Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyses van proteïnurie, renale infiltratie van leukocyten en renale afzetting van eiwitten bij lupusgevoelige MRL / lpr-muizen

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506

Summary

Het huidige protocol beschrijft een methode om lupusprogressie bij muizen te volgen. Twee aanvullende procedures worden gepresenteerd om lupus nefritis te karakteriseren op basis van celinfiltratie en eiwitafzetting in de nieren.

Abstract

Systemische lupus erythematosus (SLE) is een auto-immuunziekte zonder bekende genezing en wordt gekenmerkt door aanhoudende ontsteking in veel organen, waaronder de nieren. Onder dergelijke omstandigheden verliest de nier zijn vermogen om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren, wat uiteindelijk leidt tot nierfalen. Vrouwen, met name die in de vruchtbare leeftijd, worden negen keer vaker gediagnosticeerd dan mannen. Nierziekte is de belangrijkste doodsoorzaak bij SLE-patiënten. Het huidige protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om uitgescheiden eiwitniveaus in verzamelde urine te meten, waarbij de progressie van lupus in de loop van de tijd wordt gevolgd. Daarnaast wordt een benadering geboden om mononucleaire niercellen te isoleren op basis van grootte en dichtheidsselectie om renale infiltratie van leukocyten te onderzoeken. Verder is een immunohistochemische methode ontwikkeld om eiwitafzetting in de glomeruli en leukocyteninfiltratie in de tubulo-interstitiële ruimte te karakteriseren. Samen kunnen deze methoden helpen bij het onderzoeken van de progressie van chronische ontsteking geassocieerd met de nieren van lupus-gevoelige MRL / lpr-muizen.

Introduction

De primaire functie van de nier is de eliminatie van giftige stoffen via de urine met behoud van de homeostase van water en zouten1. Deze functie wordt bedreigd bij patiënten met systemische lupus erythematosus (SLE), wat leidt tot zogenaamde lupus nefritis (LN). LN is een gevolg van het immuunsysteem dat de nier aanvalt, wat leidt tot aanhoudende nierontsteking, waardoor het zijn vermogen verliest om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren. Dit zal uiteindelijk leiden tot nierfalen, wat fataal kan zijn. Tijdens het nefritische proces worden circulerende B-cellen, T-cellen en monocyten gerekruteerd naar de nier, waarbij chemokines, cytokines en immuuncomplexvormende auto-antilichamen worden afgescheiden. Dit resulteert uiteindelijk in endotheelcelbeschadiging, vliezige verwondingen, renale tubulaire atrofie en fibrose2.

MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) lupus-gevoelige muizen is een klassiek muismodel dat lupus-achtige klinische symptomen vertoont die lijken op menselijke SLE3. Dit model heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van een van de belangrijkste oorzaken van sterfte bij SLE-patiënten, lupus nefritis (LN)4. Bij zowel menselijke als muis SLE wordt LN gekenmerkt door geleidelijke ontsteking veroorzaakt door renale afzetting van immuuncomplexen, gevolgd door complementactivering, rekrutering van ontstekingscellen en verlies van nierfunctie5. De immuuncomplexafzetting is de eerste stap om chemokine- en cytokineproductie door intrinsieke niercellen te induceren, wat de ontstekingsreactie uitbreidt door immuuncellen te rekruteren6. Het huidige protocol presenteert verschillende technieken om de progressie van nierziekten te volgen die celinfiltratie en immuuncomplexafzetting analyseren.

Urine die elke week wordt verzameld, zorgt voor detectie en visualisatie van het tijdsverloop van proteïnurie vóór, tijdens en na het begin van lupus. Proteïnurie als biomarker kan de biologische progressie van LN bepalen. Andere voordelen van deze techniek zijn dat het niet-invasief, kostenefficiënt en eenvoudig te implementeren is7. Wanneer de nier perfect werkt, is het proteïnurieniveau constant laag; bij MRL/lpr-muizen wordt echter na een leeftijd van 8-9 weken een geleidelijke toename van het proteïnurieniveau waargenomen, dat uiteindelijk hoog genoeg is om nierfalen te veroorzaken8. Meerdere reagenstrips en colorimetrische reagentia zijn in de handel verkrijgbaar om het probleem te monitoren. De Bradford-test is echter goedkoop en zeer nauwkeurig bij het bepalen van het begin van proteïnurie en het beloop van lupus nefritis. Deze test is snel en het reagens wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van oplosmiddelen, buffers, reductiemiddelen en metaalchelaatmiddelen die zich in uw monster kunnen bevinden 9,10,11.

