Summary
本方案描述了一种跟踪小鼠狼疮进展的方法。提出了另外两种程序来表征基于细胞浸润和肾脏中蛋白质沉积的狼疮性肾炎。
Abstract
系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，没有已知的治愈方法，其特征是许多器官（包括肾脏）的持续炎症。在这种情况下，肾脏失去了清除血液中的废物并调节盐和液体浓度的能力，最终导致肾功能衰竭。女性，特别是育龄妇女，被诊断出的频率是男性的九倍。肾脏疾病是系统性红斑狼疮患者死亡的主要原因。本方案描述了一种快速简单的方法来测量收集的尿液中排泄的蛋白质水平，跟踪狼疮随时间的进展。此外，根据大小和密度选择，提供了一种分离肾脏单核细胞的方法，以研究白细胞的肾脏浸润。此外，已经开发了一种免疫组织化学方法来表征肾小球中的蛋白质沉积和肾小管间质空间中的白细胞浸润。总之，这些方法可以帮助研究与易患狼疮的MRL / lpr小鼠的肾脏相关的慢性炎症的进展。
Introduction
肾脏的主要功能是通过尿液消除有毒物质，同时保持水和盐的稳态1。该功能在系统性红斑狼疮（SLE）患者中受到威胁，导致所谓的狼疮性肾炎（LN）。LN是免疫系统攻击肾脏的结果，导致持续的肾脏炎症，因此失去了清除血液中废物和调节盐和液体浓度的能力。这最终将导致肾功能衰竭，这可能是致命的。在肾炎过程中，循环的B细胞，T细胞和单核细胞被招募到肾脏，分泌趋化因子，细胞因子和免疫复合物形成自身抗体。这最终导致内皮细胞损伤，膜损伤，肾小管萎缩和纤维化2。
容易出现狼疮的小鼠是一种经典的小鼠模型，表现出类似于人类SLE3的狼疮样临床体征。该模型有助于了解SLE患者死亡的主要原因之一，狼疮性肾炎（LN）4。在人和小鼠SLE中，LN的特征在于由肾沉积的免疫复合物引发的逐渐炎症，随后是补体激活，炎症细胞募集和肾功能丧失5。免疫复合物沉积是内在肾细胞诱导趋化因子和细胞因子产生的第一步，其通过招募免疫细胞6来扩展炎症反应。目前的方案提出了几种跟踪肾脏疾病进展的技术，分析细胞浸润和免疫复合物沉积。
每周收集的尿液可以检测和可视化狼疮发作之前、期间和之后的蛋白尿病程。蛋白尿作为生物标志物可以决定LN的生物学进展。该技术的其他优点是它是非侵入性的，具有成本效益的，并且易于实施7。当肾脏完美工作时，蛋白尿水平始终很低;然而，在MRL / lpr小鼠中，在8-9周龄后，观察到蛋白尿水平的逐渐增加，最终高到足以引起肾功能衰竭8。市面上有多种试剂条和比色试剂来监测问题。然而，Bradford测定在确定蛋白尿的发作和狼疮性肾炎的病程方面是廉价且非常准确的。该测定速度快，试剂不受样品中可能存在的溶剂、缓冲液、还原剂和金属螯合剂的影响9，10，11。
要考虑的一个重要方面是肾脏中的细胞浸润。这些浸润通过触发可溶性因子（如细胞因子）的分泌来促进发病机制，从而加重炎症12。为了更好地了解浸润中存在哪些细胞群，一种有用的方法是分离白细胞13。这里，以检测B细胞肾浸润为例。该过程从脱氧核糖核酸酶（DNase）和胶原酶的消化过程开始，然后是密度梯度分离，以去除碎片，红细胞和致密的粒细胞。分离B细胞（CD19 +）和浆细胞（CD138 +）的原因是狼疮肾可以浓缩这些细胞14。有人认为，肾脏中小聚集体中存在B细胞可以表明克隆性扩增，从而产生免疫球蛋白（Ig）。众所周知，浆细胞也存在于这些聚集体中15。一旦分离出白细胞，荧光活化细胞分选（FACS）可用于在用不同的荧光偶联抗体染色时分析感兴趣的细胞。
免疫荧光是免疫组化（IHC）检测方法之一，允许在4μm厚的肾脏组织样品中对蛋白质进行荧光可视化。其他IHC检测方法取决于分析物的性质、结合化学和其他因素16。免疫荧光是一种快速鉴定方法，可将抗原暴露于用特定荧光染料（或荧光染料）标记的对应抗体中。当激发时，它产生荧光显微镜可以检测到的光。该技术可用于观察补体C3和IgG2a17的沉积。过量的补体级联激活可能与不受控制的免疫反应和功能丧失有关18.肾脏中抗双链DNA（抗dsDNA）自身抗体的免疫沉积是一个主要问题19，其中具有IgG2a同种型的抗体与LN20相关。具体而言，抗dsDNA抗体对核材料表现出更多的致病性和亲和力，形成免疫复合物21。当存在IgG2a时，包括C3在内的补体级联反应被激活以清除免疫复合物22。C3和IgG2a标记可以单独量化或叠加以建立其相关性。
