Analyses van proteïnurie, renale infiltratie van leukocyten en renale afzetting van eiwitten bij lupusgevoelige MRL / lpr-muizen
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om lupusprogressie bij muizen te volgen. Twee aanvullende procedures worden gepresenteerd om lupus nefritis te karakteriseren op basis van celinfiltratie en eiwitafzetting in de nieren.
Abstract
Systemische lupus erythematosus (SLE) is een auto-immuunziekte zonder bekende genezing en wordt gekenmerkt door aanhoudende ontsteking in veel organen, waaronder de nieren. Onder dergelijke omstandigheden verliest de nier zijn vermogen om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren, wat uiteindelijk leidt tot nierfalen. Vrouwen, met name die in de vruchtbare leeftijd, worden negen keer vaker gediagnosticeerd dan mannen. Nierziekte is de belangrijkste doodsoorzaak bij SLE-patiënten. Het huidige protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om uitgescheiden eiwitniveaus in verzamelde urine te meten, waarbij de progressie van lupus in de loop van de tijd wordt gevolgd. Daarnaast wordt een benadering geboden om mononucleaire niercellen te isoleren op basis van grootte en dichtheidsselectie om renale infiltratie van leukocyten te onderzoeken. Verder is een immunohistochemische methode ontwikkeld om eiwitafzetting in de glomeruli en leukocyteninfiltratie in de tubulo-interstitiële ruimte te karakteriseren. Samen kunnen deze methoden helpen bij het onderzoeken van de progressie van chronische ontsteking geassocieerd met de nieren van lupus-gevoelige MRL / lpr-muizen.
Introduction
De primaire functie van de nier is de eliminatie van giftige stoffen via de urine met behoud van de homeostase van water en zouten1. Deze functie wordt bedreigd bij patiënten met systemische lupus erythematosus (SLE), wat leidt tot zogenaamde lupus nefritis (LN). LN is een gevolg van het immuunsysteem dat de nier aanvalt, wat leidt tot aanhoudende nierontsteking, waardoor het zijn vermogen verliest om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren. Dit zal uiteindelijk leiden tot nierfalen, wat fataal kan zijn. Tijdens het nefritische proces worden circulerende B-cellen, T-cellen en monocyten gerekruteerd naar de nier, waarbij chemokines, cytokines en immuuncomplexvormende auto-antilichamen worden afgescheiden. Dit resulteert uiteindelijk in endotheelcelbeschadiging, vliezige verwondingen, renale tubulaire atrofie en fibrose2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) lupus-gevoelige muizen is een klassiek muismodel dat lupus-achtige klinische symptomen vertoont die lijken op menselijke SLE3. Dit model heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van een van de belangrijkste oorzaken van sterfte bij SLE-patiënten, lupus nefritis (LN)4. Bij zowel menselijke als muis SLE wordt LN gekenmerkt door geleidelijke ontsteking veroorzaakt door renale afzetting van immuuncomplexen, gevolgd door complementactivering, rekrutering van ontstekingscellen en verlies van nierfunctie5. De immuuncomplexafzetting is de eerste stap om chemokine- en cytokineproductie door intrinsieke niercellen te induceren, wat de ontstekingsreactie uitbreidt door immuuncellen te rekruteren6. Het huidige protocol presenteert verschillende technieken om de progressie van nierziekten te volgen die celinfiltratie en immuuncomplexafzetting analyseren.
Urine die elke week wordt verzameld, zorgt voor detectie en visualisatie van het tijdsverloop van proteïnurie vóór, tijdens en na het begin van lupus. Proteïnurie als biomarker kan de biologische progressie van LN bepalen. Andere voordelen van deze techniek zijn dat het niet-invasief, kostenefficiënt en eenvoudig te implementeren is7. Wanneer de nier perfect werkt, is het proteïnurieniveau constant laag; bij MRL/lpr-muizen wordt echter na een leeftijd van 8-9 weken een geleidelijke toename van het proteïnurieniveau waargenomen, dat uiteindelijk hoog genoeg is om nierfalen te veroorzaken8. Meerdere reagenstrips en colorimetrische reagentia zijn in de handel verkrijgbaar om het probleem te monitoren. De Bradford-test is echter goedkoop en zeer nauwkeurig bij het bepalen van het begin van proteïnurie en het beloop van lupus nefritis. Deze test is snel en het reagens wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van oplosmiddelen, buffers, reductiemiddelen en metaalchelaatmiddelen die zich in uw monster kunnen bevinden 9,10,11.
Een belangrijk aspect om te overwegen is celinfiltratie in de nier. Deze infiltraten bevorderen de pathogenese door de afscheiding van oplosbare factoren zoals cytokines te activeren om ontstekingen te verergeren12. Om beter te begrijpen welke celpopulaties aanwezig zijn in de infiltraten, is een nuttige methode om leukocyten te isoleren13. Hier wordt de detectie van renale infiltratie van B-cellen als voorbeeld gebruikt. De procedure begint met een verteringsproces met deoxyribonuclease (DNase) en collagenase, gevolgd door dichtheidsgradiëntscheiding die puin, rode bloedcellen en dichte granulocyten verwijdert. De reden voor het isoleren van B-cellen (CD19+) en plasmacellen (CD138+) is dat lupus nieren deze cellen kunnen concentreren14. Er wordt gesuggereerd dat de aanwezigheid van B-cellen in kleine aggregaten in de nier kan wijzen op klonale expansie en bijgevolg op immunoglobuline (Ig) productie. Van plasmacellen is bekend dat ze ook in deze aggregaten aanwezig zijn15. Zodra leukocyten zijn geïsoleerd, kan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) worden gebruikt om de cellen van belang te analyseren bij kleuring met verschillende fluorescentie-geconjugeerde antilichamen.
Immunofluorescentie is een van de immunohistochemische (IHC) detectiemethoden die fluorescentie visualisatie van eiwitten in 4 μm dikke nierweefselmonsters mogelijk maakt. Andere IHC-detectiemethoden zijn afhankelijk van de aard van analyten, bindingschemie en andere factoren16. Immunofluorescentie is een snelle identificatiemethode die het antigeen blootstelt aan zijn tegenhanger antilichaam gelabeld met een specifiek fluorochroom (of een fluorescerende kleurstof). Wanneer het wordt geëxciteerd, produceert het licht dat een fluorescentiemicroscoop kan detecteren. Deze techniek kan worden gebruikt om de afzetting van complement C3 en IgG2a17 te observeren. Overmatige complementcascadeactivering kan worden geassocieerd met een ongecontroleerde immuunrespons en functieverlies18. Immuundepositie van anti-dubbelstrengs DNA (anti-dsDNA) auto-antilichamen in de nier is een grote zorg19, waar mensen met IgG2a isotype zijn geassocieerd met LN20. In het bijzonder vertonen anti-dsDNA-antilichamen meer pathogeniciteit en affiniteit met nucleaire materialen en vormen ze immuuncomplexen21. Wanneer IgG2a aanwezig is, wordt de complementcascade, inclusief C3, geactiveerd om de immuuncomplexen te verwijderen22. De C3- en IgG2a-markers kunnen afzonderlijk worden gekwantificeerd of eroverheen worden gelegd om hun correlatie vast te stellen.
Met name serumcreatininemeting is een andere betrouwbare techniek die samen met microscopische hematurie en nierbiopten kan worden gebruikt om LN23 te diagnosticeren. De aanwezigheid van proteïnurie is echter een sterke indicator van glomerulaire schade. In die zin kan het monitoren van het proteïnurieniveau tijdens lupus het begin van de ziekte detecteren en een aanvulling vormen op andere methoden voor het diagnosticeren van lupus. Bovendien kunnen immuuncomplexen die in glomeruli worden afgezet een ontstekingsreactie veroorzaken, het complementsysteem activeren en meer ontstekingscellen rekruteren. Een ander opmerkelijk punt van dit protocol is B-celinfiltratie in de nier. Dit, samen met de geïnfiltreerde T-cellen, versterkt lokale immuunresponsen die orgaanschade veroorzaken. Belangrijk is dat de classificatie van LN niet alleen gebaseerd is op glomerulaire morfologische veranderingen die worden waargenomen in microscopie, maar ook op immuunafzettingen waargenomen met immunofluorescentie. Daarom worden in dit protocol nauwkeurige en kosteneffectieve methoden voor de analyse van de nierfunctie aangeboden in laboratoriumomgevingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
LN is een belangrijke doodsoorzaak bij SLE-patiënten en factoren die de ziekte verergeren, blijven onduidelijk. De toepassing van dit protocol is om de nierfunctie te karakteriseren met behulp van meerdere methoden, waaronder meting van proteïnurie, FACS-analyse van geïsoleerde nierleukocyten en immunofluorescentiekleuring van bevroren niersecties.
Een belangrijk punt om te overwegen bij het verzamelen van urine is dat men consistent moet zijn met het tijdstip van de dag en de locatie van u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de Flow Cytometry Core Facility, het Histopathology Laboratory, het Fralin Imaging Center aan het Virginia Polytechnic Institute en de State University voor technische ondersteuning. Dit werk wordt ondersteund door verschillende NIH en interne subsidies.
Materials
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
References
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
- Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
- Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
- Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
- Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
- Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).
- Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
- Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
- Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
- Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
- Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
- Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
- Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
- Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
- Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
- Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
- van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
- Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
- Park, J. G. -., et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).