Een belangrijk aspect om te overwegen is celinfiltratie in de nier. Deze infiltraten bevorderen de pathogenese door de afscheiding van oplosbare factoren zoals cytokines te activeren om ontstekingen te verergeren12. Om beter te begrijpen welke celpopulaties aanwezig zijn in de infiltraten, is een nuttige methode om leukocyten te isoleren13. Hier wordt de detectie van renale infiltratie van B-cellen als voorbeeld gebruikt. De procedure begint met een verteringsproces met deoxyribonuclease (DNase) en collagenase, gevolgd door dichtheidsgradiëntscheiding die puin, rode bloedcellen en dichte granulocyten verwijdert. De reden voor het isoleren van B-cellen (CD19+) en plasmacellen (CD138+) is dat lupus nieren deze cellen kunnen concentreren14. Er wordt gesuggereerd dat de aanwezigheid van B-cellen in kleine aggregaten in de nier kan wijzen op klonale expansie en bijgevolg op immunoglobuline (Ig) productie. Van plasmacellen is bekend dat ze ook in deze aggregaten aanwezig zijn15. Zodra leukocyten zijn geïsoleerd, kan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) worden gebruikt om de cellen van belang te analyseren bij kleuring met verschillende fluorescentie-geconjugeerde antilichamen.

Immunofluorescentie is een van de immunohistochemische (IHC) detectiemethoden die fluorescentie visualisatie van eiwitten in 4 μm dikke nierweefselmonsters mogelijk maakt. Andere IHC-detectiemethoden zijn afhankelijk van de aard van analyten, bindingschemie en andere factoren16. Immunofluorescentie is een snelle identificatiemethode die het antigeen blootstelt aan zijn tegenhanger antilichaam gelabeld met een specifiek fluorochroom (of een fluorescerende kleurstof). Wanneer het wordt geëxciteerd, produceert het licht dat een fluorescentiemicroscoop kan detecteren. Deze techniek kan worden gebruikt om de afzetting van complement C3 en IgG2a17 te observeren. Overmatige complementcascadeactivering kan worden geassocieerd met een ongecontroleerde immuunrespons en functieverlies18. Immuundepositie van anti-dubbelstrengs DNA (anti-dsDNA) auto-antilichamen in de nier is een grote zorg19, waar mensen met IgG2a isotype zijn geassocieerd met LN20. In het bijzonder vertonen anti-dsDNA-antilichamen meer pathogeniciteit en affiniteit met nucleaire materialen en vormen ze immuuncomplexen21. Wanneer IgG2a aanwezig is, wordt de complementcascade, inclusief C3, geactiveerd om de immuuncomplexen te verwijderen22. De C3- en IgG2a-markers kunnen afzonderlijk worden gekwantificeerd of eroverheen worden gelegd om hun correlatie vast te stellen.

Met name serumcreatininemeting is een andere betrouwbare techniek die samen met microscopische hematurie en nierbiopten kan worden gebruikt om LN23 te diagnosticeren. De aanwezigheid van proteïnurie is echter een sterke indicator van glomerulaire schade. In die zin kan het monitoren van het proteïnurieniveau tijdens lupus het begin van de ziekte detecteren en een aanvulling vormen op andere methoden voor het diagnosticeren van lupus. Bovendien kunnen immuuncomplexen die in glomeruli worden afgezet een ontstekingsreactie veroorzaken, het complementsysteem activeren en meer ontstekingscellen rekruteren. Een ander opmerkelijk punt van dit protocol is B-celinfiltratie in de nier. Dit, samen met de geïnfiltreerde T-cellen, versterkt lokale immuunresponsen die orgaanschade veroorzaken. Belangrijk is dat de classificatie van LN niet alleen gebaseerd is op glomerulaire morfologische veranderingen die worden waargenomen in microscopie, maar ook op immuunafzettingen waargenomen met immunofluorescentie. Daarom worden in dit protocol nauwkeurige en kosteneffectieve methoden voor de analyse van de nierfunctie aangeboden in laboratoriumomgevingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het huidige protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech. Aangezien lupusziekte een hogere incidentie heeft bij vrouwen, werden alleen vrouwelijke MRL / lpr-muizen gebruikt. De monsterverzameling werd gestart op de leeftijd van 4 weken en eindigde op de leeftijd van 15 weken. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen) en werden gefokt en onderhouden in een specifieke pathogeenvrije omgeving volgens de institutionele richtlijnen.

1. Proteïnurie test

  1. Verzamel urine volgens de onderstaande stappen.
    1. Steriliseer de kap door 70% ethanol te spuiten. Plaats een steriele plastic plaat op het oppervlak. Bereid tips, 1,5 ml buizen en een pipet voor om ongeveer 20 μL van de vloeistof te verzamelen.
      OPMERKING: Tips en buizen moeten steriel zijn en zonder enige voorbehandeling.
    2. Neem de kooi en spuit 70% ethanol voordat u deze in de kap plaatst.
    3. Houd de muis met één hand vast en gebruik de andere hand om het ventrale gebied zachtjes van boven naar beneden te masseren.
    4. Gebruik een buis of pipet van 1,5 ml om de urine direct te verzamelen, of als het monster valt, verzamel het dan van het plastic vel. Gebruik verse handschoenen, lakens en tips voor elk monster.
      OPMERKING: Als dit niet werkt, gebruik dan een steriel bekerglas om de muis te isoleren en verzamel vervolgens de urine van het bekerglas nadat de muis heeft geplast.
    5. Zet de muis terug in de kooi. Haal een andere muis tevoorschijn en herhaal stap 1.1.3-1.1.4.
      OPMERKING: Reinig altijd het plastic vel en het bekerglas met 70% ethanol na het verzamelen van het monster voor elke muis. Ten minste vijf muizen per groep zijn nodig voor statistische significantie. Urinemonsters kunnen tot 12 maanden bij -80 °C worden bewaard tot gebruik.
  2. Kwantificeer de eiwitten volgens de Bradford-methode24.
    1. Laat urinemonsters, albuminestandaard en het Bradford-reagens op kamertemperatuur komen (RT) door ze 10-20 minuten buiten de vriezer te houden.
      OPMERKING: Bradford-reagens en albuminestandaard zijn inbegrepen in een in de handel verkrijgbare kit (zie Materiaaltabel). De startconcentratie van de albuminestandaard is 2 mg/ml. Seriële verdunningen (1:2 zes keer) moeten met water worden gedaan.
    2. Voeg Bradford-reagens toe aan een 96-well plaat (200 μL/put), onverdund.
    3. Pipetteer 5 μL onverdund urinemonster per putje en gebruik de punt om meerdere keren op en neer te pipetteren om goed te mengen.
    4. Voeg normen (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg / dL) toe in duplicaten. Laat een paar putjes als blanco.
      OPMERKING: Het toevoegen van monsters en normen moet snel gebeuren.
    5. Laat het 5-10 min staan bij RT.
    6. Lees de plaat op 595 nm in een plaatlezer volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).

2. Isolatie van de niercellen

  1. Euthanasieer de muis met CO2 (stroomsnelheid: 30% -70% volume / min, om bewusteloosheid of de dood te bereiken) in een kamer gevolgd door cervicale dislocatie. Ga verder met de dissectie om beide nieren te verzamelen. Plaats anderhalve nier in een ijskoud C10-medium. Zet de andere helft nier in OCT (stap 3.1.1).
    OPMERKING: C10 is gemaakt met RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1 mM natriumpyruvaat, 1% van 100x MEM niet-essentiële aminozuren, 10 mM HEPES, 55 μM 2-mercaptoethanol en 100 U / ml penicilline-streptomycine (zie materiaaltabel).
  2. Snijd de nieren in korrelgrootte (1-2 mm3 stuks) en verteer in 5 ml digestiebuffer met 1 mg/ml collagenase en 0,2 mg/ml DNase I (zie materiaaltabel) in RPMI 1640 medium met 10 mmol/l HEPES gedurende 1 uur met continu zacht schudden bij 37 °C.
    OPMERKING: Voeg 1 ml digestiebuffer toe in een steriele buis van 2 ml en gebruik een steriele schaar om de nier te hakken.
  3. Voeg 10 ml 1x ijskoude PBS met 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Vervolgens vortex de suspensie twee keer.
  4. Filtreer de celsuspensie door een zeef van 100 μM en was met 10 ml HBSS-vol.
    OPMERKING: HBSS-full bevat 5 mM EDTA, 0,1% BSA en 10 mM HEPES.
  5. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 10 min bij RT.
  6. Bereid 30%, 37% en 70% Stock Isotonic Percoll (SIP) oplossing.
    OPMERKING: Meng 1 deelvolume van 10x PBS en 9 delen volume van Percoll om SIP te bereiden (zie Tabel met materialen); gebruik HBSS-full om SIP te verdunnen tot 30%, 37% en 70% SIP.
  7. Resuspendeer cellen in 5 ml van 30% SIP en laad 37% van 5 ml (boven) en 70% van 5 ml (onder), waardoor SIP gradiënt ontstaat, langzaam met een paster pipet.
  8. Centrifugeer met Up9 down0 (of rem 0) bij 1000 x g gedurende 30 minuten bij RT.
  9. Verzamel leukocyten uit de 37% -70% interface en resuspendeer ze in 5 ml C10.
  10. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  11. Resuspendeer de celpellet in 3 ml FACS-buffer. Cellen zijn klaar voor FACS-kleuring.
    OPMERKING: FACS-buffer bevat 1x PBS en 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA).
  12. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant (SN) weg, waarbij ongeveer 50 μL overblijft.
    OPMERKING: Om het supernatant te verwijderen, giet of pipetteer de oplossing voorzichtig weg van de vaste stof of gebruik een semiautomatisch vacuüm om het supernatant aan te zuigen.
  13. Voeg 50 μL FcR-blok (zie tabel met materialen) per buis toe (voorverwijderd 1/50 in 1x PBS); meng en incubeer op ijs in het donker gedurende 10 minuten.
  14. Voeg 2 ml FACS-buffer toe om te wassen.
  15. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi SN weg, waarbij ongeveer 50 μL overblijft.
  16. Voeg 20 μL van de juiste fluorescerende kleurstof toe (verdun 1/100 met 1x PBS, zie Materiaaltabel) en laat het 15-30 minuten op ijs staan.
  17. Voeg 50 μL antilichaam15 mix per buis toe: CD138-BV711 (1/200 in 1x PBS) en CD45-AF700 (1/200 in 1x PBS) (zie Materiaaltabel).
  18. Incubeer op ijs in het donker gedurende 15-30 minuten en voeg 3 ml FACS-buffer toe.
  19. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en vacuüm SN, waarbij ongeveer 50 μL overblijft. Resuspend in 200 μL van 1x PBS. Dit is nu klaar om te worden geanalyseerd door flowcytometrie.

3. Immunofluorescente kleuring

  1. Voer de monsterverzameling uit.
    1. Integreer de halve nier in de kleine plastic cryomold met de optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding (zie Materiaaltabel).
    2. Voeg droogijs toe in een piepschuimdoos (zie Materiaaltabel) en leg de cryomold voorzichtig op het droogijs. Zorg ervoor dat de cryomolden plat worden geplaatst.
      OPMERKING: Het duurt 3-4 minuten voordat de OCT-verbinding stolt en wit wordt.
    3. Haal de cryomold eruit en wikkel deze in aluminiumfolie. Bewaar het bij -80 °C tot verder gebruik.
      LET OP: Dit kan minimaal 1 jaar bewaard worden bij -80 °C.
  2. Voer secties en bevestiging van het monster uit.
    1. Snijd de monsters in secties van 4 μm, wacht tot ten minste 2-3 uur droog is en bevestig vervolgens gedurende 10 minuten met koud aceton (bij 4 °C).
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het gebruik van aceton, waarvoor een gespecialiseerde chemische kap nodig is.
    2. Na het bevestigen van de glaasjes aan de lucht drogen gedurende 0,5-1 uur en bewaren ze voor een korte tijd bij -20 °C, of voor een lange tijd bij -80 °C.
  3. Beits de monsters.
    1. Bevestig de dia's opnieuw in koude aceton gedurende 5-10 minuten.
    2. Laat de secties opwarmen tot RT. Gebruik een PAP-pen (zie Materiaaltabel) rond de sectie en laat deze drogen.
      OPMERKING: Nagelglazuur kan ook worden gebruikt. Deze stap voorkomt dat antilichaamverdunning over de hele dia zweeft.
    3. Plaats dia's in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) in de Coplin-pot (zie Materiaaltabel) gedurende 20 minuten, zet de pot op de shaker en schud voorzichtig.
    4. Giet 1x TBS af en vul de pot met 1x TBS, 5% BSA en 0,1% Tween 20. Incubeer gedurende 20 minuten op de shaker, schud voorzichtig.
    5. Haal de dia's eruit en veeg de onderkant van de dia's droog. Schud degplaten indien nodig droog. Voeg 100 μL geconjugeerde antilichamen25 C3-FITC (1/100) en IgG2a-PE (1/100) toe aan de sectie (zie Materiaaltabel). Incubeer bij RT in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur.
    6. Was de sectie 3 keer in 1x TBS, 5% BSA en 0,1% Tween 20 gedurende 10 minuten op de shaker.
    7. Schud de dia's droog en monteer de sectie met een antifadereagens (zie Materiaaltabel) en vervolgens een coverslip.
    8. Bewaar de dia's bij 4 °C totdat ze onder de microscoop worden bekeken (bijv. confocale microscoop of microscoop van het beeldvormingssysteem). Kwantificeer afbeeldingen met behulp van software en trek achtergrondsignalen af bij het vergelijken van de fluorescentie-intensiteit tussen regio's.
    9. Voor beeldanalyse met behulp van de ImageJ-software (zie Materiaaltabel), schetst u het gewenste gebied.
    10. Stel standaardparameters in door op Analyseren te klikken en vervolgens Op metingen instellen en gebied meten om de resultaten te krijgen.
    11. Breng de gegevens die zijn verkregen uit de metingsvensters over naar een spreadsheet.
      OPMERKING: Een klein gebied kan uit de afbeelding worden geselecteerd als achtergrond; het mag geen fluorescentie hebben.
    12. Als u klaar bent, klikt u op Analyseren om de regio te meten en gegevens opnieuw over te zetten naar de vorige spreadsheet.
    13. Herhaal stap 3.3.11-3.3.12 voor verschillende regio's.
    14. Bereken de gemiddelde fluorescentie als gecorrigeerde celfluorescentie (CCF) = geïntegreerde dichtheid - (geselecteerd celgebied x gemiddelde achtergrondfluorescentie).
    15. Bereken voor elke regio en analyseer gegevens met behulp van de grafische en statistische software (zie Materiaaltabel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol maakt gebruik van meerdere methoden om MRL / lpr-muizen te beoordelen op lupus nefritis. Ten eerste wordt een procedure beschreven om verhoogde proteïnurieniveaus te bestuderen als gevolg van nierdisfunctie in de loop van de tijd. Zoals te zien is in figuur 1, werden vrouwelijke muizen behandeld met een oraal bereik van 200 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) als de controlegroep en probiotische Lactobacillus reuteri als de behandelingsgroep, in een concentratie van 109 kve / ml, tweemaal per week. De behandeling begon op 3 weken oud en eindigde op 15 weken oud. De muizengroep die met L. reuteri werd behandeld, had een agressievere proteïnurieprogressie dan de controlegroep.

Figure 1
Figuur 1: Detectie van eiwitniveaus in de urine van MRL/lpr-muizen in de loop van de tijd. n = 5 muizen per groep. De statistieken werden uitgevoerd met de eenvoudige lineaire regressietest. *P < 0,05, **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 toont de FACS-analyse van de geïsoleerde nierleukocyten. De muizen werden in dit experiment behandeld met vancomycine (2 g/L) of vancomycine plus E. coli dsDNA (80 μg). Vancomycine werd samen met het drinkwater gegeven gedurende de aangegeven periode. Orale maagsonde van bacterieel DNA werd eenmaal per week toegediend aan de met vancomycine behandelde muizen gedurende vier opeenvolgende weken op de leeftijd van 4, 5, 6 en 7 weken. Verwacht werd dat E. coli dsDNA de renale infiltratie van plasmacellen zou veroorzaken, wat leidde tot een gecompromitteerde nierfunctie, maar er werd geen significant verschil gevonden.

Figure 2
Figuur 2: Analyse van plasmacellen in geïsoleerde nierleukocyten. (A) Sequentiële gatingstrategie: totale cellen, enkele cellen, levende cellen, CD45+ cellen en ten slotte CD138+ cellen. (B) Percentage plasmacellen na behandeling met bestelwagen (Vancomycine) of van + DNA (Vancomycine + E. coli dsDNA) gedurende 3 weken (n ≥ 5 muizen per groep). Er werd geen statistische significantie ('ns') waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 toont immunofluorescentiekleuring van complement C3 en IgG2a op vrouwelijke MRL/lpr niersecties. In dit experiment werd het effect van omgevingsfactoren vergeleken met betrekking tot de renale afzetting van C3 en IgG2a. Huismuizen werden meerdere generaties in de dierenfaciliteit gefokt en ze werden vergeleken met recent gekochte muizen van een leverancier. De immunohistochemische analyse toonde geen verschil tussen verschillende faciliteiten.

Figure 3
Figuur 3: Detectie van complement C3 en IgG2a in niersecties via immunofluorescentiekleuring. (A) Representatieve foto's van niersecties gekleurd met anti-C3-FITC (groen) en anti-IgG2a-PE (rood). (B) Vergelijking van gecorrigeerde celfluorescentie (CCF) tussen de twee groepen (n ≥ 5 muizen per groep). Schaalbalk = 100 μM. Er werd geen statistische significantie ('ns') waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LN is een belangrijke doodsoorzaak bij SLE-patiënten en factoren die de ziekte verergeren, blijven onduidelijk. De toepassing van dit protocol is om de nierfunctie te karakteriseren met behulp van meerdere methoden, waaronder meting van proteïnurie, FACS-analyse van geïsoleerde nierleukocyten en immunofluorescentiekleuring van bevroren niersecties.

Een belangrijk punt om te overwegen bij het verzamelen van urine is dat men consistent moet zijn met het tijdstip van de dag en de locatie van urineverzameling. Muizen zijn nachtdieren, dus de meest nauwkeurige monsters worden in de late namiddag verzameld voordat muizen actief worden. Een andere reden om voor deze tijd te kiezen, is dat MRL / lpr-muizen de neiging hebben om 's nachts veel water te drinken, wat leidt tot verdunde urine. Zo kan verzameling op het verkeerde moment de concentratie en / of volumevariabiliteit van de urine verhogen. Het is ook belangrijk om zoveel mogelijk urine te verzamelen om nauwkeurige resultaten te krijgen.

De Bradford-test geeft ons een schatting van hoeveel eiwit aanwezig is. Het is niet specifiek voor SLE-markereiwitten, maar goed genoeg om een idee te geven van ziekteprogressie26. Bovendien is deze methode kosteneffectief in vergelijking met andere. Met name de Bradford-test is tijdgevoelig; daarom moet het binnen een half uur worden voltooid. Monsters hebben de neiging om verhoogde waarden of hoge valse resultaten te hebben als men te lang wacht. Een ander voordeel in vergelijking met de commerciële reagenstrips voor urineonderzoek is dat het nauwkeurige cijfers geeft in plaats van een bereik binnen het urinemonster. Scoringsstroken kunnen dubbelzinnige resultaten geven, vooral in het hogere bereik 9,10,24.

Voor de isolatie van nierleukocyten is de eerste belangrijke stap om de dissectie zo snel mogelijk uit te voeren. De levensvatbaarheid van niercellen heeft een grote invloed op het succes van de daaropvolgende FACS-analyse. Wanneer nieren worden verwerkt, is elke stap tijd- en temperatuurgevoelig. Opgemerkt moet worden dat DNase I- en collagenaseconcentraties en -temperatuur belangrijk zijn voor maximale efficiëntie, omdat ze DNA elimineren en de desintegratie van het orgaan mogelijk maken, respectievelijk27. De tweede belangrijke stap is het isoleren van cellen, verdeeld in twee belangrijke processen. De eerste is het gebruik van de zeef die het verwijderen van weefselresten mogelijk maakt; het tweede proces waarbij Percoll betrokken is, is de meest cruciale stap en vereist focus en geduld. Bij het doen van de dichtheidsgradiënt met Percoll is het belangrijk om duidelijke interfaces tussen verschillende concentraties SIP te behouden. Het wordt aanbevolen om een Pasteur-pipet te gebruiken, omdat de flux en druk handmatig kunnen worden geregeld. Extra fasen kunnen beter worden gebouwd met de langzame afgifte van de SIP-oplossing of zelfs druppel voor druppel. Zodra de fasen zijn vastgesteld, moet de buis voorzichtig worden behandeld; anders zullen de fasen onmiddellijk mengen en zullen monsters verloren gaan, omdat het onmogelijk is om de fasen opnieuw te scheiden. Bovendien is het belangrijk om de buis zonder breuk te centrifugeren, omdat breken te agressief kan zijn, wat leidt tot het verlies van afzonderlijke fasen. De leukocyten worden vervolgens teruggevonden uit de interfase tussen 30% en 37% SIP. We analyseerden één celpopulatie in dit voorbeeld, plasmacellen (CD45+ en CD138+). Deze techniek is echter niet beperkt tot B-cellen; het kan worden gebruikt voor andere celtypen en intracellulaire kleuring28.

De derde methode is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van intracellulaire lokalisaties van gegeven eiwitafzettingen. Zodra weefsels zijn gefixeerd met aceton, is het belangrijk om voldoende te wassen, zodat antilichamen zich alleen aan het doelwit hechten. Vervolgens vermindert blokkeren met BSA niet-specifieke bindingen en fout-positieven. Directe immunofluorescentie wordt meestal aanbevolen, omdat het sneller is dan indirecte immunofluorescentie met een secundair antilichaam, wat tijdrovend is, vooral gezien de extra was- en incubatiestappen. Directe immunofluorescentie beperkt echter de flexibiliteit van de selectie van antilichamen in vergelijking met indirecte immunofluorescentie29. Daarom kunnen beide waardevolle methoden zijn, afhankelijk van het doel. Verder moet worden vermeld dat verdunningsfactoren de sleutel zijn bij het kleuren voor IHC. Als de verdunning niet goed wordt uitgevoerd, zal een verhoogde achtergrond (niet genoeg antilichaamverdunning) of zwakke kleuring (te veel dilatatie) op de microscopiebeelden verschijnen. Het is belangrijk om te beginnen met seriële verdunningen van het antilichaam om de antilichaamconcentratie te optimaliseren voor een betere doel-achtergrondverhouding. Een andere stap om te overwegen is de hoeveelheid incubatietijd met de antilichamen. Hoe langer het antilichaam in contact is met het monster, hoe meer niet-specifieke binding kan worden gecreëerd.

De beperkingen van de huidige methoden zijn als volgt. Bepaalde klinische parameters voor LN, zoals de albumine/creatinineverhouding, kunnen met deze methoden niet worden onthuld. Bovendien kunnen sommige monsters een slechte oplosbaarheid van zuren hebben, wat leidt tot een hoge concentratiewaarde boven de standaardcurve. Dit vereist verdere verdunningen van monsters of de toevoeging van oppervlakteactieve stoffen om de kleurstof neer te slaan30. Bovendien is dit protocol mogelijk niet geschikt als er veel cellen nodig zijn na nierleuocytenisolatie. Het huidige niercelisolatieprotocol omvat verschillende wasstappen, spijsvertering en isolatiestappen om de verwijdering van andere cellen te maximaliseren, dus hoewel de celzuiverheid aan het einde hoog is, is het celaantal meestal laag. Bovendien is het een lange procedure, dus de levensvatbaarheid van cellen kan in het gedrang komen. Andere kant-en-klare testen zijn meer geschikt voor klinisch gebruik; de huidige methoden kunnen echter nauwkeurige resultaten opleveren met een kleiner budget voor onderzoekslaboratoria.

Samenvattend worden in dit protocol drie verschillende efficiënte en nauwkeurige technieken gepresenteerd om de LN-progressie te karakteriseren. Door de Bradford-methode voor de proteïnuriespiegel, FACS-analyse voor renale infiltratie van de leukocyten en IHC-analyse voor de renale afzetting van IgG2a en C3 te combineren, is een duidelijk beeld van nierdisfunctie bij vrouwelijke MRL / lpr-muizen als een model van humaan LN met succes vastgesteld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We bedanken de Flow Cytometry Core Facility, het Histopathology Laboratory, het Fralin Imaging Center aan het Virginia Polytechnic Institute en de State University voor technische ondersteuning. Dit werk wordt ondersteund door verschillende NIH en interne subsidies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Tags

Immunologie en infectie SLE lupus nefritis nier nierinfiltratie disfunctionele B-cellen eiwitdepositie
Analyses van proteïnurie, renale infiltratie van leukocyten en renale afzetting van eiwitten bij lupusgevoelige MRL / lpr-muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter