Summary
本文解释了如何手术从活斑马鱼幼虫身上摘除眼睛，作为研究视网膜输入如何影响视神经结构生长和发育的第一步。此外，本文还提供了有关幼虫麻醉、固定和脑解剖的信息，然后是免疫组化和共聚焦成像。
Abstract
斑马鱼表现出非凡的终身生长和再生能力。例如，在胚胎发生期间建立的专用干细胞生态位支持整个视觉系统在眼睛和大脑中的连续生长。视网膜和视神经结构之间的协调生长确保了在眼睛和大脑中添加新神经元时准确的视网膜图谱图。为了解决视网膜轴突是否为调节颅骨干和祖细胞行为（如存活、增殖和/或分化）提供关键信息，有必要能够比较同一动物内和动物之间的神经支配和去神经支配的构造叶。
手术从活的幼虫斑马鱼中切除一只眼睛，然后观察视网膜，实现了这一目标。随附的视频演示了如何麻醉幼虫，电解磨钨针，并用它们去除一只眼睛。接下来，它展示了如何从固定的斑马鱼幼虫中解剖大脑。最后，该视频概述了免疫组织化学方案，并演示了如何在低熔点琼脂糖中安装染色胚胎以进行显微镜检查。
Introduction
该方法的目的是研究视网膜输入如何影响斑马鱼大脑视觉处理中心视神经技术的生长和发育。通过移除一只眼睛，然后比较视网膜的两侧，可以观察和归一化同一标本内的构造变化，从而能够比较多个标本。现代分子方法与该技术相结合，将深入了解视觉系统生长和发育以及轴突变性和再生的潜在机制。
感觉系统 - 视觉，听觉和躯体感觉 - 从外部器官收集信息并将该信息传递给中枢神经系统，生成中脑外部世界的“地图”1，2。视觉是几乎所有脊椎动物（包括许多鱼类）的主要感觉方式。视网膜是眼睛中的神经组织，它通过主要由光感受器，双极细胞和视网膜神经节细胞（RGC）组成的神经元回路收集信息，RGC是视网膜的投射神经元。RGC具有长轴突，它们穿过视网膜的内表面到达视神经头，在那里它们束曲并一起穿过大脑，最终终止于背中脑的视觉处理中心。这种结构在鱼类和其他非哺乳动物脊椎动物中被称为视技术，并且与哺乳动物的上丘脑同源3。
视神经结构是背中脑中双侧对称的多层结构。在斑马鱼和大多数其他鱼类中，视神经的每个叶仅接收来自对侧眼的视觉输入，使得左视神经终止于右构造叶，右视神经终止于左构造叶4 （图1）。像哺乳动物的对应物，上丘脑一样，视神经构造将视觉信息与其他感官输入（包括试听和躯体感觉）集成在一起，控制视觉注意力和眼球运动（如扫视1，5，6）的变化。然而，与哺乳动物上丘脑不同，视神经膜不断从称为构造增殖区7的内侧和尾部边缘附近的特化干细胞位产生新的神经元和神经胶质细胞。在视神经结构和中枢神经系统其他区域维持增殖祖细胞在一定程度上有助于斑马鱼8中记录的显着再生能力。
先前对盲人或独眼鱼大脑的研究表明，视神经结构的大小与其接受的视网膜神经支配量成正比9，10，11。在成年洞穴鱼中，其眼睛在早期胚胎发生时退化，视神经构造明显小于密切相关的目击面鱼9。洞穴鱼眼变性可以通过在胚胎发生过程中用表层鱼的晶状体替换内源性晶状体来阻止。当这些独眼洞穴鱼被饲养到成年期时，神经支配的构造叶比未支配的构造叶9含有约10%的细胞。同样，在用化学处理孵育以在同一个体内产生不同大小的眼睛的幼虫基利鱼中，具有更多神经支配的构造体的一侧更大并且包含更多的神经元10。来自成年金鱼视神经压碎实验的证据表明，神经支配促进增殖，当神经支配被破坏时，构造细胞增殖减少11。
证实并扩展了这些经典研究，最近的几份报告提供了数据，表明响应神经支配的增殖至少部分受到BDNF-TrkB途径12，13的调节。关于视神经构造细胞生长和发育的许多悬而未决的问题仍然存在，包括发育中的感觉系统如何应对损伤和轴突变性，哪些细胞和分子信号使视网膜输入能够调节视神经构造的生长，当这些机制变得活跃时，以及神经支配相关的增殖和分化是否使视网膜及其靶组织能够协调生长速率并确保准确的视网膜学映射。此外，关于活动依赖性发育还有更大的问题，可以通过用外科手术方法询问斑马鱼视觉系统来解决，如下所述。
