Summary
Il presente protocollo descrive una procedura chirurgica per rimuovere il banding ascendente-aortico in un modello di ratto di ipertensione polmonare dovuta a cardiopatia sinistra. Questa tecnica studia i meccanismi endogeni di rimodellamento inverso nella circolazione polmonare e nel cuore destro, informando così le strategie per invertire l'ipertensione polmonare e / o la disfunzione ventricolare destra.
Abstract
L'ipertensione polmonare dovuta a malattie cardiache sinistre (PH-LHD) è la forma più comune di PH, ma la sua fisiopatologia è scarsamente caratterizzata dall'ipertensione arteriosa polmonare (PAH). Di conseguenza, mancano interventi terapeutici approvati per il trattamento o la prevenzione del PH-LHD. I farmaci usati per trattare il PH nei pazienti con PAH non sono raccomandati per il trattamento del PH-LHD, poiché la ridotta resistenza vascolare polmonare (PVR) e l'aumento del flusso sanguigno polmonare in presenza di un aumento della pressione di riempimento del lato sinistro possono causare scompenso del cuore sinistro ed edema polmonare. È necessario sviluppare nuove strategie per invertire il PH nei pazienti con LHD. A differenza della PAH, PH-LHD si sviluppa a causa dell'aumento del carico meccanico causato dalla congestione del sangue nella circolazione polmonare durante l'insufficienza cardiaca sinistra. Clinicamente, lo scarico meccanico del ventricolo sinistro (LV) mediante sostituzione della valvola aortica in pazienti con stenosi aortica o mediante impianto di dispositivi di assistenza LV in pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale normalizza non solo le pressioni arteriose polmonari e ventricolari destre (RV) ma anche la PVR, fornendo così prove indirette di rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare. Utilizzando un modello di RATto stabilito di PH-LHD a causa di insufficienza cardiaca sinistra innescata da sovraccarico di pressione con successivo sviluppo di PH, viene sviluppato un modello per studiare i meccanismi molecolari e cellulari di questo fisiologico processo di rimodellamento inverso. In particolare, è stato eseguito un intervento chirurgico di debanding aortico, che ha portato al rimodellamento inverso del miocardio LV e al suo scarico. Parallelamente, è stata rilevata la completa normalizzazione della pressione sistolica RV e l'inversione significativa ma incompleta dell'ipertrofia RV. Questo modello può rappresentare un valido strumento per studiare i meccanismi di rimodellamento fisiologico inverso nella circolazione polmonare e nel RV, con l'obiettivo di sviluppare strategie terapeutiche per il trattamento del PH-LHD e di altre forme di PH.
Introduction
L'insufficienza cardiaca è la principale causa di morte nei paesi sviluppati e si prevede che aumenterà del 25% nel prossimo decennio. Ipertensione polmonare (PH) - un aumento patologico della pressione sanguigna nella circolazione polmonare - colpisce circa il 70% dei pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale; l'Organizzazione Mondiale della Sanità classifica il PH come ipertensione polmonare dovuta a cardiopatia sinistra (PH-LHD)1. Ph-LHD è iniziato da compromissione della funzione sistolica e / o diastolica del ventricolo sinistro (LV) che si traduce in elevata pressione di riempimento e congestione passiva del sangue nella circolazione polmonare2. Sebbene inizialmente reversibile, il PH-LHD diventa gradualmente fisso a causa del rimodellamento vascolare polmonare attivo in tutti i compartimenti della circolazione polmonare, cioè arterie, capillari e vene 3,4. Sia il PH reversibile che quello fisso aumentano il postcarico del camper, inizialmente guidando l'ipertrofia miocardica adattativa, ma alla fine causando dilatazione RV, ipocinesia, fibrosi e scompenso che portano progressivamente al fallimento del camper 1,2,5,6. Come tale, il PH accelera la progressione della malattia nei pazienti con insufficienza cardiaca e aumenta la mortalità, in particolare nei pazienti sottoposti a trattamento chirurgico mediante impianto di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra (LVAD) e/o trapianto di cuore 7,8,9. Attualmente, non esistono terapie curative che potrebbero invertire il processo di rimodellamento vascolare polmonare, quindi è necessaria una ricerca meccanicistica fondamentale in sistemi modello appropriati.
È importante sottolineare che gli studi clinici dimostrano che la PH-LHD come complicanza frequente nei pazienti con stenosi aortica può migliorare rapidamente nel primo periodo post-operatorio dopo la sostituzione della valvola aortica10. Analogamente, l'elevata resistenza vascolare polmonare (PVR) (>3 Wood Units) che era, tuttavia, reversibile sul nitroprussiato è stata normalizzata in modo sostenibile dopo il trapianto di cuore in uno studio di follow-up di 5 anni11. Allo stesso modo, un'adeguata riduzione della PVR sia reversibile che fissa e un miglioramento della funzione RV nei pazienti con LHD potrebbero essere realizzati entro diversi mesi scaricando il ventricolo sinistro utilizzando dispositivi di assistenza ventricolare pulsatile e non pulsatile impiantabili 12,13,14. Attualmente, i meccanismi cellulari e molecolari che guidano il rimodellamento inverso nella circolazione polmonare e nel miocardio RV non sono chiari. Tuttavia, la loro comprensione può fornire importanti informazioni sui percorsi fisiologici che possono essere sfruttati terapeuticamente per invertire il rimodellamento vascolare e RV polmonare in PH-LHD e altre forme di PH.
Un modello preclinico adatto che replica adeguatamente le caratteristiche fisiopatologiche e molecolari del PH-LHD può essere utilizzato per studi traslazionali nell'insufficienza cardiaca congestizia indotta da sovraccarico di pressione dovuta a banding aortico chirurgico (AoB) nei ratti 4,15,16. Rispetto a un'insufficienza cardiaca simile dovuta a sovraccarico di pressione nel modello murino di costrizione aortica trasversale (TAC)17, il banding dell'aorta ascendente sopra la radice aortica nei ratti AoB non produce ipertensione nell'arteria carotide sinistra poiché il sito di banding è prossimale del deflusso dell'arteria carotide sinistra dall'aorta. Di conseguenza, aoB non causa lesioni neuronali del lato sinistro nella corteccia come è caratteristico per TAC18 e che può influenzare l'esito dello studio. Rispetto ad altri modelli di roditori di PH-LHD indotto chirurgicamente, i modelli di ratto in generale, e AoB in particolare, si dimostrano più robusti, riproducibili e replicano il rimodellamento della caratteristica di circolazione polmonare per i pazienti con PH-LHD. Allo stesso tempo, la letalità perioperatoria è bassa19. L'aumento delle pressioni LV e la disfunzione LV nei ratti AoB inducono lo sviluppo di PH-LHD, con conseguente aumento delle pressioni RV e rimodellamento RV. Come tale, il modello di ratto AoB si è dimostrato estremamente utile in una serie di studi precedenti da parte di gruppi indipendenti, incluso noi stessi, per identificare i meccanismi patologici del rimodellamento vascolare polmonare e testare potenziali strategie di trattamento per PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.
Nel presente studio, il modello di ratto AoB è stato utilizzato per stabilire una procedura chirurgica di debanding aortico per studiare i meccanismi di rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare e nel camper. In precedenza, sono stati sviluppati modelli di rimodellamento inverso miocardico come lo scioglimento aortico nei topi26 e nei ratti27 per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la regressione dell'ipertrofia ventricolare sinistra e testare potenziali opzioni terapeutiche per promuovere la miocardia guarigione. Inoltre, un numero limitato di studi precedenti ha esplorato gli effetti dello scioglimento aortico sul PH-LHD nei ratti e ha dimostrato che lo scioglimento aortico potrebbe invertire l'ipertrofia mediale nelle arteriole polmonari, normalizzare l'espressione della pre-pro-endotelina 1 e migliorare l'emodinamica polmonare27,28, fornendo prove della reversibilità del PH nei ratti con insufficienza cardiaca. Qui, le procedure tecniche della chirurgia di debanding sono ottimizzate e standardizzate, ad esempio, applicando una tracheotomia al posto dell'intubazione endotracheale o utilizzando clip in titanio di un diametro interno definito per il banding aortico invece di suture in polipropilene con un ago smussato26,27, fornendo così un migliore controllo delle procedure chirurgiche, una maggiore riproducibilità del modello e un migliore tasso di sopravvivenza.
Da un punto di vista scientifico, il significato del modello di debanding PH-LHD non risiede solo nel dimostrare la reversibilità del fenotipo cardiovascolare e polmonare nell'insufficienza cardiaca, ma soprattutto nell'identificazione di driver molecolari che innescano e / o sostengono il rimodellamento inverso nelle arterie polmonari come candidati promettenti per il futuro targeting terapeutico.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite seguendo la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (Istituto delle risorse animali da laboratorio, 8a edizione 2011) e approvate dal comitato governativo locale per la cura e l'uso degli animali dell'Ufficio statale tedesco per la salute e gli affari sociali (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlino; protocollo n. G0030/18). In primo luogo, l'insufficienza cardiaca congestizia è stata indotta chirurgicamente nei ratti Sprague-Dawley giovani ~ 100 g di peso corporeo (bw) (vedi Tabella dei materiali) posizionando una clip in titanio con un diametro interno di 0,8 mm sull'aorta ascendente (fascia aortica, AoB) come descritto in precedenza29,30. Alla settimana 3 dopo AoB (Figura 1), è stato eseguito un intervento chirurgico di debanding (Deb) per rimuovere la clip dall'aorta. Le procedure chirurgiche e la convalida dell'inversione del PH nei ratti AoB eseguite sono schematicamente rappresentate nella Figura 1.
1. Preparazioni chirurgiche
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici necessari (Figura 2) mediante autoclave.
- Iniettare nel ratto carprofene (5 mg/kg di peso corporeo) (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale (i.p.) per analgesia 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
- Anestetizzare il ratto mediante iniezione i.p. di ketamina (87 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (13 mg/kg di peso corporeo).
- Rimuovere i capelli dalla scollatura e dal torace dell'animale usando un rasoio elettrico.
- Applicare una goccia di unguento per gli occhi per proteggere gli occhi durante l'intervento chirurgico.
- Posizionare il ratto in posizione supina su un tavolo chirurgico sterilizzato. Fissare con cura l'addome e gli arti dell'animale con nastro adesivo.
NOTA: Per mantenere la temperatura corporea, posizionare un tappetino riscaldante a 37 °C sotto il tavolo operatorio. Evitare il riscaldamento della regione della testa per evitare l'asciugatura degli occhi. - Disinfettare la pelle animale con soluzione di povidone-iodio/iodoforo. Nota cicatrici e suture dalla chirurgia AoB primaria e drappeggia il campo chirurgico.
- Garantire un'adeguata profondità di anestesia mediante pizzicamento della punta.
NOTA: La profondità dell'anestesia deve essere controllata regolarmente durante l'intervento chirurgico.
2. Tracheotomia e ventilazione meccanica
NOTA: Durante l'intervento chirurgico, cambiare i guanti dopo aver maneggiato attrezzature non sterili.
- Con le forbici fini (Figura 2A), fare un'incisione cervicale della linea mediana lunga 7-10 mm (Figura 3A).
- Con l'aiuto di un paio di pinze smussate (Figura 2B'), sezionare il tessuto molle cervicale per esporre i muscoli infraioidi. Dividi i muscoli nella linea mediana per visualizzare la trachea. Tagliare e rimuovere la sutura dalla chirurgia primaria AoB.
- Praticare un'incisione della trachea di circa 2 mm tra due anelli cartilaginei usando forbici a molla Noyes angolate (Figura 2C,3B). Inserire la cannula tracheale di diametro esterno 2 mm (Figura 2D) nella trachea e fissarla con una sutura di seta 4-0 (Figura 2E,3C).
- Collegare la cannula tracheale a un ventilatore meccanico (vedi Tabella dei materiali) mantenendo al minimo lo spazio morto (Figura 3D-E). Mantenere la ventilazione polmonare perioperatoria ad una frequenza respiratoria di 90 respiri/min ad un volume di marea (Vt) di 8,5 ml/kg di peso corporeo.
3. Scioglimento dell'aorta
- Fai un'incisione cutanea lunga ~ 20 mm tra la seconda e la terza costola usando forbici fini (Figura 3F).
- Con l'aiuto di forbici chirurgiche più piccole (Figura 2F), allargare attentamente i muscoli e tagliarli strato per strato (Figura 3G). Fai un'incisione laterale di 10 mm lungo lo spazio intercostale tra la seconda e la terza costola.
NOTA: La linea medio-vennale deve essere avvicinata con attenzione per evitare sanguinamenti. - Utilizzare uno spandindi costole (Figura 2G) per espandere lo spazio intercostale tra la seconda e la terza costola per creare una finestra chirurgica (Figura 3H).
- Con l'aiuto di una pinza smussata (Figura 2B,B'), separare accuratamente il timo dal cuore e dalle arterie del condotto per visualizzare l'aorta con la clip (Figura 4A).
- Tenere la clip con l'aiuto della pinza e rimuovere con attenzione il tessuto connettivo attorno alla clip per esporla.
NOTA: Evitare di tenere o sollevare l'aorta con la pinza, in quanto potrebbe ferire l'aorta con conseguente sanguinamento e un esito letale. - Con l'aiuto di un portaago (Figura 2H), aprire la clip (Figura 4B) e rimuoverla dalla cavità toracica.
- Prima di chiudere il torace, aprire l'atelettasia polmonare, garantire un adeguato reclutamento polmonare senza sovradistensione, continuare la ventilazione meccanica con un Vt di 9,5 ml / kg di peso corporeo per altri 10 minuti e tornare a un Vt di 8,5 ml / kg di peso corporeo per reclutare i polmoni e risolvere un possibile pneumotorace.
- Chiudi i muscoli profondi con una semplice sutura interrotta usando la seta 4-0. Quindi collegare i muscoli superiori e la pelle con una semplice sutura continua (Figura 5A,B).
4. Estubazione tracheale
- Scollegare la cannula tracheale dalla macchina di ventilazione. Osservare attentamente il ratto fino a quando la respirazione spontanea non viene ristabilita. Se l'animale non riesce a respirare spontaneamente al momento della disconnessione, ricollegare il ventilatore e continuare a ventilare per altri 5 minuti. Quindi ripetere la procedura.
- Dopo aver ristabilito la respirazione spontanea, rimuovere la cannula dalla trachea e pulire il liquido intorno alla trachea con punti di spugna (Figura 2I) (vedi Tabella dei materiali).
- Chiudere la trachea con una semplice sutura utilizzando 6-0 prolene (Figura 2E' e Figura 5C). Quindi chiudere i muscoli infraioidi in una semplice sutura interrotta usando seta 4-0 (Figura 5D) e collegare la pelle in una semplice sutura continua (Figura 5E). Pulire e disinfettare i muscoli e la pelle durante il processo con soluzione di povidone-iodio/iodoforo.
5. Assistenza post-operatoria
- Dopo aver completato la procedura chirurgica, spostare con cura l'animale in una gabbia di recupero con ossigeno supplementare e una lampada a infrarossi per mantenere gli animali caldi e sufficientemente ossigenati durante la fase di recupero. Posizionare la maschera di ossigeno vicino al muso del ratto. Tenere un solo animale per gabbia di recupero in qualsiasi momento.
- Dopo che l'animale si è svegliato, spostalo con cura in una gabbia normale fornita di acqua e cibo. Per le successive 12 ore, controllare lo stato di salute dell'animale operato a intervalli di 2 ore.
- Dopo aver completato la procedura chirurgica, applicare l'analgesia quotidianamente mediante iniezione i.p. di carprofene (5 mg/kg p.c.) per una settimana.
- Per evitare l'infezione batterica, somministrare amoxicillina (500 mg / L) nell'acqua potabile per una settimana dopo l'intervento.
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Representative Results
In primo luogo, il successo dello scioglimento dell'aorta è stato confermato dall'ecocardiografia transtoracica eseguita prima e dopo la procedura di debanding negli animali AoB (Figura 6). A tal fine, l'arco aortico è stato valutato in modalità B parasternnale ad asse lungo (PLAX). È stata visualizzata la posizione della clip sull'aorta ascendente negli animali AoB e la sua assenza dopo l'intervento chirurgico di Deb (Figura 6A,B). Successivamente, il flusso sanguigno aortico è stato valutato mediante imaging Doppler a onde pulsate (Figura 6C-F). La velocità di picco del flusso sanguigno negli animali AoB misurata prima e dopo la clip è stata rispettivamente di 733,24 ± 17,39 mm/ s e 5215,08 ± 48,05 mm / s (n = 8 animali), dimostrando un forte gradiente attraverso il sito AoB. Dopo la rimozione della clip, la velocità di picco del flusso sanguigno è stata di 1093,79 ± 28,97 mm/s e 2578,73 ± 42,27 mm/s, rispettivamente, nelle corrispondenti posizioni aortiche, mostrando una marcata attenuazione del gradiente in linea con lo scioglimento funzionale (Figura 6D,F). Per sondare l'inversione dell'insufficienza cardiaca sinistra mediante debanding aortico, i livelli di espressione del peptide natriuretico cerebrale (BNP), un parametro di routine clinica per la valutazione della malattia cardiaca31, sono stati accessibili nel miocardio LV. Alle settimane 3 e 5 dopo il banding aortico, gli animali AoB hanno mostrato un aumento significativo della produzione di BNP rispetto ai controlli azionati da sham. Al contrario, i ratti Deb alla settimana 5 hanno espresso BNP a livelli paragonabili agli animali finti, indicando l'inversione del fallimento LV mediante debanding aortico (Figura 7A-C). Parallelamente, la valutazione della funzione LV mediante ecocardiografia transtoracica ha rivelato un aumento della frazione di eiezione LV e del volume LV negli animali Deb rispetto ai ratti AoB (Figura 7D-E). Mentre la frazione di eiezione LV negli animali Deb era paragonabile ai ratti finti, il volume LV nei ratti Deb non è riuscito a normalizzarsi completamente ai valori osservati nel gruppo sham, indicando che l'inversione della funzione LV è incompleta.
Per sondare se gli animali Deb possono servire come modello preclinico per studiare il rimodellamento vascolare polmonare inverso e ventricolare destro (RV) in PH-LHD, pressione sistolica ventricolare sinistra (LVSP) e pressione sistolica ventricolare destra (RVSP) è stato valutato utilizzando un catetere Millar microtip. In breve, i ratti sono stati nuovamente anestetizzati con ketamina (87 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (13 mg/kg di peso corporeo), tracheotomizzati e ventilati come descritto sopra. Il cateterismo cardiaco è stato eseguito dopo toracotomia mediana32 attraverso l'apice di (primo) il ventricolo sinistro e (secondo) destro, rispettivamente, poiché il cateterismo diretto del ventricolo sinistro attraverso la via vascolare è impedito dalla banda aortica negli animali AoB. A seguito di eutanasia da sovradosaggio di ketamina / xilazina, il cuore è stato asportato e l'ipertrofia ventricolare è stata valutata come il peso del ventricolo sinistro incluso il setto (LV + S) o il ventricolo destro (RV) normalizzato al peso corporeo (BW). In accordo con i ratti AoB come modello consolidato per PH-LHD, gli animali AoB hanno mostrato un aumento significativo di LVSP e RVSP e ipertrofia LV e RV rispetto agli animali con operazione fittizia a 3 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 8A-F). L'intervento chirurgico di debanding (Deb) eseguito alla settimana 3 dopo AoB ha comportato una significativa riduzione dell'ipertrofia LV SIA LVSP che LV rispetto agli animali AoB senza Deb alla settimana 3 e alla settimana 5 post-AoB, dimostrando che la normalizzazione dell'emodinamica LV dopo la rimozione della clip dall'aorta ha invertito il rimodellamento LV (Figura 8C, D). Rispetto ai ratti AoB alla settimana 3 e alla settimana 5, gli animali Deb hanno anche mostrato una significativa riduzione di RVSP e RV / BW, dimostrando un'inversione di successo di PH-LHD (Figura 8E, F). In particolare, l'RVSP nei ratti Deb era paragonabile ai valori misurati negli animali finti, indicando una completa normalizzazione dell'emodinamica RV. Al contrario, l'ipertrofia RV negli animali Deb è stata solo parzialmente invertita con RV/ BW, rimanendo significativamente aumentata rispetto ai controlli fittizi (Figura 8E, F).
Figura 1: Rappresentazione schematica delle procedure chirurgiche e validazione dell'inversione del PH nei ratti AoB. Lo schema descrive i diversi gruppi sperimentali utilizzati nel presente studio per verificare se la chirurgia di debanding inverte PH-LHD. Controlli fittizi, azionati da sham; AoB, banding aortico; Deb, debanding. I triangoli segnano il punto temporale degli interventi chirurgici: operazione primaria (sham o AoB; rosso) alla settimana 0 e operazione secondaria (Deb; verde) alla settimana 3. I cerchi segnano le analisi end-point in cui PH-LHD è stato valutato rispettivamente mediante pressioni LV e RV e misurazioni di ipertrofia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strumenti chirurgici. (A) Forbici fini Carburo di tungsteno. (B) Pinza di Moria Iris e (B') Pinza di Graefe seghettata. Le punte della pinza sono mostrate ingrandite. (C) Noyes forbici a molla. D) Cannula tracheale. (E, E') suture 4-0 e 6-0, rispettivamente. (F) Forbici fini Carburo di tungsteno. G) Spandi costole. (H) Portaago Mathieu. (I) Tessuto di punte di spugna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tracheotomia e toracotomia. Le immagini illustrano le fasi chirurgiche per la tracheotomia. (A) Incisione cervicale della linea mediana. (B) Incisione della trachea tra due anelli cartilaginei. C) Cannula tracheale inserita nella trachea e fissata con una sutura. (D) La cannula tracheale è collegata a un ventilatore meccanico. (E) Le immagini illustrano le fasi chirurgiche per la toracotomia. F) Incisione cutanea tra la seconda e la terza costola. (G) Taglio dei muscoli. (H) Creazione di una finestra chirurgica toracica mediante la diffusione della seconda e della terza costola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione della clip aortica-costrittiva in vivo ed ex vivo. (A) L'immagine mostra la cavità toracica di un ratto AoB con una clip in titanio posta sull'aorta ascendente. (B) L'immagine mostra clip chiusa e aperta ex vivo. L'asterisco segna la parte della clip che il supporto dell'ago comprime in vivo per aprire la clip. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Chiusura della ferita. Le immagini illustrano la chiusura dei muscoli toracici superiori (A) e della pelle (B) con una semplice sutura continua. La trachea (C) e i muscoli infraioidi (D) sono chiusi da una semplice sutura e la pelle sul collo (E) da una semplice sutura continua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Flusso sanguigno aortico prima e dopo l'intervento chirurgico di debanding. (A-B) Visualizzazione dell'aorta ascendente in un ratto con banding aortico (AoB, a sinistra) e un ratto dopo l'intervento chirurgico di debanding (Deb, a destra) mediante ecocardiografia transtoracica. La freccia mostra la clip in titanio sull'aorta in (A) assente in (B). (C,D) Le immagini ecocardiografiche Doppler a onde pulsate mostrano il flusso sanguigno prima della clip in un ratto AoB (C) e il flusso sanguigno nel corrispondente segmento aortico in un ratto Deb (D) presi rispettivamente un giorno prima e un giorno dopo l'intervento chirurgico di debanding aortico. (E,F) Analogamente, le immagini mostrano il flusso sanguigno nel segmento aortico dopo la clip in un ratto AoB (E) e nel corrispondente segmento aortico in un ratto Deb (F) presi rispettivamente un giorno prima e un giorno dopo l'intervento chirurgico di debanding aortico. Le linee verticali di Turquois illustrano le misurazioni della velocità del flusso aortico di picco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Normalizzazione della funzione ventricolare sinistra mediante debanding aortico. (A) I Western Blots rappresentativi mostrano livelli proteici di BNP e con GAPDH come controllo del carico nei ventricoli sinistri (LV) dei ratti AoB alla settimana 3 dopo banding aortico (n = 5) e nei corrispondenti controlli fittizi (n = 5). (B) I blot occidentali rappresentativi mostrano BNP e GAPDH nei ventricoli sinistri (LV) dei ratti AoB alla settimana 5 dopo il banding aortico (n = 4), nei ratti Deb alla settimana 5 (n = 5) e nei controlli fittizi al momento corrispondente dopo l'intervento chirurgico primario (n = 4). (C) I grafici a scatola e a baffi mostrano la quantificazione dell'espressione di BNP normalizzata a GAPDH e il controllo fittizio al momento corrispondente dopo l'intervento chirurgico primario. Le caselle mostrano rispettivamente la mediana, 25 e 75 percentili; i baffi indicano i valori minimo e massimo. Per le analisi statistiche, è stato utilizzato il t-test33 di Student. *valore p < 0,05. (D) I grafici a barre (media ± deviazione standard) mostrano la frazione di eiezione LV e il volume in animali sham (n = 4), AoB (n = 9) e Deb (n = 7) alla settimana 5 misurati mediante ecocardiografia da immagini in modalità M e B. (E) Le immagini ecocardiografiche rappresentative in modalità M mostrano cambiamenti nell'accorciamento frazionario LV negli animali sham, AoB e Deb alla settimana 5. Per le analisi statistiche è stato utilizzato il test Mann-Whitney U33 . *valore p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: L'emodinamica ventricolare è normalizzata e l'ipertrofia cardiaca è invertita dallo scioglimento aortico. (A) Misurazioni rappresentative della pressione sanguigna ventricolare sinistra (LV) e ventricolare destra (RV) in un ratto 3 settimane dopo il banding aortico (AoB) rispetto al corrispondente controllo fittizio. (B) Le immagini rappresentative mostrano ipertrofia cardiaca in un ratto AoB 3 settimane dopo il banding aortico rispetto al controllo fittizio. (C-F) I grafici di scatole e baffi mostrano la pressione sistolica ventricolare sinistra (LVSP; C), ipertrofia LV ([LV+S]/BW; D), pressione sistolica ventricolare destra (RVSP; E) e ipertrofia RV (RV/BW; F) in animali sham e AoB a 3 e 5 settimane dopo l'intervento chirurgico