Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Verfolgung des Lupusverlaufs bei Mäusen. Zwei zusätzliche Verfahren werden vorgestellt, um die Lupusnephritis basierend auf Zellinfiltration und Proteinablagerung in den Nieren zu charakterisieren.
Abstract
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung ohne bekannte Heilung und ist durch anhaltende Entzündungen in vielen Organen, einschließlich der Nieren, gekennzeichnet. Unter solchen Umständen verliert die Niere ihre Fähigkeit, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und die Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren, was schließlich zu Nierenversagen führt. Frauen, insbesondere solche im gebärfähigen Alter, werden neunmal häufiger diagnostiziert als Männer. Nierenerkrankungen sind die häufigste Todesursache bei SLE-Patienten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Messung der ausgeschiedenen Proteinspiegel im gesammelten Urin und verfolgt das Fortschreiten des Lupus im Laufe der Zeit. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Isolierung mononukleärer Nierenzellen basierend auf der Auswahl von Größe und Dichte bereitgestellt, um die renale Infiltration von Leukozyten zu untersuchen. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Methode entwickelt, um die Proteinablagerung in den Glomeruli und die Leukozyteninfiltration im tubulointerstitiellen Raum zu charakterisieren. Zusammen können diese Methoden helfen, das Fortschreiten chronischer Entzündungen im Zusammenhang mit den Nieren von Lupus-anfälligen MRL / lpr-Mäusen zu untersuchen.
Introduction
Die Hauptfunktion der Niere ist die Ausscheidung toxischer Substanzen durch den Urin unter Aufrechterhaltung der Homöostase von Wasser und Salzen1. Diese Funktion ist bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) bedroht, was zu einer sogenannten Lupusnephritis (LN) führt. LN ist eine Folge des Immunsystems, das die Niere angreift, was zu anhaltenden Nierenentzündungen führt und daher seine Fähigkeit verliert, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren. Dies führt schließlich zu Nierenversagen, das tödlich sein kann. Während des nephritischen Prozesses werden zirkulierende B-Zellen, T-Zellen und Monozyten in die Niere rekrutiert und sezernieren Chemokine, Zytokine und immunkomplexbildende Autoantikörper. Dies führt letztendlich zu Endothelzellschäden, membranösen Verletzungen, renaler tubulärer Atrophie und Fibrose2.
MRL/Mp-Fas lpr (MRL/lpr) Lupus-anfällige Mäuse sind ein klassisches Mausmodell, das lupusähnliche klinische Symptome aufweist, die dem menschlichen SLE3 ähneln. Dieses Modell hat maßgeblich zum Verständnis einer der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, der Lupusnephritis (LN)4, beigetragen. Sowohl beim menschlichen als auch bei der Maus-SLE ist LN durch eine allmähliche Entzündung gekennzeichnet, die durch renale Ablagerung von Immunkomplexen ausgelöst wird, gefolgt von Komplementaktivierung, Rekrutierung von Entzündungszellen und Verlust der Nierenfunktion5. Die Immunkomplexablagerung ist der erste Schritt, um die Chemokin- und Zytokinproduktion durch intrinsische Nierenzellen zu induzieren, die die Entzündungsreaktion durch Rekrutierung von Immunzellen erweitert6. Das aktuelle Protokoll präsentiert mehrere Techniken, um das Fortschreiten der Nierenerkrankung zu verfolgen, die die Zellinfiltration und die Ablagerung von Immunkomplexen analysieren.
Der wöchentlich gesammelte Urin ermöglicht die Erkennung und Visualisierung des zeitlichen Verlaufs der Proteinurie vor, während und nach dem Beginn des Lupus. Proteinurie als Biomarker kann das biologische Fortschreiten von LN bestimmen. Weitere Vorteile dieser Technik sind, dass sie nicht-invasiv, kostengünstig und einfach zu implementieren ist7. Wenn die Niere perfekt funktioniert, ist der Proteinurie-Spiegel konstant niedrig; Bei MRL/LPR-Mäusen wird jedoch nach einem Alter von 8-9 Wochen ein allmählicher Anstieg des Proteinuriespiegels beobachtet, der schließlich hoch genug ist, um Nierenversagen zu verursachen8. Mehrere Reagenzienstreifen und kolorimetrische Reagenzien sind im Handel erhältlich, um das Problem zu überwachen. Der Bradford-Test ist jedoch billig und sehr genau bei der Bestimmung des Beginns der Proteinurie und des Verlaufs der Lupusnephritis. Dieser Assay ist schnell und das Reagenz wird nicht durch das Vorhandensein von Lösungsmitteln, Puffern, Reduktionsmitteln und Metallchelatbildnern beeinflusst, die sich in Ihrer Probe 9,10,11 befinden können.