为了研究神经活动（特别是来自视觉输入）改变细胞存活和增殖的细胞和分子机制，所述方法直接比较单个斑马鱼幼虫内神经支配和去神经支配的构造叶（图1）。该方法允许记录视神经组织中RGC轴突变性，并确认有丝分裂细胞的数量与神经支配相关。
图1：单侧取眼前后斑马鱼幼虫的草图。 （A）在解剖显微镜下观察的5 dpf幼虫的图纸。每个幼虫都嵌入低熔点琼脂糖中，并横向定向，然后使用带有锋利钩状尖端的钨针将眼睛朝上舀出（在本例中为左眼）。（B） A中描述的手术产生的9 dpf幼虫的背视图图。只有来自右眼的三个高度模式化的RGC轴突显示脱发并与左脑叶中的神经元连接。缩写：dpf = 受精后的天数;dps = 手术后天数;RGC = 视网膜神经节细胞。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
本文中的方法是根据里德学院和伦敦大学学院的机构动物护理和使用委员会的指南和批准的。有关本研究中使用的斑马鱼品系的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 准备材料和工具
- 制定解决方案。
- 通过将60x储备液（300mM NaCl，10.2mM KCl，20mM CaCl 2-二水合物和20mM MgCl2-六水合物）稀释在去离子水中，高压灭菌并在室温下储存来制作胚胎培养基（E314）。加入160毫升60x E3到10升去离子水中。在室温下储存。
- 在E3中制造1%低熔点（LMP）琼脂糖。将1克LMP琼脂糖溶解到100毫升E3中，在微波炉中以高功率煮沸1-2分钟。将熔融琼脂糖等分试样放入1.7mL微量离心管中，并储存在4°C。 在水浴中煮沸，并在准备用于包埋时保持在40°C的加热块中。
- 通过稀释10x储备液（1 M NaCl，20 mM KCl，10 mM MgSO4，20 mM CaCl2-二水合物，50 mM HEPES，pH调节至7.5，10 M NaOH，然后高压灭菌，并在室温下储存）来制作Marc的改性Ringers（MMR 15）等渗溶液。向 90 mL 去离子水中加入 10 mL 10x MMR。
- 按照制造商的说明倒入Sylgard板，让它们凝固并干燥数天16。
- 电解磨钨针（协议从 17修改）。
- 首先，通过将200 mL去离子水加入带有螺旋盖的宽口玻璃罐中来制备10%（w / v）KOH溶液。慢慢搅拌20克KOH沉淀。
注：该腐蚀性溶液具有高放热性。戴上手套和护目镜，并在引擎盖中搅拌溶液。 - 切割2-3厘米长的钨丝并将其插入针座。
- 将阴极和阳极线连接到电源。将阴极线末端的鳄鱼夹连接到部分拉直的回形针上，然后将回形针插入KOH溶液中，将其连接到罐子的侧面。
- 接下来，将阳极线的鳄鱼夹连接到针座的颈部。打开电源（至~20 V），并将钨丝浸入KOH溶液中，以一定角度将导线从溶液中拉出，以电解方式将导线锐化成细尖。
注意：随着反应的进行，回形针会冒气泡。 - 在解剖显微镜下检查针尖，以确保其足够锋利。
- 用去离子水冲洗针头以除去所有KOH残留物。提前打几针，直到幼虫手术和解剖。
- 首先，通过将200 mL去离子水加入带有螺旋盖的宽口玻璃罐中来制备10%（w / v）KOH溶液。慢慢搅拌20克KOH沉淀。
- 制作腔室载玻片，用于用直立共聚焦显微镜对斑马鱼标本进行成像。
- 获得玻璃显微镜载玻片和双组分环氧树脂（见 材料表）。根据包装上的说明混合环氧树脂，并在载玻片上涂上厚厚的环或矩形。使用前让载玻片固化并在罩中干燥至少24小时。
2. 胚胎采集和饲养
- 在傍晚/傍晚时分，在繁殖箱中配对所需基因型的成年雄鱼和雌鱼。第二天早上，在它们产卵后，用网状过滤器收集新受精的卵，并将它们转移到100毫米培养皿中的E3中。
