Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Summary

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Abstract

Os zebrafish exibem notável crescimento ao longo da vida e habilidades regenerativas. Por exemplo, nichos especializados de células-tronco estabelecidos durante a embriogênese suportam o crescimento contínuo de todo o sistema visual, tanto no olho quanto no cérebro. O crescimento coordenado entre a retina e o tectum óptico garante um mapeamento retinotópico preciso à medida que novos neurônios são adicionados nos olhos e no cérebro. Para abordar se os axônios da retina fornecem informações cruciais para a regulação de comportamentos tectal e células progenitoras, como sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação, é necessário ser capaz de comparar lóbulos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e entre animais.

A remoção cirúrgica de um olho de zebrafish larval vivo seguida da observação do tectum óptico atinge esse objetivo. O vídeo que acompanha demonstra como anestesiar larvas, afiar eleticamente agulhas de tungstênio e usá-las para remover um olho. Em seguida, mostra como dissecar cérebros de larvas de zebrafish fixas. Finalmente, o vídeo fornece uma visão geral do protocolo de imunohistoquímica e uma demonstração de como montar embriões manchados em agarose de ponto de baixa fusão para microscopia.

Introduction

O objetivo deste método é investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico, o centro de processamento visual no cérebro de zebrafish. Removendo um olho e, em seguida, comparando os dois lados do tectum óptico, alterações tectal dentro do mesmo espécime podem ser observadas e normalizadas, permitindo a comparação entre vários espécimes. Abordagens moleculares modernas combinadas com esta técnica produzirão insights sobre os mecanismos subjacentes ao crescimento e desenvolvimento do sistema visual, bem como a degeneração e regeneração axonal.

Sistemas sensoriais - visuais, auditivos e somatosensoriais - coletam informações de órgãos externos e retransmitem essas informações para o sistema nervoso central, gerando "mapas" do mundo externo em todo o cérebro médio ^1,2. A visão é a modalidade sensorial dominante para quase todos os vertebrados, incluindo muitos peixes. A retina, o tecido neural no olho, reúne informações com um circuito neuronal composto principalmente por fotorreceptores, células bipolares e células gânglios da retina (RGCs), os neurônios de projeção da retina. Os RGCs têm longos axônios que encontram seu caminho através da superfície interna da retina até a cabeça do nervo óptico, onde eles fasciculam e viajam juntos através do cérebro, terminando no centro de processamento visual no cérebro dorsal. Esta estrutura é chamada de tectum óptico em peixes e outros vertebrados não-mamíferos e é homóloga ao colegiado superior em mamíferos³.

O tectum óptico é uma estrutura multicamadas bilateralmente simétrica no cérebro médio dorsal. Em zebrafish e na maioria dos outros peixes, cada lóbulo do tectum óptico recebe entrada visual apenas do olho contralateral, de modo que o nervo óptico esquerdo termina no lobo tectal direito e o nervo óptico direito termina no lobo tectal esquerdo⁴ (Figura 1). Assim como sua contraparte mamífera, o collículo superior, o tectum óptico integra informações visuais com outras entradas sensoriais, incluindo audição e somatosensação, controlando mudanças na atenção visual e movimentos oculares, como saccades ^1,5,6. No entanto, ao contrário do colículo superior mamífero, o tectum óptico gera continuamente novos neurônios e glia a partir de um nicho especializado de células-tronco perto das bordas medial e caudal dos lobos tectais chamado zona de proliferação tectal⁷. A manutenção de progenitores proliferativos no tecto óptico e em outras regiões do sistema nervoso central contribui, em parte, para a notável capacidade regenerativa documentada no zebrafish⁸.

Trabalhos anteriores examinando os cérebros de peixes cegos ou caolho revelaram que o tamanho do tectum óptico é diretamente proporcional à quantidade de inervação da retina que recebe ^9,10,11. Em peixes de cavernas adultos, cujos olhos degeneram em embriogênese precoce, o tectum óptico é visivelmente menor do que o de peixes de superfície^{9 intimamente} relacionados. A degeneração dos olhos dos peixes das cavernas pode ser bloqueada substituindo a lente endógena por uma lente de um peixe superficial durante a embriogênese. Quando esses peixes de caverna de um olho só são criados até a idade adulta, o lobo tectal inervatado contém aproximadamente 10% mais células do que o lobo tectal não inervado⁹. Da mesma forma, em killifish larval que foram incubados com tratamentos químicos para gerar olhos de diferentes tamanhos dentro do mesmo indivíduo, o lado do tectum com mais inervação foi maior e continha mais neurônios¹⁰. Evidências de experimentos de esmagamento de nervo óptico em peixes-dourados adultos indicam que a inervação promove a proliferação, com a proliferação de células tectais diminuindo quando a inervação foi interrompida¹¹.

Confirmando e ampliando esses estudos clássicos, vários relatórios recentes fornecem dados sugerindo que a proliferação em resposta à inervação é modulada, pelo menos em parte, pela via BDNF-TrkB^12,13. Muitas questões abertas sobre o crescimento e desenvolvimento do tectum óptico permanecem, incluindo como um sistema sensorial em desenvolvimento lida com lesões e degeneração do axônio, que os sinais celulares e moleculares permitem a entrada da retina para regular o crescimento do tectum óptico, quando esses mecanismos se tornam ativos, e se a proliferação e diferenciação ligadas à invasão permitem que a retina e seu tecido alvo coordenem as taxas de crescimento e garantam um mapeamento retinotópico preciso. Além disso, há questões muito maiores sobre o desenvolvimento dependente da atividade que podem ser abordadas interrogando o sistema visual de zebrafish com abordagens cirúrgicas como a descrita abaixo.

Para investigar os mecanismos celulares e moleculares pelos quais a atividade neural, especificamente a partir da entrada visual, altera a sobrevivência e a proliferação celular, a abordagem descrita compara diretamente os lobos tectal invatados e denervados (Figura 1) dentro de larvas individuais de zebrafish. Este método permite a documentação da degeneração do axônio RGC no tectum óptico e a confirmação de que o número de células mitóticas se correlaciona com a inervação.

Figura 1: Esboços de larvas de zebrafish antes e depois da remoção unilateral dos olhos. (A) Desenho de 5 larvas dpf vistas sob um microscópio dissecador. Cada larva é embutida em agarose de ponto de derretimento baixo e orientada lateralmente antes que uma agulha de tungstênio com uma ponta afiada e ligada seja usada para colher o olho voltado para cima (olho esquerdo neste exemplo). (B) Desenho da visão dorsal de uma larva de 9 dpf resultante da cirurgia retratada em A. Apenas três axônios RGC altamente esquematizados do olho direito são mostrados desfigurando e conectando-se com neurônios no lobo tectal esquerdo. Abreviaturas: dpf = dias pós fertilização; dps = dias após a cirurgia; RGC = células gânglios de retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Os métodos deste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Reed College e university College London. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre as cepas de zebrafish utilizadas neste estudo.

1. Prepare materiais e ferramentas

1. Faça soluções.
   1. Faça o embrião médio (E3¹⁴) diluindo um estoque de 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrato e 20 mM MgCl_{2-hexahidrato} em água desionizada, autoclavada e armazenada à temperatura ambiente). Adicione 160 mL de 60x E3 a 10 L de água desionizada. Armazene em temperatura ambiente.
   2. Faça 1% de baixo ponto de fusão (LMP) agarose em E3. Dissolver 1 g de LMP agarose em 100 mL de E3 fervendo no micro-ondas por 1-2 min em alta potência. Aliquot derretido agarose em tubos de microfuça de 1,7 mL, e armazenar a 4 °C. Ferva em um banho de água e segure em um bloco de calor de 40 °C quando estiver pronto para uso para incorporação.
   3. Faça a solução isotônica de Ringers Modificados da Marc (MMR¹⁵) diluindo uma ação de 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl 2-dihidrato, 50 mM HEPES, pH ajustado para 7,5 com 10 M NaOH, depois autoclavado e armazenado à temperatura ambiente). Adicione 10 mL de 10x MMR a 90 mL de água deionizada.
2. Despeje as placas Sylgard de acordo com as instruções do fabricante, permitindo que elas sequem e sequem por vários dias¹⁶.
3. Afiar eletróticamente agulhas de tungstênio (protocolo modificado a partir de ¹⁷).
   1. Primeiro, prepare uma solução KOH de 10% (w/v) adicionando 200 mL de água desionizada a um frasco de vidro de boca larga com uma tampa de rosca. Mexa lentamente em 20 g de pelotas KOH.
      NOTA: Esta solução cáustica é altamente exotérmica. Use luvas e proteção ocular, e mexa a solução no capô.
   2. Corte um fio de tungstênio de 2-3 cm e insira-o no suporte da agulha.
   3. Conecte os fios de cátodo e ânodo à fonte de alimentação. Conecte o clipe de jacaré na extremidade do fio do cátodo a um clipe de papel parcialmente endireitado e insira o clipe de papel na solução KOH, anexando-o ao lado do frasco.
   4. Em seguida, coloque o clipe do jacaré do fio ânodo no pescoço do suporte da agulha. Ligue a energia (para ~20 V) e mergulhe o fio de tungstênio na solução KOH, puxando o fio para fora da solução em um ângulo para afiar eleticamente o fio em uma ponta fina.
      NOTA: As bolhas virão do clipe de papel à medida que a reação prossegue.
   5. Verifique a ponta da agulha sob o microscópio de dissecação para garantir que ela esteja afiada o suficiente.
   6. Enxágüe a agulha com água deionizada para remover todo o resíduo KOH. Faça várias agulhas com antecedência e mantenha-as até as cirurgias larvais e dissecções.
4. Faça slides com câmara para imagens de espécimes de zebrafish com um microscópio confocal vertical.
   1. Obtenha slides de microscópio de vidro e resina epóxi em duas partes (veja a Tabela de Materiais). Misture o epóxi de acordo com as instruções da embalagem, e pinte anéis ou retângulos espessos nos slides de vidro. Deixe os slides curarem e secarem no capô por pelo menos 24 horas antes de usar.

2. Coleta e criação de embriões

1. Par de peixes adultos machos e fêmeas dos genótipos desejados em caixas de reprodução no final da tarde/início da noite. Na manhã seguinte, depois de desovarem, colete ovos recém-fertilizados com um coador de malha e transfira-os para a E3 em pratos petri de 100 mm.
2. Incubar os embriões a ~27,5 °C com um ciclo escuro de 14 h/10 h até o dia da cirurgia. Mude o E3 diariamente ou conforme necessário.
3. Alimente as larvas usando um cabide cheio de rotifers colhidos uma vez por dia, começando em 5 dias após a fertilização (dpf) ou um dia após a cirurgia. Depois que as larvas tiverem várias horas para comer, troque o E3 para remover quaisquer rotifers restantes e resíduos.
   NOTA: Não alimente larvas no dia da cirurgia.

3. Prepare larvas para cirurgia

1. No dia da cirurgia, use uma pipeta pasteur de vidro larga para transferir 10-15 larvas para uma placa de Petri de 35 mm cheia de E3 fresca.
2. Anestesiar as larvas adicionando 3-5 gotas de 0,4% w/v solução tricaine (0,4 g Tricaine dissolvido em 210 mM Tris, pH 9; solução final ajustada a um pH de 7,4 se necessário¹⁸) ao prato para uma concentração final de ~0,0015% w/v Tricaine. Procure por falta de resposta ao toque para determinar se as larvas estão adequadamente anestesiadas. Se eles ainda estiverem respondendo ao toque após ~3 min, adicione mais 2-3 gotas de 0,4% c/v solução tricaine e reavalie.
   NOTA: Nesta fase de desenvolvimento, é possível monitorar o fluxo sanguíneo e a frequência cardíaca, além da motilidade sob o microscópio dissecando.
3. Imobilize as larvas anesterizadas de zebrafish incorporando-as em 1% de LMP agarose dissolvida em E3.
   1. Primeiro, coloque a tampa de uma placa de Petri de 35 mm de frente para cima sob o microscópio de dissecação. Em seguida, leve uma larva para cima em uma pipeta pasteur de vidro estreita com apenas uma pequena quantidade de E3.
   2. Em seguida, aspire ~200 μL de derretido, quente (~40 °C) 1% LMP agarose na pipeta com a larva. Por fim, esguiche a larva e agarose na tampa da placa de Petri de cabeça para baixo.
   3. Use uma agulha de tungstênio maçante para manobrar rapidamente, mas suavemente, a larva para que ela seja lateral, com um olho voltado para cima. Aguarde a agarose para definir (~5 min).
      NOTA: Se a agarose endurecer enquanto a larva não estiver lateral, liberte-a da agarose (como descrito na etapa 5) e devolva-a ao prato com E3 e tricaine.

4. Remoção ocular

1. Uma vez que a agarose é definida, e a larva é posicionada lateralmente, use a ponta de uma agulha de tungstênio muito fina e eletróticamente afiada para perfurar a pele ao redor do olho, seguindo a borda da órbita ocular.
2. Em seguida, deslize a borda da agulha (não a ponta) sob o olho do lado temporal-ventral do olho. Use pressão controlada para soltar o olho da tomada.
3. Use fórceps cirúrgicos muito finos para remover o olho, beliscando o nervo óptico e empurrando o olho de medial para lateral. Alternativamente, basta continuar pressionando o olho dorsal e anteriormente com o lado da agulha, eventualmente cortando através do nervo óptico e liberando o olho.
   NOTA: Se tecidos diferentes do olho forem acidentalmente esfaqueados durante a cirurgia, mate a larva de forma rápida e humana por decapitação rápida.

5. Cuidados pós-operatórios até o ponto final experimental

1. Após a remoção bem sucedida do olho, cubra a agarose com a solução MMR.
2. Liberte cada larva da agarose escovando suavemente uma agulha de tungstênio em torno de sua cabeça e, em seguida, em torno de seu corpo enquanto estabiliza a tampa da placa de Petri com fórceps.
3. Transfira as larvas de um olho só para uma placa de Petri de 35 mm que contém MMR suplementada com uma diluição de 1:100 de um coquetel de penicilina/estreptomicina. Incubar os embriões a ~27,5 °C com um ciclo escuro de 14 h/10 h.
   NOTA: Esta solução isotônica de RMM suplementada com antibióticos inicialmente auxilia a cicatrização e sobrevivência larval. Cada prato pode conter até 15 larvas em recuperação.
4. No dia seguinte, devolva as larvas para a E3. A partir da tarde seguinte à cirurgia, alimentado larvas (~6 dpf e mais velhos) usando um cabide cheio de rotifers colhidos uma vez por dia. Depois que as larvas tiverem várias horas para comer, troque o E3 para remover quaisquer rotifers restantes e resíduos.

6. Fixação de larvas

1. Uma vez que as larvas tenham atingido o estágio de desenvolvimento desejado para análise, anestesia-as com uma dose letal de tricaine (~0,4% de concentração final) até que seus corações parem.
2. Pipeta até 30 larvas por tubo microfuça de 1,5 mL. Remova o excesso de E3 e adicione 0,5-1 mL de solução fixa (4% paraformaldeído (PFA) e 4% de sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS)) para fixar o tecido. Incubar as larvas durante a noite a 4 °C.
3. Lave as larvas com PBS no dia seguinte removendo o fixador e enxaguando as larvas 3-4 vezes com PBS. Armazene as larvas a 4 °C por até 7 dias antes da dissecação.

7. Dissecando larvas para revelar cérebros (adaptados a partir de ¹⁵)

1. Suspenda as larvas fixas em gotículas PBS em uma placa Sylgard sob um microscópio dissecando. Fixá-los lateralmente colocando dois pinos de tungstênio (agulhas de tungstênio tipicamente antigas que têm menos de 2 cm) através do notochord, com um pino apenas posterior à área pigmentada cobrindo a região de aorta-gonad-mesonephros (AGM) e outro em linha com a extremidade da extensão da gema.
   NOTA: Posicione os pinos de tungstênio no menor número possível de tentativas, pois o tecido se tornará mais friável a cada punção.
2. Use uma agulha de tungstênio muito afiada e fórceps afiados para expor o cérebro removendo, nesta ordem, o olho(s), orelha, mandíbula, trato digestivo e pele craniana dorsal.
   1. Primeiro, remova o olho usando uma técnica semelhante à remoção cirúrgica dos olhos na etapa 4. Em seguida, despreecupe a larva e gire-a para o lado oposto, para que o outro olho seja acessível e repita. Alternativamente, cutuque a agulha através da mandíbula para o outro lado e remova o olho sem despinar.
      NOTA: Os olhos podem ser coletados neste momento se a análise desse tecido for desejada (semelhante a ¹⁹).
   2. Em seguida, use a agulha de tungstênio para raspar do temporal para o lado ventral da orelha. Na mesma ação/movimento, leve a agulha posterior à mandíbula e puxe suavemente anteriormente até que a orelha e a mandíbula sejam removidas.
   3. Use fórceps para puxar os órgãos ventral e qualquer gema restante para fora.
   4. Finalmente, faça uma incisão rasa na pele craniana dorsal perto da junção entre o cérebro traseiro e a medula espinhal. Levante a pele com os fórceps e puxe-a anteriormente e ao redor do telencephalon. Se isso se mostrar muito difícil, comece com a incisão inicial no cérebro traseiro e puxe a pele primeiro lateralmente e depois ventrally e anteriormente, tomando muito cuidado para não arranhar as bordas laterais do tectum.
      NOTA: Como o cérebro médio é objeto de estudo, o cérebro traseiro pode ser cortado; no entanto, uma incisão profunda pode resultar em decapitação.
   5. Remova qualquer tecido restante com fórceps. Despreecupe a larva e transfira para PBS em um tubo de microfuça de 1,5 mL.
      NOTA: Deixe a cauda presa ao cérebro para melhor visibilidade ao executar protocolos de valor integral.

8. Desidratação cerebral e armazenamento

1. Remova o PBS do cérebro e adicione 1 mL de PBS contendo TritonX-100 (PBST) de 0,1%. Incubar por 5-10 min em temperatura ambiente.
2. Remova o PBST e substitua-o por uma solução de metanol:PBST 50:50. Incubar por 5-10 min em temperatura ambiente.
3. Lave os cérebros com 100% de metanol (MeOH) duas vezes por 5 min cada a temperatura ambiente.
4. Armazene os cérebros em 100% MeOH a -20 °C por pelo menos 16 h antes de realizar a imunohistoquímica ou outros procedimentos de totalidade.
   NOTA: Os cérebros podem ser armazenados em MeOH por até 2 anos a -20 °C.

9. Imunohistoquímica

NOTA: Protocolos estabelecidos para muitas técnicas úteis de integral em zebrafish podem ser encontrados no ZFIN²⁰. Este manuscrito fornece exemplos comparando larvas de um olho e dois olhos que estavam imunossuídas com anticorpos que reconhecem a proteína fluorescente vermelha (RFP), que é expressa em axônios nervosos ópticos na linha Tg[atoh7:RFP] (Figura 2), ou histone H3 (PH3), que destaca células mitóticas (Figura 3). Um protocolo padrão de imunohistoquímica para embriões e larvas de todo o montante é resumido abaixo.

1. Primeiro, reidratar os cérebros larvais com uma série classificada de MeOH:PBST lava à temperatura ambiente incubando os espécimes em 50:50 MeOH:PBST por 5 min, depois em 30:70 MeOH:PBST por 5 min, e terminando com 3 lavagens de PBST.
2. Para permeabilizar os cérebros, incuba-os em PBST suplementado com proteinase K (PK) em uma concentração final de 20 μg/ml PK por 30 min a 37 °C. Armazene alíquotas de 10 mg/mL PK a -20 °C e descongele-as antes de usá-las.
3. Remova a solução PK e lave qualquer enzima restante enxaguando os cérebros com PBST 3 vezes ao longo de 15 minutos.
4. Refixe os cérebros permeabilizados incubando-os em 4% pfa por 20 min a 25 °C (ou temperatura ambiente). Em seguida, remova o PFA e lave qualquer fixação restante enxaguando os cérebros 3 vezes mais de 15 minutos com PBST.
5. Substitua a lavagem final pbst por tampão de imunobloqueio (IB) recém-feito (soro de cabra 10% normal e 1% DMSO em PBST) e incubar à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
6. Diluir anticorpos primários no tampão IB na concentração apropriada (por exemplo, 1:500 para RFP e 1:300 para anticorpos PH3).
7. Remova o tampão IB dos cérebros e substitua-o pela diluição do anticorpo primário. Incubar durante a noite a 4 °C em um agitador orbital com balanço suave. Certifique-se de que os tubos estão firmemente descansando em seus lados.
8. Na manhã seguinte, remova a solução de anticorpos primária com uma micropipette, enxágue algumas vezes em PBST, e depois lave os cérebros em PBST em temperatura ambiente por 4 x 30 min.
   NOTA: As diluições de anticorpos primários podem ser reutilizadas uma vez dentro de ~7 dias se armazenadas a 4 °C.
9. Enxágüe os cérebros no tampão IB enquanto dilui anticorpos secundários no tampão IB na concentração apropriada (por exemplo, 1:500 para Alexa-fluor 568 anti-coelho).
10. Remova o tampão IB e substitua-o pela diluição de anticorpos secundários. Incubar durante a noite a 4 °C em um agitador orbital com balanço suave dos tubos descansando em seus lados.
11. Na manhã seguinte, remova a solução secundária de anticorpos, enxágue com PBST e depois lave os cérebros em PBST em temperatura ambiente por 4 x 30 min.
12. Contra-retenção com 4',6-diamidino-2-fenildole (DAPI) ou ToPro3 (1:5.000 em PBST a 4 °C durante a noite).
13. Na manhã seguinte, transfira os cérebros larvais para a PBS e prossiga para as etapas de montagem e imagem listadas abaixo.

10. Montagem e imagem

1. Fixar um deslizamento de câmara na tampa de uma placa de Petri de 100 mm com graxa de vácuo.
2. Transfira as larvas imunossuadas e processadas para uma placa de poço ou deslizamento de depressão para vê-las com um microscópio dissecando.
3. Monte as larvas no escorregador em colunas de 1% de LMP agarose.
   1. Usando uma pipeta pasteur de vidro, coloque uma larva no escorregador de câmara, depositando o mínimo de PBS possível. Com a mesma pipeta, cubra a larva com agarose LMP derretida de 1% (~40 °C).
   2. Com uma agulha de tungstênio ou fórceps, desenhe a agarose em uma coluna e, em seguida, posicione a larva o mais simétrico possível, com a superfície dorsal visível.
   3. Repita este procedimento para as larvas restantes.
   4. Uma vez que a agarose tenha gelado, cubra-o com algumas gotas de PBS e, em seguida, coloque-o no palco do microscópio confocal.
4. Alinhe a lente objetiva com a amostra, concentre o microscópio usando luz transmitida e ilumine a amostra com os lasers apropriados.
   NOTA: Neste exemplo, foram utilizados comprimentos de onda de 405 nm e 568 nm para excitar DAPI e RFP, respectivamente.
5. Ajuste o ganho, deslocamento e potência do laser movendo as barras de controle deslizante para um nível apropriado em relação ao sinal e ao detector usado. Verifique os histogramas de cada canal e clique no botão estado de indicador de saturação acima da imagem para medir o nível de exposição, garantindo que nenhum dos pixels esteja saturado e que a relação sinal-ruído seja alta. Para um exemplo de parâmetros de imagem confocal ideais para resolução celular e subcelular dentro do zebrafish, consulte ²¹.
6. Defina os limites superiores e inferiores da pilha de z-planes usando a roda de rolagem no mouse para encontrar a parte superior e inferior da amostra. Clique nos limites superior e inferior para aquisição de imagens e, em seguida, acione a captura de pilha de z clicando no botão Executar agora .
   NOTA: Dependendo de quão simetricamente o cérebro é montado, a profundidade total z para um cérebro de zebrafish larval de 9 dpf será ~150-200 μm.
7. Processe e colora as imagens com acessibilidade daltônica em mente (por exemplo, use azul e laranja ou magenta e verde para imagens bicolores). Configure tabelas de pesquisa no software usado para capturar as imagens ou softwares de processamento de imagens, como o Photoshop da Adobe.
8. No Photoshop, fotomicógrafos brutos de cor salvos como TIFF (Tagged Image File Format, formato de arquivo de imagem) de 8 bits por (i) convertendo o Modo de Imagem em RGB e (ii) acessando a opção Curvas sob a imagem | Ajustes menus e, em seguida, (iii) deslizando as saídas de luz coloridas apropriadas para 0 ou 255 níveis para alcançar a cor desejada. Por exemplo, para obter um sinal verde, selecione o canal Vermelho e deslize sua saída para 0; em seguida, selecione o canal Azul e deslize sua saída para 0 também. Da mesma forma, para obter um sinal magenta, selecione o canal Verde e deslize sua saída para 0; deixe os canais vermelho e azul como eles são.
   NOTA: Etapas semelhantes podem ser executadas no Programa gratuito de Manipulação de Imagens Gnu (GIMP).
9. Quantifique manualmente o número de células exibindo um marcador específico usando o plugin do contador de células na ImageJ²², disponível no menu Analisar no menu Plugins. Exemplos de como usar o ImageJ para contagem de células podem ser encontrados em muitos tutoriais, incluindo ²³.
10. Gerar representações gráficas de dados em softwares estatísticos como rstudio (ver dados suplementares para . Arquivo Rmd).

Representative Results

Para confirmar se a remoção dos olhos foi completa e avaliar como o tectum óptico muda, foram realizadas cirurgias na cepa Tg[atoh7:RFP], que rotula todas as RGCs com um RFP direcionado à membrana e, assim, todos os axônios que projetam a partir da retina e formam o nervo óptico²⁴. Embora o uso dessa cepa não seja absolutamente necessário, permite a observação e visualização direta do nervo óptico termini no neuropil tectum óptico. Outras abordagens para rotular o nervo óptico, como o traçado do axônio com corantes dii lipofílicos ou dio^25,26 ou multiespectrais com o cérebro²⁷, também seriam possíveis.

Como mostrado na Figura 2, a degeneração progressiva dos axônios de retina no neuropil tectum óptico foi observada após a remoção dos olhos. Por dois dias após a cirurgia, os axônios rotulados por RFP exibiram marcas da rápida degeneração walleriana²⁸, como blebbing e fragmentação (Figura 2A,B). Trabalhos recentes mostraram que a microglia engole mais material de mielina quando os neurônios são silenciados²⁹. Consistente com microglia engolindo pedaços dos axônios RGC degenerados e migrando para longe da fonte de degeneração, foram observados punctas brilhantes com etiqueta de RFP dentro e fora do neuropil tectal (Figura 1B, setas). Em quatro dias após a cirurgia, axônios fragmentados e detritos axonal rotulados por RFP são consideravelmente reduzidos em ambos os lobos tectal, indicando a liberação relativamente rápida dos axônios moribundos e degenerados (Figura 2C,D).

Para realizar a imunohistoquímica integral e visualizar o tecto óptico de zebrafish larval, o cérebro foi exposto dissecando os olhos, mandíbula, orelhas e tampa do crânio da pele e tecidos conjuntivos. Idealmente, o cérebro permanece intacto durante este procedimento (por exemplo, Figura 2C,D). No entanto, partes do cérebro, particularmente a lâmpada olfativa, são susceptíveis de serem danificadas ou completamente removidas quando a tampa do crânio da pele ou mandíbula for removida (Figura 2A, ponta de flecha). Além disso, às vezes a borda lateral do tectum pode ser cortada ao perfurar ou beliscar a pele para retirá-la do cérebro (por exemplo, Figura 2A; rasgar no lobo tectal direito).

A imunohistoquímica também foi usada para avaliar o número de células mitóticas em lóbulos inervados e não inervados do tectum óptico, manchando cérebros inteiros com um anticorpo PH3. Esses dados mostram significativamente menos células mitóticas no lado denervado de peixes larvais de um olho só (p = 0,00033, teste t de Welch; Figura 3).

Figura 2: Remoção ocular a 5 dpf desencadeia a degeneração de axônios nervosos ópticos. (A-D) Projeções representativas de intensidade máxima que mostram visões dorsais de cérebros do tipo selvagem de larvas intactas fixadas em 7 dpf (A) ou 9 dpf (C), ou larvas de um olho de cirurgias de extirpação ocular em 5 dpf, fixas 2 dps (B) ou 4 dps (D). Todos os núcleos estão manchados com DAPI (verde), e os axônios nervosos ópticos terminando no neuropilo do tectum óptico são rotulados pela atoh7:RFP transgene (magenta). O asterisco indica neuropiloto tectal inervado em larvas com apenas o olho direito intacto. Setas indicam exemplos de fragmentos de axônios RGC degenerados emanando do tectum óptico denervado. A ponta da flecha indica partes faltantes do cérebro. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: dpf = dias pós fertilização; dps = dias após a cirurgia; RGC = células gânglios da retina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Número de células mitóticas no tecto óptico aumenta com inervação. (A-B) Projeções representativas de intensidade máxima mostrando visões dorsais de cérebros do tipo selvagem de intactos (A) ou larvas de um olho (B) 9 dpf imunossuídas com anticorpos para o marcador mitotético PH3 (magenta) e núcleos de nuclei contra-manchados com DAPI (verde). O asterisco indica neuropil tectal inervado do olho direito intacto. (C) Gráfico de caixa com todos os pontos de dados individuais sobrepostos mostrando a quantitação da razão de células PH3⁺ em lóbulos tectal inervados (esquerda) versus denervados (direita) como uma razão de diferença (esquerda-direita/total) para um olho único (n = 12) e larvas de dois olhos (n = 8) 9 dpf. Meios das duas condições em comparação com o teste t de Welch (***, p < 0,0005). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: dpf = dias pós fertilização; dps = dias após a cirurgia; PH3 = histona fosforilada H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar: Contorno e instruções para o plot mostrado na Figura 3C. Este arquivo contém todos os dados e códigos para que qualquer pessoa possa reproduzir o plot da caixa com todos os pontos de dados sobrepostos, como mostrado na Figura 3C. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

As técnicas descritas neste artigo ilustram uma das muitas abordagens para estudar o desenvolvimento de sistemas visuais de vertebrados em zebrafish. Outros pesquisadores publicaram métodos para dissecar a retina embrionária e realizar análises de expressão genética¹⁹ ou visualizar a atividade neuronal no tectum^{óptico 30}. Este artigo fornece uma abordagem para explorar como a entrada diferencial da retina pode influenciar os comportamentos celulares no tectum óptico.

Para garantir a extirpação ocular bem sucedida e a sobrevivência larval após a cirurgia, é importante que as larvas sejam saudáveis, adequadamente anestesiadas e imobilizadas em 1% de agarose. Também é crucial que as agulhas de fórceps e tungstênio sejam muito afiadas e limpas. Larvas sobrevivem melhor quando não são alimentadas 24 horas antes ou depois da cirurgia, e a criação de larvas em MMR suplementadas com antibióticos acelera o processo de cicatrização. É importante ressaltar que a maior força iônica da RMM e, especialmente, a maior concentração de cálcio promove a cura¹⁴. No entanto, uma maior exposição à maior salinidade pode diminuir a sobrevida, semelhante ao que foi documentado no zebrafish^{embrionário 31}. Um passo mais crítico é a fixação para garantir dissecções cerebrais bem sucedidas, que são essenciais para a análise de dados de imagens de amostras imunoschemdas. O uso de 4% de PFA recém-feito suplementado com 4% de sacarose (carinhosamente chamado de doce de fixação) tende a aumentar a facilidade de remoção da pele e preservação do tecido cerebral. Como nas cirurgias, ferramentas afiadas e limpas são imperdíveis para dissecar cérebros.

Um dos maiores desafios deste protocolo é incorporar larvas para extirpações oculares. É importante que cada pessoa encontre o caminho que funciona melhor para elas para que possam remover o olho larval com confiança e rapidez. Se a larva for acidentalmente esfaqueada durante a cirurgia, mate-a humanamente por decapitação. Outro desafio é determinar as concentrações de anticorpos mais eficazes para imunossuagem integral. Ao determinar as concentrações de anticorpos apropriadas, use a literatura publicada como ponto de partida e otimize o protocolo como utilizando reagentes publicados em diferentes tecidos (especialmente em tecidos maiores ou animais mais velhos) pode exigir maiores concentrações e/ou tempos de incubação.

A maior limitação deste método é o tempo que um único experimento leva do início ao fim e o número de peixes que podem ser estudados a qualquer momento. Por exemplo, todos os dados mostrados na Figura 3 levaram cerca de um mês desde o emparelhamento inicial de peixes até a coleta e análise final dos dados. Essa abordagem relativamente de baixa produtividade pode ser complementada por abordagens genéticas heterólogas que silenciam seletivamente a atividade neural no sistema visual^32,33 ou por mutantes que não possuem axônios de RGC ou atividade^34,35.

O significado deste método é que ele traz uma técnica embriológica tradicional para suportar em linhas modernas de peixes transgênicos, permitindo a comparação direta dos mecanismos celulares e genéticos que operam em cada um dos lobos tectal dentro do mesmo indivíduo. Além disso, este método está maduro para aplicação a outros sistemas experimentais, incluindo peixes superficiais Astyanax ³⁶ e/ou larvas transgênicas de zebrafish com microglia de rotulação fluorescente ^37,38,39 e astrócitos⁴⁰ para estudar como o sistema nervoso de peixe em desenvolvimento responde a uma lesão tão dramática.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions.
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio			Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains.			Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.