值得注意的是，血清肌酐测量是另一种可靠的技术，可以与显微镜下血尿和肾活检一起使用来诊断LN23。然而，蛋白尿的存在是肾小球损伤的强烈指标。从这个意义上说，监测狼疮期间的蛋白尿水平可以检测疾病发作并补充其他诊断狼疮的方法。此外，沉积在肾小球中的免疫复合物可以诱导炎症反应，激活补体系统，并招募更多的炎症细胞。该协议的另一个值得注意的点是B细胞浸润在肾脏中。这与浸润的T细胞一起放大了引发器官损伤的局部免疫反应。重要的是，LN的分类不仅基于显微镜下可见的肾小球形态变化，还基于免疫荧光观察到的免疫沉积物。因此，在该协议中，在实验室环境中提供了用于分析肾功能的准确性和成本效益的方法。
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Protocol
本议定书由弗吉尼亚理工大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。由于狼疮病在女性中的发病率较高，因此仅使用雌性MRL / lpr小鼠。样本采集从4周龄开始，15周结束。小鼠是从商业来源获得的（参见 材料表），并按照机构指南在特定的无病原体环境中繁殖和维护。
1. 蛋白尿试验
- 按照以下步骤收集尿液。
- 通过喷洒70%乙醇对罩进行灭菌。在表面上放置无菌塑料片。准备吸头，1.5 mL管和移液器以收集约20μL液体。
注意：吸头和试管必须是无菌的，没有任何预处理。 - 取笼子并喷洒70%乙醇，然后将其放入罩内。
- 用一只手握住鼠标，用另一只手从上到下轻轻按摩腹侧区域。
- 使用1.5 mL管或移液管直接收集尿液，或者如果样品滴落，则从塑料片中收集尿液。对每个样品使用干净的手套、床单和吸头。
注意：如果这不起作用，请使用无菌烧杯隔离小鼠，然后在小鼠小便后从烧杯中收集尿液。 - 将鼠标放回笼子里。取出另一个鼠标并重复步骤 1.1.3-1.1.4。
注意：收集每只小鼠的样品后，始终用70%乙醇清洁塑料片和烧杯。每组至少需要五只小鼠才能具有统计学意义。尿液样品可以在-80°C下储存，直到使用长达12个月。
- 通过喷洒70%乙醇对罩进行灭菌。在表面上放置无菌塑料片。准备吸头，1.5 mL管和移液器以收集约20μL液体。
- 通过布拉德福德方法量化蛋白质24。
- 通过将尿液样品，白蛋白标准品和布拉德福德试剂保持在冰箱外10-20分钟，使它们达到室温（RT）。
注意：布拉德福德试剂和白蛋白标准品包含在市售试剂盒中（参见 材料表）。白蛋白标准的起始浓度为2毫克/毫升。连续稀释（1：2六次）必须用水完成。 - 将布拉德福德试剂加入96孔板（200μL /孔），未稀释。
- 每孔移取5μL未稀释的尿样，并使用吸头上下移液几次以正确混合。
- 添加标准品（400、200、100、50、25、12.5 mg/dL）一式两份。留下几口井作为空白。
注意：样品和标准品的添加需要快速完成。 - 让它在室温下静置5-10分钟。
- 根据制造商的协议，在读板器中读取595 nm处的板（参见 材料表）。
- 通过将尿液样品，白蛋白标准品和布拉德福德试剂保持在冰箱外10-20分钟，使它们达到室温（RT）。
2. 肾细胞的分离
- 在腔室中用CO2 （流速：30%-70%体积/分钟，以实现无意识或死亡）对小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位。继续进行解剖以收集两个肾脏。将一个半肾脏放入冰冷的C10培养基中。将另一半肾脏放入OCT（步骤3.1.1）。
注意：C10由RPMI 1640制成，并辅以10%胎牛血清，1 mM丙酮酸钠，1%100x MEM非必需氨基酸，10 mMHEPES，55μM 2-巯基乙醇和100 U / mL青霉素 - 链霉素（见 材料表）。 - 将肾脏切成粒度（1-2mm3 块），并在含有1mg / mL胶原酶和0.2mg / mL DNase I（见 材料表）的5mL消化缓冲液中在RPMI 1640培养基中消化10 mmol / L HEPES，在37°C下连续温和摇动。