Ein wichtiger zu berücksichtigender Aspekt ist die Zellinfiltration in der Niere. Diese Infiltrate fördern die Pathogenese, indem sie die Sekretion löslicher Faktoren wie Zytokine auslösen, um die Entzündung zu verschlimmern12. Um besser zu verstehen, welche Zellpopulationen in den Infiltraten vorhanden sind, ist eine nützliche Methode, Leukozyten zu isolieren13. Hier wird der Nachweis einer renalen Infiltration von B-Zellen als Beispiel verwendet. Das Verfahren beginnt mit einem Verdauungsprozess mit Desoxyribonuklease (DNase) und Kollagenase, gefolgt von einer Dichtegradiententrennung, die Trümmer, rote Blutkörperchen und dichte Granulozyten entfernt. Der Grund für die Isolierung von B-Zellen (CD19+) und Plasmazellen (CD138+) ist, dass Lupusnieren diese Zellen konzentrieren können14. Es wird vermutet, dass das Vorhandensein von B-Zellen in kleinen Aggregaten in der Niere auf eine klonale Expansion und folglich auf die Produktion von Immunglobulin (Ig) hinweisen kann. Es ist bekannt, dass Plasmazellen auch in diesen Aggregaten vorhanden sind15. Sobald Leukozyten isoliert wurden, kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um die interessierenden Zellen nach Färbung mit verschiedenen fluoreszenzkonjugierten Antikörpern zu analysieren.
Die Immunfluoreszenz ist eine der immunhistochemischen (IHC) Nachweismethoden, die eine fluoreszierende Visualisierung von Proteinen in 4 μm dicken Nierengewebeproben ermöglicht. Andere IHC-Nachweismethoden hängen von der Art der Analyten, der Bindungschemie und anderen Faktoren ab16. Immunfluoreszenz ist eine schnelle Identifizierungsmethode, bei der das Antigen seinem Gegenstück Antikörper ausgesetzt wird, der mit einem spezifischen Fluorochrom (oder einem Fluoreszenzfarbstoff) markiert ist. Wenn es angeregt wird, erzeugt es Licht, das ein Fluoreszenzmikroskop erkennen kann. Diese Technik kann verwendet werden, um die Ablagerung von Komplement C3 und IgG2a17 zu beobachten. Eine übermäßige Aktivierung der Komplementkaskade könnte mit einer unkontrollierten Immunantwort und einem Funktionsverlust in Verbindung gebracht werden18. Die Immunablagerung von Anti-Doppelstrang-DNA-Autoantikörpern (Anti-dsDNA) in der Niere ist ein Hauptanliegen19, wo diejenigen mit IgG2a-Isotyp mit LN20 assoziiert wurden. Insbesondere zeigen Anti-dsDNA-Antikörper mehr Pathogenität und Affinität zu Kernmaterialien und bilden Immunkomplexe21. Wenn IgG2a vorhanden ist, wird die Komplementkaskade, einschließlich C3, aktiviert, um die Immunkomplexezu beseitigen 22. Die C3- und IgG2a-Marker können einzeln quantifiziert oder überlagert werden, um ihre Korrelation herzustellen.
