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Medicine

Un modelo de remodelación vascular inversa en la hipertensión pulmonar debido a la enfermedad cardíaca izquierda por desbandamiento aórtico en ratas

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63502
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 2, 2, 2,3, *2,3, *1,3,4
1Department of Cardiothoracic and Vascular Surgery, German Heart Center Berlin (DHZB), 2Institute of Physiology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), Partner Site Berlin, 4Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health
* These authors contributed equally

Summary

El presente protocolo describe un procedimiento quirúrgico para eliminar las bandas aórticas ascendentes en un modelo de rata de hipertensión pulmonar debido a una enfermedad cardíaca izquierda. Esta técnica estudia los mecanismos endógenos de remodelación inversa en la circulación pulmonar y el corazón derecho, informando así estrategias para revertir la hipertensión pulmonar y/o la disfunción ventricular derecha.

Abstract

La hipertensión pulmonar debida a la enfermedad cardíaca izquierda (PH-LHD) es la forma más común de PH, sin embargo, su fisiopatología está mal caracterizada que la hipertensión arterial pulmonar (HAP). Como resultado, faltan intervenciones terapéuticas aprobadas para el tratamiento o la prevención de la PH-LHD. Los medicamentos utilizados para tratar la HP en pacientes con HAP no se recomiendan para el tratamiento de la PH-LHD, ya que la reducción de la resistencia vascular pulmonar (PVR) y el aumento del flujo sanguíneo pulmonar en presencia de un aumento de las presiones de llenado del lado izquierdo pueden causar descompensación del corazón izquierdo y edema pulmonar. Es necesario desarrollar nuevas estrategias para revertir la HP en pacientes con LHD. A diferencia de la HAP, la PH-LHD se desarrolla debido al aumento de la carga mecánica causada por la congestión de la sangre en la circulación pulmonar durante la insuficiencia cardíaca izquierda. Clínicamente, la descarga mecánica del ventrículo izquierdo (VI) por reemplazo de la válvula aórtica en pacientes con estenosis aórtica o por implantación de dispositivos de asistencia del VI en pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal normaliza no solo las presiones arterial pulmonar y ventricular derecha (RV) sino también la PVR, proporcionando así evidencia indirecta de remodelación inversa en la vasculatura pulmonar. Utilizando un modelo de rata establecido de PH-LHD debido a la insuficiencia cardíaca izquierda desencadenada por la sobrecarga de presión con el posterior desarrollo de PH, se desarrolla un modelo para estudiar los mecanismos moleculares y celulares de este proceso fisiológico de remodelación inversa. En concreto, se realizó una cirugía de desbandado aórtico, que dio lugar a la remodelación inversa del miocardio del VI y su descarga. Paralelamente, se detectó la normalización completa de la presión sistólica de RV y la reversión significativa pero incompleta de la hipertrofia de RV. Este modelo puede presentar una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de remodelación inversa fisiológica en la circulación pulmonar y el RV, con el objetivo de desarrollar estrategias terapéuticas para el tratamiento de ph-LHD y otras formas de PH.

Introduction

La insuficiencia cardíaca es la principal causa de muerte en los países desarrollados y se espera que aumente en un 25% en la próxima década. La hipertensión pulmonar (HP), un aumento patológico de la presión arterial en la circulación pulmonar, afecta aproximadamente al 70% de los pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal; la Organización Mundial de la Salud clasifica la HP como hipertensión pulmonar debida a cardiopatía izquierda (PH-LHD)1. La PH-LHD se inicia por una función sistólica y/o diastólica del ventrículo izquierdo (VI) deteriorada que resulta en una presión de llenado elevada y una congestión pasiva de la sangre en la circulación pulmonar2. Aunque inicialmente reversible, la PH-LHD se fija gradualmente debido a la remodelación vascular pulmonar activa en todos los compartimentos de la circulación pulmonar, es decir, arterias, capilares y venas 3,4. Tanto el pH reversible como el fijo aumentan la poscarga del RV, lo que inicialmente impulsa la hipertrofia miocárdica adaptativa, pero en última instancia causa dilatación del RV, hipocinesis, fibrosis y descompensación que conducen progresivamente a la falla del RV 1,2,5,6. Como tal, la HP acelera la progresión de la enfermedad en pacientes con insuficiencia cardíaca y aumenta la mortalidad, particularmente en pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico mediante la implantación de dispositivos de asistencia ventricular izquierda (DAVI) y / o trasplante de corazón 7,8,9. Actualmente, no existen terapias curativas que puedan revertir el proceso de remodelación vascular pulmonar, por lo que se necesita una investigación mecanicista fundamental en sistemas modelo apropiados.