注意：在无菌的2 mL管中加入1 mL消化缓冲液，并使用无菌剪刀切碎肾脏。 - 加入10 mL含有10mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1x冰冷PBS，并在冰上孵育10分钟。然后将悬浮液涡旋两次。
- 通过100μM过滤器过滤细胞悬浮液，并用10mLHBS满溶液洗涤。
注意：HBSS-full含有5百万的EDTA，0.1%的BSA和10百万的HEPES。 - 在室温下以350× g 离心10分钟。
- 准备 30%、37% 和 70% 的等渗珍珠 （SIP） 溶液。
注：将 1 份体积为 10 倍 PBS 的容量和 9 份体积的珍珠岩混合在一起，以制备 SIP（参见 材料表）;使用全口径将 SIP 稀释至 30%、37% 和 70%SIP。 - 将细胞重悬于 5 mL 30% SIP 中，并装载 37% 的 5 mL（顶部）和 70% 的 5 mL（底部），用糊状移液管缓慢地进行 SIP 梯度。
- 用Up9 down0（或制动0）在室温下以1000× g 离心30分钟。
- 从37%-70%界面收集白细胞，并将其重悬于5 mL C10中。
- 在4°C下以350× g 离心10分钟。
- 将细胞沉淀重悬于3mL FACS缓冲液中。细胞已准备好进行流式细胞胞浆细胞系统染色。
注意：FACS缓冲液含有1x PBS和0.1%牛血清白蛋白（BSA）。 - 在4°C下以350× g 离心5分钟，弃去上清液（SN），留下约50μL。
注意：要除去上清液，请小心地将溶液倒入或移液远离固体，或使用半自动真空吸出上清液。 - 每管加入50μLFcR块（见 材料表）（在1x PBS中预稀释1/50）;混合并在黑暗中的冰上孵育10分钟。
- 加入2毫升FACS缓冲液进行洗涤。
- 在4°C下以350× g 离心5分钟，弃去SN，留下约50μL。
- 加入20μL适当的荧光染料（用1x PBS稀释1/100，参见 材料表），并在冰上静置15-30分钟。
- 每管加入50μL抗体15 混合物：CD138-BV711（1x PBS中的1/200）和CD45-AF700（1x PBS中的1/200）（参见 材料表）。
- 在黑暗中在冰上孵育15-30分钟，并加入3mL FACS缓冲液。
- 在4°C下以350× g 离心5分钟，留下约50μL。现在可以通过流式细胞术进行分析。
3. 免疫荧光染色
- 执行示例收集。
- 将半肾嵌入具有最佳切割温度（OCT）化合物的小塑料冷冻模具中（参见 材料表）。
- 将干冰加入聚苯乙烯泡沫盒中（见 材料表），然后小心地将冷冻冻膜放在干冰上。确保冷冻模具平放。
注意：OCT化合物需要3-4分钟才能固化并变白。 - 取出冷冻模具，用铝箔包裹。将其储存在-80°C直至进一步使用。
注意：这可以在-80°C下储存至少1年。
- 对样品进行切片和固定。
- 将样品切成4μm切片，等待至少2-3小时干燥，然后用冷丙酮（在4°C）固定10分钟。
注意：使用丙酮时要小心，这需要专门的化学罩。 - 固定载玻片后，风干0.5-1小时，并在-20°C下短时间储存，或在-80°C下长时间储存。
- 将样品切成4μm切片，等待至少2-3小时干燥，然后用冷丙酮（在4°C）固定10分钟。
- 对样品进行染色。
- 将载玻片重新放入冷丙酮中5-10分钟。
- 让切片升温至室温，在切片周围使用 PAP 笔（参见 材料表）并使其干燥。
注意：也可以使用指甲珐琅。此步骤可防止抗体稀释液漂浮在载玻片上。 - 将载玻片放入Coplin罐中的1x Tris缓冲盐水（TBS）中（参见 材料表）20分钟，将罐子放在摇摇杯上，轻轻摇动。
- 倒出1x汤匙，在罐子里装满1x汤匙，5%BSA和0.1%吐温20。在摇摇杯上孵育20分钟，轻轻摇匀。