Insbesondere die Serumkreatininmessung ist eine weitere zuverlässige Technik, die zusammen mit mikroskopischer Hämaturie und Nierenbiopsien zur Diagnose von LN23 verwendet werden kann. Das Vorhandensein von Proteinurie ist jedoch ein starker Indikator für glomeruläre Schäden. In diesem Sinne kann die Überwachung des Proteinurie-Spiegels während Lupus den Ausbruch der Krankheit erkennen und andere Methoden zur Diagnose von Lupus ergänzen. Darüber hinaus können Immunkomplexe, die in Glomeruli abgelagert werden, eine Entzündungsreaktion auslösen, das Komplementsystem aktivieren und mehr Entzündungszellen rekrutieren. Ein weiterer bemerkenswerter Punkt dieses Protokolls ist die B-Zell-Infiltration in der Niere. Zusammen mit den infiltrierten T-Zellen verstärkt dies lokale Immunantworten, die Organschäden auslösen. Wichtig ist, dass die Klassifizierung von LN nicht nur auf glomerulären morphologischen Veränderungen basiert, die in der Mikroskopie beobachtet werden, sondern auch auf Immunablagerungen, die mit Immunfluoreszenz beobachtet werden. Daher werden in diesem Protokoll genaue und kostengünstige Methoden zur Analyse der Nierenfunktion im Labor angeboten.
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Protocol
Das vorliegende Protokoll wird vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech genehmigt. Da die Lupuserkrankung bei Weibchen häufiger vorkommt, wurden nur weibliche MRL/lpr-Mäuse verwendet. Die Probenentnahme wurde im Alter von 4 Wochen begonnen und nach 15 Wochen beendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle) und wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gemäß den institutionellen Richtlinien gezüchtet und gehalten.
1. Proteinurie-Test
- Sammeln Sie Urin, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Sterilisieren Sie die Haube, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Legen Sie eine sterile Plastikfolie auf die Oberfläche. Bereiten Sie Spitzen, 1,5-ml-Röhrchen und eine Pipette vor, um etwa 20 μL der Flüssigkeit zu sammeln.
HINWEIS: Spitzen und Schläuche müssen steril und ohne Vorbehandlung sein. - Nehmen Sie den Käfig und sprühen Sie 70% Ethanol, bevor Sie ihn in die Haube legen.
- Halten Sie die Maus mit einer Hand und massieren Sie mit der anderen Hand den Bauchbereich sanft von oben nach unten.
- Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen oder eine Pipette, um den Urin direkt zu sammeln, oder wenn die Probe fällt, sammeln Sie ihn von der Plastikfolie. Verwenden Sie für jede Probe frische Handschuhe, Laken und Spitzen.
HINWEIS: Wenn dies nicht funktioniert, verwenden Sie ein steriles Becherglas, um die Maus zu isolieren, und sammeln Sie dann den Urin aus dem Becherglas, nachdem die Maus uriniert hat. - Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig. Nehmen Sie eine andere Maus heraus und wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.4.
HINWEIS: Reinigen Sie die Plastikfolie und das Becherglas immer mit 70% Ethanol, nachdem Sie die Probe für jede Maus entnommen haben. Mindestens fünf Mäuse pro Gruppe sind für die statistische Signifikanz notwendig. Urinproben können bei -80 °C gelagert werden, bis sie bis zu 12 Monate verwendet werden.
- Sterilisieren Sie die Haube, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Legen Sie eine sterile Plastikfolie auf die Oberfläche. Bereiten Sie Spitzen, 1,5-ml-Röhrchen und eine Pipette vor, um etwa 20 μL der Flüssigkeit zu sammeln.
- Quantifizieren Sie die Proteine mit der Bradford-Methode24.
- Lassen Sie Urinproben, Albuminstandard und das Bradford-Reagenz auf Raumtemperatur (RT) kommen, indem Sie sie für 10-20 Minuten außerhalb des Gefrierschranks aufbewahren.
HINWEIS: Bradford-Reagenz und Albumin-Standard sind in einem handelsüblichen Kit enthalten (siehe Materialtabelle). Die Ausgangskonzentration des Albumin-Standards beträgt 2 mg/ml. Serielle Verdünnungen (1:2 sechsmal) müssen mit Wasser durchgeführt werden. - Bradford-Reagenz wird unverdünnt in eine 96-Well-Platte (200 μL/Well) gegeben.
- Pipettieren Sie 5 μL unverdünnte Urinprobe pro Vertiefung und verwenden Sie die Spitze, um mehrmals nach oben und unten zu pipettieren, um richtig zu mischen.
- Fügen Sie Standards (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg / dl) in Duplikaten hinzu. Lassen Sie ein paar Vertiefungen als Leerzeichen.
HINWEIS: Das Hinzufügen von Mustern und Standards muss schnell erfolgen. - Lassen Sie es 5-10 min bei RT stehen.
- Lesen Sie die Platte bei 595 nm in einem Plattenleser gemäß dem Protokoll des Herstellers ab (siehe Materialtabelle).
- Lassen Sie Urinproben, Albuminstandard und das Bradford-Reagenz auf Raumtemperatur (RT) kommen, indem Sie sie für 10-20 Minuten außerhalb des Gefrierschranks aufbewahren.
2. Isolierung der Nierenzellen
- Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 (Flussrate: 30% -70% Volumen / min, um Bewusstlosigkeit oder Tod zu erreichen) in einer Kammer, gefolgt von zervikaler Dislokation. Fahren Sie mit der Sektion fort, um beide Nieren zu sammeln. Legen Sie eineinhalb Nieren in ein eiskaltes C10-Medium. Legen Sie die andere Hälfte der Niere in OCT (Schritt 3.1.1).
HINWEIS: C10 wird mit RPMI 1640 hergestellt, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1% 100x MEM-nicht essentiellen Aminosäuren, 10 mM HEPES, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle). - Die Nieren in Korngröße schneiden (1-2 mm3 Stück) und in 5 ml Verdauungspuffer mit 1 mg/ml Kollagenase und 0,2 mg/ml DNase I (siehe Materialtabelle) in RPMI 1640 Medium mit 10 mmol/L HEPES für 1 h mit kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 37 °C aufrühren.
HINWEIS: Fügen Sie 1 ml Verdauungspuffer in ein steriles 2 ml Röhrchen und verwenden Sie eine sterile Schere, um die Niere zu hacken. - 10 mL 1x eiskaltes PBS mit 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben und 10 min auf Eis inkubieren. Dann wirbeln Sie die Aufhängung zweimal durch.
- Die Zellsuspension durch ein 100 μM Sieb filtrieren und mit 10 mL HBSS-full waschen.
HINWEIS: HBSS-full enthält 5 mM EDTA, 0,1% BSA und 10 mM HEPES. - Zentrifugieren bei 350 x g für 10 min bei RT.
- Bereiten Sie 30%, 37% und 70% Stock Isotonic Percoll (SIP) Lösung vor.
HINWEIS: Mischen Sie 1 Teilvolumen von 10x PBS und 9 Teile Volumen von Percoll, um SIP vorzubereiten (siehe Materialtabelle); Verwenden Sie HBSS-full, um SIP auf 30%, 37% und 70% SIP zu verdünnen. - Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml 30% SIP und laden Sie 37% von 5 mL (oben) und 70% von 5 ml (unten), wobei der SIP-Gradient langsam mit einer Pasterpipette entsteht.
- Zentrifugieren mit Up9 unten0 (oder Bremse 0) bei 1000 x g für 30 min bei RT.
- Sammeln Sie Leukozyten von der 37%-70% Grenzfläche und resuspendieren Sie sie in 5 ml C10.
- Bei 350 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml FACS-Puffer. Die Zellen sind bereit für die FACS-Färbung.
HINWEIS: Der FACS-Puffer enthält 1x PBS und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). - Bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand (SN) verwerfen, wobei etwa 50 μL übrig bleiben.
HINWEIS: Um den Überstand zu entfernen, gießen oder pipettieren Sie die Lösung vorsichtig vom Feststoff weg oder saugen Sie den Überstand mit einem halbautomatischen Vakuum ab. - 50 μL FcR-Block (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen hinzufügen (vorverdünnt 1/50 in 1x PBS); Mischen und 10 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer zum Waschen hinzu.
- Bei 350 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und SN verwerfen, wobei etwa 50 μL übrig bleiben.
- 20 μL des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffs zugeben (1/100 mit 1x PBS verdünnen, siehe Materialtabelle) und 15-30 min auf Eis stehen lassen.
