Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyser av proteinuri, renal infiltrasjon av leukocytter og nyreavsetning av proteiner i lupusutsatt MRL/lpr-mus

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å spore lupusprogresjon hos mus. Ytterligere to prosedyrer presenteres for å karakterisere lupus nefritt basert på celleinfiltrasjon og proteinavsetning i nyrene.

Abstract

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en autoimmun lidelse uten kjent kur og er preget av vedvarende betennelse i mange organer, inkludert nyrene. Under slike omstendigheter mister nyrene sin evne til å rense avfall fra blodet og regulere salt- og væskekonsentrasjoner, noe som til slutt fører til nyresvikt. Kvinner, spesielt de i fertil alder, diagnostiseres ni ganger oftere enn menn. Nyresykdom er den viktigste årsaken til dødelighet hos SLE-pasienter. Denne protokollen beskriver en rask og enkel metode for å måle utskilte proteinnivåer i innsamlet urin, og spore lupusprogresjon over tid. I tillegg er en tilnærming til å isolere mononukleære nyreceller gitt basert på størrelse og tetthetsvalg for å undersøke nyreinfiltrasjon av leukocytter. Videre er det utviklet en immunhistokjemisk metode for å karakterisere proteinavsetning i glomeruli- og leukocyttinfiltrasjon i tubulointerstitiell plass. Sammen kan disse metodene bidra til å undersøke utviklingen av kronisk betennelse assosiert med nyrene til lupus-utsatte MRL / lpr-mus.

Introduction

Nyrenes primære funksjon er eliminering av giftige stoffer gjennom urin samtidig som homeostase av vann ogsalter opprettholdes. Denne funksjonen er truet hos pasienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), som fører til såkalt lupus nefritt (LN). LN er en konsekvens av at immunsystemet angriper nyrene, noe som fører til vedvarende nyrebetennelse, og mister derfor evnen til å rense avfall fra blodet og regulere salt- og væskekonsentrasjoner. Dette vil til slutt føre til nyresvikt, noe som kan være dødelig. Under den nefritiske prosessen rekrutteres sirkulerende B-celler, T-celler og monocytter til nyrene, utskiller kjemokiner, cytokiner og immunkompleksdannende autoantistoffer. Dette resulterer til slutt i endotelcelleskade, membranøse skader, nyretubulær atrofi og fibrose2.

MRL/Mp-Fas lpr (MRL/lpr) lupusutsatte mus er en klassisk musemodell som viser lupuslignende kliniske tegn som ligner menneskelig SLE3. Denne modellen har vært medvirkende til å forstå en av de viktigste årsakene til dødelighet hos SLE-pasienter, lupus nefritt (LN)4. I både human og mus SLE er LN preget av gradvis betennelse utløst av nyreavsetning av immunkomplekser, etterfulgt av komplementaktivering, rekruttering av inflammatoriske celler og tap av nyrefunksjon5. Immunkompleksavsetningen er det første skrittet for å indusere kjemokin- og cytokinproduksjon av inneboende nyreceller, som utvider den inflammatoriske responsen ved å rekruttere immunceller6. Den nåværende protokollen presenterer flere teknikker for å følge nyresykdomsprogresjon som analyserer celleinfiltrasjon og immunkompleksavsetning.

Urin samlet hver uke muliggjør deteksjon og visualisering av tidsforløpet av proteinuri før, under og etter lupusutbrudd. Proteinuri som biomarkør kan bestemme den biologiske progresjonen av LN. Andre fordeler med denne teknikken er at den er ikke-invasiv, kostnadseffektiv og enkel å implementere7. Når nyrene fungerer perfekt, er proteinurinivået konsekvent lavt; Hos MRL/LPR-mus, etter 8-9 ukers alder, observeres imidlertid en gradvis økning av proteinurinivået, som til slutt er høyt nok til å forårsake nyresvikt8. Flere reagensstrimler og kolorimetriske reagenser er kommersielt tilgjengelige for å overvåke problemet. Bradford-analysen er imidlertid billig og svært nøyaktig for å bestemme utbruddet av proteinuri og løpet av lupus nephritis. Denne analysen er rask, og reagenset påvirkes ikke av tilstedeværelsen av løsningsmidler, buffere, reduksjonsmidler og metallchelaterende midler som kan være i prøven 9,10,11.