- 将胚胎在〜27.5°C下孵育，光照14小时/ 10小时黑暗循环，直到手术当天。每天或根据需要更换 E3。
- 每天使用装满收获的轮虫的滴管喂养幼虫，每天一次，从受精后5天（dpf）或手术后一天开始。幼虫有几个小时吃完后，更换E3以清除任何剩余的轮虫和废物。
注意：不要在手术当天喂幼虫。
3. 为手术准备幼虫
- 在手术当天，使用宽口径玻璃巴斯德移液管将10-15只幼虫转移到装有新鲜E3的35毫米培养皿中。
- 通过向培养皿中加入3-5滴0.4%w / v三卡因溶液（0.4g三卡因溶解在210mM Tris中，pH 9;如果需要，最终溶液调节至pH值为7.418）来麻醉幼虫，最终浓度为〜0.0015%w / v三卡因。寻找对触摸缺乏反应，以确定幼虫是否得到充分麻醉。如果他们在〜3分钟后仍然对触摸有反应，再加入2-3滴0.4%w / v Tricaine溶液并重新评估。
注意：在这个发展阶段，除了在解剖显微镜下的运动性外，还可以监测血流量和心率。 - 通过将麻醉斑马鱼幼虫嵌入溶解在E3中的1%LMP琼脂糖中来固定它们。
- 首先，将35毫米培养皿的盖子面朝上放在解剖显微镜下。接下来，将一只幼虫放入只有少量E3的窄孔玻璃巴斯德移液器中。
- 然后，将〜200μL熔化的温（〜40°C）1%LMP琼脂糖与幼虫一起吸入移液器中。最后，将幼虫和琼脂糖喷到倒置的培养皿盖上。
- 使用钝的钨针快速但轻轻地操纵幼虫，使其横向，一只眼睛朝上。等待琼脂糖凝固（约5分钟）。
注意：如果琼脂糖在幼虫不是横向时变硬，请将其从琼脂糖中释放出来（如步骤5中所述），并将其与E3和三卡因一起返回到培养皿中。
4. 摘除眼睛
- 一旦琼脂糖被设置，并且幼虫被横向定位，使用非常细的，电解磨的钨针的尖端沿着眼眶的边缘刺穿眼睛周围的皮肤。
- 接下来，从眼睛的颞腹侧将针的边缘（而不是尖端）滑到眼睛下方。使用受控压力将眼睛从眼窝中释放出来。
- 使用非常精细的手术镊子通过捏住视神经并将眼睛从内侧推到外侧来移除眼睛。或者，只需继续用针的侧面向背侧和前部按压眼睛，最终切开视神经并释放眼睛。
注意：如果在手术过程中意外刺伤了眼睛以外的组织，请通过快速斩首快速人道地杀死幼虫。
5. 术后护理直至实验终点
- 成功切除眼睛后，用MMR溶液覆盖琼脂糖。
- 通过将钨针轻轻地刷在头部周围，然后在身体周围，同时用镊子稳定培养皿盖，将每个幼虫从琼脂糖中释放出来。
- 将独眼幼虫转移到含有MMR的35毫米培养皿中，并补充1：100稀释的青霉素/链霉素鸡尾酒。将胚胎在〜27.5°C下孵育，光照14小时/ 10小时黑暗循环。
注意：这种补充有抗生素的MMR等渗溶液最初有助于幼虫愈合和生存。每道菜最多可容纳15只恢复幼虫。 - 第二天，将幼虫送回E3。从手术后的下午开始，每天一次使用装满收获的轮虫的滴管喂养幼虫（〜6 dpf及以上）。幼虫吃完几个小时后，更换E3以清除任何剩余的轮虫和废物。
6. 固定幼虫
- 一旦幼虫达到所需的发育阶段进行分析，用致命剂量的三卡因（约0.4%最终浓度）麻醉它们，直到它们的心脏停止。
- 每1.5 mL微量离心管移液至30个幼虫。除去多余的E3，然后加入0.5-1mL固定溶液（4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中）以固定组织。将幼虫在4°C下孵育过夜。
- 第二天用PBS清洗幼虫，方法是去除固定剂并用PBS冲洗幼虫3-4次。在解剖前将幼虫在4°C下储存长达7天。
7.解剖幼虫以揭示大脑（改编自 15）
- 将固定的幼虫悬浮在解剖显微镜下的Sylgard板上的PBS液滴中。通过将两个钨针（通常是小于2厘米的旧钨针）穿过套管来横向固定它们，其中一个针位于覆盖主动脉 - 性腺 - 中胚层（AGM）区域的色素区域的后面，另一个与卵黄延伸的末端对齐。