- Fügen Sie 50 μL Antikörper 15 Mischung pro Röhrchen hinzu: CD138-BV711 (1/200 in 1x PBS) und CD45-AF700 (1/200 in1x PBS) (siehe Materialtabelle).
- Auf Eis im Dunkeln für 15-30 min inkubieren und 3 ml FACS-Puffer hinzufügen.
- Zentrifugieren bei 350 x g für 5 min bei 4 °C und Vakuum SN, wobei etwa 50 μL übrig bleiben. Resuspendieren in 200 μL 1x PBS. Dies ist nun bereit, mittels Durchflusszytometrie analysiert zu werden.
3. Immunfluoreszierende Färbung
- Führen Sie die Beispielsammlung aus.
- Betten Sie die halbe Niere in das kleine Kunststoffkryomold mit der OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) ein (siehe Materialtabelle).
- Trockeneis in eine Styroporschaumbox geben (siehe Materialtabelle) und das Kryomold vorsichtig auf das Trockeneis legen. Stellen Sie sicher, dass die Kryoformen flach platziert werden.
HINWEIS: Es dauert 3-4 Minuten, bis die OCT-Verbindung erstarrt und weiß wird. - Nehmen Sie das Kryomold heraus und wickeln Sie es in Aluminiumfolie ein. Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Dieser kann bei -80 °C für mindestens 1 Jahr gelagert werden.
- Führen Sie das Schneiden und Fixieren der Probe durch.
- Die Proben in 4 μm Abschnitte schneiden, mindestens 2-3 h zum Trocknen warten und dann 10 min mit kaltem Aceton (bei 4 °C) fixieren.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei der Verwendung von Aceton, das eine spezielle chemische Haube erfordert. - Nach dem Befestigen der Objektträger 0,5-1 h an der Luft trocknen und kurz bei -20 °C oder lange bei -80 °C lagern.
- Die Proben in 4 μm Abschnitte schneiden, mindestens 2-3 h zum Trocknen warten und dann 10 min mit kaltem Aceton (bei 4 °C) fixieren.
- Färben Sie die Proben.
- Fixieren Sie die Objektträger in kaltem Aceton für 5-10 min.
- Lassen Sie die Abschnitte auf RT erwärmen. Verwenden Sie einen PAP-Stift (siehe Materialtabelle) um den Abschnitt herum und lassen Sie ihn trocknen.
HINWEIS: Nagelschmelz kann ebenfalls verwendet werden. Dieser Schritt verhindert, dass die Antikörperverdünnung über den gesamten Objektträger schwimmt. - Dias in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 20 min in das Coplin-Glas (siehe Materialtabelle) geben, das Glas auf den Shaker stellen und vorsichtig schütteln.
- Gießen Sie 1x TBS ab und füllen Sie das Glas mit 1x TBS, 5% BSA und 0,1% Tween 20. 20 min auf dem Shaker inkubieren, vorsichtig schütteln.
- Nehmen Sie die Objektträger heraus und wischen Sie den Boden der Objektträger trocken. Falls erforderlich, schütteln Sie die Objektträger trocken. Fügen Sie dem Abschnitt 100 μL konjugierte Antikörper25 C3-FITC (1/100) und IgG2a-PE (1/100) hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubieren bei RT in einer befeuchteten Kammer für 1 h.
- Waschen Sie den Abschnitt 3 mal in 1x TBS, 5% BSA und 0,1% Tween 20 für 10 min auf dem Shaker.
- Schütteln Sie die Objektträger trocken und montieren Sie den Abschnitt mit einem Antifade-Reagenz (siehe Materialtabelle) und einem Deckglas.
- Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C bis zur Betrachtung unter dem Mikroskop (z.B. konfokales Mikroskop oder bildgebendes Systemmikroskop). Quantifizieren Sie Bilder mit Software und subtrahieren Sie Hintergrundsignale, wenn Sie die Fluoreszenzintensität zwischen Regionen vergleichen.
- Für die Bildanalyse mit der ImageJ-Software (siehe Materialtabelle) skizzieren Sie den gewünschten Bereich.