Et viktig aspekt å vurdere er celleinfiltrasjon i nyrene. Disse infiltratratene fremmer patogenesen ved å utløse sekresjon av oppløselige faktorer som cytokiner for å forverre betennelse12. For bedre å forstå hvilke cellepopulasjoner som er tilstede i infiltratene, er en nyttig metode å isolere leukocytter13. Her brukes deteksjon av nyreinfiltrasjon av B-celler som et eksempel. Prosedyren begynner med en fordøyelsesprosess med deoksyribonuklease (DNase) og kollagenase, etterfulgt av tetthetsgradientseparasjon som fjerner rusk, røde blodlegemer og tette granulocytter. Årsaken til å isolere B-celler (CD19+) og plasmaceller (CD138+) er at lupus nyrer kan konsentrere disse cellene14. Det foreslås at tilstedeværelsen av B-celler i små aggregater i nyrene kan indikere klonal ekspansjon og følgelig immunoglobulin (Ig) produksjon. Plasmaceller er velkjente for å være til stede i disse aggregatene også15. Når leukocytter er isolert, kan fluorescensaktivert cellesortering (FACS) brukes til å analysere cellene av interesse ved farging med forskjellige fluorescenskonjugerte antistoffer.

Immunfluorescens er en av immunhistokjemi (IHC) deteksjonsmetoder som muliggjør fluorescerende visualisering av proteiner i 4 μm tykke nyrevevsprøver. Andre IHC-deteksjonsmetoder avhenger av arten av analytter, bindingskjemi og andre faktorer16. Immunfluorescens er en rask identifikasjonsmetode som utsetter antigenet for dets motpartsantistoff merket med et spesifikt fluorokrom (eller et fluorescerende fargestoff). Når den er opphisset, produserer den lys som et fluorescensmikroskop kan oppdage. Denne teknikken kan brukes til å observere avsetningen av komplement C3 og IgG2a17. Overdreven komplementkaskadeaktivering kan være forbundet med en ukontrollert immunrespons og tap av funksjon18. Immunavsetning av anti-dobbeltstrenget DNA (anti-dsDNA) autoantistoffer i nyrene er en stor bekymring19, hvor de med IgG2a isotype har vært assosiert med LN20. Spesielt viser anti-dsDNA-antistoffer mer patogenitet og affinitet til nukleære materialer, og danner immunkomplekser21. Når IgG2a er tilstede, aktiveres komplementkaskaden, inkludert C3, for å fjerne immunkompleksene22. C3- og IgG2a-markørene kan kvantifiseres individuelt eller overlappes for å fastslå korrelasjonen.

Spesielt er serumkreatininmåling en annen pålitelig teknikk som kan brukes sammen med mikroskopisk hematuri og nyrebiopsier for å diagnostisere LN23. Tilstedeværelsen av proteinuri er imidlertid en sterk indikator på glomerulær skade. I den forstand kan overvåking av proteinurinivået under lupus oppdage sykdomsutbrudd og utfylle andre metoder for å diagnostisere lupus. I tillegg kan immunkomplekser avsatt i glomeruli indusere en inflammatorisk respons, aktivere komplementsystemet og rekruttere flere inflammatoriske celler. Et annet bemerkelsesverdig poeng med denne protokollen er B-celleinfiltrasjon i nyrene. Dette, sammen med de infiltrerte T-cellene, forsterker lokale immunresponser som utløser organskade. Det er viktig at klassifiseringen av LN ikke bare er basert på glomerulære morfologiske endringer sett i mikroskopi, men også immunavsetninger observert med immunfluorescens. Derfor, i denne protokollen, tilbys nøyaktige og kostnadseffektive metoder for analyse av nyrefunksjon i laboratorieinnstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Virginia Tech. Siden lupussykdom har høyere forekomst hos kvinner, ble det kun brukt MRL/LPR-mus hos kvinner. Prøvesamlingen ble startet ved 4 ukers alder og avsluttet ved 15 uker. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Materialtabell) og ble avlet og vedlikeholdt i et spesifikt patogenfritt miljø etter de institusjonelle retningslinjene.

1. Proteinuri test

  1. Samle urin ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Steriliser hetten ved å sprøyte 70% etanol. Legg et sterilt plastark på overflaten. Forbered tips, 1,5 ml rør og en pipette for å samle ca 20 μL av væsken.
      MERK: Spisser og tuber må være sterile og uten forbehandling.
    2. Ta buret og spray 70% etanol før du setter det inn i hetten.
    3. Hold musen med den ene hånden og bruk den andre hånden til å massere ventralområdet forsiktig fra topp til bunn.
    4. Bruk et 1,5 ml rør eller pipette for å samle urinen direkte, eller hvis prøven faller, samle den fra plastplaten. Bruk ferske hansker, laken og tips for hver prøve.
      MERK: Hvis dette ikke virker, bruk et sterilt beger for å isolere musen, og samle deretter urinen fra begeret etter at musen urinerer.
    5. Sett musen tilbake i buret. Ta ut en annen mus og gjenta trinn 1.1.3-1.1.4.
      MERK: Rengjør alltid plastplaten og begeret med 70% etanol etter å ha samlet prøven for hver mus. Minst fem mus per gruppe er nødvendig for statistisk signifikans. Urinprøver kan oppbevares ved -80 °C til bruk i inntil 12 måneder.
  2. Kvantifiser proteinene ved Bradford-metoden24.
    1. La urinprøver, Albumin-standard og Bradford-reagenset komme til romtemperatur (RT) ved å holde dem utenfor fryseren i 10-20 minutter.
      MERK: Bradford-reagens og albuminstandard er inkludert i et kommersielt tilgjengelig sett (se materialfortegnelse). Startkonsentrasjonen av albuminstandarden er 2 mg/ml. Serielle fortynninger (1:2 seks ganger) må gjøres med vann.
    2. Tilsett Bradford-reagens til en 96-brønnplate (200 μL / brønn), ufortynnet.
    3. Pipetter 5 μL ufortynnet urinprøve per brønn og bruk spissen til å pipette opp og ned flere ganger for å blande riktig.
    4. Legg til standarder (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg / dL) i duplikater. La et par brønner stå som emner.
      MERK: Tilsetning av prøver og standarder må gjøres raskt.
    5. La det stå i 5-10 min på RT.
    6. Les platen ved 595 nm i en plateleser i henhold til produsentens protokoll (se materialfortegnelse).