Es importante destacar que los estudios clínicos muestran que la PH-LHD como complicación frecuente en pacientes con estenosis aórtica puede mejorar rápidamente en el período postoperatorio temprano después del reemplazo de la válvula aórtica10. Análogamente, la resistencia vascular pulmonar (PVR) preoperatoria alta (>3 unidades de madera) que, sin embargo, era reversible con nitroprusiato se normalizó de manera sostenible después del trasplante de corazón en un estudio de seguimiento de 5 años11. Del mismo modo, una reducción adecuada de la PVR reversible y fija y la mejora de la función de RV en pacientes con LHD podrían realizarse en varios meses mediante la descarga del ventrículo izquierdo mediante dispositivos de asistencia ventricular pulsátiles y no pulsátiles implantables 12,13,14. Actualmente, los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la remodelación inversa en la circulación pulmonar y el miocardio RV no están claros. Sin embargo, su comprensión puede proporcionar información importante sobre las vías fisiológicas que pueden explotarse terapéuticamente para revertir la remodelación vascular pulmonar y de RV en PH-LHD y otras formas de PH.

Se puede utilizar un modelo preclínico adecuado que replique adecuadamente las características fisiopatológicas y moleculares de PH-LHD para estudios traslacionales en insuficiencia cardíaca congestiva inducida por sobrecarga de presión debido a bandas aórticas quirúrgicas (AoB) en ratas 4,15,16. En comparación con una insuficiencia cardíaca similar debido a la sobrecarga de presión en el modelo murino de constricción aórtica transversa (TAC)17, la banda de la aorta ascendente por encima de la raíz aórtica en ratas AoB no produce hipertensión en la arteria carótida izquierda ya que el sitio de banda es proximal de la salida de la arteria carótida izquierda de la aorta. Como resultado, AoB no causa lesión neuronal del lado izquierdo en la corteza como es característico de TAC18, y que puede afectar el resultado del estudio. En comparación con otros modelos de roedores de PH-LHD inducida quirúrgicamente, los modelos de rata en general, y AoB en particular, demuestran ser más robustos, reproducibles y replican la remodelación de la circulación pulmonar característica para los pacientes con PH-LHD. Al mismo tiempo, la letalidad perioperatoria es baja19. El aumento de las presiones del VI y la disfunción del VI en ratas AoB inducen el desarrollo de PH-LHD, lo que resulta en presiones elevadas de RV y remodelación de RV. Como tal, el modelo de rata AoB ha demostrado ser extremadamente útil en una serie de estudios previos realizados por grupos independientes, incluyéndonos a nosotros mismos, para identificar mecanismos de remodelación vascular pulmonar y probar posibles estrategias de tratamiento para PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.

En el presente estudio, el modelo de rata AoB se utilizó para establecer un procedimiento quirúrgico de desbandado aórtico para estudiar los mecanismos de remodelación inversa en la vasculatura pulmonar y el RV. Anteriormente, se han desarrollado modelos de remodelación inversa miocárdica como la desbanda aórtica en ratones26 y ratas27 para investigar los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regresión de la hipertrofia ventricular izquierda y probar posibles opciones terapéuticas para promover el miocardio. recuperación. Además, un número limitado de estudios anteriores han explorado los efectos de la desbandación aórtica sobre la HP-LHD en ratas y mostraron que la desbandación aórtica podría revertir la hipertrofia medial en las arteriolas pulmonares, normalizar la expresión de pre-pro-endotelina 1 y mejorar la hemodinámica pulmonar27,28, proporcionando evidencia de la reversibilidad de la HP en ratas con insuficiencia cardíaca. Aquí, los procedimientos técnicos de la cirugía de desbandado se optimizan y estandarizan, por ejemplo, mediante la aplicación de una traqueotomía en lugar de la intubación endotraqueal o mediante el uso de clips de titanio de un diámetro interno definido para bandas aórticas en lugar de suturas de polipropileno con una aguja roma26,27, proporcionando así un mejor control de los procedimientos quirúrgicos, una mayor reproducibilidad del modelo y una mejor tasa de supervivencia.

Desde una perspectiva científica, la importancia del modelo de desbandado PH-LHD no radica únicamente en demostrar la reversibilidad del fenotipo cardiovascular y pulmonar en la insuficiencia cardíaca, sino más importante aún, en la identificación de impulsores moleculares que desencadenan y / o sostienen la remodelación inversa en las arterias pulmonares como candidatos prometedores para la futura orientación terapéutica.

