Summary
Den nuværende protokol beskriver en kirurgisk procedure for at fjerne stigende aortabånd i en rottemodel af pulmonal hypertension på grund af venstre hjertesygdom. Denne teknik studerer endogene mekanismer for omvendt ombygning i lungecirkulationen og det højre hjerte og informerer således strategier til at vende pulmonal hypertension og / eller højre ventrikulær dysfunktion.
Abstract
Pulmonal hypertension på grund af venstre hjertesygdom (PH-LHD) er den mest almindelige form for PH, men dens patofysiologi er dårligt karakteriseret end pulmonal arteriel hypertension (PAH). Som følge heraf mangler godkendte terapeutiske interventioner til behandling eller forebyggelse af PH-LHD. Medicin, der anvendes til behandling af PH hos PAH-patienter, anbefales ikke til behandling af PH-LHD, da nedsat pulmonal vaskulær resistens (PVR) og øget lungeblodstrøm i nærvær af øget venstresidig påfyldningstryk kan forårsage venstre hjertedekompensation og lungeødem. Der skal udvikles nye strategier for at vende PH hos LHD-patienter. I modsætning til PAH udvikler PH-LHD sig på grund af øget mekanisk belastning forårsaget af overbelastning af blod i lungecirkulationen under venstre hjertesvigt. Klinisk normaliserer mekanisk losning af venstre ventrikel (LV) ved udskiftning af aortaklappen hos patienter med aortastenose eller ved implantation af LV-hjælpemidler hos patienter med hjertesvigt i slutstadiet ikke kun pulmonal arteriel og højre ventrikulær (RV) tryk, men også PVR, hvilket giver indirekte bevis for omvendt ombygning i lungevaskulaturen. Ved hjælp af en etableret rottemodel af PH-LHD på grund af venstre hjertesvigt udløst af trykoverbelastning med efterfølgende udvikling af PH udvikles en model til at studere de molekylære og cellulære mekanismer i denne fysiologiske omvendte ombygningsproces. Specifikt blev der udført en aortanedbrydende operation, hvilket resulterede i omvendt ombygning af LV-myokardiet og dets losning. Parallelt hermed kunne fuldstændig normalisering af RV systolisk tryk og signifikant, men ufuldstændig reversering af RV-hypertrofi påvises. Denne model kan udgøre et værdifuldt værktøj til at studere mekanismerne for fysiologisk omvendt ombygning i lungecirkulationen og RV med det formål at udvikle terapeutiske strategier til behandling af PH-LHD og andre former for PH.
Introduction
Hjertesvigt er den hyppigste dødsårsag i de udviklede lande og forventes at stige med 25 % i løbet af det næste årti. Pulmonal hypertension (PH) - en patologisk stigning i blodtrykket i lungecirkulationen - påvirker ca. 70% af patienterne med hjertesvigt i slutstadiet; Verdenssundhedsorganisationen klassificerer PH som pulmonal hypertension på grund af venstre hjertesygdom (PH-LHD)1. PH-LHD initieres af nedsat systolisk og / eller diastolisk venstre ventrikulær (LV) funktion, der resulterer i forhøjet påfyldningstryk og passiv overbelastning af blod i lungecirkulationen2. Selvom ph-LHD oprindeligt er reversibel, bliver den gradvist fikseret på grund af aktiv pulmonal vaskulær ombygning i alle rum i lungecirkulationen, dvs. arterier, kapillærer og vener 3,4. Både reversibel og fast PH øger RV-efterbelastning, hvilket oprindeligt driver adaptiv myokardiehypertrofi, men i sidste ende forårsager RV-dilatation, hypokinesis, fibrose og dekompensation, der gradvist fører til RV-svigt 1,2,5,6. Som sådan fremskynder PH sygdomsprogression hos hjertesvigtpatienter og øger dødeligheden, især hos patienter, der gennemgår kirurgisk behandling ved implantation af venstre ventrikulære hjælpemidler (LVAD) og / eller hjertetransplantation 7,8,9. I øjeblikket findes der ingen helbredende terapier, der kan vende processen med pulmonal vaskulær ombygning, så grundlæggende mekanistisk forskning i passende modelsystemer er nødvendig.
Det er vigtigt, at kliniske undersøgelser viser, at PH-LHD som en hyppig komplikation hos patienter med aortastenose kan forbedres hurtigt i den tidlige postoperative periode efter udskiftning af aortaklappen10. Tilsvarende blev høj (>3 Træenheder) præoperativ lunge vaskulær resistens (PVR), der imidlertid var reversibel på nitroprussid, bæredygtigt normaliseret efter hjertetransplantation i en 5-årig opfølgningsundersøgelse11. Tilsvarende kunne en passende reduktion af både reversibel og fast PVR og forbedring af RV-funktionen hos LHD-patienter realiseres inden for flere måneder ved at aflæse venstre ventrikel ved hjælp af implanterbare pulsatile og ikke-pulsatile ventrikulære hjælpemidler 12,13,14. I øjeblikket er de cellulære og molekylære mekanismer, der driver omvendt ombygning i lungecirkulationen og RV-myokardiet, uklare. Alligevel kan deres forståelse give vigtig indsigt i fysiologiske veje, der kan udnyttes terapeutisk til at vende lungevask og RV-ombygning i PH-LHD og andre former for PH.