2. Isolering av nyrecellene

  1. Avliv musen med CO2 (strømningshastighet: 30%-70% volum/min, for å oppnå bevisstløshet eller død) i et kammer etterfulgt av cervikal dislokasjon. Fortsett med disseksjonen for å samle begge nyrene. Plasser halvannen nyre i et iskaldt C10-medium. Sett den andre halvdelen nyre i OCT (trinn 3.1.1).
    MERK: C10 er laget med RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 1% av 100x MEM ikke-essensielle aminosyrer, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanol og 100 U / ml penicillin-streptomycin (se materialtabell).
  2. Skjær nyrene i kornstørrelse (1-2 mm3 stykker) og fordøy i 5 ml fordøyelsesbuffer som inneholder 1 mg / ml kollagenase og 0,2 mg / ml DNase I (se materialtabell) i RPMI 1640 medium som inneholder 10 mmol / l HEPES i 1 time med kontinuerlig mild risting ved 37 ° C.
    MERK: Tilsett 1 ml fordøyelsesbuffer i et sterilt 2 ml rør og bruk steril saks for å hakke nyrene.
  3. Tilsett 10 ml 1x iskald PBS inneholdende 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og rug i 10 minutter på is. Deretter vortex suspensjonen to ganger.
  4. Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 100 μM sil og vask med 10 ml HBSS-full.
    MERK: HBSS-full inneholder 5 mM EDTA, 0,1% BSA og 10 mM HEPES.
  5. Sentrifuge ved 350 x g i 10 minutter ved RT.
  6. Forbered 30%, 37% og 70% Stock Isotonic Percoll (SIP) løsning.
    MERK: Bland 1 delvolum av 10x PBS og 9 deler volum Percoll for å forberede SIP (se Materialfortegnelse); bruk HBSS-full for å fortynne SIP til 30%, 37% og 70% SIP.
  7. Resuspender celler i 5 ml med 30% SIP og last 37% av 5 ml (øverst) og 70% av 5 ml (nederst), noe som gjør SIP-gradient, sakte med en pasterpipette.
  8. Sentrifuge med Up9 down0 (eller brems 0) ved 1000 x g i 30 min ved RT.
  9. Samle leukocytter fra 37% -70% grensesnittet og resuspendere dem i 5 ml C10.
  10. Sentrifuge ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  11. Resuspender cellepelleten i 3 ml FACS-buffer. Cellene er klare for FACS-farging.
    MERK: FACS-bufferen inneholder 1x PBS og 0,1 % bovint serumalbumin (BSA).
  12. Sentrifuge ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten (SN), og etterlater ca. 50 μL.
    MERK: For å fjerne supernatanten, hell eller pipette løsningen forsiktig vekk fra det faste stoffet eller bruk et halvautomatisk vakuum for å aspirere supernatanten.
  13. Tilsett 50 μL FcR-blokk (se Materialfortegnelse) per rør (fortynnet 1/50 i 1x PBS); Bland og rug på is i mørket i 10 min.
  14. Legg til 2 ml FACS-buffer for å vaske.
  15. Sentrifuge ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast SN, og etterlater ca. 50 μL.
  16. Tilsett 20 μL av riktig fluorescerende fargestoff (fortynn 1/100 med 1x PBS, se materialtabell) og la det stå i 15-30 minutter på is.
  17. Tilsett 50 μL antistoff 15 miks per rør: CD138-BV711 (1/200 i 1x PBS) og CD45-AF700 (1/200 i1x PBS) (se Materialfortegnelse).
  18. Inkuber på is i mørket i 15-30 minutter og tilsett 3 ml FACS-buffer.
  19. Sentrifuge ved 350 x g i 5 minutter ved 4 ° C og vakuum SN, forlater ca 50 μL. Resuspend i 200 μL av 1x PBS. Dette er nå klart til å analyseres ved hjelp av flowcytometri.