- Legen Sie Standardparameter fest, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messungen und Messbereich festlegen klicken, um die Ergebnisse zu erhalten.
- Übertragen Sie die aus den Messfenstern erhaltenen Daten in eine Tabelle.
HINWEIS: Ein kleiner Bereich kann aus dem Bild als Hintergrund ausgewählt werden. Es sollte keine Fluoreszenz haben. - Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren , um die Region zu messen und die Daten erneut in die vorherige Tabelle zu übertragen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3.11-3.3.12 für mehrere Regionen.
- Berechnen Sie die mittlere Fluoreszenz als korrigierte Zellfluoreszenz (CCF) = Integrierte Dichte - (Ausgewählte Zellregion x mittlere Hintergrundfluoreszenz).
- Berechnen Sie für jede Region und analysieren Sie Daten mit der Grafik- und Statistiksoftware (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Das Protokoll verwendet mehrere Methoden, um MRL / lpr-Mäuse auf Lupusnephritis zu untersuchen. Zunächst wird ein Verfahren beschrieben, um erhöhte Proteinuriespiegel aufgrund von Nierenfunktionsstörungen im Laufe der Zeit zu untersuchen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurden weibliche Mäuse mit oraler Sonde von 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) als Kontrollgruppe und probiotischem Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe in einer Konzentration von 109 KBE/ml zweimal wöchentlich behandelt. Die Behandlung begann im Alter von 3 Wochen und endete im Alter von 15 Wochen. Die mit L. reuteri behandelte Mäusegruppe hatte eine aggressivere Proteinurie-Progression als die Kontrollgruppe.
Abbildung 1: Nachweis von Proteinspiegeln im Urin von MRL/lpr-Mäusen im Zeitverlauf . n = 5 Mäuse pro Gruppe. Die Statistik wurde mit dem einfachen linearen Regressionstest durchgeführt. *P < 0,05, **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2 zeigt die FACS-Analyse der isolierten Nierenleukozyten. Die Mäuse wurden in diesem Experiment mit Vancomycin (2 g/L) oder Vancomycin plus E. coli dsDNA (80 μg) behandelt. Vancomycin wurde zusammen mit dem Trinkwasser während des angegebenen Zeitraums verabreicht. Die orale Sonde bakterieller DNA wurde den Vancomycin-behandelten Mäusen einmal wöchentlich für vier aufeinanderfolgende Wochen im Alter von 4, 5, 6 und 7 Wochen verabreicht. Es wurde erwartet, dass E. coli dsDNA die renale Infiltration von Plasmazellen auslöst, was zu einer beeinträchtigten Nierenfunktion führt, aber es wurde kein signifikanter Unterschied gefunden.
Abbildung 2: Analyse von Plasmazellen in isolierten Nierenleukozyten. (A) Sequentielle Gating-Strategie: Gesamtzellen, Einzelzellen, lebende Zellen, CD45+ Zellen und schließlich CD138+ Zellen. (B) Prozentsatz der Plasmazellen nach Behandlung mit van (Vancomycin) oder van + DNA (Vancomycin + E. coli dsDNA) für 3 Wochen (n ≥ 5 Mäuse pro Gruppe). Es wurde keine statistische Signifikanz ("ns") beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Komplement C3 und IgG2a auf weiblichen MRL/lpr-Nierenabschnitten. In diesem Experiment wurde die Wirkung von Umweltfaktoren auf die renale Ablagerung von C3 und IgG2a verglichen. Hausmäuse wurden mehrere Generationen lang in der Tieranlage gezüchtet und mit kürzlich von einem Anbieter gekauften Mäusen verglichen. Die immunhistochemische Analyse zeigte keinen Unterschied zwischen verschiedenen Einrichtungen.
