoB (n = 9) и Deb (n = 7) животных на 5-й неделе, измеренные эхокардиографией из изображений M- и B-моды. (E) Репрезентативные эхокардиографические изображения m-mode показывают изменения в дробном укорочении LV у животных sham, AoB и Deb на 5-й неделе. Для статистического анализа использовался тест Mann-Whitney U33 . *p-значение < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Желудочковая гемодинамика нормализуется, и сердечная гипертрофия обращается вспять путем де-полосирования аорты. (A) Репрезентативные измерения артериального давления левого желудочка (LV) и правого желудочка (RV) у крыс через 3 недели после полосирования аорты (AoB) по сравнению с соответствующим фиктивным контролем. (B) Репрезентативные изображения показывают гипертрофию сердца у крысы AoB через 3 недели после полосирования аорты по сравнению с фиктивным контролем. (С-Ф) Графики коробки и усов показывают систолическое давление левого желудочка (LVSP; C), гипертрофия ЛЖ ([LV+S]/BW; D), правожелудочковое систолическое давление (RVSP; E) и гипертрофия RV (RV/BW; F) у фиктивных и AoB животных через 3 и 5 недель после операции и нормализованные параметры (по сравнению с 3- и 5-недельными группами AoB) у крыс Deb. На полях показаны медианы, 25 и 75 процентилей соответственно; усы обозначают минимальное и максимальное значения. n = 9-12 животных были проанализированы для гемодинамических измерений, а масса сердца была измерена в n = 7-12 крыс на группу. Для статистического анализа использовался тест Манна-Уитни U. *p-значение < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь сообщается о подробном хирургическом методе деформирования аорты в модели AoB крысы, который может быть использован для исследования обратимости PH-LHD и клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют обратным ремоделированием в легочной сосудистой системе и RV. Три недели сужения аорты у ювенильных крыс приводят к тому, что PH-LHD проявляется в повышении давления ЛЖ, гипертрофии ЛЖ и одновременном повышении давления RV и гипертрофии RV. Деформирование аорты на 3-й неделе после AoB смогло разгрузить LV и полностью обратить вспять гипертрофию LV в течение двух недель после Deb. Параллельно деформирование аорты также вызвало полную нормализацию давления RV и частичное обращение вспять гипертрофии RV.
Таким образом, настоящая модель имитирует критические аспекты клинического сценария, когда ранее было обнаружено, что механическая разгрузка ЛЖ имплантируемым непульсатильным LVAD со свойствами непрерывного потока обращает вспять PH у пациентов с сердечной недостаточностью34,35. В ретроспективном анализе было показано, что поддержка LVAD снижает давление в легочной артерии до аналогичной степени у пациентов с сердечной недостаточностью с обратимым или фиксированным PH, с фиксированным PH, определяемым как среднее легочное артериальное давление >25 мм рт.ст., легочное сосудистое сопротивление >2,5 Wood Unit и среднее давление транспульмонального градиента >12 мм рт.ст., несмотря на фармакологическое лечение35. Важно отметить, что эти результаты34,35 предоставляют косвенные доказательства того, что разгрузка левого желудочка не только уменьшает пассивный легочный застой и вторичные изменения сосудистого тонуса легких, но и вызывает обратное ремоделирование легочной сосудистой системы с помощью «физиологических» механизмов, то есть путем адаптации к измененной гемодинамике. Углубленный мультиомический анализ клеточных и молекулярных процессов, которые управляют обратным ремоделированием в легочной сосудистой системе, может открыть новые возможности для выявления новых терапевтических вариантов лечения ЛГ у пациентов с сердечной недостаточностью и, возможно, также при других формах ЛГ, включая ЛАГ. Настоящая модель дебандинга у крыс AoB предоставляет уникальную возможность для таких анализов, поскольку полная нормализация RVSP подтверждает эффективное обращение вспять PH, что позволяет проводить механистические исследования для выявления путей, обладающих способностью восстанавливать гомеостатические процессы в пораженной легочной сосудистой системе.
С аналогичным обоснованием настоящая модель может быть дополнительно использована для изучения внутри- и межклеточных процессов, которые приводят к обратному ремоделированию RV. функция RV недавно была признана важным предиктором прогноза заболеваемости и смертности при сердечно-сосудистых заболеваниях. Тем не менее, ни одна терапия не была клинически одобрена для улучшения функции RV36. Таким образом, способность изучать процессы обратного ремоделирования в миокарде RV на животной модели предоставляет уникальную возможность устранить значительный пробел в знаниях и критическую медицинскую потребность.
Успех технически сложной процедуры деформирования аорты у крыс AoB зависит от хирургических навыков и точных периоперационных стратегий. Ниже описаны критические этапы хирургической процедуры, которые могут вызвать периоперационную летальность из-за чрезмерного кровотечения (1-5) или недостаточного дыхания (6), и рекомендации по предотвращению этих осложнений.
(1) Во время торакотомии к средней грудной линии необходимо осторожно подходить ножницами, чтобы избежать травмирования внутренней молочной артерии. (2) Чтобы визуализировать сердце и артерии канала, тимус должен быть мобилизован и осторожно перемещен в черепном направлении. В операции по дебандингу ткань тимуса часто соединяется с сердцем и артериями через послеоперационные спайки от первоначальной операции AoB. Эти спайки должны быть тщательно разделены парой тупых щипцов, чтобы избежать травмирования сердечно-сосудистых структур. (3) В операции по дебандированию аорта с зажимом часто внедряется в соединительную ткань. Эта соединительная ткань должна быть аккуратно рассечена тупыми щипцами, чтобы визуализировать клипсу. Здесь трансторакальная эхокардиография, выполненная перед операцией, является полезным подготовительным этапом, позволяющим определить, расположен ли клипса близко к корню аорты, в середине восходящей аорты или близко к брахиоцефальной артерии. Эти знания экономят драгоценное время на выделение клипс во время операции. (4) Ориентация зажима является критическим шагом, который необходимо тщательно рассмотреть во время первоначальной операции по перевязке аорты. Для облегчения оптимальной оценки и быстрого вскрытия зажима во время распутывания аорты часть, которую необходимо сжать держателем иглы (рисунок 4B), должна быть ориентирована вентрально. Клипсовая переориентация во время операции по дебандингу возможна, хотя и с риском травмирования аорты. Для переориентации клипсы нужно удерживать щипцами, при этом окружающие соединительные ткани аккуратно удаляют, затем клипсу следует мобилизовать и повернуть. Следует избегать удержания аорты щипцами. (5) Для снятия зажим должен удерживаться щипцами одной рукой и открываться держателем иглы другой рукой. Аорту не нужно поднимать вентрально. (6) После завершения процедуры удаления экстубированные крысы PH-LHD подвергаются значительному риску дыхательной недостаточности, причем животные обычно умирают в течение 10-20 минут после операции, все еще находясь под анестезией. Ателектаз левого легкого является наиболее распространенной причиной смерти в этот период, а длительная механическая вентиляция перед закрытием грудной клетки помогает набрать легкое и обеспечить достаточное дыхание после операции.
Мы также предполагаем, что по сравнению с эндотрахеальной интубацией, выполненной в предыдущих исследованиях26,27, трахеостомия обеспечивает лучший контроль соответствующей вентиляции во время хирургических процедур, что особенно актуально во время деформирования аорты. Это понятие основано на следующем обосновании: (1) Трахеостомия, обычно выполняемая в нашей лаборатории для периоперационной вентиляции легких, является простым и безопасным методом без периоперационных или послеоперационных осложнений. (2) Трахеостомия исключает риск интубации пищевода или травмы трахеи; обеспечивает точное позиционирование и фиксацию канюли трахеи и постоянный визуальный контроль канюли на всех этапах хирургической процедуры. (3) На момент деформирования аорты животные AoB уже находятся в состоянии сердечной недостаточности и более чувствительны к дополнительному стрессу; в результате потенциальные риски, связанные с эндотрахеальной интубацией, могут привести к увеличению летальности. (4) Наконец, когда оперированное животное отлучается от вентилятора, но у него не развивается спонтанное дыхание, трахеостомия позволяет быстро реинтубировать и воссоединяться с вентилятором, тем самым потенциально спасая жизни из-за способности к длительной послеоперационной вентиляции.
В настоящем исследовании сообщается о методе дебандирования аорты, выполненном через 3 недели после первоначального полосирования аорты у крыс. Для исследований, направленных на сравнение обратного ремоделирования легочной сосудистой системы и RV на разных стадиях PH, описанные процедуры также могут быть выполнены в более поздние моменты времени после полосирования аорты. Тем не менее, осторожность оправдана, поскольку рубцовая и соединительная ткань, окружающая аорту, вероятно, со временем станут более обильными, что еще больше усложнит процедуру и потребует дополнительного устранения неполадок и уточнения. В то же время основные принципы сообщенного протокола по-прежнему применяются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить. Все соавторы ознакомились и согласны с содержанием рукописи.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами DZHK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований) CK и WMK, BMBF (Министерство образования и исследований Германии) CK в рамках VasBio и WMK в рамках VasBio, SYMPATH и PROVID, а также Немецкого исследовательского фонда (DFG) для WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 и KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
References
- Rosenkranz, S., et al. Pulmonary hypertension due to left heart disease: Updated recommendations of the cologne consensus conference 2011. International Journal of Cardiology. 154, Suppl 1 34-44 (2011).
- Rosenkranz, S., et al. Left ventricular heart failure and pulmonary hypertension. European Heart Journal. 37 (12), 942-954 (2016).
- Fayyaz, A. U., et al. Global Pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension associated with heart failure and preserved or reduced ejection fraction. Circulation. 137 (17), 1796-1810 (2018).
- Hunt, J. M., et al. Pulmonary veins in the normal lung and pulmonary hypertension due to left heart disease. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (10), 725-736 (2013).
- Bursi, F., et al. Pulmonary pressures and death in heart failure: A community study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 222-231 (2012).
- Ryan, J. J., et al. Right ventricular adaptation and failure in pulmonary arterial hypertension. Canadian Journal of Cardiology. 31 (4), 391-406 (2015).
- Miller, W. L., Mahoney, D. W., Enriquez-Sarano, M. Quantitative Doppler-echocardiographic imaging and clinical outcomes with left ventricular systolic dysfunction: Independent effect of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 7 (2), 330-336 (2014).
- Kjaergaard, J., et al. Prognostic importance of pulmonary hypertension in patients with heart failure. The American Journal of Cardiology. 99 (8), 1146-1150 (2007).
- Shah, R., et al. Pulmonary hypertension after heart transplantation in patients bridged with the total artificial heart. ASAIO Journal. 62 (1), 69-73 (2016).
- Tracy, G. P., Proctor, M. S., Hizny, C. S. Reversibility of pulmonary artery hypertension in aortic stenosis after aortic valve replacement. The Annals of Thoracic Surgery. 50 (1), 89-93 (1990).
- Lindelow, B., Andersson, B., Waagstein, F., Bergh, C. H. High and low pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates. A 5-year follow-up after heart transplantation shows continuous reduction in resistance and no difference in complication rate. European Heart Journal. 20 (2), 148-156 (1999).
- Martin, J., et al. Implantable left ventricular assist device for treatment of pulmonary hypertension in candidates for orthotopic heart transplantation-a preliminary study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 25 (6), 971-977 (2004).
- Gallagher, R. C., et al. Univentricular support results in reduction of pulmonary resistance and improved right ventricular function. ASAIO Transactions. 37 (3), 287-288 (1991).
- Beyersdorf, F., Schlensak, C., Berchtold-Herz, M., Trummer, G. Regression of "fixed" pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates after unloading with ventricular assist devices. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (4), 747-749 (2010).
- Hoffmann, J., et al. Mast cells promote lung vascular remodelling in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 37 (6), 1400-1410 (2011).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91 (10), 2642-2654 (1995).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- de Montgolfier, O., et al. High Systolic blood pressure induces cerebral microvascular endothelial dysfunction, neurovascular unit damage, and cognitive decline in mice. Hypertension. 73 (1), 217-228 (2019).
- Breitling, S., Ravindran, K., Goldenberg, N. M., Kuebler, W. M. The pathophysiology of pulmonary hypertension in left heart disease. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (9), 924-941 (2015).
- Ranchoux, B., et al. Metabolic syndrome exacerbates pulmonary hypertension due to left heart disease. Circulation Research. 125 (4), 449-466 (2019).
- Zhang, H., Huang, W., Liu, H., Zheng, Y., Liao, L. Mechanical stretching of pulmonary vein stimulates matrix metalloproteinase-9 and transforming growth factor-beta1 through stretch-activated channel/MAPK pathways in pulmonary hypertension due to left heart disease model rats. PLoS One. 15, 0235824 (2020).
- Yin, J., et al. Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure. Circulation: Heart Failure. 4 (2), 198-206 (2011).
- Yin, N., et al. Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease. Critical Care Medicine. 37 (3), 980-986 (2009).
- Breitling, S., et al. The mast cell-B cell axis in lung vascular remodeling and pulmonary hypertension. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (5), 710-721 (2017).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: Role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circulation Research. 106 (6), 1103-1116 (2010).
- Goncalves-Rodrigues, P., Miranda-Silva, D., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Studying left ventricular reverse remodeling by aortic debanding in rodents. Journal of Visualized Experiments. (173), e60036 (2021).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9, 2956 (2019).
- Chou, S. H., et al. The effects of debanding on the lung expression of ET-1, eNOS, and cGMP in rats with left ventricular pressure overload. Experimental Biology and Medicine. 231 (6), 954-959 (2006).
- Hentschel, T., et al. Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure. Anesthesiology. 106 (1), 124-131 (2007).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. Journal of Visualized Experiments. (88), e50983 (2014).
- Angermann, C. E., Ertl, G. Natriuretic peptides--new diagnostic markers in heart disease. Herz. 29 (6), 609-617 (2004).
- Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. American Association for Laboratory Animal Science. 47 (5), 44-46 (2008).
- Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , 1-54 (2013).
- Etz, C. D., et al. Medically refractory pulmonary hypertension: treatment with nonpulsatile left ventricular assist devices. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (5), 1697-1705 (2007).
- Mikus, E., et al. Reversibility of fixed pulmonary hypertension in left ventricular assist device support recipients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 971-977 (2011).
- Zelt, J. G. E., Chaudhary, K. R., Cadete, V. J., Mielniczuk, L. M., Stewart, D. J. Medical therapy for heart failure associated with pulmonary hypertension. Circulation Research. 124 (11), 1551-1567 (2019).