- 取出载玻片，擦干载玻片底部。如有必要，摇干载玻片。向该部分加入100μL偶联抗体25 C3-FITC（1/100）和IgG2a-PE（1/100）（见 材料表）。在室温下在加湿室中孵育1小时。
- 在摇摇床上以1x TBS，5%BSA和0.1%吐温20洗涤切片3次，持续10分钟。
- 摇干载玻片，然后用抗淬灭试剂（参见 材料表）安装切片，然后用盖玻片安装切片。
- 将载玻片储存在4°C直至在显微镜下观察（例如，共聚焦显微镜或成像系统显微镜）。使用软件量化图像，并在比较区域之间的荧光强度时减去背景信号。
- 对于使用ImageJ软件进行图像分析（参见 材料表），请勾勒出所需区域。
- 通过单击“ 分析”来设置标准参数，然后单击 “设置测量 值”和 “测量面积” 以获取结果。
- 将从测量窗口获得的数据传输到电子表格。
注意：可以从图像中选择一个小区域作为背景;它不应该有任何荧光。 - 完成后，单击“ 分析 ”以测量区域，然后再次将数据传输到上一个电子表格。
- 对多个区域重复步骤 3.3.11-3.3.12。
- 将平均荧光计算为校正细胞荧光（CCF）=积分密度-（所选细胞区域x平均背景荧光）。
- 使用绘图和统计软件计算每个区域并分析数据（参见 材料表）。
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Representative Results
该方案使用多种方法来评估狼疮性肾炎的MRL / lpr小鼠。首先，描述了一种程序来研究由于肾功能障碍而引起的蛋白尿水平随时间增加。如图 1所示，雌性小鼠以口服强饲法200μL磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）作为对照组，益生菌 罗伊氏乳杆菌 作为治疗组，浓度为109 cfu / mL，每周两次。治疗从3周龄开始，到15周龄结束。用 罗伊氏乳杆菌 治疗的小鼠组比对照组具有更积极的蛋白尿进展。
图1：随着时间的推移检测MRL / lpr小鼠尿液中的蛋白质水平。 使用简单的线性回归检验执行统计。*P < 0.05，**P < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
图2 显示了对分离的肾白细胞的FACS分析。在该实验中，用万古霉素（2g / L）或万古霉素加 大肠杆菌 dsDNA（80μg）处理小鼠。在指定的时间内，万古霉素与饮用水一起给予。在4周，5周，6周和7周龄时每周对万古霉素治疗的小鼠进行一次细菌DNA的口服强饲法，连续四周。预计 大肠杆菌 dsDNA会引发浆细胞的肾浸润，导致肾功能受损，但未发现显着差异。
图2：分析分离的肾白细胞中的浆细胞 （A）顺序门控策略：总细胞，单细胞，活细胞，CD45 + 细胞，最后是CD138 + 细胞。（B）用范（万古霉素）或范+DNA（万古霉素+ 大肠杆菌 dsDNA）治疗3周（每组5只小鼠≥后浆细胞的百分比。未观察到统计学意义（'ns'）。 请点击此处查看此图的大图。
图3 显示了补体C3和IgG2a在女性MRL / lpr肾切片上的免疫荧光染色。在该实验中，比较了环境因素对C3和IgG2a肾脏沉积的影响。内部小鼠在动物设施中繁殖了几代，并将它们与最近从供应商处购买的小鼠进行了比较。免疫组化分析没有显示不同设施之间有任何差异。
图3：通过免疫荧光染色检测肾脏切片中的补体C3和IgG2a .（A）用抗C3-FITC（绿色）和抗IgG2a-PE（红色）染色的肾脏切片的代表性图片。（B）两组（每组5只小鼠≥校正细胞荧光（CCF）的比较。比例尺 = 100 μM。未观察到统计学意义（'ns'）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
LN是SLE患者死亡的主要原因，加重该病的因素尚不清楚。该方案的应用是使用多种方法表征肾功能，包括蛋白尿的测量，分离的肾白细胞的FACS分析以及冷冻肾切片的免疫荧光染色。
收集尿液时要考虑的一个要点是，必须与一天中的时间和尿液收集的位置一致。小鼠是夜间活动的动物，因此在小鼠开始活跃之前的下午晚些时候收集最准确的样本。选择这个时间的另一个原因是MRL / lpr小鼠倾向于在晚上喝大量的水，导致尿液稀释。因此，在错误的时间收集可能会增加尿液的浓度和/或体积变异性。收集尽可能多的尿液以获得准确的结果也很重要。
布拉德福德测定法可以让我们估计出有多少蛋白质存在。它对任何SLE标志物蛋白都不具有特异性，但足以给出疾病进展的想法26。此外，与其他方法相比，这种方法具有成本效益。值得注意的是，布拉德福德测定对时间敏感。因此，必须在半小时内完成。如果等待时间过长，样本往往会具有增加的值或较高的错误结果。与用于尿液分析的商用试剂条相比，另一个好处是它提供了准确的数字，而不是尿液样本内的范围。评分条可能会给出模棱两可的结果，特别是在较高的范围内9，10，24。
对于肾白细胞的分离，第一个关键步骤是尽快进行解剖。肾细胞的活力极大地影响了随后的FACS分析的成功。当肾脏被处理时，每一步都是时间和温度敏感的。需要注意的是，DNase I和胶原酶的浓度和温度对于最大效率很重要，因为它们分别消除了DNA并允许器官分解，分别为27。第二个关键步骤是分离细胞，分为两个重要过程。第一种是使用过滤器，可以去除组织碎片;涉及Percoll的第二个过程是最关键的一步，需要专注和耐心。当使用Percoll进行密度梯度时，在不同浓度的SIP之间保持清晰的界面非常重要。建议使用巴斯德移液器，因为通量和压力可以手动控制。使用SIP解决方案的慢速分配甚至一滴一滴地可以更好地构建额外的相位。一旦建立了相位，就需要轻轻地处理管子;否则，相将立即混合，样品将丢失，因为不可能再次分离相。此外，重要的是在不断裂的情况下离心管子，因为断裂可能过于激进，导致单独相的损失。然后从30%至37%SIP之间的相间期中回收白细胞。我们在这个例子中分析了一个细胞群，浆细胞（CD45 + 和CD138 +）。然而，这种技术不仅限于B细胞;它可用于其它细胞类型和细胞内染色28。
第三种方法是可视化给定蛋白质沉积的细胞内定位的强大工具。一旦用丙酮固定组织，进行充分的洗涤很重要，因此抗体仅附着在靶标上。接下来，使用BSA进行阻断可减少非特异性结合和误报。通常建议使用直接免疫荧光，因为它比使用二抗的间接免疫荧光更快，这很耗时，特别是考虑到额外的洗涤和孵育步骤。然而，与间接免疫荧光29相比，直接免疫荧光限制了抗体选择的灵活性。因此，根据目的的不同，两者都可能是有价值的方法。此外，需要提到的是，稀释因子是IHC染色的关键。如果稀释效果不佳，显微镜图像上将显示背景增加（抗体稀释不足）或染色弱（扩张过多）。重要的是从抗体的连续稀释开始，以优化抗体浓度以获得更好的靶与背景比。要考虑的另一个步骤是抗体的孵育时间。抗体与样品接触的时间越长，可以产生越多的非特异性结合。
本方法的局限性如下。LN的某些临床参数，如白蛋白/肌酐比值，不能使用这些方法揭示。此外，一些样品可能具有较差的酸溶解度，导致高浓度读数高于标准曲线。这需要进一步稀释样品或加入表面活性剂以沉淀染料30。此外，如果肾白细胞分离后需要许多细胞，则该方案可能不适合。目前的肾细胞分离方案涉及几个洗涤步骤，消化和分离步骤，以最大限度地去除其他细胞，因此即使细胞纯度在末端很高，细胞数量通常也很低。此外，这是一个漫长的过程，因此细胞活力可能会受到影响。其他即用型检测更适合临床使用;然而，本方法可能以较小的预算为研究实验室提供准确的结果。
总之，该协议中提出了三种不同的有效和准确的技术来表征LN进展。结合布拉德福德方法对蛋白尿水平、对白细胞肾浸润的FACS分析、对IgG2a和C3肾脏沉积的IHC分析，成功建立了雌性MRL/lpr小鼠肾功能不全的清晰画面，作为人LN的模型。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢流式细胞术核心设施、组织病理学实验室、弗吉尼亚理工学院 Fralin 成像中心和州立大学的技术支持。这项工作得到了各种NIH和内部赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
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