3. Immunfluorescerende farging

  1. Utfør prøvesamlingen.
    1. Bygg den halve nyren inn i det lille plastkryomold med den optimale skjæretemperaturforbindelsen (OCT) (se Materialfortegnelse).
    2. Tilsett tørris i en isoporskumboks (se Materialfortegnelse), og legg kryommet forsiktig oppå tørrisen. Sørg for at cryomolds er plassert flatt.
      MERK: Det tar 3-4 minutter for OCT-forbindelsen å stivne og bli hvit.
    3. Ta ut kryommet og pakk det inn i aluminiumsfolie. Oppbevar den ved -80 °C inntil videre bruk.
      MERK: Dette kan oppbevares ved -80 °C i minst 1 år.
  2. Utfør seksjonering og festing av prøven.
    1. Skjær prøvene i 4 μm seksjoner, vent i minst 2-3 timer for å tørke, og fest deretter med kald aceton (ved 4 ° C) i 10 minutter.
      MERK: Vær forsiktig når du bruker aceton, som krever en spesialisert kjemisk hette.
    2. Etter å ha festet lysbildene, lufttørk i 0,5-1 time og oppbevar dem i kort tid ved -20 °C, eller i lang tid ved -80 °C.
  3. Flekker prøvene.
    1. Refix lysbildene i kald aceton i 5-10 min.
    2. La seksjonene varmes opp til RT. Bruk en PAP-penn (se Materialfortegnelse) rundt seksjonen og la den tørke.
      MERK: Spiker emalje kan også brukes. Dette trinnet forhindrer at antistofffortynning flyter over hele lysbildet.
    3. Plasser lysbilder i 1x Tris-bufret saltvann (TBS) i Coplin-krukken (se Materialtabell) i 20 minutter, legg krukken på shakeren og rist forsiktig.
    4. Hell av 1x TBS og fyll krukken med 1x TBS, 5% BSA og 0.1% Tween 20. Inkuber i 20 minutter på shakeren, rist forsiktig.
    5. Ta lysbildene ut og tørk bunnen av lysbildene tørre. Rist om nødvendig lysbildene tørre. Tilsett 100 μL konjugerte antistoffer25 C3-FITC (1/100) og IgG2a-PE (1/100) i avsnittet (se materialfortegnelse). Inkuber ved RT i et fuktet kammer i 1 time.
    6. Vask seksjonen 3 ganger i 1x TBS, 5% BSA og 0.1% Tween 20 i 10 minutter på shakeren.
    7. Rist tørk lysbildene og monter seksjonen med et antifade-reagens (se Materialtabell) og deretter en deksel.
    8. Oppbevar lysbildene ved 4 °C til de vises under mikroskopet (f.eks. Konfokalmikroskop eller bildebehandlingssystemmikroskop). Kvantifiser bilder ved hjelp av programvare og trekk bakgrunnssignaler når du sammenligner fluorescensintensiteten mellom regioner.
    9. For bildeanalyse ved hjelp av ImageJ-programvaren (se Materialfortegnelse), skissere ønsket region.
    10. Angi standardparametere ved å klikke på Analyser, deretter Angi målinger og måleområde for å få resultatene.
    11. Overfør dataene hentet fra målevinduene til et regneark.
      MERK: Et lite område kan velges fra bildet som bakgrunn; det skal ikke ha noen fluorescens.
    12. Når du er ferdig, klikker du på Analyser for å måle regionen og overføre data igjen til forrige regneark.
    13. Gjenta trinn 3.3.11-3.3.12 for flere regioner.
    14. Beregn gjennomsnittlig fluorescens som korrigert cellefluorescens (CCF) = Integrert tetthet - (Valgt celleområde x Gjennomsnittlig bakgrunnsfluorescens).
    15. Beregn for hver region og analyser data ved hjelp av grafikk- og statistikkprogramvaren (se Materialfortegnelse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen bruker flere metoder for å vurdere MRL / lpr mus for lupus nefritt. Først beskrives en prosedyre for å studere økte proteinurinivåer på grunn av nyresvikt over tid. Som vist i figur 1 ble hunnmus behandlet med oral gavage på 200 μL fosfatbufret saltvann (1x PBS) som kontrollgruppe og probiotisk Lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe, i en konsentrasjon på 109 cfu/ml, to ganger i uken. Behandlingen startet ved 3 ukers alder og avsluttet ved 15 ukers alder. Musgruppen behandlet med L. reuteri hadde en mer aggressiv proteinuriprogresjon enn kontrollgruppen.

Figure 1
Figur 1: Påvisning av proteinnivåer i urinen hos MRL/LPR-mus over tid. n = 5 mus per gruppe. Statistikken ble utført med den enkle lineære regresjonstesten. *P < 0,05, **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 viser FACS-analysen av de isolerte nyreleukocyttene. Musene ble behandlet med vankomycin (2 g/l) eller vankomycin pluss E. coli dsDNA (80 μg) i dette forsøket. Vancomycin ble gitt sammen med drikkevannet i den angitte tidsperioden. Oral gavage av bakterielt DNA ble administrert til vankomycinbehandlede mus en gang i uken i fire påfølgende uker ved 4, 5, 6 og 7 ukers alder. E. coli dsDNA var forventet å utløse nyreinfiltrasjon av plasmaceller som førte til nedsatt nyrefunksjon, men ingen signifikant forskjell ble funnet.