e parametri normalizzati (rispetto ai gruppi AoB a 3 e 5 settimane) nei ratti Deb. Le caselle mostrano rispettivamente la mediana, 25 e 75 percentili; i baffi indicano i valori minimo e massimo. n = 9-12 animali sono stati analizzati per misurazioni emodinamiche e il peso cardiaco è stato misurato in n = 7-12 ratti per gruppo. Per le analisi statistiche è stato utilizzato il test Mann-Whitney U. *valore p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, viene riportata una tecnica chirurgica dettagliata per il debanding aortico in un modello AoB di ratto che può essere utilizzata per studiare la reversibilità del PH-LHD e i meccanismi cellulari e molecolari che guidano il rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare e nel RV. Tre settimane di costrizione aortica nei ratti giovani si traducono in PH-LHD evidente come aumento delle pressioni LV, ipertrofia LV e concomitante aumento delle pressioni RV e ipertrofia RV. Lo scioglimento aortico alla settimana 3 post-AoB è stato in grado di scaricare il LV e invertire completamente l'ipertrofia LV entro due settimane dopo Deb. Parallelamente, lo scioglimento aortico ha anche causato una completa normalizzazione delle pressioni RV e una parziale inversione dell'ipertrofia RV.
Il presente modello imita quindi gli aspetti critici dello scenario clinico in cui lo scarico meccanico del LV da parte di un LVAD non pulsatile impiantabile con proprietà di flusso continuo è stato precedentemente trovato per invertire il PH in pazienti con insufficienza cardiaca34,35. In un'analisi retrospettiva, il supporto LVAD ha dimostrato di ridurre la pressione dell'arteria polmonare a livelli simili nei pazienti con insufficienza cardiaca con PH reversibile o fisso, con PH fisso definito come pressione arteriosa polmonare media >25 mm Hg, resistenza vascolare polmonare >2,5 Wood Unit e un gradiente transpolmonare a pressione media >12 mm Hg nonostante il trattamento farmacologico35. È importante sottolineare che questi risultati34,35 forniscono prove indirette che lo scarico ventricolare sinistro non solo diminuisce la congestione polmonare passiva e i cambiamenti secondari nel tono vascolare polmonare, ma innesca il rimodellamento inverso della vascolarizzazione polmonare da meccanismi "fisiologici", cioè l'adattamento all'emodinamica alterata. Analisi approfondite e multi-omiche dei processi cellulari e molecolari che guidano il rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare potrebbero aprire nuove strade per l'identificazione di nuove opzioni terapeutiche per il trattamento del PH nei pazienti con insufficienza cardiaca e potenzialmente anche in altre forme di PH tra cui PAH. L'attuale modello di debanding nei ratti AoB offre una possibilità unica per tali analisi in quanto la completa normalizzazione di RVSP conferma un'efficace inversione del PH, consentendo così studi meccanicistici per identificare percorsi con la capacità di ripristinare i processi omeostatici nella vascolarizzazione polmonare malata.
Con un razionale simile, il presente modello può essere ulteriormente utilizzato per studiare i processi intra e intercellulari che guidano il rimodellamento inverso del RV. La funzione RV è stata recentemente riconosciuta come un predittore significativo della prognosi per morbilità e mortalità nelle malattie cardiovascolari. Eppure nessuna terapia è stata clinicamente approvata per migliorare la funzione RV36. Pertanto, la capacità di studiare i processi di rimodellamento inverso nel miocardio RV in un modello animale offre un'opportunità unica per affrontare una significativa lacuna di conoscenza e un'esigenza medica critica.
Il successo della procedura di debanding aortico tecnicamente impegnativa nei ratti AoB dipende dalle abilità chirurgiche e da precise strategie perioperatorie. Di seguito sono descritte le fasi critiche della procedura chirurgica che possono causare letalità perioperatoria da sanguinamento eccessivo (1-5) o respirazione insufficiente (6) e raccomandazioni su come evitare queste complicanze.