En egnet præklinisk model, der i tilstrækkelig grad replikerer de patofysiologiske og molekylære egenskaber ved PH-LHD, kan anvendes til translationelle undersøgelser i trykoverbelastningsinduceret kongestiv hjertesvigt på grund af kirurgisk aortabånd (AoB) hos rotter 4,15,16. I sammenligning med lignende hjertesvigt på grund af trykoverbelastning i murinmodellen af tværgående aortaforsnævring (TAC)17 producerer banding af den stigende aorta over aortaroden hos AoB-rotter ikke hypertension i venstre halspulsåre, da bandingsstedet er proximalt for udstrømningen af venstre halspulsåre fra aorta. Som følge heraf forårsager AoB ikke venstresidig neuronal skade i cortex, som det er karakteristisk for TAC18, og som kan påvirke undersøgelsesresultatet. Sammenlignet med andre gnavermodeller af kirurgisk induceret PH-LHD viser rottemodeller generelt og AoB i særdeleshed sig at være mere robuste, reproducerbare og replikere ombygningen af lungecirkulationskarakteristikken for PH-LHD-patienter. Samtidig er perioperativ dødelighed lav19. Øget LV-tryk og LV-dysfunktion hos AoB-rotter inducerer PH-LHD-udvikling, hvilket resulterer i forhøjet RV-tryk og RV-ombygning. Som sådan har AoB-rottemodellen vist sig yderst nyttig i en række tidligere undersøgelser af uafhængige grupper, herunder os selv, til at identificere patomekanismer af lunge vaskulær ombygning og teste potentielle behandlingsstrategier for PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.
I denne undersøgelse blev AoB-rottemodellen brugt til at etablere en kirurgisk procedure for aortadebanding for at studere mekanismer til omvendt ombygning i lungevaskulaturen og RV. Tidligere er myokardie-omvendt remodelingsmodeller såsom aortabanding hos mus26 og rotter27 blevet udviklet til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer regressionen af venstre ventrikulær hypertrofi og teste potentielle terapeutiske muligheder for at fremme myokardie Opsving. Desuden har et begrænset antal tidligere undersøgelser undersøgt virkningerne af aortadebanding på PH-LHD hos rotter og vist, at aortadebanding kan vende medial hypertrofi i lungearterioler, normalisere ekspressionen af pre-pro-endothelin 1 og forbedre lungehæmodynamik27,28, hvilket giver bevis for reversibiliteten af PH hos rotter med hjertesvigt. Her optimeres og standardiseres de tekniske procedurer for debanding kirurgi, f.eks. ved at anvende en trakeotomi i stedet for endotracheal intubation eller ved at anvende titaniumclips med en defineret indre diameter til aortabånd i stedet for polypropylensuturer med en stump nål26,27, hvilket giver bedre kontrol med de kirurgiske procedurer, øget reproducerbarhed af modellen og en forbedret overlevelsesrate.
Fra et videnskabeligt perspektiv ligger betydningen af PH-LHD-debanding-modellen ikke kun i at demonstrere reversibiliteten af den kardiovaskulære og lungefænotype ved hjertesvigt, men endnu vigtigere i identifikationen af molekylære drivere, der udløser og / eller opretholder omvendt ombygning i lungearterier som lovende kandidater til fremtidig terapeutisk målretning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i henhold til "Vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr" (Institute of Laboratory Animal Resources, 8. udgave 2011) og godkendt af det lokale statslige dyrepleje- og brugsudvalg under det tyske statskontor for sundhed og sociale anliggender (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin; protokol nr. G0030/18). For det første blev kongestiv hjertesvigt kirurgisk induceret hos juvenil Sprague-Dawley rotter ~ 100 g legemsvægt (bw) (se materialetabel) ved at placere en titaniumklemme med en indre diameter på 0,8 mm på den stigende aorta (aortabånd, AoB) som beskrevet tidligere29,30. I uge 3 efter AoB (figur 1) blev debanding (Deb) kirurgi udført for at fjerne klippet fra aorta. De kirurgiske procedurer og validering af PH-vending hos AoB-rotter udført er skematisk afbildet i figur 1.
1. Kirurgiske præparater
- Steriliser de nødvendige kirurgiske instrumenter (figur 2) ved autoklavering.
- Indsprøjt rotte med carprofen (5 mg/kg legemsvægt) intraperitonealt (i.p.) for analgesi 30 minutter før operationen.
- Bedøv rotte ved i.p. injektion af ketamin (87 mg/kg legemsvægt) og xylazin (13 mg/kg legemsvægt).
- Fjern håret fra dyrets halsudskæring og bryst ved hjælp af en elektrisk barbermaskine.