注意：尽可能少地尝试放置钨针，因为每次穿刺都会使组织变得更加易碎。 - 使用非常锋利的钨针和针锋利的镊子，按此顺序去除眼睛，耳朵，下颌，消化道和颅背皮肤，从而暴露大脑。
- 首先，使用类似于步骤4中的手术切除眼睛的技术去除眼睛。然后，解开幼虫并将其翻转到另一侧，以便另一只眼睛可以接近并重复。或者，将针头穿过下颌戳到另一侧，并在不松开的情况下取出眼睛。
注意：如果需要对这种组织进行分析，此时可以收集眼睛（类似于 19）。 - 接下来，使用钨针从耳朵的颞侧到腹侧划伤。在相同的动作/动作中，将针头向后带到下颌，轻轻地向前拉动，直到耳朵和下颌被移除。
- 使用镊子将腹侧器官和任何剩余的蛋黄拉出。
- 最后，在后脑和脊髓交界处附近的背颅皮肤上做一个浅切口。用镊子抬起皮肤，将其拉至端脑前部和周围。如果这被证明太困难，从后脑的初始切口开始，首先横向拉动皮肤，然后腹侧和前部，注意不要划伤构造的侧缘。
注意：由于中脑是研究对象，因此后脑可以切割;然而，深切口可能导致斩首。 - 用镊子去除任何剩余的组织。解开幼虫并转移到1.5 mL微量离心管中的PBS。
注意：将尾部附着在大脑上，以便在执行全挂载协议时获得更好的可见性。
- 首先，使用类似于步骤4中的手术切除眼睛的技术去除眼睛。然后，解开幼虫并将其翻转到另一侧，以便另一只眼睛可以接近并重复。或者，将针头穿过下颌戳到另一侧，并在不松开的情况下取出眼睛。
8. 大脑脱水和储存
- 从大脑中取出PBS，加入1毫升含有0.1%TritonX-100（PBST）的PBS。在室温下孵育5-10分钟。
- 取出 PBST，并用 50：50 甲醇：PBST 溶液替换。在室温下孵育5-10分钟。
- 在室温下用100%甲醇（MeOH）清洗大脑两次，每次5分钟。
- 在进行免疫组化或其他全装程序之前，将大脑在-20°C的100%MeOH中储存至少16小时。
注意：大脑可以在-20°C下在MeOH中储存长达2年。
9. 免疫组化
注意：在ZFIN20上可以找到斑马鱼中许多有用的全挂技术已建立的协议。本手稿提供了比较单眼和双眼幼虫的例子，这些幼虫被免疫染色，这些抗体识别红色荧光蛋白（RFP），其在 Tg[atoh7：RFP] 系的视神经轴突中表达（图2），或磷酸化的组蛋白H3（PH3），其突出了有丝分裂细胞（图3）。下面总结了全山胚胎和幼虫的标准免疫组化方案。
- 首先，通过在50：50 MeOH：PBST中孵育标本5分钟，然后在30：70 MeOH：PBST中孵育5分钟，并在室温下用分级的MeOH：PBST洗涤系列对幼虫大脑进行再水化，最后在30：70 MeOH：PBST洗涤5分钟，最后洗涤PBST。
- 为了使大脑透化，将它们在PBST中孵育，补充有蛋白酶K（PK），最终浓度为20μg/ ml PK，在37°C下孵育30分钟。 将10mg / mL PK的等分试样储存在-20°C下，并在使用前解冻。
- 除去PK溶液，并通过在15分钟内用PBST冲洗大脑3次来洗去任何剩余的酶。
- 通过在25°C（或室温）下在4%PFA中孵育20分钟来重新调整透膜稳定的大脑。然后，除去PFA，并用PBST在15分钟内冲洗大脑3次，洗去任何剩余的固定剂。
- 用新鲜制作的免疫阻滞（IB）缓冲液（10%正常山羊血清和1%DMSO在PBST中）替换最终的PBST冲洗液，并在室温下孵育至少1小时。
- 以适当的浓度（例如，RFP 为 1：500， PH3 抗体为 1：300）将一抗稀释到 IB 缓冲液中。
- 从大脑中取出IB缓冲液，并用一抗稀释液代替。在4°C下在轨道振荡器上孵育过夜，轻轻摇动。确保管子牢固地放在侧面。
- 第二天早上，用微量移液管取出一抗溶液，在PBST中冲洗几次，然后在室温下用PBST清洗大脑4×30分钟。
注意：如果储存在4°C下，一抗稀释液可在约7天内重复使用一次。 - 在IB缓冲液中冲洗大脑，同时以适当的浓度将二抗稀释到IB缓冲液中（例如， Alexa-fluor 568抗兔为1：500）。
- 取出IB缓冲液并用二抗稀释液替换。在4°C的轨道振荡器上孵育过夜，轻轻摇动位于其侧面的管。
- 第二天早上，取出二抗溶液，用PBST冲洗，然后在室温下用PBST清洗大脑4×30分钟。
- 用4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI）或ToPro3（4°C过夜PBST中的1：5，000）复染。
- 第二天早上，将幼虫的大脑转移到PBS中，然后进行下面列出的安装和成像步骤。
10. 安装和成像
- 用真空润滑脂将腔室载玻片固定在100毫米培养皿的盖子中。
- 将免疫染色和处理的幼虫转移到孔板或凹陷载玻片上，用解剖显微镜观察它们。
- 将幼虫安装在腔室载玻片上，在1%LMP琼脂糖的柱中。
- 使用玻璃巴斯德移液器，将一个幼虫放在腔室载玻片上，尽可能少地沉积PBS。用相同的移液器，用熔融的1%LMP琼脂糖（〜40°C）覆盖幼虫。
- 用钝钨针或镊子将琼脂糖拉入柱中，然后尽可能对称地定位幼虫，背表面可见。
- 对剩余的幼虫重复此过程。
- 琼脂糖凝胶化后，用几滴PBS覆盖它，然后将其放在共聚焦显微镜的载物台上。
- 将物镜与样品对齐，使用透射光聚焦显微镜，并用适当的激光照亮样品。
注意：在本例中，分别使用405 nm和568 nm波长来激发DAPI和RFP。 - 通过将滑块移动到相对于信号和所用检测器的适当电平来调整增益、偏移和激光功率。检查每个通道的直方图，然后单击图像上方 的饱和状态指示器 按钮以测量曝光水平，确保没有像素饱和并且信噪比很高。有关斑马鱼内细胞和亚细胞分辨率的最佳共聚焦成像参数的示例，请参见 21。
- 通过使用鼠标上的滚轮查找样品的顶部和底部，设置 z 平面堆栈的上限和下限。单击图像采集的最高和最低限制，然后通过单击 立即运行 按钮触发 z 堆栈捕获。
注意：根据大脑的对称安装方式，9 dpf幼虫斑马鱼大脑的总z深度约为150-200μm。 - 在考虑色盲可访问性的情况下处理和着色图像（例如，对双色图像使用蓝色和橙色或洋红色和绿色）。在用于捕获图像的软件或图像处理软件（如 Adobe 的 Photoshop）中设置查找表。
- 在 Photoshop 中，彩色 Raw 显微照片保存为 8 位标记图像文件格式 （TIFF），方法是 （i） 将“图像模式”转换为 RGB，以及 （ii） 访问“图像”下的“ 曲线 ”选项 |调整 菜单，然后（iii）将适当的彩色光输出滑动到0或255级，以达到所需的颜色。例如，要实现 绿色信号，请选择 红色通道 并将其输出滑动到 0;然后，选择 蓝色通道 并将其输出也滑动到 0 。同样，要获得 洋红色信号，请选择 绿色通道 并将其输出滑动到 0;保持红色和蓝色通道不变。
注意：类似的步骤可以在免费的 Gnu 图像处理程序 （GIMP） 中执行。 - 使用 ImageJ22 中的单元格计数器插件手动量化显示特定标记的单元格的数量，该插件位于“插件”菜单中的“ 分析 ”下。有关如何使用ImageJ进行细胞计数的示例可以在许多教程中找到，其中包括 23个教程。
- 在统计软件（如 RStudio）中生成数据的图形表示形式（请参阅 的补充数据。Rmd 文件）。
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Representative Results
为了确认眼睛切除是否完整并评估视神经结构如何变化，在 Tg[atoh7：RFP] 菌株中进行了手术，该菌株用膜靶向RFP标记所有RGC，从而标记从视网膜投射并形成视神经的所有轴突24。虽然使用这种菌株不是绝对必要的，但它可以直接观察和可视化视神经桥神经瘘中的视神经末端。标记视神经的其他方法，例如用亲脂性DiI或DiO染料25，26 或用脑弓27标记多光谱标记轴突示踪也是可能的。
如图 2所示，切除眼睛后观察到视神经桥神经疙膜中视网膜轴突的进行性变性。手术后两天，RFP标记的轴突表现出快速Wallerian变性的标志28 ，例如出血和碎片（图2A，B）。最近的研究表明，当神经元沉默时，小胶质细胞会吞噬更多的髓鞘物质29。与小胶质细胞吞噬退化的RGC轴突并远离退化源一致，注意到构造神经针内外明亮的RFP标记的点状突起（图1B，箭头）。手术后四天，任何一个颅脑叶中破碎的轴突和RFP标记的轴突碎片都大大减少，表明垂死和退化轴突的清除速度相对较快（图2C，D）。
为了进行全山免疫组织化学并可视化斑马鱼幼虫的视网膜，通过剖析皮肤和结缔组织的眼睛，下颌，耳朵和颅盖来暴露大脑。理想情况下，大脑在该过程中保持完整（例如， 图2C，D）。然而，当皮肤或下颌的颅盖被移除时，前脑的某些部分，特别是嗅球，可能会被损坏或完全移除（图2A，箭头）。此外，有时在刺穿或捏住皮肤以将其从大脑上拉下来时，可以切开构造的外缘（例如， 图2A;右颅叶撕裂）。
免疫组织化学还用于通过用PH3抗体染色整个大脑来评估视神经支配和非神经支配的叶中的有丝分裂细胞数量。这些数据显示，单眼幼鱼去神经化的一侧的有丝分裂细胞明显较少（p = 0.00033，韦尔 奇t检验; 图 3）。
图 2：在 5 dpf 下切除眼睛会触发视神经轴突变性。 （A-D）具有代表性的最大强度投影显示固定在7 dpf （A）或9 dpf （C）下的完整幼虫的野生型大脑的背侧视图，或来自5 dpf，固定2 dps（B）或4 dps（D）的眼灭痂手术的单眼幼虫。所有细胞核都用DAPI（绿色）染色，终止于视神经结构神经疝的视神经轴突由atoh7：RFP转基因（洋红色）标记。星号表示幼虫中神经支配的构造神经疽，只有右眼完好无损。箭头表示从去神经化光学构造发出的退化的RGC轴突碎片的例子。箭头表示前脑缺失部分。比例尺 = 50 μm。缩写：dpf = 受精后的天数;dps = 手术后天数;RGC = 视网膜神经节细胞;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的大图。
图3：视组织中有丝分裂细胞的数量随着神经支配而增加。（A-B）代表最大强度投影显示了野生型大脑的背侧视图，这些大脑来自完整（A）或单眼（B）9 dpf幼虫，免疫染色有丝分裂标志物PH3（洋红色）的抗体和用DAPI复染的细胞核（绿色）。星号表示来自完整右眼的神经支配的构造神经疙。（C）覆盖所有单个数据点的箱形图，显示支配（左）与去神经支配（右）构造叶中PH3 +细胞比例的定量，作为单眼（n = 12）和双眼（n = 8）9 dpf幼虫的差异比（左 - 右/总）。两个条件的均值与韦尔奇 t 检验的比较（***，p < 0.0005）。比例尺 = 50 μm。缩写：dpf = 受精后的天数;dps = 手术后天数;PH3 = 磷酸化组蛋白 H3;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的大图。
补充文件：图 3C所示的图示轮廓和说明。 此文件包含所有数据和代码，因此任何人都可以在叠加所有数据点的情况下重现箱形图，如图 3C 所示。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文中描述的技术说明了研究斑马鱼脊椎动物视觉系统发育的众多方法之一。其他研究人员已经发表了解剖胚胎视网膜并进行基因表达分析的方法19 或可视化视神经结构30中的神经元活动。本文提供了一种探索视网膜差异输入如何影响视神经组织中细胞行为的方法。