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Protocol

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, 8ª edición 2011) y aprobados por el comité gubernamental local de cuidado y uso de animales de la Oficina Estatal Alemana de Salud y Asuntos Sociales (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlín; protocolo no. G0030/18). En primer lugar, la insuficiencia cardíaca congestiva se indujo quirúrgicamente en ratas Sprague-Dawley juveniles ~ 100 g de peso corporal (bw) (ver Tabla de Materiales) mediante la colocación de un clip de titanio con un diámetro interno de 0,8 mm en la aorta ascendente (banda aórtica, AoB) como se describió anteriormente29,30. En la semana 3 después de AoB (Figura 1), se realizó una cirugía de desbandado (Deb) para extraer el clip de la aorta. Los procedimientos quirúrgicos y la validación de la reversión del pH en ratas AoB realizados se representan esquemáticamente en la Figura 1.

1. Preparaciones quirúrgicas

  1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos requeridos (Figura 2) en autoclave.
  2. Inyecte carprofeno a la rata (5 mg/kg de peso corporal) (ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal (i.p.) para analgesia 30 min antes de la cirugía.
  3. Anestesiar a la rata mediante inyección i.p. de ketamina (87 mg/kg de peso corporal) y xilazina (13 mg/kg de peso corporal).
  4. Retire el pelo del escote y el pecho del animal con una afeitadora eléctrica.
  5. Aplique una gota de ungüento para los ojos para proteger los ojos durante la cirugía.
  6. Coloque la rata en posición supina sobre una mesa quirúrgica esterilizada. Fije cuidadosamente el abdomen y las extremidades del animal con cinta adhesiva.
    NOTA: Para mantener la temperatura corporal, coloque una estera calefactora de 37 °C debajo de la mesa quirúrgica. Evite el calentamiento de la región de la cabeza para evitar la sequedad de los ojos.
  7. Desinfecte la piel de los animales con solución de povidona-yodo/yodóforo. Tenga en cuenta las cicatrices y suturas de la cirugía primaria de AoB y cubra el campo quirúrgico.
  8. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia mediante el pellizco de los dedos de los pies.
    NOTA: La profundidad de la anestesia debe controlarse regularmente durante la cirugía.

2. Traqueotomía y ventilación mecánica

NOTA: Durante toda la cirugía, cámbiese los guantes después de manipular equipos no estériles.

  1. Con tijeras finas (Figura 2A), haga una incisión en la línea media cervical de 7-10 mm de largo (Figura 3A).
  2. Con la ayuda de un par de fórceps contundentes (Figura 2B'), diseccionar el tejido blando cervical para exponer los músculos infrahioides. Divida los músculos en la línea media para visualizar la tráquea. Cortar y retirar la sutura de la cirugía primaria de AoB.
  3. Haga una incisión de tráquea de ~ 2 mm entre dos anillos cartilaginosos usando tijeras de resorte Noyes en ángulo (Figura 2C, 3B). Inserte la cánula traqueal de diámetro exterior de 2 mm (Figura 2D) en la tráquea y asegúrela con una sutura de seda 4-0 (Figura 2E, 3C).
  4. Conecte la cánula traqueal a un ventilador mecánico (consulte la Tabla de materiales) manteniendo el espacio muerto al mínimo (Figura 3D-E). Mantenga la ventilación pulmonar perioperatoria a una frecuencia respiratoria de 90 respiraciones/min a un volumen corriente (Vt) de 8,5 ml/kg de peso corporal.

3. Desbandado aórtico

  1. Haga una incisión en la piel de ~ 20 mm de largo entre la segunda y la tercera costilla con tijeras finas (Figura 3F).
  2. Con la ayuda de tijeras quirúrgicas más pequeñas (Figura 2F), extienda cuidadosamente los músculos y córtelos capa por capa (Figura 3G). Haga una incisión lateral de 10 mm a lo largo del espacio intercostal entre la segunda y la tercera costilla.
    NOTA: La línea media debe abordarse cuidadosamente para evitar el sangrado.
  3. Utilice un esparcidor de costillas (Figura 2G) para expandir el espacio intercostal entre la segunda y la tercera costilla para crear una ventana quirúrgica (Figura 3H).
  4. Con la ayuda de fórceps contundentes (Figura 2B, B'), separe cuidadosamente el timo del corazón y las arterias del conducto para visualizar la aorta con el clip (Figura 4A).
  5. Sostenga el clip con la ayuda de las pinzas y retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del clip para exponerlo.
    NOTA: Evite sostener o levantar la aorta con las fórceps, ya que puede lesionar la aorta, lo que resulta en sangrado y un resultado letal.
  6. Con la ayuda de un soporte de aguja (Figura 2H), abra el clip (Figura 4B) y retírelo de la cavidad torácica.
  7. Antes de cerrar el tórax, abra la atelectasia pulmonar, asegure un reclutamiento pulmonar adecuado sin sobredistensión, continúe la ventilación mecánica con una Vt de 9,5 mL/kg de peso corporal durante otros 10 min, y vuelva a una Vt de 8,5 mL/kg de peso corporal para reclutar los pulmones y resolver un posible neumotórax.
  8. Cierre los músculos profundos con una simple sutura interrumpida con seda 4-0. Luego conecte los músculos superiores y la piel con una sutura continua simple (Figura 5A, B).

4. Extubación traqueal

  1. Desconecte la cánula traqueal de la máquina de ventilación. Observe atentamente a la rata hasta que se restablezca la respiración espontánea. Si el animal no respira espontáneamente al desconectarse, vuelva a conectar el ventilador y continúe ventilando durante 5 minutos adicionales. A continuación, repita el procedimiento.
  2. Después de restablecer la respiración espontánea, retire la cánula de la tráquea y limpie el líquido alrededor de la tráquea con puntos de esponja (Figura 2I) (ver Tabla de Materiales).
  3. Cierre la tráquea con una sutura simple usando proleno 6-0 (Figura 2E' y Figura 5C). Luego cierre los músculos infrahioides en una sutura interrumpida simple usando seda 4-0 (Figura 5D), y conecte la piel en una sutura continua simple (Figura 5E). Limpie y desinfecte los músculos y la piel durante el proceso con la solución de povidona-yodo/yodóforo.

5. Cuidados postoperatorios

  1. Después de completar el procedimiento quirúrgico, mueva cuidadosamente al animal a una jaula de recuperación con oxígeno suplementario y una lámpara infrarroja para mantener a los animales calientes y suficientemente oxigenados durante la fase de recuperación. Coloque la máscara de oxígeno cerca del hocico de la rata. Solo mantenga un animal por jaula de recuperación en cualquier momento.
  2. Después de que el animal se despierte, muévalo con cuidado a una jaula regular provista de agua y comida. Durante las siguientes 12 h, controle el estado sanitario del animal operado en intervalos de 2 h.
  3. Después de completar el procedimiento quirúrgico, aplique analgesia diariamente mediante inyección i.p. de carprofeno (5 mg/kg de peso corporal) durante una semana.
  4. Para evitar la infección bacteriana, administre amoxicilina (500 mg/L) en el agua potable durante una semana después de la operación.

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Representative Results

En primer lugar, se confirmó el éxito de la desbandación aórtica mediante ecocardiografía transtorácica realizada antes y después del procedimiento de desbandado en animales AoB (Figura 6). Con este fin, se evaluó el arco aórtico en la vista de modo B del eje largo paraesternal (PLAX). Se visualizó la posición del clip en la aorta ascendente en animales AoB y su ausencia después de la cirugía Deb (Figura 6A,B). A continuación, se evaluó el flujo sanguíneo aórtico mediante imágenes Doppler de onda pulsada (Figura 6C-F). La velocidad máxima del flujo sanguíneo en animales AoB medida antes y después del clip fue de 733.24 ± 17.39 mm / s y 5215.08 ± 48.05 mm / s (n = 8 animales), respectivamente (Figura 6C, E), lo que demuestra un gradiente pronunciado en todo el sitio AoB. Después de la extracción del clip, la velocidad máxima del flujo sanguíneo fue de 1093,79 ± 28,97 mm/s y 2578,73 ± 42,27 mm/s, respectivamente, en las ubicaciones aórticas correspondientes, mostrando una marcada atenuación del gradiente en línea con la desbanda funcional (Figura 6D,F). Para sondear la reversión de la insuficiencia cardíaca izquierda por desbandado aórtico, se accedió a los niveles de expresión del péptido natriurético cerebral (BNP), un parámetro de rutina clínica para evaluar la enfermedad cardíaca31, en el miocardio del VI. En las semanas 3 y 5 después de la banda aórtica, los animales AoB mostraron un aumento significativo de la producción de BNP en comparación con los controles operados simuladamente. En contraste, las ratas Deb en la semana 5 expresaron BNP a niveles comparables a los animales simulados, lo que indica la reversión de la falla del VI por desbanda aórtica (Figura 7A-C). Paralelamente, la evaluación de la función del VI mediante ecocardiografía transtorácica reveló un aumento de la fracción de eyección del VI y del volumen del VI en animales Deb en comparación con ratas AoB (Figura 7D-E). Mientras que la fracción de eyección del VI en animales Deb fue comparable a la de las ratas simuladas, el volumen del VI en las ratas Deb no se normalizó completamente a los valores observados en el grupo simulado, lo que indica que la inversión de la función del VI es incompleta.