- Påfør en dråbe øjensalve for at beskytte øjnene under operationen.
- Placer rotten i en liggende stilling på et steriliseret kirurgisk bord. Fastgør forsigtigt dyrets mave og lemmer med tape.
BEMÆRK: For at opretholde kropstemperaturen skal du placere en 37 ° C varmemåtte under operationsbordet. Undgå opvarmning af hovedområdet for at forhindre tørring af øjnene. - Desinficere dyrehud med povidon-jod/iodophoropløsning. Bemærk ar og suturer fra den primære AoB-operation og drapere det kirurgiske felt.
- Sørg for tilstrækkelig dybde af anæstesi ved tåknipsning.
BEMÆRK: Dybden af anæstesi skal kontrolleres regelmæssigt under operationen.
2. Trakeotomi og mekanisk ventilation
BEMÆRK: Under hele operationen skal du skifte handsker efter håndtering af ikke-sterilt udstyr.
- Med fin saks (figur 2A) laves et 7-10 mm langt cervikalt midterlinjesnit (figur 3A).
- Ved hjælp af et par stumpe tang (figur 2B') dissekeres det cervikale bløde væv for at udsætte infrahyoidmusklerne. Split muskler i midterlinjen for at visualisere luftrøret. Skær og fjern suturen fra den primære AoB-operation.
- Lav ~ 2 mm luftrørssnit mellem to bruskringe ved hjælp af vinklede Noyes-fjedersakse (figur 2C,3B). Træk trakealkanylen med udvendig diameter 2 mm (figur 2D) ind i luftrøret, og fastgør den med en 4-0 silkesutur (figur 2E,3C).
- Tilslut trakealkanylen til en mekanisk ventilator (se Materialetabel), mens du holder død plads på et minimum (figur 3D-E). Hold perioperativ lungeventilation ved en respirationshastighed på 90 vejrtrækninger / min ved et tidevandsvolumen (Vt) på 8,5 ml / kg legemsvægt.
3. Aorta debanding
- Lav et ~ 20 mm langt hudsnit mellem det andet og tredje ribben ved hjælp af en fin saks (figur 3F).
- Ved hjælp af mindre kirurgisk saks (figur 2F) spredes forsigtigt muskler og skæres lag for lag (figur 3G). Lav et 10 mm lateralt snit langs det interkostale rum mellem den anden og tredje ribben.
BEMÆRK: Den midterste linje skal kontaktes omhyggeligt for at undgå blødning. - Brug en ribbensspreder (figur 2G) til at udvide det interkostale rum mellem det andet og tredje ribben for at skabe et kirurgisk vindue (figur 3H).
- Ved hjælp af stump tang (figur 2B, B') adskilles thymus forsigtigt fra hjerte- og ledningsarterierne for at visualisere aorta med klippet (figur 4A).
- Hold klemmen ved hjælp af tangen, og fjern forsigtigt bindevævet omkring klemmen for at udsætte det.
BEMÆRK: Undgå at holde eller løfte aorta med tangen, da det kan skade aorta, hvilket resulterer i blødning og et dødeligt udfald. - Ved hjælp af en nåleholder (figur 2H) skal du åbne klemmen (figur 4B) og fjerne den fra brysthulen.
- Før du lukker brystet, skal du åbne lungeelektase, sikre tilstrækkelig lungerekruttering uden overdistension, fortsætte mekanisk ventilation med en Vt på 9,5 ml / kg legemsvægt i yderligere 10 minutter og vende tilbage til en Vt på 8,5 ml / kg legemsvægt for at rekruttere lungerne og løse en mulig pneumothorax.
- Luk de dybe muskler med en simpel afbrudt sutur ved hjælp af 4-0 silke. Forbind derefter de øvre muskler og huden med en simpel kontinuerlig sutur (figur 5A, B).
4. Trakeal ekstubation
- Frakobl trakealkanylen fra ventilationsmaskinen. Observer opmærksomt rotten, indtil spontan vejrtrækning er genoprettet. Hvis dyret ikke trækker vejret spontant ved afbrydelse, skal du tilslutte ventilatoren igen og fortsætte med at ventilere i yderligere 5 minutter. Gentag derefter proceduren.
- Når spontan vejrtrækning er genoprettet, skal du fjerne kanylen fra luftrøret og rense væsken omkring luftrøret med svampepunkter (figur 2I) (se Materialetabel).
- Luftrøret lukkes med en simpel sutur med 6-0 prolen (figur 2E' og figur 5C). Luk derefter infrahyoidmuskler i en simpel afbrudt sutur ved hjælp af 4-0 silke (figur 5D), og forbind huden i en simpel kontinuerlig sutur (figur 5E). Rengør og desinficer musklerne og huden under processen med povidon-jod/iodophoropløsning.
5. Postoperativ pleje
- Efter afslutningen af den kirurgiske procedure skal du forsigtigt flytte dyret til et genopretningsbur med supplerende ilt og en infrarød lampe for at holde dyrene varme og tilstrækkeligt iltede i genopretningsfasen. Placer iltmasken tæt på rottens snude. Hold kun ét dyr pr. bjærgningsbur ad gangen.