Figure 2
Figur 2: Analyse av plasmaceller i isolerte nyreleukocytter. (A) Sekvensiell gatingstrategi: totale celler, enkeltceller, levende celler, CD45+-celler og til slutt CD138+-celler. (B) Prosentandel plasmaceller etter behandling med van (Vancomycin) eller van + DNA (Vancomycin + E. coli dsDNA) i 3 uker (n ≥ 5 mus per gruppe). Ingen statistisk signifikans ('ns') ble observert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 viser immunfluorescensfarging av komplement C3 og IgG2a på kvinnelige MRL/lpr nyreseksjoner. I dette forsøket ble effekten av miljøfaktorer sammenlignet med hensyn til nyreavsetning av C3 og IgG2a. Interne mus ble oppdrettet i dyreanlegget i flere generasjoner, og de ble sammenlignet med nylig fra en leverandør. Den immunhistokjemiske analysen viste ingen forskjell mellom ulike innretninger.

Figure 3
Figur 3: Påvisning av komplement C3 og IgG2a i nyreseksjoner via immunfluorescensfarging. (A) Representative bilder av nyreseksjoner farget med anti-C3-FITC (grønn) og anti-IgG2a-PE (rød). (B) Sammenligning av korrigert cellefluorescens (CCF) mellom de to gruppene (n ≥ 5 mus per gruppe). Skala bar = 100 μM. Ingen statistisk signifikans ('ns') ble observert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LN er en ledende dødsårsak hos SLE-pasienter, og faktorer som forverrer sykdommen er fortsatt uklare. Anvendelsen av denne protokollen er å karakterisere nyrefunksjonen ved hjelp av flere metoder, inkludert måling av proteinuri, FACS-analyse av isolerte nyreleukocytter og immunfluorescensfarging av frosne nyreseksjoner.

Et viktig poeng å vurdere når du samler urin er at man må være konsistent med tidspunktet på dagen og plasseringen av urinsamlingen. Mus er nattdyr, så de mest nøyaktige prøvene samles sent på ettermiddagen før mus begynner å være aktive. En annen grunn til å velge denne tiden er at MRL/lpr-mus har en tendens til å drikke mye vann om natten, noe som fører til fortynnet urin. Dermed kan oppsamling på feil tidspunkt øke urinens konsentrasjon og/eller volumvariasjoner. Det er også viktig å samle så mye urin som mulig for å få nøyaktige resultater.

Bradford-analysen gir oss et estimat på hvor mye protein som er til stede. Det er ikke spesifikt for noen SLE-markørproteiner, men godt nok til å gi en ide om sykdomsprogresjon26. I tillegg er denne metoden kostnadseffektiv sammenlignet med andre. Spesielt er Bradford-analysen tidssensitiv; Derfor må den fullføres innen en halv time. Prøver har en tendens til å ha økte verdier eller høye falske resultater hvis man venter for lenge. En annen fordel sammenlignet med de kommersielle reagensstrimlene for urinalyse er at det gir nøyaktige tall i stedet for et område i urinprøven. Scoring strips kan gi tvetydige resultater, spesielt i det høyere området 9,10,24.

For isolering av nyreleukocytter er det første viktige trinnet å utføre disseksjonen så fort som mulig. Levedyktigheten til nyreceller påvirker i stor grad suksessen til etterfølgende FACS-analyse. Når nyrene behandles, er hvert trinn tids- og temperaturfølsomt. Det må bemerkes at DNase I og kollagenase konsentrasjoner og temperatur er viktige for maksimal effektivitet, da de eliminerer DNA og tillater oppløsning av orgelet, henholdsvis27. Det andre nøkkeltrinnet er å isolere celler, delt inn i to viktige prosesser. Den første bruker silen som tillater fjerning av vevsrester; Den andre prosessen som involverer Percoll er det mest avgjørende trinnet og krever fokus og tålmodighet. Når du gjør tetthetsgradienten med Percoll, er det viktig å opprettholde klare grensesnitt mellom forskjellige konsentrasjoner av SIP. Det anbefales å bruke en Pasteur-pipette siden fluksen og trykket kan styres manuelt. Ytterligere faser kan bygges bedre med langsom dispensering av SIP-løsningen eller til og med dråpe for dråpe. Når faser er etablert, må røret håndteres forsiktig; Ellers vil fasene blandes umiddelbart, og prøver vil gå tapt, da det er umulig å skille fasene igjen. I tillegg er det viktig å sentrifugere røret uten pause fordi brudd kan være for aggressivt, noe som fører til tap av separate faser. Leukocyttene blir deretter gjenvunnet fra interfase mellom 30% og 37% SIP. Vi analyserte en cellepopulasjon i dette eksemplet, plasmaceller (CD45+ og CD138+). Denne teknikken er imidlertid ikke begrenset til B-celler; Den kan brukes til andre celletyper og intracellulær farging28.