(1) Durante una toracotomia, la linea medio-venale deve essere avvicinata con attenzione con le forbici per evitare lesioni all'arteria mammaria interna. (2) Per visualizzare il cuore e le arterie del condotto, il timo deve essere mobilitato e accuratamente ricollocato nella direzione cranica. Nella chirurgia di debanding, il tessuto del timo è spesso collegato al cuore e alle arterie tramite aderenze post-operatorie dalla chirurgia AoB originale. Queste aderenze devono essere accuratamente separate con un paio di pinze smussate per evitare lesioni alle strutture cardiovascolari. (3) Nell'intervento chirurgico di debanding, l'aorta con la clip è spesso incorporata nel tessuto connettivo. Questo tessuto connettivo deve essere delicatamente sezionato con una pinza smussata per visualizzare la clip. Qui, l'ecocardiografia transtoracica eseguita prima dell'intervento chirurgico è un'utile fase di preparazione, che consente di identificare se la clip si trova vicino alla radice aortica, nel mezzo dell'aorta ascendente o vicino all'arteria brachiocefalica. Questa conoscenza consente di risparmiare tempo prezioso per l'allocazione delle clip durante l'intervento chirurgico. (4) L'orientamento della clip è un passaggio critico che deve essere considerato attentamente durante l'intervento chirurgico iniziale di bendaggio aortico. Per facilitare la valutazione ottimale e l'apertura rapida della clip durante lo scioglimento aortico, la parte che deve essere compressa dal supporto dell'ago (Figura 4B) deve essere orientata ventralmente. Il riorientamento della clip durante l'intervento chirurgico di debanding è fattibile, anche se a rischio di lesioni all'aorta. Per il riorientamento delle clip, le clip devono essere tenute da una pinza mentre il tessuto connettivo circostante viene accuratamente rimosso, quindi la clip deve essere mobilitata e girata. Tenere l'aorta con la pinza è da evitare. (5) Per la debanding, la clip deve essere tenuta da una pinza con una mano e aperta con un portaago con l'altra mano. L'aorta non deve essere sollevata ventralmente. (6) Dopo aver completato la procedura di debanding, i ratti con PH-LHD estubato sono a notevole rischio di insufficienza respiratoria, con animali che comunemente muoiono entro 10-20 minuti dall'intervento chirurgico mentre sono ancora sotto anestesia. L'atelettasia del polmone sinistro è la causa più comune di morte in questo periodo e la ventilazione meccanica prolungata prima della chiusura del torace aiuta a reclutare il polmone e garantisce una respirazione sufficiente dopo l'intervento chirurgico.
Suggeriamo inoltre che rispetto all'intubazione endotracheale eseguita in studi precedenti26,27, la tracheostomia fornisce un migliore controllo della ventilazione appropriata durante le procedure chirurgiche, che è specificamente rilevante durante lo scioglimento dell'aorta. Questa nozione si basa sul seguente razionale: (1) La tracheostomia, eseguita abitualmente nel nostro laboratorio per la ventilazione polmonare perioperatoria, è una tecnica semplice e sicura senza complicazioni perioperatorie o post-operatorie. (2) La tracheostomia elimina il rischio di intubazione esofagea o lesioni tracheali; consente un posizionamento e una fissazione precisi della cannula tracheale e un controllo visivo costante della cannula durante tutte le fasi della procedura chirurgica. (3) Al momento dello scioglimento dell'aortica, gli animali AoB sono già in insufficienza cardiaca e sono più sensibili allo stress aggiuntivo; di conseguenza, i potenziali rischi che derivano dall'intubazione endotracheale possono aumentare la letalità. (4) Infine, quando l'animale operato viene svezzato dal ventilatore ma non riesce a sviluppare una respirazione spontanea, una tracheostomia consente una rapida reintubazione e riconnessione con il ventilatore, salvando così potenzialmente vite umane grazie alla capacità di una ventilazione post-operatoria prolungata.
Il presente studio riporta una tecnica di debanding aortico eseguita 3 settimane dopo il banding aortico iniziale nei ratti. Per gli studi volti a confrontare il rimodellamento inverso della vascolarizzazione polmonare e del RV in diversi stadi di PH, le procedure descritte possono anche essere eseguite in momenti successivi dopo il banding aortico. Tuttavia, la cautela è giustificata in quanto la cicatrice e il tessuto connettivo che circondano l'aorta diventeranno probabilmente più abbondanti con il tempo, complicando ulteriormente la procedura e richiedendo ulteriori problemi e perfezionamento. Allo stesso tempo, si applicano ancora i principi di base del protocollo riportato.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Tutti i co-autori hanno visto e concordano con il contenuto del manoscritto.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) a CK e WMK, il BMBF (Ministero tedesco dell'istruzione e della ricerca) a CK nel quadro di VasBio, e a WMK nel quadro di VasBio, SYMPATH e PROVID, e la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) a WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 e KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
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