- Når dyret vågner op, skal du forsigtigt flytte det til et almindeligt bur forsynet med vand og mad. I de næste 12 timer kontrolleres det opererede dyrs sundhedsstatus i intervaller på 2 timer.
- Efter afslutning af den kirurgiske procedure påføres analgesi dagligt ved i.p. injektion af carprofen (5 mg/kg legemsvægt) i en uge.
- For at undgå bakteriel infektion skal amoxicillin (500 mg/l) administreres i drikkevandet i en uge efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første blev vellykket aortadebanding bekræftet ved transthoracisk ekkokardiografi udført før og efter debandingproceduren hos AoB-dyr (figur 6). Til dette formål blev aortabuen vurderet i parasternal lang akse (PLAX) B-mode visning. Placeringen af klippet på den stigende aorta i AoB-dyr og dets fravær efter Deb-operationen blev visualiseret (figur 6A, B). Dernæst blev aorta blodgennemstrømning evalueret ved pulsed-wave Doppler imaging (figur 6C-F). Den maksimale blodgennemstrømningshastighed hos AoB-dyr målt før og efter klippet var henholdsvis 733,24 ± 17,39 mm/s og 5215,08 ± 48,05 mm/s (n = 8 dyr) (figur 6C,E), hvilket viser en stejl gradient over AoB-stedet. Efter klipfjernelse var den maksimale blodgennemstrømningshastighed henholdsvis 1093,79 ± 28,97 mm/s og 2578,73 ± 42,27 mm/s på tilsvarende aortaplaceringer, hvilket viser en markant dæmpning af gradienten i overensstemmelse med funktionel debanding (figur 6D,F). For at undersøge for reversering af venstre hjertesvigt ved aortadebanding blev ekspressionsniveauerne af hjernenatriuretisk peptid (BNP), en klinisk rutineparameter til vurdering af hjertesygdom31, adgang til i LV-myokardiet. I uge 3 og 5 efter aortabanding viste AoB-dyr en signifikant øget produktion af BNP sammenlignet med falske kontroller. I modsætning hertil udtrykte Deb-rotter i uge 5 BNP på niveauer, der kan sammenlignes med falske dyr, hvilket indikerer vending af LV-svigt ved aortabanding (figur 7A-C). Parallelt hermed viste evaluering af LV-funktion ved transthoracisk ekkokardiografi en øget LV-udstødningsfraktion og LV-volumen hos Deb-dyr sammenlignet med AoB-rotter (figur 7D-E). Mens LV-udstødningsfraktionen hos Deb-dyr var sammenlignelig med fuprotter, kunne LV-volumen i Deb-rotter ikke fuldt ud normaliseres til værdier set i sham-gruppen, hvilket indikerer, at vending af LV-funktion er ufuldstændig.
For at undersøge, om Deb-dyr kan tjene som en præklinisk model til undersøgelse af omvendt pulmonal vaskulær og højre ventrikulær (RV) ombygning i PH-LHD, blev venstre ventrikulært systolisk tryk (LVSP) og højre ventrikulært systolisk tryk (RVSP) vurderet ved hjælp af et mikrotip Millar kateter. Kort fortalt blev rotter igen bedøvet med ketamin (87 mg/kg legemsvægt) og xylazin (13 mg/kg legemsvægt), trakeotomiseret og ventileret som beskrevet ovenfor. Hjertekateterisering blev udført efter median thoracotomi32 gennem toppen af henholdsvis (første) venstre og (anden) højre ventrikel, da direkte kateterisering af venstre ventrikel via vaskulær vej forhindres af aortabåndet hos AoB-dyr. Efter eutanasi ved en overdosis af ketamin / xylazin blev hjertet udskåret, og ventrikulær hypertrofi blev vurderet som vægten af venstre ventrikel inklusive septum (LV + S) eller højre ventrikel (RV) normaliseret til kropsvægt (BW). I overensstemmelse med AoB-rotter som en etableret model for PH-LHD viste AoB-dyr en signifikant øget LVSP- og RVSP- og LV- og RV-hypertrofi sammenlignet med skinopererede dyr 3 uger efter operationen (figur 8A-F). Debanding (Deb) kirurgi udført i uge 3 efter AoB resulterede i en signifikant reduktion af både LVSP og LV hypertrofi i forhold til AoB dyr uden Deb i uge 3 og uge 5 post-AoB, hvilket viser, at normalisering af LV hæmodynamik efter klipfjernelse fra aorta omvendt LV-ombygning (figur 8C, D). Sammenlignet med AoB-rotter i uge 3 og uge 5 viste Deb-dyr også en signifikant reduktion i RVSP og RV / BW, hvilket viste vellykket vending af PH-LHD (figur 8E, F). Især var RVSP i Deb-rotter sammenlignelig med værdier målt i shamdyr, hvilket indikerer en fuldstændig normalisering af RV-hæmodynamik. I modsætning hertil blev RV-hypertrofi hos Deb-dyr kun delvist vendt med RV / BW og forblev signifikant øget sammenlignet med falske kontroller (figur 8E, F).