为了确保手术后成功消灭眼部和幼虫存活，重要的是幼虫健康，充分麻醉，并在1%琼脂糖中固定。同样重要的是，镊子和钨针必须非常锋利和干净。幼虫在手术前后24小时未喂食时存活率最高，并且在补充抗生素的MMR中饲养幼虫可加速愈合过程。重要的是，MMR的更高离子强度，特别是较高浓度的钙促进愈合14。然而，长时间暴露于较高盐度会降低存活率，类似于胚胎斑马鱼31中记录的情况。最关键的一步是固定以确保成功的脑解剖，这对于免疫染色样品图像的数据分析至关重要。使用新鲜制作的4%PFA补充4%蔗糖（亲切地称为甜味修复）往往会增加皮肤去除和脑组织保存的便利性。与手术一样，锋利干净的工具是解剖大脑的必备条件。
该方案的最大挑战之一是嵌入幼虫进行眼部灭绝。重要的是，每个人都要找到最适合他们的方式，这样他们才能自信而迅速地去除幼虫的眼睛。如果幼虫在手术过程中被意外刺伤，请人道地将其斩首杀死。另一个挑战是确定全山免疫染色最有效的抗体浓度。在确定适当的抗体浓度时，使用已发表的文献作为起点并优化方案，因为在不同组织（特别是在较大的组织或老年动物上）上使用已发表的试剂可能需要增加浓度和/或孵育时间。
这种方法的主要限制是单个实验从开始到结束所需的时间以及在任何给定时间可以研究的鱼的数量。例如， 图3 所示的所有数据从最初的鱼类配对到最终的数据收集和分析大约需要一个月的时间。这种相对低通量的方法可以通过异源遗传方法进行补充，这些方法要么选择性地沉默视觉系统32，33 中的神经活动，要么由缺乏RGC轴突或活性34，35的突变体来补充。
这种方法的意义在于，它带来了传统的胚胎学技术，可以对同一个体内每个构造裂片中起作用的细胞和遗传机制进行直接比较。此外，这种方法已经成熟，可以应用于其他实验系统，包括 Astyanax 表面鱼36 和/或转基因斑马鱼幼虫与荧光标记的小胶质细胞37，38，39 和星形胶质细胞40 ，以研究发育中的鱼类神经系统如何对这种戏剧性的伤害作出反应。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作的资金主要由里德学院到KLC的启动资金，海伦斯塔福德研究奖学金基金到OLH，以及里德学院科学研究奖学金到YK。该项目始于史蒂夫威尔逊的实验室，与人力资源部门合作，人力资源部门得到了惠康信托学生奖学金（2009-2014）的支持。我们感谢Máté Varga，Steve Wilson和Wilson实验室的其他成员对这个项目的初步讨论，我们特别感谢Florencia Cavodeassi和Kate Edwards，他们是第一个教KLC如何在琼脂糖中安装胚胎并进行斑马鱼大脑解剖的人。我们还感谢Greta Glover和Jay Ewing帮助组装我们的钨针磨刀设备。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation. | ||
| Fine forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae. |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions. | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. | Available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
References
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