Abbildung 3: Nachweis von Komplement C3 und IgG2a in Nierenschnitten mittels Immunfluoreszenzfärbung . (A) Repräsentative Bilder von Nierenschnitten, die mit Anti-C3-FITC (Grün) und Anti-IgG2a-PE (Rot) gefärbt wurden. (B) Vergleich der korrigierten Zellfluoreszenz (CCF) zwischen den beiden Gruppen (n ≥ 5 Mäuse pro Gruppe). Maßstabsbalken = 100 μM. Es wurde keine statistische Signifikanz ("ns") beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
LN ist eine der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, und Faktoren, die die Krankheit verschlimmern, bleiben unklar. Die Anwendung dieses Protokolls besteht darin, die Nierenfunktion mit mehreren Methoden zu charakterisieren, einschließlich der Messung der Proteinurie, der FACS-Analyse isolierter Nierenleukozyten und der Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen Nierenabschnitten.
Ein wichtiger Punkt, der beim Sammeln von Urin zu beachten ist, ist, dass man mit der Tageszeit und dem Ort der Urinsammlung konsistent sein muss. Mäuse sind nachtaktive Tiere, daher werden die genauesten Proben am späten Nachmittag gesammelt, bevor Mäuse aktiv werden. Ein weiterer Grund für die Wahl dieser Zeit ist, dass MRL / lpr-Mäuse dazu neigen, nachts viel Wasser zu trinken, was zu verdünntem Urin führt. Daher kann die Sammlung zum falschen Zeitpunkt die Konzentration und / oder die Volumenschwankungen des Urins erhöhen. Es ist auch wichtig, so viel Urin wie möglich zu sammeln, um genaue Ergebnisse zu erhalten.
Der Bradford-Assay gibt uns eine Schätzung, wie viel Protein vorhanden ist. Es ist nicht spezifisch für SLE-Markerproteine, aber gut genug, um eine Vorstellung vom Krankheitsverlauf zu geben26. Darüber hinaus ist diese Methode im Vergleich zu anderen kostengünstig. Bemerkenswert ist, dass der Bradford-Assay zeitkritisch ist; Daher muss es innerhalb einer halben Stunde abgeschlossen sein. Proben neigen dazu, erhöhte Werte oder hohe falsche Ergebnisse zu haben, wenn man zu lange wartet. Ein weiterer Vorteil im Vergleich zu den kommerziellen Reagenzstreifen für die Urinanalyse ist, dass sie genaue Zahlen und nicht einen Bereich innerhalb der Urinprobe liefern. Scoring-Streifen können zu mehrdeutigen Ergebnissen führen, insbesondere im höheren Bereich 9,10,24.
Für die Isolierung von Nierenleukozyten besteht der erste wichtige Schritt darin, die Dissektion so schnell wie möglich durchzuführen. Die Lebensfähigkeit von Nierenzellen hat großen Einfluss auf den Erfolg der nachfolgenden FACS-Analyse. Bei der Verarbeitung von Nieren ist jeder Schritt zeit- und temperaturempfindlich. Es muss beachtet werden, dass DNase I- und Kollagenase-Konzentrationen und Temperatur für maximale Effizienz wichtig sind, da sie DNA eliminieren und den Zerfall des Organs ermöglichen, bzw.27. Der zweite wichtige Schritt ist die Isolierung von Zellen, unterteilt in zwei wichtige Prozesse. Die erste ist die Verwendung des Siebes, das die Entfernung von Gewebeablagerungen ermöglicht; Der zweite Prozess, an dem Percoll beteiligt ist, ist der wichtigste Schritt und erfordert Konzentration und Geduld. Bei der Durchführung des Dichtegradienten mit Percoll ist es wichtig, klare Schnittstellen zwischen verschiedenen SIP-Konzentrationen beizubehalten. Es wird empfohlen, eine Pasteur-Pipette zu verwenden, da Flussmittel und Druck manuell gesteuert werden können. Zusätzliche Phasen können mit der langsamen Abgabe der SIP-Lösung oder sogar Tropfen für Tropfen besser aufgebaut werden. Sobald Phasen etabliert sind, muss das Rohr sanft gehandhabt werden; Andernfalls mischen sich die Phasen sofort und die Proben gehen verloren, da es unmöglich ist, die Phasen wieder zu trennen. Darüber hinaus ist es wichtig, das Rohr ohne Unterbrechung zu zentrifugieren, da das Brechen zu aggressiv sein könnte, was zum Verlust separater Phasen führen kann. Die Leukozyten werden dann aus der Interphase zwischen 30% und 37% SIP gewonnen. Wir analysierten in diesem Beispiel eine Zellpopulation, Plasmazellen (CD45+ und CD138+). Diese Technik ist jedoch nicht auf B-Zellen beschränkt; Es kann für andere Zelltypen und intrazelluläre Färbung verwendet werden28.
Die dritte Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Visualisierung intrazellulärer Lokalisationen gegebener Proteinablagerungen. Sobald das Gewebe mit Aceton fixiert ist, ist es wichtig, eine ausreichende Wäsche durchzuführen, damit Antikörper nur an das Ziel anlagern. Als nächstes reduziert das Blockieren mit BSA unspezifische Bindungen und Fehlalarme. Die direkte Immunfluoreszenz wird in der Regel empfohlen, da sie schneller ist als die indirekte Immunfluoreszenz mit einem sekundären Antikörper, was insbesondere angesichts der zusätzlichen Wasch- und Inkubationsschritte zeitaufwendig ist. Die direkte Immunfluoreszenz schränkt jedoch die Flexibilität der Antikörperselektion im Vergleich zur indirekten Immunfluoreszenzein 29. Daher können beide je nach Zweck wertvolle Methoden sein. Darüber hinaus muss erwähnt werden, dass Verdünnungsfaktoren bei der Färbung für IHC von entscheidender Bedeutung sind. Wenn die Verdünnung nicht gut durchgeführt wird, zeigt sich auf den Mikroskopiebildern ein erhöhter Hintergrund (nicht genügend Antikörperverdünnung) oder eine schwache Färbung (zu starke Dilatation). Es ist wichtig, mit seriellen Verdünnungen des Antikörpers zu beginnen, um die Antikörperkonzentration für ein besseres Ziel-zu-Hintergrund-Verhältnis zu optimieren. Ein weiterer zu berücksichtigender Schritt ist die Inkubationszeit mit den Antikörpern. Je länger der Antikörper mit der Probe in Kontakt ist, desto mehr unspezifische Bindung kann erzeugt werden.
Die Einschränkungen der vorliegenden Methoden sind wie folgt. Bestimmte klinische Parameter für LN, wie das Albumin/Kreatinin-Verhältnis, können mit diesen Methoden nicht aufgedeckt werden. Darüber hinaus können einige Proben eine schlechte Säurelöslichkeit aufweisen, was zu einem hohen Konzentrationswert oberhalb der Standardkurve führt. Dies erfordert weitere Verdünnungen von Proben oder die Zugabe von Tensiden, um den Farbstoff30 auszufällen. Darüber hinaus ist dieses Protokoll möglicherweise nicht geeignet, wenn viele Zellen nach der Nierenleukozytenisolierung benötigt werden. Das aktuelle Nierenzellisolierungsprotokoll umfasst mehrere Waschschritte, Verdauungs- und Isolierungsschritte, um die Entfernung anderer Zellen zu maximieren, so dass, obwohl die Zellreinheit am Ende hoch ist, die Zellzahl normalerweise niedrig ist. Darüber hinaus ist es ein langwieriges Verfahren, so dass die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt werden kann. Andere gebrauchsfertige Assays sind für den klinischen Einsatz besser geeignet; Die derzeitigen Methoden können jedoch genaue Ergebnisse mit einem geringeren Budget für Forschungslaboratorien liefern.
Zusammenfassend werden in diesem Protokoll drei verschiedene effiziente und genaue Techniken vorgestellt, um den LN-Verlauf zu charakterisieren. Durch die Kombination der Bradford-Methode für den Proteinurie-Level, der FACS-Analyse für die renalen Infiltration der Leukozyten und der IHC-Analyse für die renale Ablagerung von IgG2a und C3 wird ein klares Bild der Nierenfunktionsstörung bei weiblichen MRL/lpr-Mäusen als Modell für humanes LN erfolgreich etabliert.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Wir danken der Flow Cytometry Core Facility, dem Histopathology Laboratory, dem Fralin Imaging Center am Virginia Polytechnic Institute und der State University für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
References
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