Para sondear si los animales Deb pueden servir como modelo preclínico para estudiar la remodelación pulmonar inversa vascular y ventricular derecha (RV) en PH-LHD, la presión sistólica del ventrículo izquierdo (LVSP) y la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) se evaluó mediante un catéter Millar de microtipo. En resumen, las ratas fueron nuevamente anestesiadas con ketamina (87 mg / kg de peso corporal) y xilazina (13 mg / kg de peso corporal), traqueotomizadas y ventiladas como se describió anteriormente. El cateterismo cardíaco se realizó después de la toracotomía mediana32 a través del ápice de (primero) el ventrículo izquierdo y (segundo) el ventrículo derecho, respectivamente, ya que el cateterismo directo del ventrículo izquierdo a través de la vía vascular es prevenido por la banda aórtica en animales AoB. Después de la eutanasia por una sobredosis de ketamina/xilazina, se extirpó el corazón y se evaluó la hipertrofia ventricular como el peso del ventrículo izquierdo, incluido el tabique (LV + S) o el ventrículo derecho (RV) normalizado al peso corporal (BW). De acuerdo con las ratas AoB como modelo establecido para PH-LHD, los animales AoB mostraron un aumento significativo de LVSP y RVSP e hipertrofia de LV y RV en comparación con los animales operados simuladamente a las 3 semanas después de la cirugía (Figura 8A-F). La cirugía de desbandado (Deb) realizada en la semana 3 después de AoB resultó en una reducción significativa de la hipertrofia de LVSP y LV en comparación con los animales AoB sin Deb en la semana 3 y la semana 5 después de AoB, lo que demuestra que la normalización de la hemodinámica del VI después de la eliminación del clip de la aorta revirtió la remodelación del VI (Figura 8C, D). En comparación con las ratas AoB en la semana 3 y la semana 5, los animales Deb también mostraron una reducción significativa en RVSP y RV / BW, demostrando una reversión exitosa de PH-LHD (Figura 8E, F). En particular, RVSP en ratas Deb fue comparable a los valores medidos en animales simulados, lo que indica una normalización completa de la hemodinámica rv. En contraste, la hipertrofia de RV en animales Deb solo se revirtió parcialmente con RV / BW, permaneciendo significativamente aumentada en comparación con los controles simulados (Figura 8E, F).

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de los procedimientos quirúrgicos y validación de la reversión del pH en ratas AoB. El esquema representa los diferentes grupos experimentales utilizados en el presente estudio para probar si la cirugía de desbandado revierte la PH-LHD. Controles simulados, operados por simulación; AoB: bandas aórticas; Deb, desbandado. Los triángulos marcan el punto temporal de las intervenciones quirúrgicas: operación primaria (simulada o AoB; rojo) en la semana 0 y operación secundaria (Deb; verde) en la semana 3. Los círculos marcan los análisis de punto final en los que se evaluó ph-LHD mediante presiones de VI y RV y mediciones de hipertrofia, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Instrumentos quirúrgicos. (A) Tijeras finas carburo de tungsteno. B) Fórceps Moria Iris y (B') fórceps Graefe serrados. Las puntas de los fórceps se muestran agrandadas. (C) Tijeras de resorte Noyes. (D) Cánula traqueal. (E, E') suturas 4-0 y 6-0, respectivamente. (F) Tijeras finas carburo de tungsteno. (G) Esparcidor de costillas. (H) Soporte de aguja Mathieu. (I) Tejido de puntos de esponja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Traqueotomía y toracotomía. Las imágenes ilustran los pasos quirúrgicos para la traqueotomía. (A) Incisión cervical en la línea media. (B) Incisión de la tráquea entre dos anillos cartilaginosos. (C) Cánula traqueal insertada en la tráquea y asegurada con una sutura. (D) La cánula traqueal está conectada a un ventilador mecánico. (E) Las imágenes ilustran los pasos quirúrgicos para la toracotomía. (F) Incisión en la piel entre la segunda y tercera costillas. (G) Corte de músculos. (H) Creación de una ventana quirúrgica torácica mediante la extensión de la segunda y la tercera costillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Visualización del clip de constricción aórtica in vivo y ex vivo. (A) La imagen muestra la cavidad torácica de una rata AoB con un clip de titanio colocado en la aorta ascendente. (B) La imagen muestra el clip cerrado y abierto ex vivo. El asterisco marca la parte del clip que el soporte de la aguja comprime in vivo para abrir el clip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cierre de heridas. Las imágenes ilustran el cierre de los músculos torácicos superiores (A) y la piel (B) con una sutura continua simple. La tráquea (C) y los músculos infrahioides (D) están cerrados por una sutura simple y la piel del cuello (E) por una sutura continua simple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Flujo sanguíneo aórtico antes y después de la cirugía de desbandado. (A-B) Visualización de la aorta ascendente en una rata con bandas aórticas (AoB, izquierda) y una rata después de la cirugía de desbandado (Deb, derecha) mediante ecocardiografía transtorácica. La flecha muestra el clip de titanio en la aorta en (A) ausente en (B). (C,D) Las imágenes ecocardiográficas Doppler de onda pulsada muestran el flujo sanguíneo antes del clip en una rata AoB (C) y el flujo sanguíneo en el segmento aórtico correspondiente en una rata Deb (D) tomadas un día antes y un día después de la cirugía de desbandado aórtico, respectivamente. (E,F) Análogamente, las imágenes muestran el flujo sanguíneo en el segmento aórtico después del clip en una rata AoB (E) y en el segmento aórtico correspondiente en una rata Deb (F) tomadas un día antes y un día después de la cirugía de desbandación aórtica, respectivamente. Las líneas verticales de Turquois ilustran las mediciones de la velocidad máxima del flujo aórtico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Normalización de la función ventricular izquierda por desbandamiento aórtico. (A) Los Western blots representativos muestran niveles proteicos de BNP y con GAPDH como control de carga en ventrículos izquierdos (VI) de ratas AoB en la semana 3 después de la banda aórtica (n = 5) y en los controles simulados correspondientes (n = 5). (B) Los Western blots representativos muestran BNP y GAPDH en ventrículos izquierdos (VI) de ratas AoB en la semana 5 después de la banda aórtica (n = 4), en ratas Deb en la semana 5 (n = 5) y en controles simulados en el momento correspondiente después de la cirugía primaria (n = 4). (C) Los gráficos de caja y bigotes muestran la cuantificación de la expresión de BNP normalizada a GAPDH y el control simulado en el momento correspondiente después de la cirugía primaria. Los recuadros muestran percentiles mediano, 25 y 75, respectivamente; los bigotes indican los valores mínimo y máximo. Para los análisis estadísticos, se utilizó la prueba t de Student33 . *p-valor < 0.05. (D) Los gráficos de barras (media ± desviación estándar) muestran la fracción de eyección del VI y el volumen en animales simulados (n = 4), AoB (n = 9) y Deb (n = 7) en la semana 5 medidos por ecocardiografía a partir de imágenes en modo M y B. (E) Las imágenes ecocardiográficas representativas en modo M muestran cambios en el acortamiento fraccional del VI en animales simulados, AoB y Deb en la semana 5. Para los análisis estadísticos se utilizó la prueba U de Mann-Whitney33 . *p-valor < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: La hemodinámica ventricular se normaliza y la hipertrofia cardíaca se invierte mediante la desbandación aórtica. (A) Mediciones representativas de la presión arterial del ventrículo izquierdo (VI) y del ventrículo derecho (RV) en una rata 3 semanas después de la banda aórtica (AoB) en comparación con el control simulado correspondiente. (B) Las imágenes representativas muestran hipertrofia cardíaca en una rata AoB 3 semanas después de la banda aórtica en comparación con el control simulado. (C-F) Los gráficos de caja y bigotes muestran presión sistólica del ventrículo izquierdo (LVSP; C), hipertrofia del VI ([LV+S]/BW; D), presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP; E), e hipertrofia RV (RV/BW; F) en animales simulados y AoB a las 3 y 5 semanas después de la cirugía, y parámetros normalizados (en comparación con los grupos AoB de 3 y 5 semanas) en ratas Deb. Los recuadros muestran percentiles mediano, 25 y 75, respectivamente; los bigotes indican los valores mínimo y máximo. n = 9-12 animales fueron analizados para mediciones hemodinámicas, y el peso cardíaco se midió en n = 7-12 ratas por grupo. Para los análisis estadísticos se utilizó la prueba U de Mann-Whitney. *valor p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, se informa una técnica quirúrgica detallada para la desbandación aórtica en un modelo AoB de rata que se puede utilizar para investigar la reversibilidad de PH-LHD y los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la remodelación inversa en la vasculatura pulmonar y el RV. Tres semanas de constricción aórtica en ratas juveniles dan como resultado ph-LHD evidente como aumento de las presiones del VI, hipertrofia del VI y concomitantemente aumento de las presiones de RV e hipertrofia de RV. La desbandación aórtica en la semana 3 después de la AoB fue capaz de descargar el VI y revertir completamente la hipertrofia del VI dentro de las dos semanas posteriores a La Deb. Paralelamente, la desbandación aórtica también causó una normalización completa de las presiones de RV y una reversión parcial de la hipertrofia de RV.

Por lo tanto, el presente modelo imita aspectos críticos del escenario clínico donde la descarga mecánica del VI por un DAVI implantable no pulsátil con propiedades de flujo continuo se ha encontrado previamente para revertir la HP en pacientes con insuficiencia cardíaca34,35. En un análisis retrospectivo, se demostró que el soporte de DAVI reduce la presión arterial pulmonar en grados similares en pacientes con insuficiencia cardíaca con PH reversible o fija, con PH fijo definido como presión arterial pulmonar media >25 mm Hg, resistencia vascular pulmonar >2.5 Unidad de madera y un gradiente transpulmonar de presión media >12 mm Hg a pesar del tratamiento farmacológico35. Es importante destacar que estos hallazgos34,35 proporcionan evidencia indirecta de que la descarga ventricular izquierda no solo disminuye la congestión pulmonar pasiva y los cambios secundarios en el tono vascular pulmonar, sino que desencadena la remodelación inversa de la vasculatura pulmonar por mecanismos "fisiológicos", es decir, por adaptación a la hemodinámica alterada. Los análisis multiómicos en profundidad de los procesos celulares y moleculares que impulsan la remodelación inversa en la vasculatura pulmonar podrían abrir nuevas vías para identificar nuevas opciones terapéuticas para tratar la HP en pacientes con insuficiencia cardíaca y potencialmente también en otras formas de HP, incluida la HAP. El modelo actual de desbandado en ratas AoB proporciona una posibilidad única para tales análisis, ya que la normalización completa de RVSP confirma la reversión efectiva de la HP, lo que permite estudios mecanicistas para identificar vías con la capacidad de restaurar los procesos homeostáticos en la vasculatura pulmonar enferma.

Con una lógica similar, el presente modelo puede utilizarse para estudiar los procesos intra e intercelulares que impulsan la remodelación inversa de la RV. La función RV ha sido reconocida recientemente como un predictor significativo del pronóstico de morbilidad y mortalidad en enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, no se han aprobado clínicamente terapias para mejorar la función deRV 36. Como tal, la capacidad de estudiar los procesos de remodelación inversa en el miocardio rv en un modelo animal brinda una oportunidad única para abordar una brecha de conocimiento significativa y una necesidad médica crítica.

El éxito del procedimiento de desbandado aórtico técnicamente desafiante en ratas AoB depende de las habilidades quirúrgicas y las estrategias perioperatorias precisas. A continuación se describen los pasos críticos del procedimiento quirúrgico que pueden causar letalidad perioperatoria por sangrado excesivo (1-5) o respiración insuficiente (6) y recomendaciones para evitar estas complicaciones.

(1) Durante una toracotomía, la línea mediaernal debe abordarse cuidadosamente con tijeras para evitar lesiones en la arteria mamaria interna. (2) Para visualizar el corazón y las arterias del conducto, el timo debe movilizarse y reubicarse cuidadosamente en la dirección craneal. En la cirugía de desbandado, el tejido del timo a menudo está conectado al corazón y las arterias a través de adherencias postoperatorias de la cirugía AoB original. Estas adherencias deben separarse cuidadosamente con un par de fórceps contundentes para evitar lesiones en las estructuras cardiovasculares. (3) En la cirugía de desbandado, la aorta con el clip se incrusta con frecuencia en el tejido conectivo. Este tejido conectivo debe diseccionarse suavemente con fórceps contundentes para visualizar el clip. Aquí, la ecocardiografía transtorácica realizada antes de la cirugía es un paso de preparación útil, que permite identificar si el clip se encuentra cerca de la raíz aórtica, en el medio de la aorta ascendente o cerca de la arteria braquiocefálica. Este conocimiento ahorra un tiempo precioso para la asignación de clips durante la cirugía. (4) La orientación del clip es un paso crítico que debe considerarse cuidadosamente durante la cirugía inicial de bandas aórticas. Para facilitar una evaluación óptima y una apertura rápida del clip durante el desbancado aórtico, la parte que necesita ser comprimida por el soporte de la aguja (Figura 4B) debe estar orientada ventralmente. La reorientación del clip durante la cirugía de desbandado es factible, aunque a riesgo de lesión de la aorta. Para la reorientación del clip, los clips deben sujetarse con fórceps mientras que el tejido conectivo circundante se retira cuidadosamente, luego el clip debe movilizarse y girarse. Se debe evitar sostener la aorta con los fórceps. (5) Para el desbandado, el clip debe sujetarse con un fórceps con una mano y abrirse con un soporte de aguja con la otra mano. La aorta no necesita ser levantada ventralmente. (6) Después de completar el procedimiento de desbandado, las ratas extubadas con PH-LHD tienen un riesgo considerable de insuficiencia respiratoria, y los animales comúnmente mueren dentro de los 10-20 minutos posteriores a la cirugía mientras aún están bajo anestesia. La atelectasia del pulmón izquierdo es la causa más común de muerte en este período, y la ventilación mecánica prolongada antes del cierre del tórax ayuda a reclutar el pulmón y garantiza una respiración suficiente después de la cirugía.

También sugerimos que, en comparación con la intubación endotraqueal realizada en estudios previos 26,27, la traqueostomía proporciona un mejor control de la ventilación adecuada durante los procedimientos quirúrgicos, lo cual es específicamente relevante durante la desbandación aórtica. Esta noción se basa en la siguiente lógica: (1) La traqueostomía, realizada rutinariamente en nuestro laboratorio para la ventilación pulmonar perioperatoria, es una técnica sencilla y segura sin complicaciones perioperatorias o postoperatorias. (2) La traqueostomía elimina el riesgo de intubación esofágica o lesión traqueal; permite el posicionamiento preciso y la fijación de la cánula traqueal y el control visual constante de la cánula durante todos los pasos del procedimiento quirúrgico. (3) En el momento de la desbandación aórtica, los animales AoB ya tienen insuficiencia cardíaca y son más sensibles al estrés adicional; como resultado, los riesgos potenciales que vienen con la intubación endotraqueal pueden aumentar la letalidad. (4) Finalmente, cuando el animal operado es destetado del ventilador pero no desarrolla respiración espontánea, una traqueostomía permite una rápida reintubación y reconexión con el ventilador, lo que podría salvar vidas debido a la capacidad de ventilación postoperatoria prolongada.

El presente estudio informa una técnica de desbandado aórtico realizada 3 semanas después de la banda aórtica inicial en ratas. Para los estudios que tienen como objetivo comparar la remodelación inversa de la vasculatura pulmonar y la RV en diferentes etapas de la HP, los procedimientos descritos también se pueden realizar en puntos de tiempo posteriores después de la banda aórtica. Sin embargo, se justifica la precaución ya que la cicatriz y el tejido conectivo que rodea la aorta probablemente se volverán más abundantes con el tiempo, lo que complicará aún más el procedimiento y requerirá una solución de problemas y refinamiento adicionales. Al mismo tiempo, siguen aplicándose los principios básicos del protocolo notificado.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar. Todos los coautores han visto y están de acuerdo con el contenido del manuscrito.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por subvenciones del DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular) a CK y WMK, el BMBF (Ministerio Alemán de Educación e Investigación) a CK en el marco de VasBio, y a WMK en el marco de VasBio, SYMPATH y PROVID, y la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 y KU1218/11-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amoxicillin Ratiopharm PC: 04150075615985 Antibiotic
Anti-BNP antibody Abcam ab239510 Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel Parker Laboratories BT-025-0037L Echocardiography consumables
Bepanthen Bayer 6029009.00.00 Eye ointment
Carprosol (Carprofen) CP-Pharma 401808.00.00 Analgesic
Clip holder Weck stainless USA 523140S Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide Fine Science Tools 14568-12 Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide Fine Science Tools 14568-09 Surgical scissors
High-resolution imaging system FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands VeVo 3100 Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane CP-Pharma 400806.00.00 Anesthetic
Ketamine CP-Pharma 401650.00.00 Anesthetic
Mathieu needle holder Fine Science Tools 12010-14 Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator) UGO Basile S.R.L. 7025 Volume controlled respirator
Metal clip Hemoclip 523735 Surgical consumables
Microscope Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters ADInstruments SPR-671 Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps Fine Science Tools 11373-12 Surgical forceps
Noyes spring scissors Fine Science Tools 15013-12 Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution B/Braun 16332M01 Disinfection
PowerLab ADInstruments 4_35 Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0 Ethicon EH7830 Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) Austos AE-BV010R Surgical instruments
Serrated Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10 Surgical forceps
Silk Suture, 4-0 Ethicon K871 Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored) B/Braun 19412M07 Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel Parker Laboratories TB-250-0241H Echocardiography consumables
Sponge points tissue Sugi REF 30601 Surgical consumables
Sprague-Dawley rat Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France Study animals
Tracheal cannula Outer diameter 2 mm
Xylazin CP-Pharma 401510.00.00 Anesthetic

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Sang, P., Kucherenko, M. M., Yao, J., Li, Q., Simmons, S., Kuebler, W. M., Knosalla, C. A Model of Reverse Vascular Remodeling in Pulmonary Hypertension Due to Left Heart Disease by Aortic Debanding in Rats. J. Vis. Exp. (181), e63502, doi:10.3791/63502 (2022).

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