Figur 1: Skematisk repræsentation af de kirurgiske procedurer og validering af PH-vending hos AoB-rotter. Skemaet viser de forskellige eksperimentelle grupper, der anvendes i denne undersøgelse til at teste, om debanding kirurgi vender PH-LHD. Sham, sham-opererede kontroller; AoB, aortabånd; Deb, debanding. Trekanter markerer tidspunktet for kirurgiske indgreb: primær operation (sham eller AoB; rød) i uge 0 og sekundær operation (Deb; grøn) i uge 3. Cirkler markerer slutpunktsanalyserne, hvor PH-LHD blev vurderet ved henholdsvis LV- og RV-tryk og hypertrofimålinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kirurgiske instrumenter. (A) Fin saks Wolframcarbid. (B) Moria Iris tang og (B') Savtakket Graefe tang. Tangens spidser er vist forstørrede. (C) Noyes fjedersaks. (D) Trakeal kanyle. (E, E') henholdsvis 4-0 og 6-0 suturer. (F) Fin saks Wolframcarbid. (G) Ribbensspreder. (H) Mathieu nåleholder. (I) Svampespidsvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Trakeotomi og thoracotomi. Billeder illustrerer de kirurgiske trin for trakeotomien. (A) Cervikal midterlinje snit. (B) Indsnit i luftrøret mellem to bruskringe. (C) Trakeal kanyle indsat i luftrøret og sikret med en sutur. (D) Trakealkanylen er forbundet til en mekanisk ventilator. (E) Billeder illustrerer de kirurgiske trin for thoracotomi. (F) Hudsnit mellem andet og tredje ribben. (G) Skæring af muskler. (H) Oprettelse af et thoraxkirurgisk vindue ved at sprede det andet og det tredje ribben. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visualisering af det aorta-indsnævrende klip in vivo og ex vivo. (A) Billedet viser thoraxhulen hos en AoB-rotte med en titaniumklemme placeret på den stigende aorta. (B) Billedet viser lukket og åbnet klip ex vivo. Stjerne markerer den del af klemmen, som nåleholderen komprimerer in vivo for at åbne klemmen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sårlukning. Billeder illustrerer lukningen af de øvre brystmuskler (A) og huden (B) med en simpel kontinuerlig sutur. Luftrøret (C) og infrahyoideamusklerne (D) lukkes af en simpel sutur og huden på nakken (E) af en simpel kontinuerlig sutur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Aorta blodgennemstrømning før og efter debanding kirurgi. (A-B) Visualisering af den stigende aorta i en rotte med aorta banding (AoB, venstre) og en rotte efter debanding kirurgi (Deb, højre) ved transthoracic ekkokardiografi. Pilen viser titaniumklemmen på aorta i (A) fraværende i (B). (C,D) Pulsed-wave Doppler ekkokardiografiske billeder viser blodgennemstrømning før klippet i en AoB rotte (C) og blodgennemstrømning i det tilsvarende aortasegment i en Deb rotte (D) taget henholdsvis en dag før og en dag efter aortanedbrydningsoperationen. (E,F) Tilsvarende viser billeder blodgennemstrømning i aortasegmentet efter klippet i en AoB-rotte (E) og i det tilsvarende aortasegment i en Deb-rotte (F) taget henholdsvis en dag før og en dag efter aorta-debanding-operationen. Turquois lodrette linjer illustrerer målinger af maksimal aortastrømningshastighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Normalisering af venstre ventrikulær funktion ved aorta debanding. (A) Repræsentative Western blots viser proteinniveauer af BNP og med GAPDH som belastningskontrol i venstre ventrikler (LV) af AoB-rotter i uge 3 efter aortabånd (n = 5) og i tilsvarende skinkontroller (n = 5). (B) Repræsentative Western blots viser BNP og GAPDH i venstre ventrikler (LV) af AoB-rotter i uge 5 efter aortabånd (n = 4), hos Deb-rotter i uge 5 (n = 5) og i sham-kontroller på det tilsvarende tidspunkt efter primær operation (n = 4). (C) Box- og whisker-plot viser kvantificering af BNP-ekspression normaliseret til GAPDH og sham-kontrol på det tilsvarende tidspunkt efter primær operation. Kasser viser henholdsvis median, 25 og 75 percentiler; whiskers angiver minimums- og maksimumsværdierne. Til statistiske analyser blev Student's t-test33 brugt. *p-værdi < 0,05. (D) Søjlediagrammer (middel ± standardafvigelse) viser LV-udstødningsfraktion og volumen i sham (n = 4), AoB (n = 9) og Deb (n = 7) dyr i uge 5 målt ved ekkokardiografi fra M- og B-tilstandsbilleder. (E) Repræsentative M-mode ekkokardiografiske billeder viser ændringer i LV fraktioneret forkortelse i sham, AoB og Deb dyr i uge 5. Til statistiske analyser blev Mann-Whitney U test33 anvendt. *p-værdi < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Ventrikulær hæmodynamik normaliseres, og hjertehypertrofi vendes ved aortadebanding. (A) Repræsentative målinger af venstre ventrikulær (LV) og højre ventrikulær (RV) blodtryk hos en rotte 3 uger efter aortabånd (AoB) sammenlignet med tilsvarende skamkontrol. (B) Repræsentative billeder viser hjertehypertrofi hos en AoB-rotte 3 uger efter aortabånd sammenlignet med skinkontrol. (C-F) Kasse- og whisker-plot viser venstre ventrikulært systolisk tryk (LVSP; C), LV hypertrofi ([LV+S]/BW; D), højre ventrikulært systolisk tryk (RVSP; E) og RV hypertrofi (RV / BW; F) hos sham- og AoB-dyr 3 og 5 uger efter operationen og normaliserede parametre (sammenlignet med 3- og 5-ugers AoB-grupper) hos Deb-rotter. Kasser viser henholdsvis median, 25 og 75 percentiler; whiskers angiver minimums- og maksimumsværdierne. n = 9-12 dyr blev analyseret til hæmodynamiske målinger, og hjertevægten blev målt i n = 7-12 rotter pr. Gruppe. Til statistiske analyser blev Mann-Whitney U-test brugt. *p-værdi < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporteres en detaljeret kirurgisk teknik til aortadebanding i en rotte AoB-model, der kan bruges til at undersøge reversibiliteten af PH-LHD og de cellulære og molekylære mekanismer, der driver omvendt ombygning i lungevaskulaturen og RV. Tre ugers aortaforsnævring hos unge rotter resulterer i PH-LHD tydeligt som øget LV-tryk, LV-hypertrofi og samtidig øget RV-tryk og RV-hypertrofi. Aorta debanding i uge 3 efter AoB var i stand til at aflæse LV og helt vende LV hypertrofi inden for to uger efter Deb. Parallelt forårsagede aortadeliming også en fuldstændig normalisering af RV-tryk og en delvis vending af RV-hypertrofi.
Den nuværende model efterligner således kritiske aspekter af det kliniske scenarie, hvor mekanisk losning af LV ved en implanterbar ikke-pulserende LVAD med kontinuerlige flowegenskaber tidligere har vist sig at vende PH hos patienter med hjertesvigt34,35. I en retrospektiv analyse blev LVAD-understøttelse vist at reducere lungearterietrykket til lignende grader hos hjertesvigtpatienter med enten reversibel eller fast PH, med fast PH defineret som gennemsnitligt lungearterielt tryk >25 mm Hg, pulmonal vaskulær resistens >2,5 Wood Unit og en gennemsnitlig tryktranspulmonal gradient >12 mm Hg på trods af farmakologisk behandling35. Det er vigtigt, at disse fund 34,35 giver indirekte bevis for, at venstre ventrikulær losning ikke kun reducerer passiv lungebelastning og sekundære ændringer i lunge vaskulær tone, men udløser omvendt ombygning af lungevaskulaturen ved "fysiologiske" mekanismer, dvs. ved tilpasning til ændret hæmodynamik. Dybdegående multi-omics analyser af de cellulære og molekylære processer, der driver omvendt ombygning i lungevaskulaturen, kan åbne nye muligheder for at identificere nye terapeutiske muligheder for behandling af PH hos hjertesvigtpatienter og potentielt også i andre former for PH, herunder PAH. Den nuværende model for debanding i AoB-rotter giver en unik mulighed for sådanne analyser som fuldstændig normalisering af RVSP bekræfter effektiv vending af PH, hvilket giver mulighed for mekanistiske undersøgelser til at identificere veje med evnen til at genoprette homeostatiske processer i den syge lungevaskulatur.
Med en lignende begrundelse kan den nuværende model yderligere bruges til at studere intra- og intercellulære processer, der driver omvendt ombygning af RV. RV-funktionen er for nylig blevet anerkendt som en signifikant forudsigelse for prognose for sygelighed og dødelighed i hjerte-kar-sygdomme. Alligevel er ingen terapier blevet klinisk godkendt til at forbedre RV-funktion36. Som sådan giver evnen til at studere omvendte ombygningsprocesser i RV-myokardiet i en dyremodel en unik mulighed for at løse et betydeligt videngab og et kritisk medicinsk behov.
Succesen med den teknisk udfordrende aorta-debandingprocedure hos AoB-rotter afhænger af kirurgiske færdigheder og præcise perioperative strategier. Beskrevet i det følgende er kritiske kirurgiske proceduretrin, der kan forårsage perioperativ dødelighed ved overdreven blødning (1-5) eller utilstrækkelig respiration (6) og anbefalinger om at undgå disse komplikationer.
(1) Under en thoracotomi skal den midterste linje kontaktes omhyggeligt med en saks for at undgå skade på den indre brystarterie. (2) For at visualisere hjertet og ledningsarterierne skal thymus mobiliseres og omhyggeligt flyttes i kranial retning. I den nedbrydende kirurgi er thymusvævet ofte forbundet med hjertet og arterierne via postoperative adhæsioner fra den oprindelige AoB-operation. Disse adhæsioner skal omhyggeligt adskilles med et par stumpe tang for at undgå skade på de kardiovaskulære strukturer. (3) I debanding kirurgi er aorta med klemmen ofte indlejret i bindevæv. Dette bindevæv skal forsigtigt dissekeres med stumpe tang for at visualisere klippet. Her er den transthoraciske ekkokardiografi udført før operationen et nyttigt forberedelsestrin, der gør det muligt at identificere, om klippet er placeret tæt på aortaroten, midt i den stigende aorta eller tæt på brachiocephalic arterien. Denne viden sparer dyrebar tid til kliptildeling under operationen. (4) Klippets orientering er et kritisk trin, der skal overvejes nøje under den indledende aortabåndsoperation. For at lette optimal vurdering og hurtig åbning af klemmen under aortadebanding skal den del, der skal komprimeres af nåleholderen (figur 4B), orienteres ventralt. Klipomorientering under debanding kirurgi er mulig, men med risiko for skade på aorta. Til klipomorientering skal klip holdes af pincet, mens omgivende bindevæv forsigtigt fjernes, derefter skal klemmen mobiliseres og drejes. At holde aorta med tangen skal undgås. (5) Ved afbinding skal klemmen holdes af en tang med den ene hånd og åbnes med en nåleholder med den anden hånd. Aorta behøver ikke løftes ventralt. (6) Efter afslutning af debandingsproceduren er ekstuberede PH-LHD-rotter i betydelig risiko for respirationssvigt, hvor dyr almindeligvis dør inden for 10-20 minutter efter operationen, mens de stadig er under anæstesi. Atelektase af venstre lunge er den mest almindelige dødsårsag i denne periode, og langvarig mekanisk ventilation før brystlukning hjælper med at rekruttere lungen og berettige tilstrækkelig respiration efter operationen.
Vi foreslår også, at sammenlignet med endotracheal intubation som udført i tidligere undersøgelser26,27 giver trakeostomi bedre kontrol med passende ventilation under kirurgiske procedurer, hvilket er specifikt relevant under aortadebanding. Denne opfattelse er baseret på følgende begrundelse: (1) Trakeostomi, rutinemæssigt udført i vores laboratorium for perioperativ lungeventilation, er en ligetil og sikker teknik uden perioperative eller postoperative komplikationer. (2) Trakeostomi eliminerer risikoen for spiserørsintubation eller trakeal skade; det muliggør præcis positionering og fiksering af trakealkanylen og konstant visuel kontrol af kanylen under alle trin i den kirurgiske procedure. (3) På tidspunktet for aortabinding er AoB-dyr allerede i hjertesvigt og er mere følsomme over for yderligere stress; som følge heraf kan de potentielle risici, der følger med endotracheal intubation, øge dødeligheden. (4) Endelig, når det opererede dyr fravænnes fra respiratoren, men ikke udvikler spontan vejrtrækning, giver en trakeostomi mulighed for hurtig reintubation og genforbindelse med ventilatoren, hvilket potentielt redder liv på grund af evnen til langvarig postoperativ ventilation.
Denne undersøgelse rapporterer en aorta debanding teknik udført 3 uger efter indledende aorta banding i rotter. For undersøgelser, der sigter mod at sammenligne omvendt ombygning af lungevaskulaturen og RV på forskellige PH-stadier, kan de beskrevne procedurer også udføres på senere tidspunkter efter aortabånd. Alligevel er forsigtighed berettiget, da ar og bindevæv omkring aorta sandsynligvis vil blive mere rigeligt med tiden, hvilket yderligere komplicerer proceduren og nødvendiggør yderligere fejlfinding og forfining. Samtidig gælder de grundlæggende principper i den rapporterede protokol stadig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære. Alle medforfattere har set og er enige i manuskriptets indhold.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af bevillinger fra DZHK (tysk center for kardiovaskulær forskning) til CK og WMK, BMBF (det tyske ministerium for uddannelse og forskning) til CK inden for rammerne af VasBio og til WMK inden for rammerne af VasBio, SYMPATH og PROVID og den tyske forskningsfond (DFG) til WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 og KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
References
- Rosenkranz, S., et al. Pulmonary hypertension due to left heart disease: Updated recommendations of the cologne consensus conference 2011. International Journal of Cardiology. 154, Suppl 1 34-44 (2011).
- Rosenkranz, S., et al. Left ventricular heart failure and pulmonary hypertension. European Heart Journal. 37 (12), 942-954 (2016).
- Fayyaz, A. U., et al. Global Pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension associated with heart failure and preserved or reduced ejection fraction. Circulation. 137 (17), 1796-1810 (2018).
- Hunt, J. M., et al. Pulmonary veins in the normal lung and pulmonary hypertension due to left heart disease. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (10), 725-736 (2013).
- Bursi, F., et al. Pulmonary pressures and death in heart failure: A community study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 222-231 (2012).
- Ryan, J. J., et al. Right ventricular adaptation and failure in pulmonary arterial hypertension. Canadian Journal of Cardiology. 31 (4), 391-406 (2015).
- Miller, W. L., Mahoney, D. W., Enriquez-Sarano, M. Quantitative Doppler-echocardiographic imaging and clinical outcomes with left ventricular systolic dysfunction: Independent effect of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 7 (2), 330-336 (2014).
- Kjaergaard, J., et al. Prognostic importance of pulmonary hypertension in patients with heart failure. The American Journal of Cardiology. 99 (8), 1146-1150 (2007).
- Shah, R., et al. Pulmonary hypertension after heart transplantation in patients bridged with the total artificial heart. ASAIO Journal. 62 (1), 69-73 (2016).
- Tracy, G. P., Proctor, M. S., Hizny, C. S. Reversibility of pulmonary artery hypertension in aortic stenosis after aortic valve replacement. The Annals of Thoracic Surgery. 50 (1), 89-93 (1990).
- Lindelow, B., Andersson, B., Waagstein, F., Bergh, C. H. High and low pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates. A 5-year follow-up after heart transplantation shows continuous reduction in resistance and no difference in complication rate. European Heart Journal. 20 (2), 148-156 (1999).
- Martin, J., et al. Implantable left ventricular assist device for treatment of pulmonary hypertension in candidates for orthotopic heart transplantation-a preliminary study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 25 (6), 971-977 (2004).
- Gallagher, R. C., et al. Univentricular support results in reduction of pulmonary resistance and improved right ventricular function. ASAIO Transactions. 37 (3), 287-288 (1991).
- Beyersdorf, F., Schlensak, C., Berchtold-Herz, M., Trummer, G. Regression of "fixed" pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates after unloading with ventricular assist devices. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (4), 747-749 (2010).
- Hoffmann, J., et al. Mast cells promote lung vascular remodelling in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 37 (6), 1400-1410 (2011).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91 (10), 2642-2654 (1995).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- de Montgolfier, O., et al. High Systolic blood pressure induces cerebral microvascular endothelial dysfunction, neurovascular unit damage, and cognitive decline in mice. Hypertension. 73 (1), 217-228 (2019).
- Breitling, S., Ravindran, K., Goldenberg, N. M., Kuebler, W. M. The pathophysiology of pulmonary hypertension in left heart disease. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (9), 924-941 (2015).
- Ranchoux, B., et al. Metabolic syndrome exacerbates pulmonary hypertension due to left heart disease. Circulation Research. 125 (4), 449-466 (2019).
- Zhang, H., Huang, W., Liu, H., Zheng, Y., Liao, L. Mechanical stretching of pulmonary vein stimulates matrix metalloproteinase-9 and transforming growth factor-beta1 through stretch-activated channel/MAPK pathways in pulmonary hypertension due to left heart disease model rats. PLoS One. 15, 0235824 (2020).
- Yin, J., et al. Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure. Circulation: Heart Failure. 4 (2), 198-206 (2011).
- Yin, N., et al. Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease. Critical Care Medicine. 37 (3), 980-986 (2009).
- Breitling, S., et al. The mast cell-B cell axis in lung vascular remodeling and pulmonary hypertension. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (5), 710-721 (2017).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: Role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circulation Research. 106 (6), 1103-1116 (2010).
- Goncalves-Rodrigues, P., Miranda-Silva, D., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Studying left ventricular reverse remodeling by aortic debanding in rodents. Journal of Visualized Experiments. (173), e60036 (2021).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9, 2956 (2019).
- Chou, S. H., et al. The effects of debanding on the lung expression of ET-1, eNOS, and cGMP in rats with left ventricular pressure overload. Experimental Biology and Medicine. 231 (6), 954-959 (2006).
- Hentschel, T., et al. Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure. Anesthesiology. 106 (1), 124-131 (2007).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. Journal of Visualized Experiments. (88), e50983 (2014).
- Angermann, C. E., Ertl, G. Natriuretic peptides--new diagnostic markers in heart disease. Herz. 29 (6), 609-617 (2004).
- Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. American Association for Laboratory Animal Science. 47 (5), 44-46 (2008).
- Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , 1-54 (2013).
- Etz, C. D., et al. Medically refractory pulmonary hypertension: treatment with nonpulsatile left ventricular assist devices. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (5), 1697-1705 (2007).
- Mikus, E., et al. Reversibility of fixed pulmonary hypertension in left ventricular assist device support recipients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 971-977 (2011).
- Zelt, J. G. E., Chaudhary, K. R., Cadete, V. J., Mielniczuk, L. M., Stewart, D. J. Medical therapy for heart failure associated with pulmonary hypertension. Circulation Research. 124 (11), 1551-1567 (2019).