Den tredje metoden er et kraftig verktøy for å visualisere intracellulære lokaliseringer av gitte proteinavsetninger. Når vev er festet med aceton, er det viktig å utføre tilstrekkelig vask, slik at antistoffer bare festes til målet. Deretter reduserer blokkering med BSA uspesifikke bindinger og falske positiver. Direkte immunfluorescens anbefales vanligvis, da det er raskere enn indirekte immunfluorescens med et sekundært antistoff, noe som er tidkrevende, spesielt med tanke på de ekstra vaske- og inkubasjonstrinnene. Direkte immunfluorescens begrenser imidlertid fleksibiliteten ved valg av antistoff sammenlignet med indirekte immunfluorescens29. Derfor kan begge være verdifulle metoder avhengig av formålet. Videre må det nevnes at fortynningsfaktorer er viktige mens flekker for IHC. Hvis fortynningen ikke er godt utført, vil økt bakgrunn (ikke nok antistofffortynning) eller svak farging (for mye dilatasjon) vises på mikroskopibildene. Det er viktig å starte med serielle fortynninger av antistoffet for å optimalisere antistoffkonsentrasjonen for et bedre mål-til-bakgrunn-forhold. Et annet skritt å vurdere er mengden inkubasjonstid med antistoffene. Jo lenger antistoffet er i kontakt med prøven, jo mer uspesifikk binding kan opprettes.

Begrensningene i dagens metoder er som følger. Visse kliniske parametere for LN, som albumin / kreatininforholdet, kan ikke avsløres ved hjelp av disse metodene. I tillegg kan noen prøver ha dårlig syreløselighet som fører til høy konsentrasjonsavlesning over standardkurven. Dette krever ytterligere fortynninger av prøver eller tilsetning av overflateaktive stoffer for å utfelle fargestoffet30. Videre kan denne protokollen ikke være egnet hvis mange celler er nødvendig etter nyre leukocytt isolasjon. Den nåværende nyrecelleisolasjonsprotokollen innebærer flere vasketrinn, fordøyelse og isolasjonstrinn for å maksimere fjerningen av andre celler, så selv om cellens renhet er høy på slutten, er celletallet vanligvis lavt. Videre er det en lang prosedyre, slik at cellens levedyktighet kan bli kompromittert. Andre bruksklare analyser er mer egnet for klinisk bruk; Imidlertid kan de nåværende metodene gi nøyaktige resultater med et mindre budsjett for forskningslaboratorier.

Oppsummert presenteres tre forskjellige effektive og nøyaktige teknikker i denne protokollen for å karakterisere LN-progresjonen. Ved å kombinere Bradford-metoden for proteinurinivået, FACS-analyse for nyreinfiltrasjon av leukocyttene og IHC-analyse for nyreavsetning av IgG2a og C3, er et klart bilde av nyredysfunksjon hos kvinnelige MRL / lpr-mus som en modell av human LN vellykket etablert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center ved Virginia Polytechnic Institute og State University for teknisk støtte. Dette arbeidet støttes av ulike NIH og interne tilskudd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Tags

Immunologi og infeksjon SLE lupus nefritt nyre nyreinfiltrasjon dysfunksjonelle B-celler proteinavsetning
Analyser av proteinuri, renal infiltrasjon av leukocytter og nyreavsetning av proteiner i lupusutsatt MRL/lpr-mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses … More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter